专利名称：：抗肿瘤方法和抗肿瘤剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及利用抗肿瘤细胞表面的肿瘤抗原的免疫反应的一种抗肿瘤方法和一种抗肿瘤剂。在日本未审查专利公开第2-48532号中，公开了一种由癌携带动物的腹水生产具有抗肿瘤作用的生理活性物质的技术。在该技术中，将肿瘤细胞移植到哺乳动物的腹膜腔中，给予一种抗肿瘤剂，给予从正常同源哺乳动物获得的脾细胞，并经过预定的时间后，从积集在腹膜腔的腹水中获得生理活性物质。另外，从经过免疫监视治疗表明改善的癌症病人的腹膜腔中所收集腹水的上清液中获得生理活性物质。然而，消除肿瘤携带动物中的肿瘤细胞的免疫学机理直到现在仍未被充分阐明。本发明的一个目的是提供一种利用抗肿瘤抗原免疫反应的抗肿瘤方法。本发明的另一目的是提供一种利用抗肿瘤抗原的免疫反应的抗肿瘤剂。本发明提供一种抗肿瘤的方法，其中给予非经典组织相容性组1抗原(non-classicalhistocompatibilityclass1antigen)，一种由所说抗原识别的抗体或一种细胞毒的脾细胞，并给予包含所说抗原作为有效成分的一种抗肿瘤剂。作为使用非经典组织相容性组1抗原的方法，许多方法都是可能的，包括(1)使用具有与一种由肿瘤细胞表达的非经典组织相容性组1抗原交叉反应性的同种基因淋巴细胞;(2)使用一种由基因工程方法产生的非经典组织相容性组1抗原;和(3)将分离的非经典组织相容性组1抗原CDNA导入到培养的淋巴细胞中，使该淋巴细胞在淋巴细胞的表面上表达该经典组织相容性组1抗原。在体外增殖这些淋巴细胞，并在此后使用该淋巴细胞。这些技术在现有技术中是公知的。例如，为产生上(2)和(3)中的抗原，采用一种包含下列步骤的方法a.由表达非经典组织相容性组1抗原的肿瘤细胞来制备mRNA;b.使用一种逆转录酶制备与mRNA相应的cDNA;c.使用λ噬菌体由cDNA制得cDNA文库;d.采用斑块杂交法，由cDNA文库中筛选包含所需非经典组织相容性组1cDNA的λ噬菌体;e.将此cDNA掺入到表达载体使用大肠杆菌来产生非经典组织相容性组1抗原蛋白分子;和f.使用DNA转染方法，把在d步中获得的cDNA引入培养的淋巴细胞中，在白细胞介素2存在下培养这些淋巴细胞，并通过限定稀释法建立强烈表达所需抗原的细胞克隆。作为制备一种识别非经典组织相容性1抗原的抗体的方法，也能使用现有技术中许多已知的方法。例如，能使用下列方法1.通过融合脾细胞(该脾细胞是由以上步骤e中制备的抗原分子免疫的动物中获得的)或者淋巴细胞(该淋巴细胞由癌携带个体外周血液获得，并在以上步骤e中获得的抗原分子存在下与淋巴瘤细胞一起体外培养刺激而得到)制备杂交瘤，然后2.通过采用限定稀释法，从这些杂交瘤中筛选出产生能够识别所需非经典组织相容性组1抗原的抗体的杂交瘤。对于这种筛选，可采用使用微量滴定板的酶联免疫吸附测定(ELISA)。也能通过现有技术中已知的方法来制备识别非经典组织相容性组1抗原的细胞毒淋巴细胞。例如，能采用下列方法1.在以上步骤f中获得的淋巴细胞存在下，体外培养从动物中获得的脾细胞来制备所需的细胞毒淋巴细胞，该动物是通过表达非经典组织相容性组1抗原的淋巴细胞(在以上步骤f中制备的)或者由肿瘤携带个体的外周血液中获得的淋巴细胞免疫的;2.使用限定稀释法，建立从这些淋巴细胞获得的所需细胞毒克隆;和3.通过测定对以上步骤f中制备的淋巴细胞的细胞毒性和对未导入cDNA的对照淋巴细胞的细胞毒性来确定识别的特异性。虽然本发明不局限于那些实施例，但对本发明作详细描述涉及下列的实施例。图1是表示在来源于H-2k小鼠肿瘤细胞株上存在的Qa-2抗原的曲线;图2是表示抗-Qa-2单克隆抗体(mAb)和闪式蛋白液相色谱层析(FPLC)纯化材料的补体依赖性细胞毒活性试验结果的曲线;图3描述125I-标记FPLC-纯化材料放射自显影的结果;图4是表示一种抗-IgD-琼脂糖凝胶柱对退化血清(RS)活性的吸附曲线。图5是通过酶联免疫吸附测定(ELISA)表示在RS中抗Qa-2抗原的IgD存在的曲线;图6描述在聚合酶链反应(PCR)中用作引物的寡聚糖核苷酸的特异性;图7表示DNA-DNA杂交分析结果;图8表示DNA-RNA杂交分析结果;图9表示通过聚合酶链反应(PCR)对BW5147cDNA的放大。图10表示对由大肠杆菌衍生的融合蛋白的Qa-2特异性mAb的反应性;和图11表示由人体肿瘤细胞株制备的cDNAs的核苷酸放大。实施例1[材料和方法](1)动物使用具有已知Qa、TL和Ly表现型(列于表1中)的13个同系基因小鼠菌株(KLEIN，J.，FIGVEROA，F.，DAVID，C.S.，H-2Haplotypes，geneandantigens∶SecondListing，Immunogenetics，1983，17∶553，MCKENZIE，IFC.，POTTER，T.;Murinelymphocytesurfaceantigens，AdvImmanol，1979，27∶179)。B6，B6.K1和B6.K2与Qa-1，Qa-2和Qa-3抗原是同类系的(STANTON，TH.，BOYSE，EA;AnewSerologicallydefinedLowsQa-1，intheTlaregionofthemouse，Immunogenetics，1976，3∶525)。C3H/He和C3H-Ly6.2与Ly6抗原的异型是同类系的。此B6.K1，B6.K2和C3H-Ly6.2株由Dr.T.Takahashi(theAichiCancerCenterResearchInstitute)提供并由该发明人保存。表1小鼠菌株的H-2、Qa、TL和Ly表现型细胞株H-2LyLyLyLyLyLyLyTLQaQaQa-1-2-3-4-5-6-7-1-2-3C3H/Hek1121112b---C3H-k1121122b---Ly6.2CBAk1121112b---CEk2121112b---AKRk2111122b---C58k2111121a+--BALB/cd2221112c---DBA/2d1121122c-++DBA/1q1121112b+-A/Ja2221112a+++C57BL/6b2222121b-++B6.K1b2222121b+--B6.K2b2222121b++-(2)肿瘤细胞腹水型癌细胞，MM2、MM46、MM48、MM102D、FM3A、MH125F、MH125P和X5563来源于C3H/He小鼠腹水型癌细胞，methA来源于BALB/C小鼠;腹水型癌细胞，EL-4来源于B6小鼠;且培养的癌细胞，BW5147来源于AKR小鼠;使用这些细胞。(3)单克隆抗体及其补体从AustralianMonoclonalDevelopment，NSW，购买Qa-2-特异性单克隆抗体(mAb)141-15.8。从BindingsiteLtd.，BirminghamU.K.购买单独特异于每个小鼠免疫球蛋白亚组IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgM和IgA的羊抗血清。从ICNImmunoBiologicals，ILL，购买单独特异于小鼠IgD的羊抗血清。从themeijiInstituteofHealthScience，Kanagawa，Japan购买特异于小鼠IgG2b和小鼠IgD的鼠单克隆抗体和后者的过氧化物酶衍生物。特异于抗菌成分(大肠杆菌的NuSA蛋白)的小鼠单克隆抗体mAb(IgG2b组)由Dr.Y.Nakamura(theMeijiInstituteofHealthScience)提供并用其作为与肿瘤细胞表面抗原无关的单克隆抗体。由Tago，Inc.，Burlengane，Calif获得抗小鼠免疫球蛋白的山羊抗体F(ab′)2及其异氰酸荧光素衍生物。通过用2-疏基乙胺还原F(ab′)2并用SephacrylS-200柱色谱层析分离来制备山羊抗体的Fab′片段。用作补体来源的吸收前兔血清从CederLaneLaboratoriesWestbury，N，Y，购得。(4)退化血清(RegressorSerumRS)据报道，用MM2癌细胞移植的C3H/He小鼠在腹膜内接种后第12到第14天间从小鼠中与腹水一起移出癌细胞时表明肿瘤以值得考虑的频率退化(KIMURA，Y.，TANINO-KOMAIJI，T.，Survivalofhostsmiceandindueedresistomcetotransplantableascitestumors，JapanJ，Exp.Med.，196636∶371)。癌细胞移出两周后，选择显示完全退化的小鼠并在乙醚麻醉下由心脏穿刺取血。从该血中分离血清(此后称为“退化血清”，RS)并贮存在-60℃温度下备用。(5)R1S的吸附为了将RS用于吸附试验中，通过用0.35饱和度的硫酸铵沉淀并按下列所描述的淀粉凝胶区带电泳从RS中除去γ-球蛋白。所得材料虽仍含有一些γ-球蛋白，但它可被用作除去γ-球蛋白的RS。用由7%胎牛血清(FCS)补充的RPMI-1640培养基将除去γ-球蛋白的RS稀释到原RS体积的100倍。1ml的该溶液与2×107淋巴细胞混合(脾细胞或脾细胞和肠系膜淋巴结细胞的混合物)，该淋巴细胞已通过氯化铵法(BOYLE，W，AnextensionofCytotoxins，Transplantion1968，6∶761)除去红细胞，并用Eagle′s最低必需培养基(MEM)洗涤三次或用(4到6)×106腹水肿瘤细胞按同法洗涤。将混合物在25℃温度下培养30分钟然后在0℃下培养60分钟。经在1，000rpm转速下离心5分钟去除细胞。在用淋巴细胞吸附的情况下，重复一次该过程。所得上层清液用作吸附的RS。(6)细胞毒性的分析腹膜内移植MM2细胞后3天获得的C3H/He小鼠的脾细胞被用作体外RS-依赖性细胞毒性反应中的效应细胞(TANINOT，EGAWAK;RegressorSerumfactor-dependentnonspecifickillersintumor-beeningmice)。将此效应细胞与1×10451Cr-标记的靶细胞在0.5ml用7%FCS补充的RPMI-1640介质中混合。在吸附试验中，将吸附前或吸附后的除去γ-球蛋白RS加到原RS500倍稀释的最终深度。MM2细胞，各种淋巴母细胞和L细胞转化细胞被用作靶细胞。在37℃温度下Co2培养器中，将该混合物在使用肿瘤细胞情况下培养18小时，在使用淋巴母细胞情况下培养5到7小时，和在使L细胞转化细胞情况下培养10小时。培养后，测定从细胞释放进入上清液和放射活性和保留在细胞中的放射活性并用特异溶解百分数表达细胞毒性。所有测定均重复一次。在吸附试验中，通过用RS活性的降低百分数表示法使重复或不同实验的结果标准化。通过以1×106细胞/ml的细胞密度培养从各种鼠中得到的脾细胞来制备淋巴母细胞，该培养是在用10%FCS补充的RPMI-1640培养基中培养2天然后在含有5μg/ml伴刀豆球蛋白A(Sigma，St.Louis)的培养基中培养3天。通过Q7b/Kb杂种基因DNA和H-2Kb基因DNA转染到Ltk-细胞中来获得LQ7b/kb和Lkb细胞。LQ7b/kb细胞表达Q7b基因产物的α1和α2区域和H-2Kb分子的α3区域。α1和α2区域主要决定免疫定义的H-2b小鼠淋巴细胞的Qa-2特异性(WANECK，G.L.，SHERMAN，D.H.，CLAUIN，S.，ALLEN，H.，andFLAVELL，R.A.;Tissue-Specificexpressionofcell-SurfaceQa-2antigenfromatransfectedQb7geneofC57BL/10，J.micrExpmed.，1987，165∶1358)。Lkb细胞在它们的表面表达H-2b分子。通过染色排除法用肠系膜淋巴结细胞作为靶细胞来测定补体依赖的细胞毒活性。将该细胞(5×105)混悬在100μl含5%FCS和抗体的MEM中。该混悬物在室温下培养90分钟。将该细胞用MEM洗涤两次，37℃温度下在100μl含有补体的MEM中培养45分钟，用MEM再洗涤两次，加入含有0.2%锥虫蓝的盐水并在显微镜下检查记录溶解百分数并减去作为背景的缺乏抗体的值。(7)血清蛋白的分级分离将在4℃下以0.35和0.50之间饱和度的硫酸铵沉淀的血清蛋白亚级份，通过使用0.07M巴比妥钠缓冲液(PH8.6)缓冲的10×40×15cm淀粉块的淀粉凝胶区带电泳来进行分级分离。用于凝胶电泳的水解淀粉从ConnaughtLaboratories，Willowdale，Ontario购得。在4℃、35mA下电泳24小时后，将该凝胶切成1cm宽的块并将每部分凝胶用10ml水洗脱。所得β-球蛋白部分与0.01M三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(PH8.6)进行渗析，使用1ml闪式蛋白液相色谱层析(FPLC)mono-Q柱装置(Pharmacia，Uppsala)并在相同缓冲液中用0到0.5M线性梯度的NaCl洗脱(TOMONO，T.，IKEDA，H.，TOKUNAGA，E.;High-Performanceion-exchangechromatographyofplasmaproteins，JChromatography，1983，266∶39)。再次用色谱层析后，获得具有对称洗脱组份的活性级分。采用溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B(Phorrmacia，Uppsala)和各个抗体来制备与单独特异于各个小鼠IgG1、IgG2a、IgG3、IgA、IgM和IgD的羊抗血清结合的琼脂糖凝胶4B。在4℃温度下，将FPLC-纯化的材料用于它们每个0.4ml柱上。将该柱用盐水洗涤并用含有5mM盐酸的盐水洗脱。洗脱液(0.2ml级分)直接滴入0.4ml用10%FCS补充的RPMI-1640培养基中并用于活性的测定。(8)蛋白的放射性碘标记和聚丙烯酰胺凝胶电泳通过氯胺T法(GREENWOOD，HC.，HUNTER，WM，GLOVER，JS.;Thepreparationof131I-LabelledhumangrowthhormoneofhighSpecificradioactivity，BiochemJ，1963，89∶114)使用1mCi的无载体钠[125I]-碘(NEN)，用125I标记FPLC-纯化的材料(10μg)。经过交联葡聚糖凝胶G-50(SephadexG-50)柱，将标记材料从游离碘中分离出来。在第一次中使用非平衡PH梯度电泳(NEPHGE)并在材料还原后第二次中使用SDS(十二烷基磺酸钠)-PAGE来完成两次PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)(O′FARRRELL，PZ.，GOODMAN，HM，O′FARRELL，PH.，Highresalutiontwo-dimentionalelectrophoresisofbasicaswellasaeidicproteins，cell，1977，12∶1233)。(9)采用流式细胞计进行Qa-2抗原检测使用一种小鼠脾细胞的富含T细胞部分，小鼠腹水肿瘤细胞，和BW5147细胞。通过尼龙羊毛的吸附由小鼠脾细胞来获得此T细胞浓缩级分的(JURIUS，MH.，SIMPSON，E.，HERZENBERG，LA;Arapidmethodforisolationoffunctionalthymus-derivedmurinelymphocytes，EurJImmunal1973，3∶645)。该细胞用最低必需培养基洗涤两次。通过在室温下用由一种山羊抗-(小鼠免疫球蛋白)抗体制备的Fab′部分处理60分钟来阻滞污染B细胞的细胞表面的免疫球蛋白。然后，将该细胞与Qa-2特异单克隆抗体141-15.8(200倍稀释液)进行反应。使用标准的B6.K1小鼠血清或抗一种细菌成分的单克隆抗体作为对照。在室温下该细胞用该单克隆抗体培养90分钟然后用抗小鼠免疫球蛋白的山羊抗体的FITC(异硫氰酸荧光素)标记的F(ab′)2级分培养60分钟。将所有的反应物稀释在含有10%山羊血清和1%牛血清白蛋白(BSA)的最低必需培养基中。培养是在50μl体积中进行的，并且在各自培养后在微型离心机中以5，000rpm转速离心2分钟而用磷酸缓冲的盐水(PBS)将该细胞洗涤两次。用1%多聚甲醛来固定异硫氰酸荧光素(FITC)标记的细胞并用荧光激活细胞分离器Ⅲ设备(FACSⅢapparatus，BeetonDiokinson，MountainView，Calf.)对它们进行分析。(10)通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来进行血清IgD的检测为了Qa-2特异性IgD的检测，使用将在实施例2中描述的Qa-2-LacZ融合蛋白。通过异丙基硫半乳糖苷(IPTG)诱导在大肠杆菌中产生融合蛋白后，收集诱导后的细胞，用50%乙酸溶解。然后通过离心除去不溶的材料。并在用含有1%牛血清白蛋白的磷酸缓冲的盐水广泛渗析后，所获得的融合蛋白用于酶联免疫吸附测定(ELISA)。将平底96孔板(免疫板，NUNC)用大肠杆菌提取物涂铺或用羊抗(小鼠IgD)血清涂铺，二者都已用50mM碳酸盐缓冲液(PH9.0)稀释。然后再用3%牛血清白蛋白涂铺。在每个预先涂铺并洗涤的孔中，加入在磷酸缓冲的盐水中系列稀释的血清样品50μl，并在室温下保持2小时。弃去该溶液并用磷酸缓冲的盐水将孔洗涤3次。然后加入50μl抗小鼠IgD，用1%牛血清白蛋白稀释的过氧化物酶标记的鼠单克隆抗体溶液。在室温下保持1小时后，弃去该溶液并用磷酸缓冲的盐水将孔洗涤4次。然后将100μl的2，2′-连氮基-二-(3-乙基苯基噻唑啉硫酸盐)(2，2′-azino-di-(3-ethylben-ztgiazolinesulfonatei)溶液和过氧化氢溶液的混合物(KirkegaardandPerryLaboratories，MD)加到各个孔中并使之在室温下放置5分钟。加100μl1%十二烷基磺酸钠终止该反应。测定该溶液在410nM处的吸收率。(1)RS因子的识别特异性已经报告，从接种3天后携带腹水肿瘤细胞的C3H/He小鼠中获得的脾细胞，通过RS-依赖性细胞毒反应，可溶解各种同系基因(MM2，MM46等)和同种异体基因(MethA，EL-4等)。某些同系基因肿瘤细胞(MM48，×5563等)通过该反应溶解甚少(TANINO，T.，EGAWA，K.;RegressorSerumfactor-dependentwonspecifickillersintumer-beeningmice)。RS的此活性被那些对该反应敏感的肿瘤细胞以各种程度吸附。然而RS的活性不被那些对该反应有抵抗力的肿瘤细胞所吸附。一般地，同种异体基因肿瘤细胞的敏感性可使RS中(指RS因子)的活性成分能识别可在肿瘤细胞表面不合理表达的同种异体基因抗原。通过从小鼠的各种细胞系中获得的淋巴细胞对RS的吸附来试验这种可能性。结果显示在表2中。表2小鼠各种细胞株的淋巴细胞对RS活性的吸附用于吸附的H-2靶细胞淋巴细胞源单位型MM2MethA%RS活性的降低*C3H/Hek3.4±2.06.5±4.3CBAk2.1±1.85.5±4.1CEk23.5±1.43.6±0.0AKRk40.5±2.76.5±6.5C58k47.0±2.724.2±8.2C57BL/6b68.7±16.174.3±12.8BALB/cd41.8±9.743.3±3.1DBA/2d67.9±11.379.6±8.7DBA/1q46.8±14.868.9±12.2A/Ja49.8±6.584.5±9.9＊两次实验结果的平均值±SE。在未吸附材料存在情况下MM2和MethA细胞的特定溶解百分数分别为33.2±4.4和28.4±4.0。按表2中所显示的，用MM2靶细胞测定的RS的活性被具有K的H-2单倍体的淋巴细胞(CE，AKR和C58)和那些不具有K的H-2单倍体淋巴细胞(B6，BALB/C，DBA/2，DBA/1和A/J)以各种程度吸附，但不被C3H/He和CBA小鼠(均为H-2k)淋巴细胞吸附。当MethA被用作细胞毒性反应的靶细胞时，观察到相似但不相同的吸附类型，结果表明，当淋巴细胞的LY组中的一种或一些抗原的同种异型不同于C3H/He的同种异型，或当在脾细胞上表达一种或一些Qa/TL抗原时则发生RS因子的吸收，通过双吸附实验获得更进一步支持此结论的结果并显示在表3中。表3小鼠各种细胞株的淋巴细胞对RS活性的双吸附使用的淋巴细胞原靶细胞第一次吸附第二次吸附MM2MethARS活性的降低(%)*A.C58C3H/He37.8±11.534.4±5.2C58C57BL/697.4±2.697.2±1.7C58B6.K133.1±2.245.1±4.2C58B6.K294.1±14.493.7±4.2C58DBA/19.6±6.394.1±0.3C58BALB/c50.7±6.838.6±3.1B.C57BL/6C3H/He57.5±4.3C57BL/6A/J95.7±1.1C.A/JC3H/He38.4±5.699.3±1.0A/JC57BL/692.4±0.8103.5±0.7A/JDBA/296.0±2.8103.9±8.8A/JDBA/142.8±0.4106.7±1.0A/JBALB/c55.2±0.4103.5±2.8＊两次实验结果的平均值±SE。将用C3H/He淋巴细胞双预吸附的RS用作对照实验。特异溶解的MM2和MethA细胞的百分值在A中分别为27.0±3.0和28.2±5.4，在B中为25.4±1.0，在C中分别为25.0±1.3和28.2±2.0。一部分RS活性被C58淋巴细胞吸附。以Qa/TL或Ly组抗原靶向与RS因子结合的设想为根据，此吸附后活性的降低表明RS含有与一个或一些Ly1.2、Ly3.1、Ly6.2、Ly7.1，Qa-1或TL抗原结合的因子。如果血清有任何与Ly2.2、Ly4.2、Ly5.2，Qa-2或Qa-3任一结合的因子，该因子就应保持不吸附。保留的活性几乎完全被B6、B6′.K2或DBA′/1淋巴细胞吸附。B6.K1或BALB/C淋巴细胞都不会明显地吸附预先吸附的RS中的活性因子。这些结果启示Qa-2抗原吸附一些活性因子。同样地，通过B6淋巴细胞对RS的吸附然后A/J淋巴细胞对RS的吸附，发明者研究了Qa-1和TL抗原对反应的参与。尽管结果因预先吸附的RS的低活性而确实模棱两可，但它揭示一个或一些Qa-1和TL抗原可吸附一部分活性。用A/J脾细胞预先吸附的并用MM2靶测定的RS活性几乎完全被DBA/2或B6淋巴细胞吸附但不被DBA/1或BALB/C淋巴细胞所吸附。这启示Ly6.2抗原吸附一部分RS活性。当MethA细胞被用作靶细胞时，A/J脾细胞完全吸附其活性。总而言之，这些结果启示RS含有多个与Qa-2，Ly6.2和与一个或一些Qa-1和TL抗原结合的因子。所有这些抗原的表现型对C3H/He都是同种异体的。其中Qa-1，Qa-2和TL抗抗属于非经典组织相容性组1抗原组。该结果也似乎表明MM2细胞表达Qa-2，Ly6.2和一种或一些Qa-2及TL抗原。某些Qa-1，Qa-2及TL抗原也可被表达在MethA细胞上。与以上观察相一致，各种表达一种或一些这些抗原(CE，C58，C57BH6，B6.K1，B6.K2，DBA/1，DBA/2，A/J和C3H-Ly6.2)的同种异体淋巴母细胞，但不是C3H/He和AKR淋巴母细胞，通过RS-依赖的细胞介导反应所溶解(表4)。C3H-Ly6.2淋巴母细胞但不是C3H/He淋巴母细胞的溶解直接表明Ly6.2抗原的参与。利用Qa-2，3一同类系的小鼠淋巴母细胞和L细胞转化了的RS-依赖性溶解证实了Qa-2特异因子的存在(表5)。支持B6和B6.K2淋巴母细胞溶解的RS的活性仅部分地被B6.K1淋巴细胞吸附但完全被B6或B6.K2淋巴细胞吸附(表5-A)。使用LQ7b/kb和Lkb细胞的类似实验表明RS包含一种具有特异识别Q7b基因产物α1/α2区的活性成分(表5-B)。该α1/α2区具有血清Qa-2-特异性。表4各种淋巴母细胞的RS-依赖的细胞介异溶解淋巴母细胞来源RS靶细胞-+%特异溶解*C3H/He0.3±1.24.2±5.2C3H-Ly6.20.0±0.630.5±12.5CE0.4±0.320.1±3.5C580.2±0.431.6±5.1C57BL/65.2±4.837.5±12.0B6.K10.1±0.233.2±4.9B6.K20.1±0.337.1±7.0DBA/14.8±5.332.8±2.7DBA/22.3±3.231.4±1.5A/J0.3±0.236.7±1.2＊两次实验结果的平均值±SE。将除去Ig的RS加成500倍稀释的最终浓度。表5通过吸附试验对RS活性的Qa-2特异性证明用于吸附的细胞靶细胞淋巴母细胞A.淋巴细胞B6.K1B6.K2RS活性的降低(%)*C3H/He0.0±1.0-1.9±11.9B6.K195.8±8.111.6±17.8B6.K295.1±3.996.9±1.4L细胞转化子B.L细胞转化子LQ7b/KbLKb%RS活性的降低*LKb59.0±1.690.7±4.5LQ7b/Kb93.1±2.496.0±2.2＊两次实验结果的平均值±SE。用淋巴细胞或L细胞转化子吸附除去Ig的RS并为500倍稀释的最终浓度加入反应混合物中。在未吸附RS存在的情况下B6，B6.K1和B6.K2淋巴母细胞特异溶解的百分值分别为30.3±4.2，28.3±1.2和35.4±2.2。LQ7b/kb和Lkb细胞的百分值分别为45.0±1.7和333.8±1.3在未吸附的RS存在下分别为16.3±2.7和10.1±1.2。(2)通过流式细胞计进行Qa-2抗原的证明通过使用Qa-2-特异性单克隆抗体141-15.8的膜免疫荧光法更直接地证明在MM2和一些其它来源于H-2k(Qa-2-)小鼠的肿瘤细胞系表面上Qa-2抗原的存在。如图1中显示的，在测试的九个细胞系中(MH134(A)，MH125F(B)，MH125P(C)，MM2(D)，FM3A(E)，MM102D(F)，MM46(G)，MM48(H)和BW5147(I)，有七个重复地检测到显著的Qa-2特异的荧光。这些结果表明在肿瘤细胞上表达的Qa-2同种异体抗原不是偶然地特异于MM2而是普遍存在于各种淋巴瘤和非淋巴瘤细胞系中并且似乎在一定程度上说明RS依赖反应的广泛靶向选择性的原因。(3)Qa-2特异性RS因子的特性被认为存在于RS中的能识别同种异体抗原的多因子当中，按以上所描述的，最清楚地证明了对Qa-2的因子的特殊性。所以发明者将注意力集中在该因子上并且更进一步试验其特性。通过硫酸铵沉淀和血清蛋白的制备性电泳，发现支持B6淋巴母细胞，但不是B6.K1淋巴母细胞的细胞介导溶解的活性主要在β-球蛋白级分中。然后将该级分通过使用单-Q柱的FPLC进行分级分离。该活性与0.3MNaCl洗脱的物质相关，而几乎所有的IgG亚组和那些IgM组的小鼠单克隆抗体分别在0.25M和0.35MNaCl周围处洗脱出来。对半纯化材料也要测试其对Qa-2+淋巴细胞的补体依赖细胞毒活性(图2)。在每个测定中使用35μg蛋白也没有检测出FPLC纯化物质对B6肠系膜淋巴结细胞的补体依赖溶解。另一方面，在补体存在下1gG2b组的抗-Qa-2单克隆抗体在每个测定中低于1μg蛋白的抗体浓度的溶解相同的靶细胞。为了对Qa-2特异性RS成分进一步特征化，FPLC纯化的材料用125I进行放射标记，用C58淋巴细胞预吸附，被吸附到Qa-2+细胞表面并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE或通过两次聚丙烯酰胺凝胶电泳后再放射自显影来进行分析(图3)。图3中，A表示在非还原(a)和还原(b)条件下使用7.5%聚丙烯酰胺凝胶一次性十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。B表示两次聚丙烯酰胺凝胶电泳的模型。观察到约2%总放射性与细胞特异性的结合。在非还原条件下估计结合物质的相对量为160KDa。在还原条件下，它表现的谱带为约50KDa和25KDa的相对量。这些结果表明该物质具有类似于IgG的一种重链和轻链结构。标记材料的两次凝胶电泳表明它由四个或更多个等电点约在5.5到6.5范围的成分组成并且所有的成分都具有重链和轻链结构。已知IgD存在于血清蛋白的β-球蛋白级分中并包含一组酸性的糖蛋白(ISHIHARA，E.，TEJIMA，Y.TAKAHASHI，R.TAKAYASU，T.，SHINODA，T.;StructureandlocationofaSparagine-linkedslygosaccharidesintheFcregionofahumomimmunoglobuinD，BiochemBiophysResComm，1983，110∶181)，而IgGs通常是碱性蛋白。IgD具有象IgGs样由重链和轻链组成的结构，但不与补体系统的C1q相互作用(SPIEGELBERG，HL.，ImmunoglobulinD(IgD)，methodsinEnzymology，1985，116∶95，SPIEGELBERG，HL.;TheStructureandbiologyofhumanIgD，ImmunologicalRev，1977，37∶3)。已报道，有两种类型的小鼠血清IgD，一种具有约170-200KDa的分子量，而缺乏重链C1区域的另一种具有大约150-160KDa的分子量(FINKELMANFD.，KESSLER，SW.，MUSHINSKI，JF.，POTTER，M.;IgD-SecretingmurineplasmacytomasIdentificationandPartialcharacterizationoftwoIgDmyelomaproteinsJImmunol1981，126∶680，MOVNTZ，JD.，MUSHINSKI，JF.，OWENS，JD.，FINKELMAN，FD.;TheinvivogenerationofmunrineIgD-secretingcellsisaccompaniedbydeletionofCμgeneandoccasionaldeletionofthegenefortheCδdomain，JImmunol，1990，145∶583)。人体单克隆IgD(NIG-65骨髓瘤蛋白)的糖基的不同似乎引起高电点在5.6和6.8间的异质性。这些特性与那些具有Qa-2特异性的血清成分的特性一致，因此，发明者推测Qa-2特异的成分是一种IgD。为试验这种可能性，将用Lkb细胞吸附后的FPLC-纯化材料用结合有抗各种小鼠免疫球蛋白亚组的抗体之一的Sepharose4B来进一步吸附。图4-A中，表示了在吸附前(▲)，用Lkb吸附后(■)和更进一步用Sepharose4B吸附后(●)该材料对Q7b/kb细胞的细胞介导溶解的活性。通过使用LQ7b/kb作为靶细胞证明了该活性明显地被结合有抗IgD原Sepharose4B所吸附。保留在柱上并从该抗IgD柱中洗脱的材料具有显著支持LQ7b/kb细胞溶解的活性(图4-B)。图4-B中箭头表示洗脱开始的位置。该活性不被与抗IgG1、抗IgG2b、抗IgG3、抗IgA和抗IgM之一结合的Sepharose4B明显地吸附。仅有轻微的活性被吸附在一种抗IgG2a结合的Sepharose4B柱上并从中回收。这些结果是可重现的，并表明在RS中具有Qa-2特异性的活性成分是IgD。通过使用Qa-2-LacZ融合蛋白的酶联免疫吸附测定更进一步证明在RS中具有特异于Qa-2抗原的IgD的存在。如图5中所示，Qa-2-特异性IgD在RS中被检测，而在正常成人C3H/He血清中未被检测到。根据Qa-2特异性IgD的表现，与正常对照血清相比，在RS中血清IgD总量的增加也被检测到。使用融合蛋白涂铺的平板和过氧化物标记的分别抗小鼠IgG2a和IgG2b的鼠单克隆抗体，通过酶联免疫吸附测定在RS中检测到小量的Qa-2特异性IgG2a和IgG2b。在FPLC纯化的材料中未检测到Qa-2特异性IgG2a和IgG2b而检测到Qa-2特异性IgD。从这些结果断定，在RS中，具有Qa-2特异活性的血清成分是IgD。实施例2[材料和方法](小鼠)使用C3H/He，AKR，B6和B6.K1小鼠。前两种小鼠具有H-2k和Qa-2-，3-表现型。B6和B6.K1小鼠分别具有Qa-1-，2+，3+和Qa-1+，2-，3-表现型。(2)肿瘤细胞BW5147是一种来源于AKR小鼠的T细胞淋巴瘤的体外细胞系。MM2和FM3A是病毒诱导C3H/He小鼠乳房癌的腹水细胞系。MH134是一种化学诱导C3H/He的肝细胞瘤的腹水细胞系。已经表明这些细胞系与Qa-2特异性单克隆抗体141-15.8反应(TANINO，T.，SEO，N.，OKAZAKI，T.，NAKANISHI-ITO，C.，SEKIMATA，M.andEGAWA，K.;HumoralresponsestoQa-2andothertumorantigensinmice，SublnittedforPublucationinCancerImmunologyImmunotheraphy)。通过Q7b/kb杂种基因DNA和H-2Kb基因组DNA的转染来分别确立LQ7b/kb和Lkb细胞。LQ7b/kb细胞表达Q7b基因产物的α1和α2区域和H-2Kb的α3，转膜和脆质区域。Lkb细胞表达H-2Kb抗原。两种细胞及非转染的L细胞表达H-2k抗原。(3)抗体从AmericanTypeCultureCallectionMA获得抗Qa-2抗原的单克隆抗体141-15.8(MAb141-15.8)。从AustralianMonoalonalDevelopmentNSW获得抗Qa-2抗原的单克隆抗体34-1.2(MAb34-1.2)。通过融合NS-1细胞与来源于用B6淋巴细胞免疫的B6K1的淋巴细胞新确立一种产生Qa-2特异性mAb59的杂交瘤克隆。从MeijiInstituteofHealthScience，Japan购买Thy1.1-特异性mAb。从CederLaneLaboratories，N.Y.购买Thy1.2-特异性mAb。从Dr.Y.Nakamura(MeijiInstituteofHealthScience)热心提供一种抗一种细菌成分的IgG2b组的小鼠mAb，并用作一种与肿瘤细胞表面抗原无关的mAb。从TagoInc，CA，获得抗小鼠免疫球蛋白的山羊抗体F(ab′)2及其FITC衍生物。用2-疏基乙基胺还原F(ab′)2并通过SephacrglS-200柱色谱层析分级分离获得抗体的Fab′片断。(4)用磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)进行肿瘤细胞的处理从SapporoBeerCo.，TOKYO购买由Bacillusthurigiensis衍生的PI-PLC1(IKEZAWA，H.，andTAGUCHI，R.;Phosphatidylinositol-SpecificPhospholipaseCfromBacilluscereusandBacillusthurigiensis，MethodinEnzymal，1981，71∶731)。将癌细胞(2×106)在30μl含有0.1mUPI-PLC和1mg/ml卵白蛋白的D-MEM(PH7.5)中37℃温度下培养60分钟。培养后，将细胞用D-MEM洗涤两次并用于细胞表面抗原的检测。(5)免疫荧光分析通过流式细胞计进行细胞表面Qa-2和Thyl抗原的检测。简而言之，将细胞与Qa-2特异性mAb反应然后与抗小鼠免疫球蛋白的FITC-标记的山羊抗体F(ab′)2部分反应。对于淋巴细胞来说，通过穿过尼龙棉柱浓缩T细胞并用抗体Fab′片断处理阻滞污染B细胞的细胞表面免疫球蛋白。用1%多聚甲醛来固定FITC-标记的细胞并使用荧光激活细胞分离器(FACSⅢ，BectonDickinson，CA)进行分析。(6)cDNA的制备通过异硫氰酸胍的方法(SCHIBLER，U.，TOSI，M，PINETT，A.-C.，FABIANI，L.，andWELLAUER，P.K.;Tissue-Specificexpressionofmousealpha-amirasegenesJmolBiol，1980，142∶93)将总细胞RNA从肿瘤细胞和胸腺细胞中提取出来并通过在寡聚(脱氧胸苷)-纤维素(BoehringerMannheimGmbH，Germany)上分离多聚(腺苷)+RNA来浓缩mRNA-(AVIV，H.，andLEDER，P.;PulificatiionofbiologicallyactiveglobinmessengerRNAbychromatographyonoligothymidylicacidcellulose，ProcNatlAcadSciUSA，1972，69∶1408)。使用寡聚-脱氧胸苷作为引物，用cDNA合成药盒(cDNA加号，AmershamCorp，ArlingtonHeights，IL)实现由mRNA到cDNA的合成。(7)寡聚核苷酸引物和探针基于报道的C3H/He的Qa-2，3区中基因的核苷酸序列(WATTS，S.，DAVIS，A，C.，GANT，B.WHEELER，C.，HILL，L.andGOODENOW，R.S.;OrganizationandStructureoftheQagenesofthemajorhistocompatibilitycomplexoftheC3Hmouse，ImpplicationsforQafunctionandclassIevolutionEmBoJ，1989，8∶1749)，在DNA合成器上(AppliedBiosystemsmodel391)制备十一个20聚体寡聚核苷酸并用作聚合酶链反应(PCR)的引物。它们的序列和特异性显示在表6和图6中。寡聚核苷酸第1、2、3、4、5和6号分别与存在于各个H-2Dk、Qk1、Qk2、Qk4、Qk5、和Qk10基因的第一外含子中的特异反意序列互补。第10和11号分别互补于外显子8和外显子7中的Qk5特异有意义序列。第7、8和9号互补于组1基因的共同序列。分别互补于第1到6号的寡聚核苷酸第12到17号也被合成并被用作DNA-RNA杂交实验中的探针。表6用作引物和探剂的合成的脱氧寡聚核苷酸名称序列(5′-3′)特异性No.1TGGCCCCGGCTCAGACCCGCH-2DkNo.2TGACCCTGACCAAAACCGGAQ1kNo.3CCCGGACCCAGAACCGAGCCQ2kNo.4AGTCGCCCAGACCCTGATCGQ4kNo.5CTCTGACCCAGACCCGCGCTQ5kNo.6CCCCGACCCAGACCCAGGCAQ10kNo.7GCTGGGCCCTGGGCTTCTACclass1No.8AGGGTGAGGGGCTCAGGCAGclass1No.9CTGGCAGTTGAATGGGGAGGclass1No.10ATCGTCTGTCACTCAGTCCAQ5kNo.11GCTCTAGGAGCTGTCCCTGCQ5kNo.12到No.17分别互补于No.1到No.6(8)聚合酶链反应(PCR)在100μl反应混合物中实现PCR，该反应混合物包含50ng的DNA，50pmole各个互补于有意和反意义序列的引物，20mM氯化三羟甲基氨基甲烷缓冲液(PH8.3)，1.5mMMgCl2，25mMKCl。0.05%吐温20，0.1mg/ml明胶，各50μm的dNTP和2单位的TaqDNA聚合酶(Parkin-Elmer/Getus，Norwalk，C7)。该反应混合物用100μl的矿物油覆盖以防止蒸发。将热循环器(thermalcycler，Atto，Tokyo，Japan)运转40圈(分别为94℃温度下1分钟，55℃温度下1.8分钟和72℃温度下2分钟)。(9)对PCR放大的DNA克隆和测序。将经PCR放大的DNA直接地或在克隆到PUC119的SmaI部位后进行排序。为了进行克隆，将活性大肠杆菌MV1184细胞用质粒DNA转化并在含有X-gal，异丙基硫半乳糖苷(IPTG)和氨苄青霉素的平板上生长。挑选出白色的菌落并在2XYT肉汤培养基中生长。然后将该细胞用M13K07辅助噬菌体感染。通过二脱氧方法(SAMAGE，F.，NICKLEN，S，andCOULSON，A，R.，DNASequencingwithchain-terminatinginhibitorsProcNatlAcadSciUSA，1977，74∶5463)使所得单股DNA及PCR-放大的DNA测序，该方法使用一种DNA序列测定药盒(SequenaseVersion2.0，UnitedStatesBiochemicalCorp.，Cleaveland，OH)和用作PCR引物或M13合适引物的合成寡聚核苷酸。(10)制备基因组DNA和DNA-DNA杂交将B6，C3H/He和AKR小鼠的脾细胞和BW5147细胞在含有0.1mg/ml蛋白酶K的0.03%SDS溶液中60℃温度下培养过夜然后用苯酚提取。所得水相与含有1mMEDTA10mM氯化三羟甲基氨基甲烷缓冲液(PH7.5)渗析过夜并用作DNA溶液。将10μg各种基因组DNA用HindⅢ或用BamHⅠ消化，通过0.8%琼脂糖凝胶电泳并转移到尼龙滤器上(Hybridon-N+Amersham)。该滤器在37℃温度下干燥并在6ml的含有1mg鲑精液DNA的杂交缓冲液(6×SSC，5×Denhardt′s溶液，0.5%SDS，50%甲酰胺，20mM磷酸钠缓冲液，PH6.5)中60℃温度下培养1小时。然后将通过随机引物法已用32P标记的DNA探针加到该培养物中。在42℃温度下过夜完成杂交。杂交后，将滤器在室温下在含有0.1%SDS的2×SSC中两次洗涤15分钟并在37℃温度下在含有0.1%SDS的0.2×SSC中两次洗涤30分钟。然后将滤器用0.1×SSC漂洗并用一种强化荧光屏将滤器曝露于X-射线照相下。(11)DNA-RNA杂交按以上所描述的方法由AKR胸腺细胞和BW5147细胞制备多聚(腺苷)+RNA，用乙二醛使多聚(腺苷)+RNA变性在含有20mM磷酸盐(PH7.4)的1.2%琼脂糖凝胶上电泳并转移到尼龙滤器上。该滤器在37℃温度下干燥并在2ml含有100μg鲑精液DNA的杂交缓冲液中60℃温度下培养1小时。然后将寡聚核苷酸探针(其5′-未端已用32P标记)加到培养物中。在42℃温度下培养过夜后，将滤器室温下用2×SSC两次洗涤15分钟并在50℃温度下用含有0.1%SDS的2×SSC两次洗涤30分钟。然后将滤器用0.2×SSC漂洗并使用一种强化荧光屏将滤器曝露于X-射线照相下。(12)Q5k蛋白的合成和蛋白质Western印迹。将对应于Q5k基因的外显子1到4的已被从BW5147cDNA放大的DNA克隆pUC119中并按以上描述的方法测序。选择一种在右向和LacZ启动子下游框架中有插入的菌落。该菌落在含有氨苄青霉素的L肉汤培养基中生长直到在600nm处的光密度达到0.3。向培养物中加入IPTG，使培养物到50μm并继续培养直到光密度变为0.75。收集该细胞，用10%三氟乙酸沉淀，用丙酮洗涤并在25mM含有2%SDS，5%甘油，0.0125%BPB和2.5%2-巯基乙醇的三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐缓冲液中(PH6.8)在100℃温度下加热30分钟溶解。将溶解的材料通过12%含有0.1%SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳，并通过在一种由25mM三羟甲基氨基甲烷碱，192mM甘氨酸，20%甲醇和0.02%SDS组成的溶液中电吸收来将其转移到聚乙烯二氟化物膜上(Immobilon，Millipore，Bedford，NA)。然后该膜用含有0.2%吐温20的0.15M氯化钠漂洗并用10mM三羟甲基氨基甲烷-氯化氢(PH7.6)(TTBS)缓冲，在含有10%山羊血清和10%马血清的TTBS中37℃温度下培养2小时。将该膜用水漂洗并在5ml相同培养基中在含mAb59的200倍稀释的小鼠腹水中室温下培养过夜。培养后，将滤膜用TTBS漂洗3次并与在用10mM三羟甲基氨基甲烷硼酸盐(PH7.6)缓冲的盐水中的过氧化酶标记的抗小鼠IgG(Amersham)在37℃温度下反应1小时。该膜再用TTBS洗涤3次并在50ml含有40mg的3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(Wakochemicals，Osaka，Japan)和15μl30%过氧化氢的TTBS中处理染色。(1)表达在H-2k小鼠肿瘤细胞上的Qa-2抗原的特性在TANINO，T.，SEO，N.，OKAZAKI，T.NAKANISHIITO，C.，SEKIMATA，M.，和EGAWA，K，小鼠中对Qa-2和其它肿瘤抗原的体液应答(呈送Immunogenetics出版)的报告中，证明了大部分H-2k(Qa-2-)小鼠肿瘤细胞系(9个细胞系中试验了7个)表达Qa-2抗原，使用抗Qa-2抗血清或Qa-2特异性mAb141-15.8通过膜免疫荧光法可检测到该Qa-2抗原。然而，发现当使用另外Qa-2特异性mAb34-1.2时，通常在这些细胞上检测不到Qa-2抗原。检查最新获得的mAb59的Qa-2特异性并与mAb141-15.8和34-1.2的Qa-2特异性作比较。其结果显示在表7中。表7使用抗Qa-2单克隆抗体进行各种细胞上Qa-2抗原的检测Qa-2特异性mAb不相关的mAb细胞34-1.259141-15.8平均荧光强度B6淋巴细胞156.159.022.3B6.K1淋巴细胞30.725.030.9C3H/He胸腺细胞16.717.416.616.8AKR胸腺细胞18.119.219.518.0MM258.9101.3102.864.8BW514746.480.4102.345.2LQ7b/Kb192.0180.242.148.4LKb81.268.271.5证明mAb59识别Qa-2分子(Q7b基因的产物)的α1或α2区域且至少不与H-2k和H-2b抗原交叉反应。不同于mAb34-1.2，mAb59不仅与H-2b淋巴细胞反应而且与各种如MM2和BW5147的H-2k肿瘤细胞反应。如此对Qa-2特异性mAbs的反应性表明这些肿瘤细胞表达一种Qa-2抗原，该抗原与H-2b小鼠正常淋巴细胞上检测的Qa-2抗原密切相关但不等同，并且这两种Qa-2抗原至少一部分不同是由该分子的α1或α2区域所致。表7也表明当使用这些mAbs之一时，在H-2k小鼠(C3H/He和AKR)的胸腺细胞和脾细胞上检测不到Qa-2抗原。已报道，表达在H-2b小鼠淋巴细胞上的Qa-2抗原对用PI-PLC消化是敏感的(SCHIBLER，U.，TOSHIM.，PINETT，A，-C，FABIANI，L.，andWELLAUER，P，K.;Tissue-Specificexpressionofmousealpha-amirasegenesJmolBiol1980，142∶93)。这表明该细胞通过糖磷脂酰肌醇glycophosphatidylinositol(GPI))基团固定到细胞膜上。已知GPI结构与细胞表面蛋白分子的天门冬氨酸相连(LOW，M.G.，Biochemistryoftheglycosyl-phosphatidylinositolmembranceanchorsBiochemI，1987，244∶1)关于Qa-2分子，已证明GPI锚与Q7b基因外显子5中的CAC编码的295位天门冬氨酸残基相连(WANECK，G.L.，SHERMAN，D.H.，KINCADE，P.W.，LOW，M.G.andFAVELL，R.A.，MolecularmappingofsignalsintheQa-2antigenrequiredforattachmentofthephosphatidylinositolmembraneanehor，ProcNatlAcadSciUSA，1988，85∶577)。在H-2抗原分子中，它对PI-PLC的处理有抗性，此天门冬氨酸由缬氨酸取代。到目前报告的Qa-2，3区域的基因DNA序列表明所有所谓的Q基因产物(Q7和Q9除外)在该位置具有缬氨酸(DEVLIN，T.J.，WEISS，E.H.，PANSLON，M.andFLAVELL，R.A.;DuplicationofgenepairsandallelesofclassIgenesintheQa-2regionofthemurinemajorhistocompatibilitycomplexacomparisonEMOB，J.，1985，4∶3203)。根据这些观察资料，提出在H-2k肿瘤细胞表面表达的Qa-2抗原可抵抗PI-PLC处理。按表8-A所显示的由H-2k小鼠的各种肿瘤细胞上的mAb141-15.8检测到的Qa-2分子可抵抗PI-PLC处理。在对照实验中，试验了BW5147细胞上Thy-1抗原的敏感性。Thy-1抗原也是已知具有GPI锚的细胞表面分子之一(LOW，M.G.，andKINDADE，P.W.，Phosphatidylinositolisthememtrrane-anchoringdomainofthethy-1glycoprotein，Nature.1985，318∶62)。按表8-B中显示的，表达在BW5147细胞上的Thy-1抗原对PI-PLC处理是敏感的。该结果表明在BW5147细胞Qa-2抗原上GPI锚的缺乏不是由于细胞合成GPI-锚的机制欠缺，而是由于Qa-2分子本身的生化差别。表8Qa-2和Thy1抗原对PI-PLC处理的敏感性A.抗体mAb141-15.8不相关mAbPI-PLC处理细胞-+-+平均荧光强度B6淋巴细胞152.059.730.629.4BW514785.196.435.836.2MM288.298.073.274.6FM3A108.0109.371.172.3MH134101.2102.967.972.5B.抗体抗-Thy1.1抗-Thy1.2不相关mAbPI-PLC处理细胞-+-+-平均荧光强度AKR胸腺细胞193.098.034.5B6胸腺细胞176.079.740.1BW5147176.095.1根据这些观察资料，证明表达在H-2k小鼠肿瘤细胞上的Qa-2抗原(Qa-2k抗原)与表达在H-2b正常淋巴细胞上的Qa-2抗原在免疫学上和生化上是截然不同的。Qa-2k抗原能被定义为一种表达在H-2k小鼠肿瘤细胞上的PI-PLC抗性的分子，而且它与mAbs59和141-15.8是反应的，但不与mAb34-1.2反应。(2)编码BW5147细胞Qa-2k表现型的基因的鉴定在Qa-2k阳性肿瘤细胞中，因为Qa-2k的表达相当强而且也因为从宿主动物中获得该细胞没有细胞污染，所以选择体外生长的BW5147细胞来更进一步地试验。图7显示基因组DNAsHindⅢ或BamHⅠ片断与一种32P-标记的约800bp的DNA探针杂交的DNA-DNA杂交分析的结果。该探测针能检测含有所有组1基因的外显子2，3和4的DNA区域。使用C3H/He小鼠，AKR小鼠和BW5147细胞的DNA获得的放射自显影谱图型基本上相同，并且它们明显区别于使用B6小鼠DNA获得的图型。根据这些结果，认为组1基因的排列保存在这些H-2k小鼠(C3H/He和AKR)的基因组和来源于AKR的淋巴瘤细胞系中。报道C3H/He基因组的Qa-2，3区域含有Qk1、Qk2、Qk4、Qk5和Qk10基因(WATTS，S.，DAVIS，A.C.，GANT，B.，WHEELER，C.，HILL，L.，andGOODENOW，R.S.;OrganizationandStructureoftheQagenesofthemayorhistocompatibilitycomplexoftheC3Hmouse.ImplicationsforQafunetionandclassIevolutionEMBOJ，1989，8∶1749，WEISS，E.H.，BEVEC，D.，MESSER，G.，SCHWEMMLE，S.，GROSSHAUSE，C.，STEINMETZ，M.andSCHMIDT;OrganizationoftheAKRQaregionStructureofadivergentclassISequence，Q5k，JImmunogenet，1989，16∶283)。Q3k基因是一种假基因，并且对应于Q6、Q7、Q8的基因和大部分的Q9基因缺失。Q5k基因似乎是一种由大部分的Q5基因5′端和小部分的Q9基因3′端组成的杂交基因。发明者试图识别沉静在AKR中的一种基因，该基因已通过DNA-RNA杂交在BW5147中转录，并且使用特异于各个Qk1、Qk2、Qk4和Qk10基因的探针和引物通过PCR进行cDNA放大(表6和图6)。特异于H-2Dk基因的探针和引物也被用作阳性对照。图8显示DNA-RNA杂交实验的结果。H-2Dk特异性探针(No.12)显示在1.5kb处有与AKR胸腺细胞RNA和BW5147RNA两者的特异性杂交谱带。相对的，Q5k特异性探针(No.16)大约与BW5147RNA中的1.2、1.5和4.0kb种杂交，而关于AKRRNA却未检测到杂交。当使用探针第13、14、15和17号时，也未检测到与AKRRNA或与BW5147RNA的杂交(数据未显示)。这些结果表示Q5k基因(其转录未在H-2k胸腺细胞中检测到)被特异地转录到BW5147细胞的Q基因中。通过PCR的结果来支持Q5k基因在BW5147细胞中的转录。使用特异于H-2Dk，Qk1、Qk2、Qk4、Qk5和Qk10(分别为No.1到No.6)的引物和与外显子4的3′未端区域中组1共同有意序列互补的引物(No.8)实现PCR。按图9中显示的，仅仅当引物第1和第5号(它们分别互补于H-2Dk和Q5k外显子1反意序列)分别与引物第8号一同使用时，BW5147cDNA的放大才是成功的。当将引物第2、3、4和6号与引物第8号一起使用，甚至退火温度低于45℃时，也未检测到放大。使用引物第5、7、8号和M13通用引物，将用引物第5和第8号放大的DNA直接地也可在克隆进入pUC119后进行测序。发现该序列与报告的C3H/HeQ5k基因的外显子1到4的核苷酸序列相同。在直接测序期间，除Q5k外检测不到基因的放大。使用引物第1和第8号也检测到AKRcDNAH-2Dk序列的放大。然而，没有一种Q-特异性序列能引起AKRcDNA的放大。当使用引物第9号(它互补于外显子4中组1共同反意序列)和引物第10号(它互补于外显子8中Q5k特异性有意义序列)时，也观察到BW5147cDNA的放大。使用引物第9号和第10号直接测定出用这些引物放大的DNA核苷酸序列。由这些结果推断的cDNA的核苷酸序列完全与报告的Q5k基因序列所预期的核苷酸序列相符。所以，证明在正常H-2k淋巴细胞中不被转录的Q5k基因在BW5147细胞中被转录。为确定BW5147的Q5k基因是否编码免疫学上定义的Qa-2抗原，对使用引物第5号和第9号进行PCR放大的cDNA序列所编码的肽与酶标记抗原的反应性进行分析。将放大的DNA直接连结在pUC119的SmaI位点上来获得重组体，并被引入到活性大肠杆菌MV1184细胞中，通过在IPTG存在的条件下培养细胞来诱导具有LacZ蛋白的融合蛋白。按图10显示的，获得的大肠杆菌表明具有约35KDa分子量肽的诱导合成，该分子量是对融合蛋白的估计值。将此35KDa蛋白与过氧化物酶标记的抗Qa-2mAb59反应。当使用过氧化物酶标记的抗Qa-2mAb34-1.2时在相同条件下检测不到该蛋白。根据这些结果，本发明者断定在BW5147细胞表面上的Qa-2k抗原是Q5k基因的产物，该抗原可被mAb59检测到但不被mAb34-1.2检测到，并且它们抗PI-PLC的处理。实施例3根据以上实施例的实验，证明在Qa/Tla区域中存在活化的Q5k基因，此Q5基因具有与正常Qa-2淋巴细胞抗原共同的抗原性(交叉一反应性)，而且更进一步，携带肿瘤细胞的Qa-2-小鼠对由肿瘤细胞表达的Q5基因产物的应答，也能与同种异体基因的正常淋巴细胞表面上的Qa-2抗原发生反应。所以，本发明人进行实验，来通过用Qa-2抗原的免疫性诱导抵抗肿瘤细胞的抗性。将Qa-2-小鼠用Qa-2+同种异体基因小鼠的正常淋巴细胞免疫。如同Qa-2-小鼠，使用(C3H/He×B6.K1)F1小鼠，并腹膜内给予C57BL16小鼠的脾细胞来对Qa-2抗原进行特异地免疫。使用C3H/He小鼠的Qa-2+肿瘤细胞作为肿瘤细胞。(1)经以上特异于Qa-2抗原的免疫处理，在F1小鼠中诱导了抵抗肿瘤细胞(如C3H/He小鼠来源的MM2)抗性。也就是说，2×105肿瘤细胞的移植在对照未处理组中是奏效的，而在免疫的小鼠中移植是不奏效的。更进一步，当用B6.K2小鼠的淋巴细胞代替C57BL16小鼠的淋巴细胞使F1小鼠免疫时，获得了相同的结果。显示在下表9中。表9＊分母使用小鼠的总数分子对移植奏效的小鼠的数(2)通过使用C57BL16小鼠脾细胞体外刺激由免疫F1小鼠获得的脾细胞再次诱导具有抗Qa-2抗原细胞毒性的T细胞。这些T细胞不仅强烈地刺激Qa-2+同种异体基因小鼠的正常淋巴细胞而且也刺激C3H/He小鼠的肿瘤细胞。更进一步，通过用B6.K2小鼠的淋巴细胞体外刺激从B6.K2小鼠淋巴细胞免疫的F1小鼠获得的脾细胞时，诱导了具有抗Qa-2细胞毒性的T细胞。测量了抗靶肿瘤细胞的细胞毒活性，并显示在下表10中。表10效应细胞靶细胞＝100∶1(3)用C3H/He小鼠的NSFa肿瘤细胞移植到F1小鼠的足跖部。当肿瘤的直径达1cm时，切下小鼠的大腿以除去肿瘤细胞，并在1到4天后，用C57BL/6小鼠的脾细胞对Qa-2抗原进行特异免疫。在所有对照未处理组的小鼠中，产生许多肺转移瘤，并在约4周后，所有小鼠死于肺转移瘤，然而尽管在少数小鼠中发现一个或两个转移但大部分小鼠未观察到转移。更进一步，用C3H/He小鼠的NFSa肿瘤细胞移植在F1小鼠的足跖部。当肿瘤细胞直径达8到10mm时切下小鼠的大腿以除去肿瘤细胞，并在3天后通过腹膜内给予B6.K2小鼠的脾细胞来对Qa-2抗原进行特异地免疫。17天后，将小鼠解剖并在体视显微镜下观察它们的肺，记录肺转移瘤而获得下表11。因此，证明用Qa-2+同种异体基因正常淋巴细胞免疫的Qa-2-能诱导显示抗肿瘤细胞的抗性。也就是说，在Qa-2-小鼠中抗Q7基因产物的免疫反应与Q3基因产物具有交叉反应性，并证明此交叉反应性构成以上抗肿瘤细胞的抗性。实施例4作为人类非经典组织相容性组1抗原，在某些抗原中，已经确定了该基因的所有核苷酸序列。也知道某些基因在正常成人中是不活跃的。然后，已制备一种具有特异于该基因的核苷酸序列的聚核苷酸，并在试图通过PCR方法放大由人体肿瘤细胞菌株(HL60，U937，HmyZClR和SKW-3)制备的CDNAs过程中作为一种引物。按图11显示的，检测到预期长度的核苷酸放大(用箭头显示)。该结果表明非经典组织相容性组1抗原，在正常成人中是不活跃的，而在人肿瘤细胞中是活跃的。搂以上所描述的，在Qa-2-小鼠中用Qa-2+同种异体基因正常淋巴细胞免疫的Qa-2-小鼠诱导出抗肿瘤细胞的抗性。更进一步，在正常成年小鼠中不活跃的Q5基因，在Qa-2+小鼠来源的肿瘤细胞中是活跃的，所以，使用Q5基因产物的免疫治疗能诱导特异于Q5基因产物的免疫反应，因此使它可能诱导抗自身肿瘤细胞的抗性。而且，在人类中，非经典组织相容性组1抗原也是在正常成人中不活跃，在肿瘤细胞中活跃。因此，本发明提供了一种抗肿瘤的方法和抗肿瘤剂。也就是，通过给予一种非经典组织相容性组1抗原，一种识别该抗原的抗体，或一种细胞毒淋巴细胞，可诱导抗肿瘤细胞的抗性。权利要求1.一种抗肿瘤方法包含给予一种非经典组织相容性组1抗原。2.一种抗肿瘤方法包含给予一种识别非经典组织相容性组1抗原的抗体。3.一种抗肿瘤方法包含给予一种识别非经典组织相容性组1抗原的细胞毒淋巴细胞。4.一种抗肿瘤剂，包含一种作为有效成分的非经典组织相容性组1抗原。5.一种抗肿瘤剂，包含作为有效成分的一种识别非经典组织相容性组1抗原的抗体。6.一种抗肿瘤剂，包含作为有效成分的一种识别非经典组织相容性组1抗原细胞毒淋巴细胞。全文摘要一种抗肿瘤方法和一种抗肿瘤剂，使用特异于表达在肿瘤细胞表面的肿瘤抗原的免疫反应。将一种人体非经典组织相容性组1抗原，识别该抗原的一种抗体或一种细胞毒淋巴细胞给予癌症病人作为免疫治疗来诱导抗肿瘤的抗性。文档编号A61K35/14GK1079400SQ9310384公开日1993年12月15日申请日期1993年3月5日优先权日1992年3月5日发明者江川滉二,佐藤一英申请人:株式会社生体调节研究所