专利名称：重组腺病毒载体及其使用方法
技术领域：
本发明的背景本申请是1994年5月19日申请的美国申请号为08/233,777的部分继续申请，后者又是1993年10月25日申请的美国申请号为08/142,669的部分继续申请，在此其内容以其全文作为本申请的参考资料。
本申请中通过在括号中和在权利要求书之前的著录叙述中的引用提及了各种出版物。为更完整地描述与本发明有关的技术的现状，在此将这些出版物作为本发明的参考资料。
用于基因疗法的重组腺病毒的生产需要利用一可反式提供这些重组病毒所缺失的病毒E1区的基因产物的细胞株。目前唯一可获得的有用细胞株是1977年由Graham等首先描述的293细胞株。293细胞大约含有5型腺病毒基因组(AielIo (1979)及Spector (1983))的左端的12％(4.3kb)。
通常被检测的用于基因疗法的腺病毒载体一般是Ad2或Ad5 DNA的缺失，从病毒基因组的5’端的约400bp缺失到5’端的约3.3kb，以形成2.9kb的E1区的完全缺失。因此在重组病毒的DNA序列和细胞株的Ad5 DNA之间存在约1kb的同源区。此同源区界定了一个在病毒和细胞的腺病毒序列之间可能发生重组的区域。如此之重组会产生带有获得了293细胞的Ad5E1区的表型为野生型的病毒。这种重组事件被推测为在重组病毒的制备物中经常检测到野生株的原因并且已被直接证明是引起以Ad2为基础的重组病毒Ad2/CFTR-1 (Rich等(1993))的野生型污染的原因。
考虑到在C型腺病毒亚群中序列的高度同源性，若载体是基于任何C型腺病毒(1，2，5，6型)则这种重组便可能发生。
在重组腺病毒的小规模生产中，引起污染的野生型病毒的产生可通过弃掉那些发现被污染了的病毒制备物的筛选过程中来控制。为满足遗传疗法的预计需求，随着病毒生产规模的不断增长，任意一批制备物被野生型病毒污染的机会以及提供无污染重组制备物的难度也会增加。
今年将会有愈百万的新的癌症病例被诊断，而与癌有关的死亡将达50万(美国癌症协会，1993)，p53突变是与人类癌症有关的最常见的遗传改变，引起人类癌症的50-60％(Hollstein等(1991)，Bartek等(1991)，Levine(1993))。举例来说，基因疗法在治疗p53缺陷的肿瘤时的目标是通过恢复野生型p53基因的一正常的有功能的拷贝以恢复对细胞增殖控制。p53在细胞周期过程中起着关键作用，它抑制生长以便启动与DNA损伤有关的修复或细胞程序死亡(apoptosis)。目前野生型p53已被确认为由辐射或化疗试剂引起的细胞程序死亡的必需成份(Lowe等(1993)A和B)，由于p53突变在人类肿瘤中的高度流行，化学疗法和放射疗法难以治疗的肿瘤很可能部分是由于缺少野生型p53所致。通过向这些肿瘤重新提供有功能的p53可推测这些肿瘤会变得对通常与辐射和化疗诱致的DNA损伤相关的细胞程序死亡敏感。
在成功的人肿瘤抑制基因治疗中关键的一点是能够影响癌细胞的关键部分。为此目的已在各种肿瘤模型中广泛探索了反转录病毒载体的用途。例如反转录病毒载体对肝恶性肿瘤的治疗几乎没有效果，这是由于这些载体不能达到体内基因治疗所需要的高水平的基因转导(Huber，B.E.等，1991；CarusoM.等，1993)。
为了获得更持续的病毒产生源，研究人员试图通过将带有反转录病毒的细胞株直接注入固态肿瘤而克服与低水平的基因转导相关的问题(Caruso M.等，1993；Ezzidine，Z.D.等，1991；Culver，K.W.等，1992)。然而由于其繁琐及在病人中会导致对包装细胞株的炎症反应，这些方法在用于病人时难以令人满意。反转录病毒载体的另外一个缺点是它们要求正在分裂的细胞有效地整合并表达重组的目的基因(Huber，B.E.1991)。稳定地整合到关键性的宿主基因上会导致致病的疾病状态的发生和遗传。
与反转录病毒及其它基因送递方法(综述可见Siegfried(1993))相比，重组腺病毒有明显优点。从未发现腺病毒会在人体中引起肿瘤而且它已被安全地用为活疫苗(Straus(1984))。通过用目的基因取代复制所必需的E1区可产生复制缺陷的重组腺病毒。由于腺病毒不会作为感染的正常结果整合到人基因组中，因此大大减少了用反转录病毒或腺病毒伴病毒(AAV)载体可能引起的插入突变的危险。不会稳定整合也导致了另一安全特点，因为被导入的基因的作用将是暂时的，这是由于随着正常细胞的持续分裂染色体外的DNA会逐渐丢失。稳定的高滴定度的重组腺病毒能以反转录病毒或AAV无法达到的规模进行生产，从而允许生产足够的材料以治疗庞大的发病人口。另外，腺病毒载体能在体内高效地将基因导入广泛的组织和肿瘤细胞。例如，已有人证明腺病毒介导的基因送递对于如囊性纤维变性(Rosenfeld等(1992)，Rich等(1993))及α1-抗胰蛋白酶缺陷(Lemarchand等(1992))之类的疾病的基因治疗有极大的潜力。虽然基因送递的其它方法如阳离子脂质体/DNA复合体目前也在被探索，但目前看来都不如腺病毒介导的基因送递有效。
与治疗p53缺陷肿瘤一样，基因疗法对其它肿瘤的目的也是恢复对细胞增殖的控制。对p53来说，有功能的基因的导入恢复了细胞周期的控制，它允许由治疗药剂导致的细胞程序死亡，与此相似，基因疗法也同样适用于其它的可单独使用也可与其他治疗药剂一起使用的控制肿瘤细胞的细胞进程和/或引起细胞死亡的肿瘤抑制基因。另外，不编码细胞周期调控蛋白但直接导致细胞死亡的基因如自杀基因或对细胞有直接毒性的基因也可直接用于基因疗法以直接消除肿瘤细胞的细胞周期进程。
无论将哪一个基因用于恢复对细胞周期进程的控制，此途径的理论的和实际的可行性是相同的，即获得高效的基因转导以表达出治疗剂量的重组产物。因此选择哪一个载体用于实现高效基因转导并对病人有最小的危险是关系到基因疗法能否成功的重要因素。
故此需要能提供使基因治疗安全有效的高水平的基因转导效率和蛋白质表达的载体和方法。本发明满足了此种需要并同时提供了相关的优点。
发明简述本发明提供了一种重组腺病毒表达载体，其特征是部分或全部缺失了腺病毒蛋白IX的DNA且有一编码外源蛋白或其有功能的片段或突变体的基因。转化的宿主细胞和产生重组蛋白及基因治疗的方法也包括在本发明的范围之内。
因此举例来说，本发明的腺病毒载体可包含一外源基因以表达对细胞周期有控制作用的蛋白质如p53，Rb或分裂激素，或可诱导细胞死亡的蛋白质如条件性自杀基因胸苷激酶。(为了有效，后者必须与胸苷激酶的代谢物一起使用。)附图的简要说明
图1显示了本发明的一个重组腺病毒载体。此构建物如图1所示进行安装。所形成的病毒带有一从356到4042位核苷酸的腺病毒序列的5’端缺失，且在除去完整的蛋白质IX编码序列的同时也去掉了E1a和E1b基因，保留了E1b和pIX基因共用的多聚腺苷酸位点以用于任一目的基因的转录终止。
图2显示了p110RB的氨基酸序列。
图3显示了编码成视网膜细胞瘤抑制蛋白的DNA序列。
图4显示了在本发明范围之内的重组p53/腺病毒构建物的图示。此p53重组体以Ad5为基础，用由后接Ad2的三联前导cDNA的Ad2 MLP(A/M/53)或人CMV(A/C/53)启动子驱动的1.4Kb的全长p53cDNA取代了E1区的360-3325位核苷酸。对照病毒A/M具有与A/M/53病毒相同的Ad5缺失，但没有1.4kb p53 cDNA的插入。残存的E1b序列(705个核苷酸)被缺失以产生蛋白质IX缺失的构建物A/M/N/53和A/C/N/53。这些构建物也在5型腺病毒的E3区域内有一1.9Kb的XbaI缺失。
图5A和5B显示了p53蛋白在用A/M/53和A/C/53感染的肿瘤细胞中的表达。图5A用A/M/53或A/C/53的纯化病毒以图中所示的感染复数(MOI)感染Saos-2(骨瘤)细胞并于24小时后收获。用p53抗体pAb1801对以相同的总蛋白浓度上样的样品的免疫印迹进行染色。用相同蛋白浓度的过量表达突变的p53蛋白的SW480细胞的抽提物作为p53大小的分子量标记。A/C/53题头下的“O”表示模拟感染，含有未受处理的Saos-2裂解物。图5B用A/M/53或A/C/53病毒以所示的MOI感染Hep 3B(肝细胞瘤)细胞，并按A部分进行分析。箭头指示p53蛋白的位置。
图6A-6C显示了依赖于p53的Saos-2的形态学改变。接近铺满(1×105细胞/10cm培养皿)的Saos-2细胞或未被感染(A)，或以MOI＝50用对照的A/M病毒(B)或A/C/53病毒(C)进行感染。细胞在感染72小时后照像。
图7显示了在人肿瘤细胞中由A/M/N/53和A/C/N/53和A/C/N/53所引起的依赖于p53的DNA合成的抑制。在图中所示的不断提高的MOI下用对照腺病毒A/M/(-×-×-)或表达p53的A/M/N/53(-△-△-)或A/C/N/53(-○-○-)病毒感染九个不同的肿瘤细胞株。对每一个细胞株都标注了肿瘤类型和p53状态(Wt＝野生型，null＝无蛋白表达，mut＝突变的蛋白被表达)。如下述实验II所述在感染后72小时测量DNA的合成。每一剂量下的结果来自三次测量(平均值+/-标准差)且相对于MOI以培养基对照的百分比在图中标明。*H69细胞仅用A/M和A/M/N/53病毒进行了测试。
图8显示了p53感染的Saos-2细胞在裸鼠中的肿瘤发生。Saos-2细胞以MOI＝30用对照的A/M病毒或p53重组病毒A/M/N/53进行感染。将处理后的细胞皮下注射到裸鼠的肋腹中。测量肿瘤的体积每周两次(如实验II所述)，连续8周。对对照A/M(-×-×-)和A/M/N/53(-△-△-)处理的细胞，结果均以肿瘤体积对肿瘤细胞植入后的天数在图上标明。误差杆代表每一时间点上每组4个动物的平均肿瘤体积+/-SEM。
图9显示了在已建立的肿瘤中rAd/p53 RNA的表达。将H69(SCLC)细胞皮下注射裸鼠并使之发育成肿瘤约32天直至体积达到约25-50mm3。将鼠随机分组并用2×109pfu的对照A/C/β-gal或A/C/53病毒在肿瘤周围进行注射。注射2天和7天后切下肿瘤，并从每个肿瘤样品中制备polyARNA。用相同的RNA浓度和对重组p53信使特异的引物进行RT-PCR。PCR扩增在Omnigen温度循环仪(Hybaid)中连续进行30个循环94℃ 1分钟，55℃ 1.5分钟，72℃ 2分钟，最后在72℃延伸10分钟。所用的PCR引物是5’三联前导cDNA(5’-CGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTC-3’)和-3’p53引物(5’-TTCTGGGAAGGGACAGAAGA-3’)。泳道1，2，4，5是p53处理后的于2天和7天(如图中所示)时切下的样品。泳道3和6则是β-gal处理后的肿瘤。泳道7，8，9分别是泳道4，5，6的重复，只是扩增引物为肌动蛋白引物以证实进样量的相等。泳道10是用含三联/p53的质粒所做的正对照。
图10A和10B显示了体内的肿瘤抑制及A/M/N/53处理所致的存活时间的增加。将H69(SCLC)肿瘤细胞皮下注射到裸鼠中，使之发育2周。然后在肿瘤四周注射缓冲液(---)，对照A/M腺病毒(-×-×-)，或A/M/N/53病毒(-△△-)，二个病毒(2×109pfu/注射)每周都注射二次共8次。每周二次测量肿瘤的大小。肿瘤的体积按实验II所述进行估算。A)图中标出了与每个病毒对应的肿瘤的体积，与H69细胞注射后的时间(天)相对应。误差杆表明每5个动物一组的平均肿瘤体积+/-SEM。箭头指示病毒注射的天数。B)监测鼠的存活，并且标明了与注入缓冲液(---)，对照A/M(………)或A/M/N/53(——)病毒处理的H69细胞后的时间相对应的每群的存活分数。
图11A-11C显示了重组质粒的构建路线。质粒按如下详述进行构建。构建中粗线表示目的基因而粗体字表示用于产生有待连接以形成箭头所指的后述质粒的片段的限制位点。图11A中显示了pACNTK质粒的构建，通过从pMLBKTK (ATCC No.39369)中将HSV-TK基因亚克隆到一克隆载体的多酶接头，然后分离带有所需末端的TK基因，再将其克隆到pACN载体即得。pACN载体含有在体内发生重组以形成重组腺病毒所必需的腺病毒序列(见图12)。在图11B中显示了质粒pAANTK的构建，通过将编码α-胎蛋白增强子(AFP-E)和启动子(AFP-P)区的PCR扩增片段经过几步亚隆到一最终质粒而得，此质粒中AFP增强子和启动子位于HSV-TK基因的上游，而为在体内发生重组以形成重组腺病毒所必需的2型腺病毒序列则位于HSV-TK的下游。图11C中显示了质粒pAANCAT的构建，先从一可购得的质粒上分离氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，然后将它亚克隆到pAAN质粒(见上)中以产生终极质粒pAANCAT，其中AFP增强子/启动子指导在腺病毒序列背景下CAT基因的转录。
图12是重组腺病毒ACNTK，AANTK和AANCAT的简图。为从图11所述的质粒构建重组腺病毒，将4份(20μg)经EcoRI线性化处理的质粒pACNTK，pAANTK或pAANCAT与1份(5μg)经Cla1消化的带E3区缺失的重组腺病毒(rACβ-gal)(Will等1994)的大片段共转染。在所形成的病毒中，Ad5的360-4021位核苷酸被驱动HSV-1TK或CAT基因表达的CMV启动子和三联前导cDNA(TPL)或α-胎蛋白增强子和启动子(AFP)所取代。所产生的重组病毒分别称为ACNTK，AANTK和AANCAT。
图13显示了在重组腺病毒载体中CAT表达的启动子特异性。将指定细胞株的2×106个细胞用重组腺病毒AANCAT在MOI＝30或100下感染或不感染(UN)。HepG2和Hep3B细胞表达α-胎蛋白而其它的细胞则不表达。感染3天后收集细胞，调整抽提物的体积使总蛋白的浓度保持相等，按下面方法部分所述测量CAT的活性。相等数量的未被感染的细胞作为单个对照以显示CAT的本底活性，而14C标记的氯霉素(14C-only)和从表达CAT活性的稳定细胞株(B21)提取的抽提物则分别作为负对照和正对照。图中标明了乙酰辅酶A的转化百分率，表明CAT的表达局限于那些表达α-胎蛋白的细胞。
图14显示了TK/GCV处理对肝细胞瘤细胞株的作用和启动子特异性的作用。Hep-G2(AFP阳性)和HLF(AFP阴性)细胞株以30的感染复数被ACNTK[-△-]，AANTK[-▲-]或对照ACN[-□-]病毒感染过夜，然后以所示浓度用单一剂量的ganciclovir处理。通过在收集前约18小时向细胞中加入3H-胸苷以估测细胞的增殖。感染72小时后测量3H-胸苷向细胞核酸中的掺入(Top Count，Packard)，以未处理的对照的百分比(平均值+/-标准差)表示。结果表明CMV驱动下的构建物对增殖有依赖于剂量的非选择性抑制，而被AFP驱动的TK则选择性地抑制Hep-G2。
图15显示了在HCC中ACNTK加ganciclovir的细胞毒性。以30的MOI值用ACNTK[-●-]或对照病毒ACN[-□-]感染HLF细胞，并用ganciclovir以所示剂量处理之。在ganciclovir处理后72小时通过比色法测量释放到细胞上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)的量，图中标出了与ganciclovir浓度相对应的二个病毒处理组的吸光值(平均值+/-SEM)。
图16A和16B显示了在裸鼠中ACNTK加ganciclovir对已建立的肝细胞瘤肿瘤(HCC)的作用。将1×107个Hep 3B细胞皮下注射入雌性裸鼠的肋腹，使之生长27天。然后向肿瘤内或肿瘤周围注入ACNTK[-●-]或对照ACN[-□-]病毒(1×109iu，体积100μl)，隔一天一次共三次(箭头所示)。在第一次注射病毒后24小时开始注射ganciclovir(100mg/kg ip)，持续10天。图16A显示了与注射后天数相对的肿瘤体积(均值+/-SEM)。图16B以均值+/-SEM显示了与注射后天数相对的每个被病毒处理的动物组的体重。
本发明的详细描述为了减少野生型腺病毒的污染频率，有必要改进病毒或细胞株以减少重组机率。例如，来自与C型病毒有低同源性的类群的腺病毒可用于工程重组病毒，该重组病毒保持低的与293胞中的Ad5序列重组的倾向。然而，另外一个降低病毒与细胞序列之间重组的较容易的方法是增大重组病毒中缺失的大小并因此而减少病毒和293细胞中Ad5基因，间的共有序列的长度。
腺病毒基因组5’端的超过3.5kb的缺失会影响编码蛋白质IX的基因，在腺病毒载体中尚未被认为是值得的(见下面)。
腺病毒的蛋白质IX基因编码腺病毒外衣壳的一种次要成份，起稳定组成病毒衣壳主要成分的九组六联体的作用(Stewart，(1993))。基于对腺病毒缺失突变体的研究，开始时认为蛋白质IX是腺病毒的一非必需组分，虽然与野生型相比，此蛋白的缺失与较大的热不稳定性相关(colby和shenk(1981))。更近的发现表明蛋白质IX对将全长的病毒DNA装入衣壳是必需的，且在缺失蛋白质IX时只有比野生型至少小1kb的基因组才能作为重组病毒被增殖(Ghosh-Choudhury等(1987))。考虑到这种包装局限性，在设计腺病毒载体时尚未有意考虑缺失蛋白质IX。
在本申请中，含有本发明所遇到的定义，方法及实现基本技术的手段的分子生物学的常规教科书可作为参考。参见如Sambrook等(1989)和其中所引用的各种参考文献。此参考文献和被引用的出版物以其全文作为本发明的参考资料。
与已知技术相反，本发明要求了利用带有蛋白质IX缺失的重组体腺病毒作为一种在用于诊断和治疗如基因治疗的病毒制备物中减少野生型腺病毒污染的手段的用途权利要求。在此术语“重组体”是指作为遗传工程的结果所形成的后代。这些缺失可从存在于传统的E1缺失病毒(可能有更小的不希望的pIX基因的某些部分的缺失，这些缺失被包括在本发明的范围之内)中并可用于与整合在293细胞中的Ad.5序列发生重组的DNA序列中再除去500-700碱基对。本发明包括以任一C型病毒，血清型1，2，5和6，为基础的重组腺病毒。本发明也包括以表达来自2型腺病毒主要晚期启动子的人p53 cDNA的Ad2/Ad.5杂合体为基础的重组病毒。此构建物如图1所示进行组装。所产生病毒带有腺病毒序列的从约357-4020位核苷酸的5’缺失并去除了E1a和E1b基因以及完整的蛋白质IX编码序列，保留了E1b和蛋白质IX基因所共有的用于目的基因转录终止的完整的多聚腺苷酸位点。另外一种不同的实施方案示于图4中。作为替代方法，缺失可进一步延伸30-40碱基对而不会影响相邻的编码蛋白质IVa2的基因，虽然此时需要提供一外源的多聚腺苷酸信号以终止插入重组病毒的目的基因的转录。用此缺失构建的初始病毒很容易在293细胞中增殖且未发现野生型病毒的污染，且此病毒可指导从插入在缺失位点的转录单元强烈地表达p53。
带有上述蛋白质IX缺失的重组病毒的插入容量大约为2.6kb。这对包括p53cDNA在内的许多基因是足够的。通过向腺病毒骨架中引入其它的缺失如在早期区域3或4中的缺失可增大插入容量(综述可参见Graham和Prevec(1991))。例如，使用带有早期区域3内的非必需序列的1.9kb缺失的腺病毒骨架。利用此附加的缺失，载体的插入容量增加到约为4.5kb，这对许多更大的cDNA，包括成视网膜细胞瘤肿瘤抑制基因，已足够大。
本发明提供了一种重组腺病毒表达载体，其特征在于部分或全部缺失了腺病毒蛋白质IX DNA且带有编码一外蛋白白或其功能片段或突变体的基因。这些载体对生产诊断性和治疗性多肽和蛋白质的安全重组体，以及更重要的，对在基因治疗中导入基因是十分有用的。因此，举例说来，本发明的腺病毒载体可包含一外源基因以表达对调控细胞周期有作用的蛋白质如p53，Rb或分裂激素，或表达能诱导细胞死亡的蛋白质如条件性自杀基因胸苷激酶(为了有效，后者必须与胸苷激酶的代谢物一起使用)。任何一个表达盒都可用于本发明的载体中。“表达盒”指带有转录启动子/增强子如CMV启动子增强子等，外源基因以及在一些下述的实施方案描述的带有一多聚腺苷酸信号的DNA分子。此处之术语“外源基因”指不象野生型腺病毒中发现的对应DNA分子那样的精确的方向和位置存在的DNA分子。外源基因是长度可达4.5kb的DNA分子。“表达载体”是指当载体在合适的宿主细胞中增殖即DNA编码的蛋质白或多肽被宿主的系统合成时导致插入的DNA序列表达的载体。重组腺病毒表达载体可含有编码腺病毒蛋白质IX的部分基因，条件是不产生有生物学活性的蛋白质IX或其片段。此类载体的例子是有图1或图4所示的限制酶图谱的表达载体。
诱导性启动子也可用于本发明的腺病毒载体。这些启动子只有在附加的分子存在时才能启动转录。诱导性启动子的例子包括那些可从β-干扰素基因，热休克基因，金属硫蛋白基因或从甾类激素应答基因获得的启动子。组织特异性表达已在基因表达、组织特异性和诱导性启动子领域被很好地叙述。这些基因用于在转入靶细胞后调控外源基因的表达。
本发明也提供了重组腺病毒表达载体，如上所述，其中一个实施方案有较小的蛋白质IX基因缺失，从病毒5’端的3500bp延伸到约4000bp。在另一不同的实施方案中，重组腺病毒表达载体可进一步缺失腺病毒早期区域3和/或4的非必需DNA序列和/或缺失名为腺病毒E1a和E1b的DNA序列。在此实施方案中外源基因是大小可达4.5kb的DNA分子。
另外一个实施方案有一位于E1a和E1b缺失的3’端的多达40个核苷酸和pIX的缺失，并带有一从可调控外源基因表达的位置插入到重组载体中的编码多聚腺苷酸信号的外源DNA分子。
为了本发明的各种目的，重组腺病毒表达载体可从野生型类群的腺病毒如血清型1，2，5或6衍生而来。
在一实施方案中，重组腺病毒表达载体带有编码一有功能的肿瘤抑制蛋白或其生物学活性片段的外源基因。此处之术语“有功能的”当与肿瘤抑制基因有关时，指编码能有效抑制行为象肿瘤细胞的细胞的肿瘤抑制蛋白的肿瘤抑制基因。有功能的基因可包括，如，正常基因的野生型和保持了其编码有效的肿瘤抑制蛋白能力的正常基因的修饰型和其它抗肿瘤基因如条件性自杀基因蛋白或毒素基因。
与此相似，本文中“无功能的”是“失活”的同义词，无功能的或缺陷的基因可由各种条件所致，包括如点突变、缺失、甲基化和其它熟知的条件。
本文中一个基因的“活性片段”包括保持了编码有肿瘤抑制活性的蛋白质的能力的此基因的较小部分。下面详细描述的p56RB只是有功能的肿瘤抑制基因的一个活性片段的一个例子。肿瘤抑制基因的修饰也是在活性片段的意义之内进行考虑，如增加、缺失或取代，只要保持未修饰基因的功能活性就行。
肿瘤抑制基因的另外一个例子是成视网膜细胞瘤抑制基因(RB)。完整的RB cDNA核苷酸序列和预期的RB蛋白(称为p110RB)的氨基酸序列可见Lee等(1987)和图3。为表达成视网膜细胞瘤抑制基因，编码图2所示的氨基酸序列或有图3所示的DNA序列的DNA分子也是有用的。p110RB的一个截短的模本，称为p56RB也是有用的。p56RB的序列见Huang等(1991)。其它的肿瘤抑制也可用于本发明的载体中。仅为举例说明起见，这些可以是p16蛋白(Kamb等(1994))，p21蛋白，Wilm肿瘤WT1蛋白，分裂激素，h-NUC，或结肠癌DCC蛋白。分裂激素述于X.Zhu和W-HLee的1993年10月22日申请的美国申请号为08/141,239的申请中，以及由相同发明人提交的于1994年10月24日申请的代理人标号为P-CJ1191的一个部分继续申请。在此将二者以其全文作为本申请的参考资料。与此相似，h-NUC由W-HLee和P-LChen述于1993年12月20日申请的美国申请号为08/170，586的申请中，在此将此申请以其全文作为参考资料。
如本领域技术人员所熟知的，术语“蛋白质”指由肽键的特殊顺序连接起来的氨基酸的线性多聚体。此处之术语“氨基酸”指氨基酸的D型或L型全体异构体，除非有特别说明。等价蛋白或等价多肽，如具有纯化的野生型肿瘤抑制蛋白质的生物学活性的等价蛋白质或多肽也包括在本发明范围内。其中“等价蛋白质”和“等价多肽”是指从天然发生的蛋白质或多肽的线性序列分离出来的化合物，但有不改变其生物学活性的氨基酸取代。这些等价物与天然序列的差异可通过用相关氨基酸如带相似电荷的氨基酸取代一个或多个氨基酸，或置换或修饰侧链或功能团而引起。
在有功能的肿瘤抑制蛋白的定义中也包括其存在会减少宿主细胞致瘤性，恶性或过量增殖型的蛋白质。此定义中的肿瘤抑制蛋白的例子包括但不限于P100RB，p56RB，分裂激素，h-NUC和p53。“致瘤性”意指能够形成肿瘤或有能力引起肿瘤形成，与赘生性生长是同义词。“恶性”旨在描述能够转移且危及宿主生命的致瘤细胞。“过量增殖型”旨在描述以超过该型细胞的正常生长极限的速率生长并分裂的细胞。“赘生性”也旨在包括缺乏有功能的内源性肿瘤抑制蛋白的细胞或细胞不能表达编码有功能的肿瘤抑制蛋白的内源性核酸。
本发明所提供的载体的一个例子是带有编码p53蛋白或其活性片段的外源基因的重组腺病毒表达载体。p53基因的编码序列公布于下面的表1中。表150V*SHR PGSR* LLGSG DTLRS GWERA FHDGD TLPWI GSQTA FRVTA MEEPQ100SDPSV EPPLS QETFS DLWKL LPENN VLSPL PSQAM DDLML SPDDI EQWFT150EDPGP DEAPR MPEAA PPVAP APAAP TPAAP APAPS WPLSS SVPSQ KTYQG200SYGFR LGFLH SGTAK SVTCT YSPAL NKMFC QLAKT CPVQL WVDST PPPGT250RVRAM AIYKQ SQEMT EVVRR CPHHE RCSDS DGLAP PQHLI RVEGN LRVEY300LDDRN TFRHS VVVPY EPPEV GSDCT TIHYN YMCNS SCMGG MNRRP ILTII350TTEDS SGNLL GRNSF EVRVC ACPGR DRRTE EENLR KKGEP HHELP PGSTK400RALPN NTSSS PQPKK KPLDG EYFTL QIRGR ERFEM FRELN EALEL KDAQAGKEPG GSRAH SSHLK SKKGQ STSRH KKLMF KTEGP DSD**＝终止密码子此外所描述的任一表达载体均可作为组合物用于诊断或治疗。这些载体可用于筛选许多在基因疗法中有用的肿瘤抑制基因。例如，从患者或哺乳动物体上取下疑为赘生物的细胞样本，然后在适当的条件下将细胞与本发明的有效剂量的已插入编码有功能的肿瘤抑制基因之一的外源基因的重组载体相接触。可以通过在软琼脂上集落的形成或在裸鼠体中肿瘤的形成观察这一基因的导入是否能逆转其恶性表型。若恶性表型被逆转，则前述外源基因可被确认为能对该患者或哺乳动物成功地进行基因治疗的一个有益候选对象。药用时，可将这些表达载体与一个或多个药物学可接受载药体结合运用。药物学可接受载体已在本领域熟知，包括水溶液如生理缓冲盐水或其他溶剂或赋形剂如乙二醇、甘油、植物油(如椰榄油)或可注射的有机酯。可用药物学可接受载体将准备好的组合物体外用于一细胞或体内用于一患者。
药物学可接受载体可以含有，例如，起稳定组合物或者提高或降低药剂吸收性等作用的生理上可接受的化合物。这种生理上可接受化合物包括，如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或萄聚糖，抗氧化剂例如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白或其它稳定剂或赋形剂。其他生理上可接受化合物包括致湿剂，乳化剂，分散剂或专门用于防止微生物生长或活动的防腐剂。各种防腐剂已为人们所熟知，包括，如，酚和抗坏血酸。本领域技术人员应会知道药物学可接受载体，包括生理上可接受化合物，的选择依赖于，如，多肽的用药途径以及具体多肽的具体生理化学特性。例如，象单硬脂酸铝或明胶的生理上可接受化合物作为迟发剂特别有用，它可以延缓患者对所用药物组合物的吸收速率。载体、稳定剂、辅剂的其他例子可在第十五版的Martin Remington’s Pharm Sci.中找到(Mack Publ.Co.，Easton，1975)。在此将其作为本发明的参考资料。若有必要，药物组合物也可被掺入到脂质体，微球体或其他聚合物基质中(Gregoriadis，Liposome Technology，vol.1，(CRC Press，Boca Raton，Florida 1984)，在此作为本发明的参考资料)。举例来说，由磷脂或其它脂类所组成的脂质体是无毒的、生理可接受且可代谢并相对地较容易制备和给药的载体。
在此，“药物组合物”指与上述一种或多种药物学上可接受载体结合使用的本文述及的任何组合物。这些组合物可用于治疗和预防。它们可以有效剂量在体内，离体下或体外与宿主细胞相接触。下面给出了在体外和离体下接触宿主细胞的方法。体内运用时，含有本发明载体的药物的给药方式已为本领域技术人员熟知，包括但并不限于，口服用药，瘤内用药，静脉用药，肌内用药或腹膜内用药。给药可以是连续的，或间歇性的，并会随患者处理条件，如与其他药物组合物一起作用的情况(Landmann等(1992)；Aulitzky等(1991)；Lantz等(1990)；Supersaxo等(1988)；Demetri等(1989)；和Le Maistre等(1991)，的不同而不同。
本发明还提供了插入了上述重组腺病毒表达载体的转化的原核或真核宿主细胞，如动物细胞或哺乳动物细胞。合适的原核细胞包括但并不限于细菌细胞如E.coli细胞。用反转录病毒载体转化宿主细胞的方法已熟知，见Sambrook等(1989)，它包括但并不限于转染，电穿孔和微注射。
在整个申请中所用的术语“动物”与哺乳动物同义，包括但并不限于牛、猪、猫、猴、狗、马、鼠、大鼠或人类。其它的宿主细胞包括但并不限于任何赘生性或肿瘤细胞，如骨瘤，卵巢癌，乳腺癌，黑素瘤，肝癌，肺癌，脑癌，结肠直肠癌，造血细胞，前列腺癌，颈癌，成视网膜细胞癌，食道癌，膀胱癌，神经母细胞癌，或肾癌。
另外，任何能够表达E1a，E1b或E1a，E1b和pIX的真核细胞株均为此载体的合适宿主。在一实施方案中，293细胞株即是一种合适的真核宿主细胞，它可以从American Type Culture Collection，12301ParkIawn Drive，Rockville，Maryland，U.S.A20231获得。
此处所述的任何转化的宿主细胞均可作为组合物用于诊断和治疗。药用时，它们可与不同的药理上可接受的载体结合使用。合适的药理上可接受的载体已为本领域的技术人员所熟知，并如上面所述。此组合物然后可以有效剂量用于治疗或诊断，详细叙述见下文。
本发明同时也提供了一种转化宿主细胞的方法。此方法在合适的条件下使宿主细胞，即原核或真核宿主细胞，与任何上述表达载体相接触。由此方法转化的宿主细胞也在本发明权利要求范围之内。使用本领域熟知的方法(Sambrook等(1989)和有效剂量的表达载体可在体外、体内或离体条件下实现接触。本发明还提供一种通过在合适的便于转录或翻译插入的外源基因的条件下培养转化的宿主细胞以产生重组蛋白或多肽的方法。在若干种宿主细胞，如哺乳动物，酵母，昆虫或细菌细胞中表达重组蛋白的方法已广为熟知，包括述于上面Sambrook等中的方法。然后运用传统的方法如柱纯化或用抗蛋白抗体纯化，可分离被翻译的外源基因。分离的蛋白或多肽也在本发明范围之内。此处之纯化的或分离的指基本上没有了在自然或宿主细胞环境下通常与重组蛋白或多肽相联结的天然蛋白或核酸。
本发明也提供了插入了表达载体的非人类动物或转化的宿主细胞。运用本领域人员所熟知的方法，如U.S.专利NO.5,175,384所述，或通过常规离体治疗技术如Culver等(1991)所述的方法可获得这些“转基因”动物。
如下所详述，表达上述野生型肿瘤抑制因子野生型p53的重组腺病毒可有效地抑制DNA合成并抑制许多包括临床目标在内的类型广泛的人类肿瘤细胞的生长。而且，重组腺病毒可在体内形成的肿瘤中表达肿瘤抑制基因如p53，而无需依靠直接向肿瘤内注射或对癌细胞进行离体处理。表达的p53是有功能的且可在体内有效地抑制肿瘤的生长，并可在人肺癌的裸鼠模型中明显提高存活时间。
因此，本发明的载体特别适用于基因疗法。因此利用这些载体的基因治疗方法也在本发明范围之内。将载体纯化，然后以有效剂量对患者体内或离体条件下用药。基因治疗的方法已为人熟知，可见于如Larrick，J.W和Burck，K.L.(1991)，和Kreigler，M.(1990)。“患者”指任何动物，哺乳动物，大鼠，小鼠，牛，猪，马，狗、猫或人患者。当外源基因编码肿瘤抑制基因或其他抗肿瘤蛋白时，此载体可用于治疗或减少患者体内的过量增殖细胞，抑制患者体内肿瘤的增殖或改良相关的特殊病理。病理的过量增殖细胞有如下病态特征，如甲状腺增生-Grave疾病，牛皮癣，良性前列腺肥大，包括乳腺癌，肉瘤和其它肿瘤的Li-Fraumeni综合症，膀胱癌，结肠癌，肺癌，各种白血病和淋巴瘤。已经发现了非病理的过量增殖细胞的实例，例如，在泌乳期乳腺导管上皮细胞和与伤口修复有关的细胞。病理性过量增殖特征性地表现出接触抑制的丧失及表明细胞表面特性改变并进而破坏细胞间通讯的选择性吸附能力的下降，这些变化包括对分裂的刺激以及能够分泌蛋白水解酶。
另外，本发明还涉及到在通过使用本发明的载体将一野生型肿瘤抑制基因导入细胞制备物(来自自身的外周血或骨髓)中以实现骨髓重建的过程中，消耗某些污染造血前体的哺乳动物的病理性过量增殖细胞的合适样品的方法。在此，“合适样品”指从患者取得的不同类细胞制备物，例如含有表型上正常和病态细胞的混合物。“给药”包括，但并不限于通过静脉注射向肿瘤直接注射，瘤内注射，腹膜内给药，向肺气溶给药或局部性给药而导入细胞或患者中。这类用药可与上述药物学上可接受的载体结合使用。
术语“降低的致瘤性”是指已被转变为低致瘤性或非致瘤性细胞的肿瘤细胞。致瘤性降低的细胞或在体内不形成肿瘤，或体内肿瘤生长出现之前将延迟时间延长数周至数月，和/或与具有完全失活或无功能的肿瘤抑制基因的肿瘤相比有较慢三维肿瘤块的生长速度。
在此，术语“有效量”用来指在控制细胞增殖中产生正结果的载体或抗癌蛋白的量。例如，一个剂量包含大约108-1013个感染单位。一个典型疗程为每天一剂共五天。有效量会因病理和治疗条件，病人及其状态以及其他本领域人员所熟知的因素而有所改变。有效量可被本领域熟练人员很容易地确定下来。
一种改善以过量增殖细胞或患者的遗传缺陷为特征的病态的方法也包括在本发明的范围内，该方法通过在合适条件下给予患者有效量的含有编码具有改善病态能力的基因产物的外源基因的上述载体而实现。本文中的术语“遗传缺陷”是指由遗传因子产生的疾病或异常，如镰形细胞贫血症或Tay-Sachs症。
本发明还提供了种通过将有效量的含有抗瘤基因而非肿瘤抑制基因的腺病毒表达载体导入肿瘤细胞从而降低患者体内肿瘤细胞的增殖的方法。例如这种抗瘤基因可编码胸苷激酶(TK)。然后对患者给予有效量的治疗药剂，这种药剂在抗瘤基因存在时对细胞是有毒的。在胸苷激酶的具体情况下，治疗药剂为胸苷激酶的代谢物，如ganciclovir(GCV)，6-甲氧嘌呤阿拉伯糖核苷(araM)，或其功能等价物。为了对宿主细胞致毒，胸苷激酶和胸苷激酶代谢物必须一起使用。而在GCV存在时，GCV会被磷酸化并转换成DNA合成的强烈的抑制剂，而araM则被转变为有细胞毒性的合成代谢产物araATP。其他抗瘤基因也可与相应的治疗药剂结合使用以降低肿瘤细胞的增殖。这些基因及治疗药剂的结合使用已为本领域人员所熟知。另一个例子是本发明的表达胞嘧啶脱氨酶的载体。此载体可与药剂5-氟尿嘧啶(Austin和Huber，1983)的用药结合使用，或与最近描述的与6-甲基嘌呤-2’-脱氧核糖核苷(Sorscher等，1994)一起使用的E.Coli Deo△基因的用药结合使用。
正如前述肿瘤抑制基因的使用，其他抗癌基因，单独或与合适的治疗药剂相结合使用，对作为肿瘤和恶性病变的特征的细胞不受控制的生长和增殖提供了一种治疗方法。因此，本发明提供了一种疗法以终止患者体内不受控制的细胞的生长，从而改善患者体内的疾病或恶病质症状。此疗法的效果包括但并不限于患者存活时间的延长，肿瘤块或容积的降低，肿瘤细胞的细胞程序死亡或参与循环的肿瘤细胞数量的降低。本领域人员熟知对此疗法的有益效果进行定量的方法。
本发明提供了一种重组腺病毒表达载体，其特征为腺病毒蛋白IX DNA部分或全部缺失并且具有编码外源蛋白的外源基因，其中外源蛋白为自杀基因或其功能等价物。上述抗癌基因TK是自杀基因的一例，因为表达后的基因产物对于细胞是或可以成为致死性的。对于TK来说，GCV的存在诱导这种致死性。运用本领域技术人员熟知的方法可从单式疱疹病毒中取得TK基因。E.Coli HB101中的质粒pMLBKTK(取自ATCC#39369)是本发明使用的单式疱疹病毒(HSV-1)胸苷激酶(TK)基因的来源。然而也存在许多其它的来源。
通过将腺病毒表达载体与合适的药学可接受载体相结合可将TK基因导入肿瘤组织。例如，通过向肿瘤组织直接注射重组腺病毒可实现这一导入。对于某一特定肿瘤如肝细胞肿瘤(HCC)，可直接进行肝动脉注射以输药，因为大部分HCC由此动脉开始循环。为了控制肿瘤的增殖，可通过用TK代谢物如ganciclovir对病人进行治疗以引起细胞死亡，从而减小肿瘤体积。例如，TK代谢物可通过例如对肿瘤作局部注射而系统用药，或对HCC而言，向肝动脉注射。TK代谢物每天最好至少用药一次，但也可据需要增加或减少。TK代谢物可在含TK的载体用药的同时或之后给药。本领域人员知道或能确定出有效的用药剂量和持续时间。
通过用有效量的本发明的腺病毒表达载体接触动物体内的靶组织可实现将肿瘤抑制基因进行肿瘤特异性送递的方法。此基因用以编码抗瘤物质，如有功能的肿瘤抑制基因或自杀基因。“接触”包括任何为了有效地导入载体所用的任何送递方法，如瘤内注射。
本发明还提供了本发明的腺病毒载体用于制备治疗疾病或治疗的药物的用途。
下面的实施例旨在举例说明，并不限制本发明的范围。
实验I用质粒pAd/MLP/p53/E1b-作为这些操作的出发材料。此质粒以pBR322衍生物pML2(缺失了1140-2490碱基对的pBR322)为出发点，并含有1-5788但缺失了357-3327碱基对的5型腺病毒的序列。在Ad5 357/3327缺失位点插入由2型腺病毒主要晚期启动子，2型腺病毒三联前导cDNA和人p53 cDNA组成的转录单位。它是一种典型的缺失了Ad5 E1a和E1b基因但含有Ad5蛋白IX基因的E1取代载体(腺病毒载体综述参见Graham和Prvec(1992))。Ad2 DNA购自Gibco BRL。限制性核酸内切酶和T4 DNA连接酶购自New Engl and Biolabs。E.coli DH5α感受态细胞购自Gibco BRL，293细胞从Armerican Type Culture Collection (ATCC)获得。Prep-A-gene DNA纯化树脂购自BioRad。LB肉汁细菌生长培养基购自Difc.o。Qiagen DNA纯化柱购自Qiagen公司.Ad5 dl327来自R.J.Schneider，NTU.MBS DNA转染试剂盒购自Stratagene。
按照生产厂商的推荐，各用20单位限制性内切酶Ec1 136II和NgoMI消化1μg pAd/MLP/p53/E1b-。按照生产厂商的推荐，各用20单位限制性核酸内切酶DraI和NgoMI消化5μg Ad2 DNA。将限制性消化液加入0.8％琼脂糖凝胶的不同泳道，100v电泳三小时。按照生产厂商的具体说明，用Prep-A-GeneDNA提取树脂将pAd/MLP/p53/E1b-样品中的4268bp限制性片段和Ad2样品中的6437bp片段从凝胶中分离出来。将限制性片段混合并按照生产厂商的推荐，用T4 DNA连接酶16℃在总体积50μl的溶液中处理16小时。连接后取5μl反应液转化E.Coli DH5α细胞，筛选抗氨苄青霉素的转化子。将由此过程产生的6个细菌菌落分别接种到2ml LB生长培养基并于37℃过夜振荡培养。用常规方法(Sambrook等(1989))从每一细胞培养物中制备DNA。用20单位限制性核酸内切酶XhoI消化从每一分离物中获得的1/4的质粒DNA以筛选带有3627、3167、2466和1445bp的XhoI限制片段的正确重组子。六个被筛选的菌落中有五个含有正确的质粒。将其中之一接种到1升LB培养基中以便大量提取质粒DNA。隔夜培育后，按照生产厂商的推荐，用QiagenDNA纯化柱从1升培养物中分离质粒DNA。所得质粒称为Pad/MLP/p53/PIX-。此质粒的样品已于1993年10月22日保藏于American Type Cultrue collection，12301Parklawn Drive，Rockville，Maryland，U.S.A，12301。此保藏是按照布达佩斯条约关于用于专利程序的微生物的国际保藏的规定而进行的。保藏物的ATCC登记号为75576。
为了构建重组腺病毒，用40单位限制性核酸内切酶EcoRI处理10μg Pad/MLP/p53/PIX-以使之成线性。用限制性核酸内切酶C1aI消化5型腺病毒dl327 DNA(Thimmappaya(1982))，通过蔗糖梯度离心纯化大片段(约33kb)。将10μg EcoRI处理过的Pad/MLP/p53/E1b-和2.5μg ClaI处理过的Ad5 dl327混合，并按照供应商的推荐用MBS哺乳动物转染试剂盒用此混合物转染大约106个293细胞。转染八天后，将293细胞一分为三接种到新鲜的培养基中，两天后腺病毒诱导的细胞病变效应会在被转染的细胞上显著表现出来。在转染后第13天，用常规方法(Graham和Prevec(1991))从感染细胞制备DNA，并用限制性核酸内切酶XhoI通过限制性消化进行分析。在用病毒裂解物感染Saos2骨癌细胞并用名为1801的抗p53单克隆抗体(Novocasta Lab.Ltd.U.K.)免疫杂交后，证实了病毒指导的p53的表达。
实验II材料和方法细胞株在培养于含10％纯化的补给性小牛血清(Hyclone)的DME培养基中的人胚肾细胞株293(ATCC CRL 1573)中生长并裂殖重组腺病毒。将Saos-2细胞在用15％胎牛血清补给的Kaighn培养基中培养。将Hela和Hep 3B细胞在用10％胎牛血清补给的DME培养基中培养。其它的细胞株在用10％胎牛血清补给的Kaighn培养基中生长。Saos-2细胞由Eric Stanbridge博士提供。其他细胞株均来自ATCC。重组腺病毒的构建。
为了构建Ad5/p53病毒，从pGEM1-p53-B-T(Dr.Wen Hwa Lee提供)分离含编码p53的全长cDNA(表1)的1.4kb Hind III-SmaI片段并用常规克隆方法(Sambrook等(1989))将其插入表达载体pSP72(Promeg)的多克隆位点。XhoI-BglII消化此载体并经凝胶电泳片段可回收p53插入。然后将p53编码序列插入pNL3C或pNL3CMV腺病毒基因转导载体(Robert Schneider博士惠赠)，此载体含有Ad5 5’反向末端重复和病毒包装信号及位于后接三联前导cDNA和PML2背景下的3325-5525bp的Ad5序列的Ad2主要晚期启动子(MLP)和人的细胞肥大病毒早期基因启动子(CMV)上游的E1a增强子。
这些新构建物用后接三联前导cDNA的Ad2MLP(A/M/53)或人CMV启动子(A/C/53)驱动的p53代替了Ad5的E1区(bp360-3325)。插入的p53使用了剩余的E1b下游的多聚腺苷酸位点。另外还构建了为去掉蛋白质IX(PIX)编码区而进一步缺失了Ad5序列的705个核苷酸的MLP和CMV驱动的p53重组子(A/M/N/53，A/C/N/53)。作为对照，从不存在p53插入序列的亲代PNL3C质粒构建了一重组腺病毒(A/M)。另外一个对照由编码在CMV启动子控制下的β-半乳糖苷酶基因的重组腺病毒(A/C/β-gal)构成。用NruI或EcoRI线化质粒，并用Ca/PO4转染试剂盒(Stratagene)使其与ClaI消化的Ad5d1309或d1327突变体的大片段(Jones和Shenk(1979))共转染。分离病毒蚀斑，同时用限制酶消化分析和用对带有p53cDNA下游序列的三联前导cDNA序列有特异性的重组体引物进行的PCR确认重组体。利用有限稀释进一步纯化重组病毒，用常规方法(Graham和vander Erb(1973)；Graham和Prevec(1991))纯化并滴定病毒颗粒。p53蛋白的检测以不断增加的病毒蚀斑形成单位/细胞的感染复数(MOI)用所示重组腺病毒感染Saos-2或Hep3B细胞(5×105)24小时。用PBS洗涤一。次细胞，然后在裂解缓冲液(50mMTris-HCl pH7.5，250mMNaCl，0.1％NP40，50mM NaF，5mMEDTA，10μg/ml aprotinin，10μg/ml抑酶醛肽和1mM PMSF)中收集。用10％SDS-PAGE分离细胞蛋白(大约30μg)，并转移到硝酸纤维素膜上。将膜与α-p53抗体PAb 1801(Novocastro)一起保温，然后再加入与辣根过氧化物酶偶联的绵羊抗鼠IgG保温。在Kodark XAR-5胶片上通过化学发光可观察到p53蛋白。DNA合成速率测定将细胞(5×103/孔)植入96孔滴定板(Costar)并使之过夜吸附(37℃，7％CO2)。然后以0.3-100的MOI值用纯化的重组病毒颗粒感染细胞24小时。感染24小时后更换培养液继续培养，共培养72小时。收集前18小时加入3H-胸苷(Amersham，1μCi/孔)。用玻璃纤维滤膜收集细胞，并在β闪烁计数器上测量放射性的掺入水平。3H-胸苷的掺入以培养基为对照以平均值％(+/-SD)的方式表达，并与MOI相对应作图。在裸鼠中的致瘤性以3或30的MOI值用含有纯化的A/M/N/53或A/M病毒的悬浮缓冲液(含1％蔗糖的PBS)处理植于T225培养瓶内的大约2.4×108个Saos-2细胞。过夜感染后，将细胞皮下注入BALB/c无胸腺裸鼠(每组四只)的左肋和右肋。其中一肋中注入A/M/N/53处理过的细胞，而另一肋中注入对照的A/M处理过的细胞，每只鼠均以自身为对照物。两肋均注入缓中液处理的细胞的动物作为另外的对照物。然后每周二次测量肿瘤的三维尺寸(长、宽、高)和鼠的体重，共八周。对每一动物均通过假设肿瘤为球形几何体来估算其体积，其半径等于测得的肿瘤三维尺寸的平均值的1/2。瘤内RNA的分析向BALB/c无胸腺裸鼠(大约5周大)的右肋皮下注入1×107个H69小细胞肺癌(SCLC)细胞。肿瘤生长32天至大约25-50mm3。经瘤周注射将A/C/53或A/C/β-gal重组腺病毒(2×109蚀斑形成单位(pfu))注入到鼠肿瘤组织下方的皮下空间。腺病毒处理2天和7天后将肿瘤从动物体内切下并用PBS冲洗。将肿瘤样品匀浆，并用Tri Reagent试剂盒(Molecular Research Center，Inc.)分离总RNA。用Poly ATract mRNA Isolation System(Promega)分离Poly ARNA，并用大约10ng样品进行RT-PCR以确定p53 mRNA的表达(Wang等，(1989))。设计引物以扩增腺病毒三联前导cDNA和下游的p53cDNA之间的序列，要保证只有重组的非内源性的p53被扩增。裸鼠中已形成的肿瘤的p53基因疗法将约1×107个H69(SCLC)肿瘤细胞以200μl的体积皮下注入雌性BALB/c无胸腺裸鼠。肿瘤生长二周，此时按照肿瘤的大小将动物随机分组(N＝5/组)。瘤周注射A/M/N/53或对照A/M腺病毒(2×109pfu/注射)或单独注射缓冲液(1％蔗糖于PBS)，每周注射二次，共8剂/组。肿瘤大小和体重每周测二次，共七周，并按前述方法估计肿瘤的体积。然后观察用药处理对鼠存活情况的影响。结果重组p53-腺病毒的构建通过用在Ad2 MLP(A/M/53)或CMV(A/C/53)启动子控制下的p53cDNA取代5型腺病毒的E1a区和E1b区中的一部分即可构建成p53腺病毒(示于图4)。E1取代严重损伤了重组腺病毒的复制能力，使其增殖局限于能反式提供Ad5E1基因产物的293细胞(Graham等(1977))。在用限制酶消化和PCR分析确认为p53重组腺病毒后，对其中一个重组腺病毒(A/M/53)的完整的p53cDNA进行测序以证明不存在突变。然后用此p53重组体的纯化制备物感染Hela细胞以检测野生型腺病毒的存在。Hela细胞不允许E1缺失的腺病毒复制，用1-4×109重组腺病毒的感染单位感染之，培养3周，观察细胞病变效应(CPE)是否出现。经此试验未能检测到重组腺病毒的复制或野生型的污染，而在用野生型腺病毒感染的对照细胞中可以约1/109的灵敏度经CPE明显观察到此现象。从重组腺病毒表达p53蛋白为了确定p53重组腺病毒是否表达p53蛋白，用此病毒感染不表达内源性p53蛋白的肿瘤细胞株。以0.1-200pfu/细胞的MOI使用p53重组腺病毒A/M/53或A/C/53感染人肿瘤细胞株Saos-2(骨瘤)和Hep3B(肝细胞癌)。由感染细胞制备的裂解物的Western分析表明在二个细胞类型中都有一剂量依赖性的p53蛋白表达(图5)。二株细胞用A/C/53感染后所表达的p53蛋白水平都比用A/M/53感染的高(图3)。在未被感染的细胞中检测不到p53蛋白。内源的野生型p53蛋白的表达水平通常很低，用Western分析细胞抽提物几乎无法检测到(Bartek等(1991))。然而，野生型p53蛋白的水平在以较低的MOI使用A/M/53或A/C/53感染后显然很容易检测到(图5)，这表明即使低剂量的p53重组腺病毒也能表达出有效水平的p53。依赖p53的形态学变化向p53阴性的骨瘤细胞株Saos-2中重新导入野生型p53导致了那些正常的纺锤形细胞的特征性扩张和平铺(Chen等(1990))。以50的MOI使用A/C/53或对照的A/M病毒感染接近平铺的Saos-2细胞(1×105细胞/10cm平皿)，37℃培养72小时直到未感染的对照平皿长至铺满。此时预期的形态学变化在用A/C/53处理的平皿中很明显(图6，C)，而在未感染的(图6，A)或用对照病毒感染的平皿(图6，B) 中则不然。此效应并非细胞密度的函数，因为一个起始时以较低的密度接种的对照平皿中72小时仍保持正常的形态，而这时其铺满程度接近A/C/53处理的平皿的铺满。原先的结果已表明在MOI＝50时在Saos-2细胞中p53蛋白有高水平表达(图5A)。这些结果证明由这些重组腺病毒表达的p53蛋白是有生物学活性的。p53对细胞DNA合成的抑制为了进一步测试p53重组腺病毒的活性，通过测量细胞对3H-胸苷的吸收测定了此病毒对人肿瘤细胞增殖的抑制能力。原先已经表明将野生型p53导入不表达内源性野生型p53的细胞中可在G1/S瞬时捕获细胞，导致抑制被标记的胸苷吸收到新合成的DNA中(Baker等(1990)；Mercer等(1990)；Diller等(1990))。用A/M/N/53，A/C/N/53或不表达p53的对照重组腺病毒(A/M)感染各种p53缺陷的肿瘤细胞株。发现A/M/N/53和A/C/N/53重组体同时对9个被测的不同的细胞株中的7个细胞株的DNA合成有强烈的、剂量依赖性的抑制(图7)。二个重组体都能抑制这些人肿瘤细胞的DNA合成，无论其是表达突变的p53还是不表达p53蛋白。还发现在此试验中A/C/N/53构建物一直比A/M/N/53更有效。在Saos-2(骨瘤)和MDA-MB468(乳腺癌)细胞中，A/C/N/53构建物以低至10的MOI值即可接近100％地抑制DNA的合成。在对照腺病毒仅有10-30％抑制的剂量下，用两个p53重组腺病毒的任何一个均可观察到DNA合成减少50-100％。与此成鲜明对比的是与对照病毒相比，这两个构建物对HEP G2细胞(表达内源性野生型p53的肝细胞瘤细胞株，Bressac等(1990))和K562(p53无效)白血病细胞株都无明显的p53特异性作用。在裸鼠中的致瘤性在更严格地检测p53重组腺病毒功能的试验中，先将肿瘤细胞在体外感染，然后注射到裸鼠中以估测重组体在体内抑制肿瘤生长的能力。将用A/M/N/53或对照A/M病毒以MOI＝3或30感染的Saos-2细胞注射到裸鼠相对的肋腹中。然后测量肿瘤体积，每周二次，共八周。在MOI＝30时在每个动物的p53处理的肋腹中观察不到肿瘤的生长，而用对照病毒处理的肿瘤则持续生长(图8)。用对照病毒处理的肿瘤的持续增大与在用缓冲液处理的对照动物中观察到的相似。在MOI＝3时用对照腺病毒和p53处理的4个鼠中有2个的肿瘤在约6周后确实开始显示出某些生长。
因此，A/M/N/53重组腺病毒能够在体内环境下介导p53特异性的肿瘤抑制。Ad/p53的体内表达虽然先离体处理癌细胞，然后再将之注入动物提供了一个检测肿瘤抑制的关键试验，但更临床相关的实验是要确定注入的p53重组腺病毒能否在体内感染并在已形成的肿瘤中表达p53。为此，将H69(SCLC，p53null)细胞皮下注入裸鼠，使肿瘤发育32天。此时再向环绕肿瘤的瘤周空间一次注入2×109pfu的A/C/53或A/C/β-gal腺病毒。在注入腺病毒后2天或7天切下肿瘤，从每个肿瘤中分离poly A RNA。然后用重组体-p53特异性的引物进行RT-PCR，以检测p53处理的肿瘤中p53的mRNA(图9，泳道1，2，4，5)。从β-gal处理的动物切下的肿瘤中无明显的p53信使(图9，泳道3和6)。用肌动蛋白引物进行的扩增作为RT-PCR反应的对照(图9，泳道7-9)，而含重组体-p53序列的质粒则作为重组体-p53特异性带的正对照(图9，泳道10)。此实验表明p53重组腺病毒在一次注入瘤周空间后能在已形成的肿瘤中特异地指导p53mRNA的表达。还表明用p53重组腺病毒注射后病毒在体内至少能存在一周。体内效用为阐明基因疗法对已形成的肿瘤的可行性，使用一带瘤裸鼠模型。将H69细胞注入鼠右肋腹的皮下空间，使肿瘤生长2周。然后用缓冲液或重组病毒对鼠进行瘤周注射，每周二次，共八次。在用缓冲液或对照的A/M病毒处理的鼠中，整个治疗过程中肿瘤持续快速生长，而用A/M/N/53病毒处理的肿瘤生长的速率则大大降低(图10A)。停止注射后，对照处理的肿瘤继续生长而p53处理的肿瘤则在不另外补给外源p53时至少有一周不生长或几乎不生长(图10A)。虽然与用病毒处理的群体相比单独用缓冲液处理的对照动物肿瘤加速长生，但在处理期间三个群体的体重未发现明显不同。某些动物的肿瘤广烂限制了在42天之后的肿瘤体积测量之间的相关性。然而为了确定存活时间对这些动物进行的继续监测表明p53处理的动物有存活优势(图10B)。用对照腺病毒处理的动物最后一个死于第83天，而单独用缓冲液处理的对照则于56天前全部死亡。相比之下，用A/M/N/53处理的5个动物都继续存活着(细胞注射后130天)(图10B)。综合起来，此数据确定了p53对带有已形成的p53缺陷肿瘤的动物的肿瘤生长和动物存活时间有特异性作用。表达p53的腺病毒载体构建了能以剂量依赖形式高水平表达野生型p53蛋白的人重组腺病毒载体。每个载体均含有导致病毒复制缺陷的E1a和E1b区的缺失(Challberg和Kelly(1979)；Horowitz(1991))。更有意义的是这些缺失包括编码E1b19和55kd的蛋白质。据报道19Kd的蛋白质涉及抑制细胞程序死亡(White等(1992)；Rao等(1992))，而55kd的蛋白质能结合野生型的p53蛋白(Sarnow等(1982)；Heuvel等(1990))。通过缺失这些腺病毒序列，可除去通过直接地结合p53或潜在地抑制p53介导的细胞程序死亡而起作用的p53功能的潜在抑制因子。还构建了其它的也缺失了残存的3’E1b序列，包括所有的蛋白质IX编码序列的构建物。虽然有人报道这会使腺病毒包装体积的容量比野生型的降低3Kb(Ghosh-Choudhury等(1987))，但这些构建物也在E3区发生了缺失以致于A/M/N/53和A/C/N/53构建物正好处于此体积范围之内。通过缺失PIX区，与包含在293细胞中的序列同源的腺病毒序列降低到约300bp，从而降低了通过重组重新产生有复制能力的野生型腺病毒的机会。目前看来，缺少pIX编码序列的构建物与带有pIX的构建物有相同的效应。p53/腺病毒的体外效用与感染的细胞中p53蛋白质表达的强烈的剂量依赖性相一致，实验表明对肿瘤细胞生长的抑制也具有剂量依赖性和p53特异性。在已知的缺少野生型p53蛋白质表达的多种肿瘤细胞类型中，通过抑制DNA合成可抑制和表明细胞分裂。在相似试验中运用p53重组腺病毒，Bacchetti和Graham(1993)最近报导了在卵巢癌细胞株SkOV-3中DNA合成的p53特异性抑制。除卵巢癌以外，代表在临床上重要的人类癌症的并包括过量表达突变型p53蛋白质的细胞株的其他人肿瘤细胞株也表明其生长可被本发明的p53重组病毒所抑制。当A/C/N/53重组腺病毒以90-100％的效力抑制这些肿瘤的DNA合成时，对照腺病毒在同样的MOI下介导的抑制不超过20％。
虽然Feinstein等(1992)报道野生型p53的重新引入会导致分化并提高白血病K562细胞中G1期细胞对S+G2期细胞的比例，但是在这一细胞株中未发现p53的特异作用。Horvath和Weber(1988)报道人外周血淋巴细胞高度不易被腺病毒感染。在另外的实验中，用重组的A/C/β-gal腺病毒明显感染了不应答的K562细胞，而其他细胞株，包括对照Hep G2细胞株和显示p53强烈作用的细胞株却很容易被感染。因此，尽管也有其他因素的影响，但是至少效应变异性的一部分看来应归因于感染的变异性。
图8中用A/M/N/53病毒观察的结果表明在体内环境下完全抑制是可能的。在较低MOI下4个p53处理的动物中有2个动物的肿瘤重新生长很可能是由于在此剂量下有一小部分细胞在开始时未被p53重组体感染。然而，在较高剂量下用A/M/N/53进行的完全抑制表明能够克服肿瘤重新生长能力。p53腺病毒的体内效用本文及由其它研究组(Chen等(1990)；Takahashi等(1992))所做的工作已经表明可将不表达野生型p53的人肿瘤细胞在离体情况下用p53处理，后转入动物模型会导致对肿瘤生长的抑制。申请人首次证明体内已形成的肿瘤的肿瘤抑制基因治疗能导致肿瘤生长的抑制和动物存活时间的延长。在申请人的实验体系中对肿瘤细胞的送递并不依赖于直接注射到瘤块中，而是将p53重组腺病毒注入瘤周空间并且能在瘤中检测到p53mRNA的表达。重组腺病毒表达的p53是有功能的且与作为对照的不表达p53的腺病毒处理的肿瘤的生长相比，它能够强烈地抑制肿瘤的生长。然而与用缓冲液处理的对照组相比，p53病毒和对照病毒处理的肿瘤组都表现肿瘤抑制。已有实验表明肿瘤坏死因子(TNF)，γ-干抗素，白细胞介素(IL)-2，IL-4或IL-7的局部表达能在裸鼠中导致依赖于T-细胞的瞬时肿瘤抑制(Hoch等(1992))。将单核细胞暴露于腺病毒颗粒也是IFN-α/β的微弱诱导因子(由Gooding和Wold综述(1990))。因此即使用对照腺病毒也可在裸鼠中观察到某种程度的肿瘤抑制就毫不令人吃惊了。这种肿瘤介导的肿瘤抑制在前面所述的在离体条件下用对照病毒处理的Saos-2肿瘤细胞中观察不到。通过持续监测图10中的动物可明显发现p53特异性的体内肿瘤抑制。p53处理的鼠的存活时间显著增加，所处理的5个动物在细胞注入130天以后都仍然存活，而对照腺病毒处理的5个动物则全部死亡。存活的动物仍然有肿瘤生长，这可能表明有起始时未被p53重组腺病毒感染的细胞存在。更高剂量或更频繁的用药安排可以阐明此点。另外启动子关闭(Palmer等(1991))或附加突变也会导致这些细胞对p53重组腺病毒的处理产生抗性。例如，最近描述的WAF1基因能被野生型p53诱导，此基因然后能抑制细胞周期进入S期(El-Deiry等(1993))；Hunter(1993)，WAF1基因中的突变能形成抗p53的肿瘤。
实验III
此例显示了自杀基因在本文所述的基因疗法中的应用及其组织特异性表达。选择肝细胞癌作为作用对象，因为它是最常见的影响人类的人恶性肿瘤之一，据估计每年在全世界引起1,250,000例死亡。在东南亚和非州此癌与乙型和丙型肝炎的感染及对黄曲霉素的暴露相关，发病率很高。目前手术是唯一可能治愈HCC的疗法，虽然只有不超过20％的病人被认为适合作切除(Ravoet C.等1993)，然而肝细胞癌以外的其它肿瘤也同样适合本文所述的降低其增殖的方法。细胞株除HLF外的所有细胞株均来自the American Type Tissue CultureCollection (ATCC)，12301Parklawn Drive，Rockville Maryland，ATCC登记号注于括号中。人胚肾细胞株293(CRL1573)用于产生和扩增本文所述的重组腺病毒，在含10％去毒的补给性小牛血清(Hyclone)的DME培养液中保持该细胞。肝细胞癌细胞株Hep 3B(HB 8064)，Hep G2(HB 8065)及HLF在补加了10％胎牛血清的DME/F12培养液中保持，乳腺癌细胞株MDA-MB468(HTB132)和BT-549(HTB 122)亦然。Chang肝细胞(CCL 13)在补加了10％胎牛血清的MEM培养液中生长。HLF细胞株来自日本Kyushu大学医学院的T.Morsaki和H.Kitsuki博士。重组腺病毒的构建本文中被称为ACNTK和AANTK的无蛋白质IX功能的二个腺病毒表达载体(示于图11)能在肿瘤细胞内指导TK自杀基因的表达。另外一个命名为AANCAT的腺病毒表达载体则用于进一步表明用腺病毒载体在特定细胞类型中表达特异的目的基因的可行性。这些腺病毒构建物如图11和12所示进行组建，是前面所述的用于表达肿瘤抑制基因的腺病毒载体的衍生物。
为表达外源基因，载体插入了利用人细胞大病毒前早期启动子/增强子(CMV)(Boshart M.等，1985)或人类α-胎蛋白(AFP)增强子/启动子(Watanable，K.等，1987；Nakabayashi，H.等，1989)指导TK基因或氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)的转录的表达盒。CMV增强子/启动子能够在广泛的细胞类型中指导强的基因表达，而AFP增强子/启动子则将表达限制在肝细胞癌细胞(HCC)中，其在70-80％的HCC患者中表达AFP。在利用CMV启动子/增强子的构建物中，也插入了2型腺病毒三联前导序列以提高TK转录的翻译(Berkner，K.L和Sharp，1985)。除E1缺失以外，腺病毒载体均在病毒E3区还另外缺失了1.9kbDNA.在E3区被缺失的DNA对病毒繁殖无关紧要，它的缺失相当于提高了1.9kb的重组病毒对外源DNA的插入容量(Graham和Prevec，1991)。
为表明AFP启动子/增强子的特异性，还构建了AANCAT病毒，其中氯霉素乙酰转移酶基因处于AFP增强子/启动子控制之下。在ACNTK病毒构建物中，Ad2的三联前导序列被置于CMV启动子/增强子和TK基因之间。据报道三联前导序列可提高连锁基因的翻译。E1置换削弱了重组病毒的复制能力，将其增殖局限于能反式提供Ad5 E1基因产物的293细胞(Graham等(1977))。
腺病毒载体ACNTK以来自E.coli HB101(来自ATCC#39369)的质粒pMLBKTK作为单式疱疹病毒(HSV-1)胸苷激酶(TK)基因的来源。通过用限制性内切酶Bg1 II和PvuII消化以1.7kb的基因片段从此质粒切下TK基因，并用标准克隆技术(Sambrook等，1989)将之亚克隆列质粒pSP72(Promega)上的相匹配的BamHI，EcoR V限制位点。然后通过用XbaI和Bg1II消化以1.7kb的片段从此载体上分离TK基因，并将之克隆到XbaI，BamHI消化的质粒pACN(Wills等，1994)上。用EcoRI线化20μg pACN质粒，并用CaPO4转染试剂盒(Stratagene，San Diego，California)将之与5μg Cla I消化的ACBGL(Wills等，1994，见上)共转染293细胞。分离病毒斑，用XhoI和BsiWI对分离的DNA进行限制消化分析确认被命名为ACNTK的重组体。通过有限稀释进一步纯化阳性重组体，并用标准方法进行扩增和滴定(Graham和Prevec，1991)。
腺病毒载体AANTK用在两端含有限制位点的引物进行PCR扩增从人类基因组DNA(Clontech)上克隆α-胎蛋白启动子(AFP-P)和增强子(AFP-E)。用来分离210bp AFP-E的引物在5’引物上含有NheI限制位点，在3’引物上含有XbaI，XhoI和KpnI接头。5’引物的序列为5’-CGC GCT AGC TCT GCC CCA AAG AGC T-3。5’引物的序列为5’-CGC GGT ACC CTCGAG TCT AGA TAT TGC CAGTGG TGG AAG-3’。用于分离1763bp AFE片段的引物在5’引物上含有NotI限制位点，在3’引物上含有Xba I位点。5’引物的序列为5’-CGT GCG GCC GCTGGA GGA CTT TGA GGA TGTCTG TC-3’。3’引物序列为5’-CGCTCT AGA GAG ACC AGT TAGAA GTT TTC GCA-3’。为了进行PCR扩增，将DNA在97°变性7分钟，然后以97°，1分钟，53°，1分钟，72°，2分钟，进行五个扩增周期，最后在72°延伸10分钟。用NotI和XbaI消化扩增后的AFE，并插入含有被含NotI，XhoI，XbaI，HindIII，kpnI，BamHI，NcoI，SmaI和Bg1II位点的多酶接头分开的5型腺病毒的1-350和3330-5790序列的质粒载体(pA/ITR/B)的NotI和XbaI位点。用NheI和KpnI消化扩增后的AFP-E，并插入上述含AFP-E的已用XbaI和KpnI消化的构建体中。然后用XbaI和NgoMI进一步消化此新构建物以除去腺病毒的3330-5780序列，然后用含有2型腺病毒的4021-10457位核苷酸的质粒pACN的XbaI，NgoMI限制性片段代替被除去的腺病毒序列，从而构建同时含有α-胎蛋白增强子和启动子的质粒pAAN。然后用EcoRI和XbaI消化此构建物以分离含有Ad5的反向末端重复、AFP-E和AFP-p的2.3kb的片段，然后将此片段与EcoRI，XbaI消化的上述pACNTK的8.55kb的片段相连接以产生pAANTK质粒，其中TK基因在腺病毒的背景中被α-胎蛋白增强子和启动子驱动。然后用EcoRI线化此质粒，并与ClaI消化的上述ALBGL的大片段共转染，并如上述分离和纯化称为AANTK的重组体。
腺病毒载体AANCAT通过XbaI，BamAI消化从pCAT-Basic Vector (Promega Corporation)分离氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因。将1.64kb的片段连接到XbaI，BamHI消化的pAAN(如上述)上以产生pAANCAT。然后用EcoRI线化此质粒，并与ClaI消化的rA/C/β-gal的大片段共转染以产生ANNCAT。报道基因的表达β-半乳糖苷酶的表达将细胞以1×105细胞/孔铺入24孔组织培养板(Costar)上，使之过夜吸附(37℃，7％CO2)，以30的感染复数(MOI)过夜感染ACBGL。24小时后，将细胞用3.7％的甲醛，PBS固定，然后用1mg/ml Xgal试剂(USB)染色。通过估计每一感染复数下正染色细胞的百分比记录数据(+，++，+++)。[+＝1-33％，++＝33-67％，+++＝＞67％]报道基因的表达CAT的表达将2×106个细胞(Hep G2，Hep 3.B，HLF，Chang和MDA-MB468)植入10cm平皿上，一式三份，过夜培育(37℃，7％CO2)。然后每一平皿用ANNCAT以MOI＝30或100进行感染，或不感染，并培育三天。然后胰酶消化细胞，用PBS洗涤，重悬于100μl 0.25M Tris pH7.8中。将样品冻融三次，将上清液移至新试管内，并在60℃保温10分钟。然后将样品4℃离心5分钟，用Bradford分析法(Bio-Rad Protein Assay kit)测量上清液的蛋白浓度。用0.25M Tris，25μl 4mM乙酰辅酶A和1μl14C-氯霉素将样品调至等蛋白浓度，终体积75μl。37℃过夜培育。在每一样品中加入500μl乙酸乙酯并旋转混合，然后室温离心5分钟。然后将上清液移至一新试管，并在真空下离心蒸发乙酸乙酯。然后将反应产物重新溶于25μl乙酸乙酯，并将其点到薄层层析(TLC)的层析板上，然后将此板置于预先平衡的TLC小室(95％氯仿，5％甲醇)中。使溶剂迁移到层析板的上端，然后将板干燥，并对X光片曝光。细胞增殖3H-胸苷的掺入将细胞以5×103个细胞/孔铺入96孔微滴定板(Costar)并过夜培育(37℃，7％CO2)。用在DMEM，15％FBS，1％谷氨酰胺中连续稀释的ACN，ACNTK或AATK病毒以30的感染复数转染细胞过夜，这时将细胞一式三份用ganciclovir(Cytovene)以0.001-100mM(毫摩尔)之间的对数间隔浓度给药。收获前12-18小时在每孔中加入1μCi3H-胸苷(Amersham)，感染72小时后，将细胞收集于玻璃纤维滤膜上，用液体闪烁计数器(Top Count，Packard)计数掺入的3H-胸苷。以未处理的对照细胞繁殖的百分比绘图，并以与对照相比将增殖降低50％的有效剂量(ED50±SD)列表。通过一抑合剂量应答数据的逻辑方程估计ED50值。细胞毒性LDH的释放如上所述将细胞(HLF，人HCC)铺板，用ACN或ACNTK感染并用ganciclovir处理以测量细胞增殖。ganciclovir处理72小时后，离心细胞，弃掉上清液。通过比色法(Promega，Cytotox96TM)测量乳酸脱氢酶的水平。将LDH释放的平均值(+/-S.D)与MOI相对应作图。体内疗法将人肝细胞瘤细胞(Hep 3B)皮下注入10只雌性无胸腺nu/nu小鼠(Simonsen Laboratories，Gilroy，CA)。每一只动物左肋大约注入1×107个细胞。让肿瘤生长72天，然后按肿瘤体积将鼠随机分组。通过瘤间及瘤周注射ACNTK或对照病毒ACN(1×109iu，体积100μl)治疗小鼠，每隔一天治疗一次，共三次。第一次注入腺病毒24小时后，每天用ganciclovir(Cytovene，100mg/kg)对鼠腹腔用药，共十天。每周二次测量鼠的肿瘤大小和体重。用游标卡尺测量肿瘤的三维尺寸，并用公式3/4πr3计算其体积，其中r等于肿瘤平均尺寸的一半。结果用重组腺病毒感染三个HCC细胞株(HLF，Hep 3B和Hep-G2)。用一个人肝细胞株(Chang)和两个乳腺癌细胞株(MDAMB468和BT549)作为对照物。为表明AFP启动子/增强子的特异性，构建了AANCAT病毒。用此病毒感染表达(Hep 3B，HepG2)或不表达(HLE，Chang，MDAMB468)HCC肿瘤标记α-胎蛋白(AFP)的细胞。如图13所示，AANCAT仅在那些能表达AFP的HCC细胞中指导CAT标记基因的表达(图13)。
用3H-胸苷掺入试验估计ACNTK和AANTK对HCC的疗效，从而测量HSV-TK表达和ganciclovir处理对细胞增殖的复合作用。用ACNTK或AANTK或不指导HSV-TK表达的对照病毒ACN(Wills等，1994，见上)感染这些细胞株，然后用ganciclovir以不断上升的浓度处理。将治疗效果作为ganciclovir的不断上升的浓度的函数进行估测，并确定将3H-胸苷的掺入抑制50％的ganciclovir的浓度(ED50)。另外，用指导标记基因β-半乳糖苷酶表达的对照病毒测定每一细胞株的腺病毒介导的基因转导和表达的相对值。图14和下表I中的数据表明，同与ganciclovir结合使用的对照腺病毒ACN相比，ACNTK病毒/ganciclovir复合剂的治疗能够抑制所有被检测的细胞株的细胞增殖。相比之下，AANTK病毒载体只在那些已证明表达α-胎蛋白的HCC细胞株中有效。另外，当细胞以高密度铺板时，AANTK/GCV复合剂更加有效。
表1
用等剂量的ACNTK或ACN对照瘤内或瘤周治疗长有Hep 3B肿瘤的裸鼠(N＝5/组)。第一次重组腺病毒用药24小时后，对所有鼠每天开始用hanciclovir治疗。用卡尺每周二次测量每只鼠肿瘤的大小，图16中绘出了肿瘤的平均大小。在58天时，ACNTK处理的动物的平均肿瘤体积较小，但此差异未能达到统计意义(p＜0.09，unpaired t-test)。这些数据表明ACNTK在体内对肿瘤生长有特异作用。测得的平均体重在组间无明显差异。
虽然参照上述实施方案已叙述了本发明，但应该认识到也可进行不脱离本发明之精神的各种修改。因此本发明仅受限于如下的权利要求。
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权利要求
1.一种重组腺病毒表达载体，包括蛋白质IXDNA的部分或全部缺失及编码一外源蛋白的基因。
2.权利要求1的重组腺病毒表达载体，其中蛋白质IX基因序列的缺失从距病毒5’端约3500bp处延伸到距病毒5’端约4000bp处。
3.权利要求2的重组腺病毒表达载体，进一步含有腺病毒早期区域3和/或早期区域4的非必需DNA序列的缺失。
4.权利要求2的重组腺病毒表达载体，进一步含有称为腺病毒E1a和E1b的DNA序列的缺失。
5.权利要求2的重组腺病毒表达载体，进一步含有早期区域3和/或4及称为腺病毒E1a和E1b的DNA序列的缺失。
6.权利要求4或5的重组腺病毒表达载体，进一步含有位于E1a和E1b3’的多达40个核苷酸的缺失和蛋白质IX缺失及一编码多聚腺苷酸信号的外源DNA分子。
7.权利要求1-6的重组腺病毒表达载体，其中的腺病毒是选自血清型1、2、5或6的C型腺病毒。
8.权利要求1的重组腺病毒表达载体，其中的基因是一长达2.6kb的DNA分子。
9.权利要求6的重组腺病毒表达载体，其中的基因是长达4.5kb的DNA分子。
10.权利要求1的重组腺病毒表达载体，其中的基因编码一有功能的外源蛋白或其生物学活性片段。
11.权利要求10的重组腺病毒表达载体，其中的基因编码一有功能的外源肿瘤抑制蛋白或其生物学活性片段。
12.权利要求1的重组腺病毒表达载体，其中的基因编码一自杀蛋白或其有功能的等价物。
13.含有权利要求1或10的重组腺病毒表达载体的已转化的宿主细胞。
14.权利要求13的已转化的宿主细胞，其中宿主细胞是原核或真核细胞。
15.转化病理性过量增殖哺乳动物细胞的方法，包括用权利要求1的表达载体接触所述的细胞。
16.治疗由于缺乏肿瘤抑制基因或存在发生病理性突变的肿瘤抑制基因而在动物或哺乳动物引起的病理状态的方法，包括在合适条件下，将有效量的含有编码具有肿瘤抑制功能的外源蛋白的基因的权利要求1的载体给予所述的动物或哺乳动物。
17.权利要求16的方法，其中外源蛋白是一有功能的肿瘤抑制蛋白。
18.基因治疗方法，包括将有效量的权利要求1的载体给予患者。
19.在动物中抑制肿瘤增殖的方法，包括在合适条件下将有效量的权利要求1的腺病毒表达载体给予所述的动物。
20.权利要求19的方法，其中的基因编码抗肿瘤物质。
21.权利要求20的方法，其中的抗肿瘤物质是一种肿瘤抑制基因。
22.权利要求20的方法，其中的抗肿瘤物质是一自杀基因或其功能等价物。
23.权利要求21的方法，其中的肿瘤为非小细胞肺癌，小细胞肺癌、肝癌，黑素瘤，成视网膜细胞瘤，乳瘤，结肠直肠癌，白血病，淋巴瘤、脑瘤，颈癌、肉瘤，前列腺瘤，膀胱瘤，网状内皮组织瘤，Wilm氏瘤，显形细胞瘤，成胶质细胞瘤，神经母细胞瘤，卵巢癌，骨癌和肾癌。
24.权利要求19的方法，其中的载体经瘤内注射给药。
25.包含权利要求1、10或12的重组腺病毒表达载体的药物组合物。
26.在患者中降低肿瘤细胞增殖的方法，包括在合适条件下给予有效量的权利要求12的腺病毒表达载体和有效量的胸苷激酶代谢物或其功能等价物。
27.权利要求26的方法，其中的胸苷激酶代谢物为ganciclovir或6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖核苷或其功能等价物。
28.权利要求26的方法，其中的腺病毒表达载体经注入瘤块给药。
29.权利要求26的方法，其中的肿瘤细胞是肝细胞癌。
30.权利要求29的方法，其中的腺病毒表达载体经直接注入患者的肝动脉而给药。
31.降低肿瘤细胞增殖的试剂盒，包括权利要求12的腺病毒表达载体，胸苷激酶代谢物或其功能等价物，药用载体及用所述试剂盒的成份治疗肝细胞癌的说明。
全文摘要
本发明提供了一种重组腺病毒的表达载体，其特征是部分或全部缺失了腺病毒IX蛋白的DNA且带有一编码外源蛋白或其功能性片段或突变体的基因。本发明也包括被转化的宿主细胞、重组蛋白的产生方法及基因疗法。因此，例如本发明的腺病毒载体可包含一外源基因用以表达对细胞周期有调控作用的蛋白质如p53，Rb或分裂激素，或对细胞死亡有诱导作用的蛋白质如条件性自杀基因胸苷酶。(为了有效后者须与胸苷激酶的代谢物一起使用)。
文档编号A61K48/00GK1147837SQ94193919
公开日1997年4月16日 申请日期1994年10月25日 优先权日1993年10月25日
发明者理查德·J·乔治里, 肯·N·威尔斯, 丹尼尔·C·曼尼瓦 申请人:坎吉公司