专利名称：从蛇毒中分离纯化神经生长因子的方法
技术领域：
本发明涉及一种从蛇毒中分离纯化神经生长因子的方法，特别是用于从蝮亚科江浙蝮蛇毒中分离纯化神经生长因子的方法。
自从1956年，Levi-Montaleini(意大利)和Cohen(美国)首次从蛇毒中发现神经生长因子以来，许多学者对此进行了大量的研究和报导。神经生长因子(Nerve growth factor NGF)是最早发现的细胞生长调节因子，也是神经系统最重要的生物活性分子之一。由于NGF具有广泛的应用价值，所以世界上的各大制药公司，都投入大量的人力物力对NGF进行开发和研究。据有关文献报道，已从多种生物材料中分离纯化出NGF。这些材料包括蛇毒、雄性小鼠颌下腺、人足月胎盘、豚鼠前列腺和牛精囊等。但是，由于蛇毒成份复杂，NGF仅占蛇毒蛋白含量的1%左右，因此从蛇毒中分离纯化NGF是一种比较困难的工作，作为分离纯化手段，一般需经过凝胶过滤、离子交换层析以及盐析、超滤、制备性凝胶电泳，甚至高压液相层析等方法，才能获得均一的NGF。不同种属蛇毒NGF分子量，等电点均有所差异，所以从不同种属蛇毒分离纯化NGF的方法不固定，需根据各自的特点确定没有确定的模式。目前，国内外已对从眼睛蛇科、响尾蛇科和蝰亚科等多种蛇毒中分离纯化的NGF进行了报道。但是从蝮亚科江浙蝮蛇毒中分离纯化NGF至今未见报道。
本发明的目的是提供一种从江浙蝮蛇毒中分离纯化NGF的高效纯化模式，它一次层析上样量大、分辩率高，有利于工业化生产，纯化的神经生长因子对酸、碱和温度有较好的稳定性。
本发明的目的是这样实现的采用江浙蝮蛇毒经冷冻干燥制成干粉，在4℃条件下完成以下四个层析步骤1、CM-Sephadex C50柱层析取江浙蝮蛇毒干粉溶解于PH6.4磷酸盐缓冲液中，离心除去不溶物，上清液上样于经上述缓冲液已平衡好的CM-Sep-hadex C50层析柱(2.6×50cm)，先用起始缓冲液洗去未吸附的杂蛋白，再用0-1MNacl直线梯度洗脱，自动部分收集，洗脱液用280nm波长紫外检测仪检测并记录洗脱曲线，同时用分光光度计测每管280nm光吸收值，各峰分别收集，测各峰蛋白浓度，然后测NGF的生物活性，将具有NGF生物活性的组份，透析除盐，冷冻干燥;
2、Sephadex G100凝胶过滤层析将第一步层析的NGF样品溶于PH7.0磷酸盐缓冲液中，上SephadexG100层析柱(2.6×95cm)，用同种缓冲液洗脱，按峰收集，测NGF的生物活性，将具有NGF生物活性的组份，透析除盐，冷冻干燥;
3、DEAE-Sephadex A50层析将Sephadex G100具有NGF活性组份溶于Tris-Hcl，PH8.4缓冲液中，上样于DEAE-Sephadex A50层析柱(1.6×35cm)，Nacl直线梯度洗脱，按峰收集。测NGF生物活性，将具有NGF活性，透析除盐，冻干;
4、高效液相色谱仪(FPLC)层析取DEAE-Sephadex A50层析的NGF组份溶于Tris-hcl，PH8.0缓冲液中上FPLCMono QHR5/5阴离子交换柱，用Nacl浓度梯度洗脱，收集NGF活性峰，除盐、冻干，即得纯化的神经生长因子。
由于本发明不采用常规分离蛇毒NGF的第一步就选用凝胶过滤的方法，而是选择CM-Sephadex C50阳离子交换层析作为初始步骤，选用2.6×50cm层析柱，一次上样量大，从而有效克服了现有技术中凝胶过滤层析作为初始步骤，存在着一次上样量小的缺点，可提高分辨率，有利于工业化生产。另外第一步骤起始缓冲液的PH值定为6.4，可使蛇毒中大量的酸性杂蛋白除去，利用CM-SephadexC50凝胶层析，很容易将碱性蛋白中的主要成份神经毒分离出来。经上述四个步骤即可分离纯化出NGF。再经酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相分子筛层析验证，用本发明方法分离出的NGF为单一物质，高效凝胶过滤色谱测得江浙蝮蛇毒中的NGF分子量为30.3KD，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定该物质为单链结构，分子量为30KD。等电聚焦电泳测得等电点为7.8。用过碘酸Schiff′s试剂染色，证明江浙蝮蛇毒中的NGF为糖蛋白，对酸、碱和温度有较好的稳定性。经8日龄鸡胚背根节、14日龄鸡胚交感节体外培养证明具有促进神经节神经纤维生长的活性。江浙蝮蛇毒中的NGF在25ng/ml浓度时，鸡胚背根节神经纤维生长达最大反应，即它的生物活性单位为25ng/ml。由此可见，本发明的方法提供了一种行之有效的从江浙蝮蛇毒中分离纯化神经生长因子的高效纯化模式。
以下结合实施方法和各层析的洗脱曲线图Ⅰ-Ⅳ对本发明作进一步说明。
首先将江浙蝮蛇毒经冻干制成干粉，在4℃条件下完成以下四个层析步骤1、CM-Sephadex C50柱层析取江浙蝮蛇毒干粉1g溶解于10ml0.05M，PH6.4磷酸盐缓冲液中，离心除去不溶物10，000g，15min，上清液上样于经上述缓冲液已平衡好的CM-Sephadex C50层析柱(2.6×50cm)，先用起始缓冲液洗去未吸附的杂蛋白，再用0-1MNacl直线梯度洗脱，流速30ml/小时，10ml/管，20min自动部分收集，洗脱液用280nm波长紫外检测仪检测并记录洗脱曲线(见
图1)，同时用分光光度计测每管280nm光吸收值，得到四个大峰，各峰分别收集。经测试NGF的生物活性，NGF在第Ⅲ峰，第Ⅰ峰和第Ⅳ峰分别是中性和碱性PLA2峰，将具有NGF生物活性的组份，透析除盐，冷冻干燥得118mg。
2、Sephadex G100凝胶过滤层析将第一步层析的NGF样品溶于0.05M，PH7.0磷酸盐缓冲液中，内含0.15M Nacl，上Sephadex G100层析柱(2.6×95cm)，用同种缓冲液洗脱，流速12ml/小时，4ml/管，20min按峰收集，测NGF的生物活性在第Ⅱ峰(见图2)，将具有NGF生物活性的组份，透析除盐，冷冻干燥得32mg。
3、DEAE-Sephadex A50层析将第二步骤得到的NGF组份溶于0.01M Tris-Hcl，PH8.4缓冲液中，上样于DEAE-Sephadex A50层析柱(1.6×35cm)，0-0.5M Nacl直线梯度洗脱，流速15ml/小时，5ml/管，20min，按峰收集(见图3)，测NGF生物活性，将具有NGF活性第Ⅲ峰收集，透析除盐，冷冻干燥得4.7mg。
4、高效液相色谱仪(FPLC)层析取第三步骤得到的NGF组份溶于0.01M Tris-hcl，PH8.0缓冲液中，上FPLC MonoQHR5/5阴离子交换柱，用Nacl浓度梯度洗脱，流速1ml/小时，收集NGF活性峰第Ⅱ峰(见图4)，除盐、冷冻干燥最终得到1.1mgNGF。
经过上述四个步骤层析，即可从1g粗蛇毒中分离纯化出1.1mgNGF，产率为0.11%。
权利要求
1.一种从蛇毒中分离纯化神经生长因子的方法，其特征是采用江浙蝮蛇毒经冻干制成干粉，在4℃条件下完成以下四个层析步骤(1)、CM-Sephadex C50 柱层析取江浙蝮蛇毒干粉溶解于PH6.4磷酸盐缓冲液中，离心除去不溶物，上清液上样于经上述缓冲液已平衡好的CM-Sep-hadex C50层析柱(2.6×50cm)，起始缓冲液洗去未吸附的杂蛋白，再用0-1MNacl直线梯度洗脱，按峰分别收集，测各峰蛋白浓度，然后测NGF的生物活性，将具有NGF生物活性的组份，透析除盐，冷冻干燥；(2)、Sephadex G100凝胶过滤层析将第一步层析的NGF样品溶于PH7.0磷酸盐缓冲液中，上SephadexG100层析柱(2.6×95cm)，用同种缓冲液洗脱，按峰收集，测NGF的生物活性，将具有NGF生物活性的组份，透析除盐，冷冻干燥；(3)、DEAE-Sephadex A50层析将SephadexG100具有NGF活性组份溶于Tris-Hcl，PH8.4缓冲液中，上样于DEAE-Sepha-dexA50层析柱(1.6×35cm)，0-0.5MNacl直线梯度洗脱，按峰收集。测NGF生物活性，将具有NGF活性，透析除盐，冻干；(4)、高效液相色谱仪(FPLC)层析取DEAE-Sephadex A50层析的NGF组份溶于Tris-hcl，PH8.0缓冲液中，上FPLCMonoQHR5/5阴离子交换柱，用Nacl浓度梯度洗脱，收集NGF活性，除盐、冻干，即得纯化的神经生长因子。
全文摘要
本发明提供一种从江浙蛇毒中分离纯化神经生长因子的方法。采用江浙蝮蛇毒经冻干成干粉，在4℃条件下完成下述步骤；(1)CM-Scphadcx C50柱层析；(2)Scphadcx G100凝胶过滤层析；(3)DEAE-Scphadcx A50层析；(4)高效液相色谱仪(FPLC)层析。该方法一次层析上样量大，分辨率高，有利于工业化生产，纯化的神经生长因子对酸、碱和温度有较好的稳定性。
文档编号A61K35/58GK1074448SQ9210996
公开日1993年7月21日 申请日期1992年9月29日 优先权日1992年9月29日
发明者潘 清, 郝文学, 郝小菁 申请人:中国医科大学