专利名称：人趋化因子多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及新鉴别的多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的用途以及这些多核苷酸和多肽的生产。更具体地，本发明的多肽是人趋化因子β-4和人趋化因子β-10。有时后文中所称的“Ckβ-4”和“Ckβ-10”都指的是“趋化因子多肽”。本发明还涉及抑制这种多肽的作用。
趋化因子是一类正在被发现的在结构和功能上相关的小的分泌细胞因子超家族。所有的趋化因子在氨基酸水平呈25～75％的同源性且包含空间保守的半胱氨酸残基，本发明的多肽也是如此。“C-X-C分支”的成员(根据在保守部分开始两个半胱氨酸的位置)，也称为嗜中性白细胞激活肽(NAP)/IL-8家族，主要通过其作用于嗜中性白细胞激发促炎性活性(例如，IL-8HAP-2)，而“C-C分支”家族的成员似乎去引诱某些单核细胞。“C-C分支”成员包括PF4，MIPs，MCPs，MCPs，及本发明的趋化因子多肽。
这一趋化因子家族已确定有许多生物学功能。巨噬细胞炎性蛋白1α和1β是特定的淋巴细胞群和单核细胞的趋化物(Schall，T.J.，Cytokine，3165(1991))，而MCP-1已被阐明是特异的单核细胞化学引诱剂(Matsushima，K.，et al.，J.Exp.Med.，691485(1989))。这一趋化因子家族的共同功能是能激发特定细胞如免疫细胞(白细胞)和成纤维细胞的趋化性移动。这些趋化因子也能激活这一家族中的某些细胞。
对趋化因子应答的免疫细胞有许多体内功能，因此通过此类趋化因子对其的调节功能在疾病的治疗中是一个重要领域。
例如，嗜酸性细胞可杀灭寄生虫以减轻寄生虫感染，嗜酸性细胞也能引起呼吸系统的气道慢性炎症。巨噬细胞可抑制脊椎动物肿瘤的形成。另外，嗜碱性粒细胞可释放在变态反应中起重要作用的组胺。由此，促进和抑制这些细胞有广泛的治疗效用。
根据本发明的一方面，提供了新的多肽Ckβ-4和Ckβ-10，以及其片段，类似物和衍生物。本发明的多肽是人源的。
根据本发明的另一方面，提供了编码这些多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。
根据本发明的再一方面，提供了通过重组技术生产这些多肽的方法。
根据本发明的又一方面，提供了为治疗目的而使用此多肽或编码此多肽的多核苷酸的方法，如治疗实体瘤、慢性感染、自身免疫疾病、银屑病、气喘症、过敏症，调节造血功能及促进伤口愈合。
根据本发明的再一方面，提供了抗这些多肽的抗体。
根据本发明的又一方面，提供了这些多肽的拮抗剂/抑制剂，其可用于例如在治疗自身免疫疾病，慢性炎症及感染性疾病，组胺介导的变态反应，不依赖于前列腺素的发热，骨髓功能低下，矽肺，结节病、嗜酸性细胞增多综合征及肺炎时抑制这些多肽的作用。
本发明的这些及其它方面根据本文的教导对本领域技术人员将是显而易见的。
下述附图旨在说明本发明的实施方案，并非限制本发明的范围。
图1示出Ckβ-4的cDNA序列及相应推出的氨基酸序列，前24个氨基酸代表推导的Ckβ-4的前导序列，因此推测的成熟多肽有72个氨基酸。使用了标准的单字母氨基酸缩写。
图2示出Ckβ-10的cDNA序列及相应推出的氨基酸序列，前23个氨基酸代表推测的Ckβ-10的前导序列，因此推测的成熟多肽有75个氨基酸。使用了标准的单字母氨基酸缩写。
图3示出Ckβ-4和原趋素(eotaxin)(底行)成熟多肽间的氨基酸序列同源性。
图4示出Ckβ-10(顶行)与人MCP-3(底行)间氨基酸序列同源性。
根据本发明的一方面，提供了分离的核酸(多核苷酸)，其编码具有图1推导的氨基酸序列的成熟Ckβ-4多肽，或编码由ATCC保藏号75848的克隆(1994年7月29日保藏)的cDNA编码的成熟多肽，以及编码具有图2推导的氨基酸序列的成熟Ckβ-10多肽，或编码由ATCC保藏号75849的克隆(1994年7月29日保藏)的cDNA编码的成熟多肽。
编码Ckβ-4的多核苷酸在衍生自人胆囊的cDNA文库中发现。Ckβ-4与趋化因子家族在结构上相关，含有一编码116个氨基酸残基的蛋白质的开放读框，该蛋白质大约头24个氨基酸残基是推测的前导序列，如此成熟蛋白含92个氨基酸。该蛋白质在全部编码序列上与原趋素具有最高程度的同源性，呈20％同一性及37％相似性。另外在趋化因子中的4个空间保守的半胱氨酸残基在本发明的多肽中也被发现，这一点是很重要的。
编码Ckβ-10的多核苷酸在衍生自9周早期人胚胎组织的cDNA文库中被发现。Ckβ-10与趋化因子家族在结构上相关，含有一编码98个氨基酸残基的蛋白质的开放读框，该蛋白质大约头23个氨基酸残基是推测的前导序列，如此成熟蛋白质含有75个氨基酸。该蛋白质在全部编码序列上与MCP-3具有最高的同源性，呈65％同一性和77％相似性。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，DNA可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以与图1和图2所示的编码序列相同，或与保藏克隆的编码序列相同，或者也可以是不同的编码序列，该编码序列由于遗传密码的丰余性或简并性，与图1和图2的DNA或保藏的cDNAs编码相同的成熟多肽。
编码图1和图2的成熟多肽或编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和另外的编码序列如前导序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(和任选的另外的编码序列)和非编码序列如内含子或成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包含如下的多核苷酸，即仅包括多肽编码序列的多核苷酸，以及包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码具有图1和图2的推导的氨基酸序列的多肽或编码由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这些多核苷酸的变异体可以是天然发生的该多核苷酸的等位基因变异体，或是该多核苷酸的非天然发生的变异体。
因此，本发明包括编码图1和图2所示的相同成熟多肽或由保藏克隆的cDNA编码的相同成熟多肽的多核苷酸，以及这些多核苷酸的变异体，所述变异体编码图1和图2的多肽或由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物，这些核苷酸变异体包括缺失变异体、取代变异体和添加或插入变异体。
如上所述，多核苷酸可以具有为图1和图2所示的编码序列的天然发生的等位基因变异体的编码序列，或保藏克隆的编码序列的天然发生的等位基因变异体的编码序列。如本领域所公知的，等位基因变异体是多核苷酸序列的另一种形式，其可以取代、缺失或添加一个或多个核苷酸，但基本上不改变所编码的多肽的功能。
本发明还包括多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以在同一读框内与有助于多肽从宿主细胞表达和分泌的多核苷酸融合，例如前导序列，其是用于控制多肽从细胞转运的分泌序列。具有前导序列的多肽是一种前蛋白(preprotein)，前导序列可以由宿主细胞切下以形成多肽的成熟形式。多核苷酸还可编码一种蛋白原(proprotein)，其是成熟蛋白加上另外的5’氨基酸残基。具有序列原(prosequence)的成熟蛋白为蛋白原并是蛋白质的非活性形式，一旦序列原被切掉，则保留活性成熟蛋白。
因此，例如，本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白，或编码具有序列原的蛋白或具有序列原和前序列(前导序列)的蛋白。
本发明的多核苷酸还可以具有在读框内与标记序列融合的编码序列，其可用于纯化本发明的多肽。标记序列可以是，例如，由pQE-9载体提供的六组氨酸标记物用于在细菌宿主中纯化与该标记物融合的成熟多肽，或者，例如，当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是血凝素标记物(HA)。HA标记物相应于由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et al.，Ce ll，37767(1984))。
本发明还涉及可与上述序列杂交的多核苷酸，条件是序列间具有至少50％、优选70％的同一性。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所用的，术语“严格条件”是指杂交仅发生在序列间具有至少95％、优选97％同一性的情况下。在一优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码基本上保持了由图1和图2的cDNA或保藏的cDNA编码的成熟多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。
本文所指的保藏物将根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定期限保藏。这些保藏仅为本领域技术人员提供方便，而不是对根据35 U.S.C112索取保藏物的许可。保藏物中所含的多核苷酸的序列以及该序列编码的多肽的氨基酸序列引入本文作参考，并且在与本文的序列描述有抵触时，其是参照。制造、使用或销售保藏物需经许可，而本文不授予这种许可。
本发明还涉及具有图1和图2的推导的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的趋化因子多肽，以及该多肽的片段、类似物和衍生物。
当指图1和图2的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持这些多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括蛋白原，其可通过裂解蛋白原部分而激活以生产有活性的成熟多肽。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。
图1和图2的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中的一或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基取代(优选由保守的氨基酸残基取代)，并且这种取代的氨基酸残基可以由遗传密码编码，也可不是由遗传密码编码，或者(ii)其中的一或多个氨基酸残基包括一取代基，或者(iii)其中的成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物例如为增加多肽的半寿期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加的氨基酸与成熟多肽融合，例如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。这种片段、衍生物和类似物被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。
本发明的多肽和多核苷酸优选地以分离的形式提供，并优选纯化至均一性。
术语“分离的”是指从其原始环境(例如，若其是天然存在的则是天然环境)中脱离的物质。例如，存在于活体动物中的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但从一些或所有共存物质中分离的相同的多核苷酸或DNA或多肽则是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是某种组合物的一部分，并且如果这种载体或组合物不是其天然环境的一部分，则其还是分离的。
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体遗传工程化的宿主细胞，以及用重组技术生产本发明的多肽。
宿主细胞用本发明的载体遗传工程化(转导或转化或转染)，所述的载体可以是克隆载体或表达载体。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。遗传工程化的宿主细胞可以在改良的传统营养培养基中培养，改良培养基是为了激活启动子，选择转化子或扩增Ckβ-4或Ckβ-10基因。培养条件如温度、pH等是先前用于选择用来表达的宿主细胞的条件，其对本领域普通技术人员是显而易见的。
本发明的多核苷酸可通过重组技术用于生产多肽，因此，例如，该多核苷酸可以包括在任一种表达载体中特别是载体或质粒中以表达多肽。这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；衍生于质粒和噬菌体DNA的结合体的载体；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和拟狂犬病毒。然而，也可使用任何其它载体，只要其在宿主中可复制和生存。
如上所述，可通过多种程序将合适的DNA序列插入载体，通常，通过本领域公知的程序将DNA序列插入合适的限制性内切酶位点。这些和其它程序属于本领域熟练技术人员的范畴。
表达载体中的DNA序列与合适的表达调控序列(启动子)连接以指导mRNA合成，作为这些启动子的代表性例子，可提及的有LTR或SV40启动子，E.coli lac或trp启动子，λ噬菌体PL启动子和其它公知用于控制基因在原核细胞或真核细胞或者病毒中表达的启动子。表达载体还含有一用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可包括用于扩增表达的合适的序列。
另外，表达载体优选含有一个用于为选择转化的宿主细胞提供表型标记的基因，如对于真核细胞培养为二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，而在E.coli中例如为四环素或氨苄青霉素抗性。
可采用含有如上所述合适DNA序列以及合适启动子或调控序列的载体转化合适的宿主以使宿主表达蛋白质。
作为合适的宿主的例子，可以提及的有细菌细胞，如E.coli、链霉菌、鼠伤寒沙门氏杆菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇和Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物细胞等。选择合适的宿主细胞被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。
更具体地，本发明还包括重组构建体，所述构建体包含一或多种上述序列。该构建体包括载体，如质粒或病毒载体，在该载体中以正向或反向插入本发明的序列。在这一实施方案的一个优选方面，该构建体还包括调节序列，包括例如，与所述序列连接的启动子。本领域熟练技术人员已知大量的合适的载体和启动子，它们是可商购的。以下举出载体的例子，细菌的载体pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，psiX174，pBluescript SK，pbsks，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核载体pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它质粒或载体，只要其可在宿主中复制和生存即可。
启动子区可以选自使用CAT(氯霉素转移酶)的载体或其它带有选择性标记的载体的任何所需基因，两个合适的载体是pKK232-8和pCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，lambda PR，PL和trp；真核启动子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反转录病毒的LTR，和鼠金属硫蛋白-I。选择合适的载体和启动子属于本领域普通技术人员的水平范畴。
在另一实施方案中，本发明涉及含有上述构建物的宿主细胞，所述的宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))将构建物导入宿主细胞。
可以用传统的方式使用宿主细胞中的构建物以生产由重组序列编码的基因产物。或者，也可通过常规的肽合成仪合成生产本发明的多肽。
在合适的启动子的控制下，可以在哺乳细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白质，也可采用无细胞翻译系统使用由本发明的DNA构建物衍生的RNA生产这种蛋白质。原核和真核宿主使用的合适的克隆和表达载体见Sambrook，etal，Molecular ClonningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，该书引入本文作参考。
高等真核生物对编码本发明的多肽的DNA的转录可通过在载体中插入一增强子序列而得以增加，增强子是约10-300bp的顺式作用的DNA因子，其作用于启动子以增加其转录。其例子包括位于复制起点晚期侧(100-270bp处)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子，以及腺病毒增强子。
通常，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞的转化的选择标记，如E.coli的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母的TRP1基因，以及衍生于高表达基因的启动子以指导下游结构序列的转录。这种启动子可以衍生于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或热休克蛋白的操纵子。在合适的阶段，杂合结构序列装配上翻译起始和终止序列，以及优选地，装配一能指导翻译的蛋白质进入周质空间或胞外培养基的前导序列。任选地，杂合序列可以编码一包括N-末端鉴别肽的融合蛋白质，以赋予所需的特征，如表达的重组产物的稳定性和纯化简便性。
用于细菌的表达载体的构建是通过将编码所需蛋白质的结构DNA序列与合适的翻译起始和终止信号一起插入带有功能启动子的可操纵阅读相而完成。载体包括一或多种表型选择标记及一个复制起点以确证载体保持在宿主中，并且，如果需要，可以在宿主中扩增。合适的用于转化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各菌种，当然，也可采用其它菌。
作为代表性而非限制性的例子，有用的细菌表达载体可以包括衍生于包含熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传因子的商购质粒的选择标记和细菌复制起点，这些商购质粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacma Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分与合适的启动子及待表达的结构序列结合。
转化合适的宿主菌株并将宿主菌株培养至合适的细胞密度后，用合适的方法(如温度改变或化学诱导)诱导选定的启动子，并继续培养细胞一段时间。
典型地，细胞由离心收集，用物理或化学方法破碎，保留得到的粗提物以进一步纯化。
用于表达蛋白质的微生物细胞可用任何常规方法破碎，如冻-融循环、超声处理、机械破碎，或使用细胞裂解试剂，这些方法是本领域熟练技术人员熟知的。
也可使用各种哺乳细胞培养系统表达重组蛋白，哺乳细胞表达系统的例子包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系，以及其它能表达相容载体的细胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK细胞系。哺乳类表达载体包括复制起点，合适的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点，多腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5’旁侧非转录序列。可使用源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接体和多腺苷酸化位点以提供所需的非转录遗传因子。
可通过硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阳离子或阴离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析羟基磷灰石层析和凝集素层析等方法从重组细胞培养物中回收并纯化趋化因子多肽。如果需要，可使用蛋白质重折叠步骤以完成成熟蛋白的构型，最后，可采用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化步骤。
本发明的趋化因子多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成过程的产物，或者通过重组技术从原核或真核宿主(例如，通过培养细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳类细胞)而生产。根据在重组生产过程中采用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化或是非糖基化的。本发明的多肽还可以包括一起始的甲硫氨酸残基。
趋化因子多肽在癌症化疗及治疗白血病期间可被用于抑制骨髓干细胞群形成以作为辅助的保护性治疗。
趋化因子多肽也可用于抑制表皮角化细胞增殖以治疗以角化细胞增殖为特征的银屑病。
趋化因子多肽也可通过激发宿主防御细胞如细胞毒性T细胞和巨噬细胞的侵入及活化用于治疗实体肿瘤。它们也可被用于提高患者防御机能抵御有抵抗力的慢性感染，如通过对微生物杀伤性白细胞的引诱和激活来抵御分支杆菌感染。
趋化因子多肽还可通过对IL2生物合成的抑制来抑制T细胞增殖以治疗自身免疫疾病和白血病。
Ckβ-4和Ckβ-10也可用于伤口愈合，都是通过清除碎屑及结缔组织促炎细胞的募集，也通过其对过量的TGFβ-4介导的纤维化的控制来完成。以这种相同方式，Ckβ-4和Ckβ-10可被用于治疗其它纤维性疾病，包括肝硬化，骨关节炎和肺纤维化。趋化因子多肽也可提高嗜酸性细胞数量，这些细胞具有独特的杀死侵入组织中寄生虫的幼虫的功能，如在血吸虫病，毛线虫病和蛆虫病中。趋化因子多肽也可通过调节各种原始造血细胞的活化和分化来调节造血机能。
趋化因子还可被用作血管发生抑制剂，因而它们具有抗肿瘤功能。
本发明的趋化因子也可用于鉴别具有相似生物活性的其它分子。如此筛选的一个例子是用已知的DNA序列合成寡核苷酸探针来分离基因的编码区。具有与本发明的基因互补的序列的标记的寡核苷酸用来筛选人cDNA，基因组DNA或mRNA文库以确定与探针杂交的文库成员。
本发明还涉及一种诊断分析方法，以定量和定性检测多肽或为该多肽提供信息的mRNA的改变的水平。本领域人员熟知这类分析方法，包括ELISA分析、放射免疫分析及RT-PCR。分析中检测出的多肽及其mRNA的水平可用于阐明多肽在各种疾病中的显著性及用于诊断其中多肽水平改变明显的疾病。
本发明提供了一种鉴别多肽的受体的方法，编码受体的基因经表达克隆被鉴别。从对多肽有应答的细胞中制备多腺苷酸化RNA，将产自该RNA的cDNA文库分成各集合体用于转染对多肽无应答的COS细胞或其它细胞。将在玻片上生长的转染细胞暴露于标记的多肽。可用多种方法包括碘化或引入位点特异性蛋白激酶的识别位点将多肽标记。在固定和温育后，对玻片进行放射自显影分析。鉴别出阳性集合体并使用重复的亚集合体和重筛选方法制备亚集合体，最后产生编码推测的受体的单一克隆。作为受体鉴别的另一种方法，可将标记的多肽与细胞膜或表达受体分子的提取制备物光亲和性连接。经PAGE分析将交联材料分解并在X线下曝光。切下含多肽受体的标记复合物，分解成肽片段并进行蛋白质微量测序。由微量测序得到的氨基酸序列用于设计生成一套寡核苷酸探针以筛选cDNA文库从而鉴别编码推测的受体的基因。
本发明提供了一种用以鉴别那些能增强(刺激剂)或阻断(拮抗剂)多肽与其鉴定的受体的相互作用的药物的筛选药物的方法。刺激剂是一种能提高多肽固有生物功能的化合物，而拮抗剂则消除这种功能。例如将表达多肽受体的哺乳细胞或其膜制备物在药物的存在下与如放射性标记的趋化因子多肽进行温育，则可检测药物促进或阻断此相互作用的能力。
潜在的拮抗剂包括抗体，或在某些情况下，与多肽结合的寡核苷酸。潜在的拮抗剂的另一例子是多肽的显性失活突变体。显性失活突变体是与野生型多肽的受体结合但不能保持其生物活性的多肽。
检测多肽显性失活突变体的分析包括一种体外趋化性分析，其中配有不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜的多孔趋化室用来检测在潜在的拮抗剂/抑制剂或刺激剂分子的存在或不存在下，多肽对白细胞的化学引诱能力。
用反义技术制备的反义构建物也是可能的拮抗剂。反义技术通过三螺旋形成或反义DNA或RNA可用于控制基因表达，这两种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，用编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码区设计长度为10-40bp的反义RNA寡核苷酸。设计一DNA寡核苷酸以互补于转录涉及的基因的某区域(三螺旋-见Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al，Science，241456(1988)；andDervan et al，Seience，2511360(1991)，从而防止多肽的转录和生产。反义RNA寡核苷酸与mRNA体内杂交并阻断mRNA分子翻译成多肽。(反义-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。上述的寡核苷酸也可输送至细胞，从而反义RNA或DNA可以在体内表达以抑制多肽的生产。
另一种潜在的拮抗剂是多肽的肽衍生物，所述的多肽是失去生物学功能但仍能识别并与多肽受体结合从而有效地阻断受体的多肽的天然或合成的修饰的类似物，肽衍生物的例子包括但不限于小肽或类肽分子。
拮抗剂可用于在自身免疫疾病、慢性炎症及感染性疾病当中抑制巨噬细胞及其前体、嗜中性白细胞、嗜碱性粒细胞、B淋巴细胞及一些T细胞亚型如活化的CD8细胞毒性T细胞及天然杀伤细胞的趋化性和活化作用。自身免疫疾病的例子包括风湿性关节炎、多发性硬化症及胰岛素依赖型糖尿病。一些感染性疾病包括阻止单核噬细胞的增生及激活的矽肺、结节病、原发性肺纤维化，阻止嗜酸细胞的生产和迁移的原发性嗜酸细胞增多综合症，阻止巨噬细胞的迁移及本发明的多肽的产物的生产的内毒性休克。拮抗剂也可通过阻止在动脉壁的单核细胞的侵润用于治疗动脉硬化。
拮抗剂也可通过抑制趋化因子诱导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱粒并释放组胺用以治疗组胺型变态反应。
拮抗剂也可通过阻止单核细胞对伤口区域侵润治疗炎症。由于急性和慢性肺部炎症与肺内单核吞噬细胞的隔绝有关，因而拮抗剂也可用于调节正常肺吞噬细胞数量。
拮抗剂也可通过阻止单核细胞对患者关节内滑液的侵润用以治疗风湿性关节炎。单核细胞的侵入及激活是退化性和炎症性关节病的一个重要致病因素。
拮抗剂也可用于干扰主要是IL-1和TNF引起的损害性级联作用，其能阻止其它炎性细胞因子的生物合成。由此拮抗剂可用于预防炎症。拮抗剂也可用于抑制趋化因子诱导的前列腺素不依赖型发热。
拮抗剂也可用于治疗骨髓机能低下疾病，如再生障碍性贫血和骨髓发育不良综合症。
拮抗剂也可通过阻止嗜酸性粒细胞在肺内的积聚用于治疗气喘及变态反应。拮抗剂还可与如下文所述的药物学可接受的载体形成组合物而应用。
本发明的趋化因子多肽及刺激剂或拮抗剂可以与合适的药物学载体联合应用。如此的组合物包括治疗有效量的多肽和药物学可接受的载体或赋形剂。这种载体包括但不限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其结合物。配制品应适合给药的方式。
本发明还提供了一种药物包装盒或试剂盒，其包括一或多个填充有一或多种本发明的药物组合物成分的容器。与这种容器在一起的还有由控制药品或生物产品的生产、使用或销售的政府机构出具的通知，该通知反应了该机构许可其为人体用而生产、使用或销售。另外，本发明的多肽可以与其它药物化合物结合应用。
此药物组合物可以诸如局部，静脉，腹膜内，肌内，肿瘤内，皮下，鼻内，或皮内途径的传统方式给药。多肽的给药量是足以治疗和/或预防特定的病症。一般来说，多肽的给药量最低为大约每天每千克体重10微克，大多数情况下给药量不超过每天每千克体重约8毫克。大多数情况下，考虑到给药途径、症状等，药剂量为每天每千克体重约10微克至1毫克。
根据本发明，趋化因子多肽和刺激剂或拮抗剂也可以用于体内表达多肽，即经常被称为“基因治疗”的方法。
因此，例如，可用编码来自体内的多肽的多核苷酸(DNA或RNA)对患者的细胞进行工程化，随后将工程化的细胞再提供给需用多肽治疗的患者，这些方法是本领域公知的。例如，可用含编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒利用本领域熟知的程序对细胞进行工程化。
类似地，例如也可通过本领域公知的程序在体内对细胞进行工程化以在体内表达多肽。如本领域所公知的，可将生产含编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒的生产者细胞给予患者以在体内进行细胞的工程化并在体内表达多肽。通过这种方法给予本发明的多肽的这些和其它方法对于本领域熟练技术人员根据本发明的教导是显而易见的。例如，用于工程化细胞的表达载体可以不是反转录病毒，而是例如腺病毒，其在与合适的输送载体结合后可用于在体内工程化细胞。
本发明的序列还可用于染色体鉴定，该序列特异地定向于个别的人染色体的特定位置并可与之杂交。另外，目前需要鉴定染色体上的特定位点，而现在只有很少几种基于实际序列资料(重复多态性)的染色体标记试剂可以商购用于标记染色体位置。本发明的将DNA定位于染色体是将这些序列与相关疾病的基因联系起来的非常重要的第一步。
简而言之，可通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)而将序列定位在染色体上。使用cDNA的计算机分析快速选择长度不超过基因组DNA的一个外显子并因而不会使扩增复杂化的引物，随后使用这些引物对含有个别的人染色体的体细胞杂合子进行PCR筛选。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合子能得到扩增片段。
体细胞杂合子的PCR作图是将特定DNA定位于特定染色体的一个快速程序。采用本发明相同的寡核苷酸引物，可以类似的方式将来自特定染色体的一组片段或大基因组克隆的集合体进行亚定位。其它的可类似用于染色体作图的作图策略包括原位杂交、用标记的流选的染色体进行的预筛选，以及通过杂交预选以构建染色体-特异cDNA文库。
cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来提供精确的一步法染色体定位。这一技术可使用短至500或600个碱基cDNA；然而，大于2000bp的克隆更易于与独特的染色体位置结合以具有足够的信号强度便于检测。FISH需要使用衍生EST的克隆，越长越好。例如，2000bp是好的，更好为4000bp，而超过4000则可能不是获得好结果所必须的，因其时间百分比不合理。此技术的综述见Verma et al.，HumanChromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精确定位于染色体某一位置，则可比较该序列在染色体上的物理位置与遗传图谱资料的关系，这种资料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance inMan中发现(可在线从Johns Hopkins University Welch Medical Library获得)。随后可通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)鉴别基因与已定位于相同染色体区的疾病之间的关系。
接着，必须确定感染个体和未感染个体之间的cDNA或基因组序列的差异，如果在一些或所有感染个体中观察到某一突变而未在任何正常个体中观察到这种突变，则该突变可能是该疾病的致病原。
应用目前的物理作图和遗传作图技术的分辨率，一种精确定位于与疾病有关的染色体区的cDNA可以是50-500个潜在的致病基因中的一个(这假定作图分辨率为1兆碱基，并且每20kb为一个基因)。
多肽、其片段或其它衍生物、或其类似物、或表达其的细胞可用作免疫原生产抗体，这些抗体可以是例如多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还包括嵌合抗体、单链抗体和人源化抗体，以及Fab片段，或者Fab表达文库的产物。可使用现有技术中公知的各种程序生产这些抗体和片段。
抗对应于本发明的序列的多肽的抗体可以通过将多肽直接注射给动物或将多肽给予动物、优选非人而获得，如此获得的抗体随后与多肽本身结合。以这种方式，仅编码多肽的一个片段的序列也可用于生产与完整天然多肽结合的抗体，这种抗体随后可用于从表达该多肽的组织中分离该多肽。
为制备单克隆抗体，可使用任何提供由连续细胞系培养物生产的抗体的技术，例如杂交瘤技术(Kohler and Milstein，1975，Nature，256495-497)，三瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(kozbor et al.，1983，Immunology Today 472)，以及生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
用于生产单链抗体的技术(USP4.946，778)可以用来生产本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。
以下将参照实施例进一步描述本发明，但是应理解的是，本发明不受这些实施例的限制。除非另有说明，所有的份或量均为重量份或重量。
为促进对下述实施例的理解，以下将描述常用的方法和/或术语。
“质粒”的命名是将小写字母p置于前面和/或后跟大写字母和/或数字。本文的起始质粒或者是商购得到的，或者是公众可以不受限制地得到的，或者可以根据公布的程序由可得到的质粒构建的。另外，与所述的这些等效的质粒是本领域公知的，并对本领域普通技术人员是显而易见的。
DNA的“消化”是指用仅作用于DNA的特定序列的限制性酶对DNA的催化裂解。本文所用的各种限制性酶是可商购的，其反应条件、辅因子和其它要求对于本领域普通技术人员是公知的。为分析目的，典型地，1μg质粒或DNA片段使用约2单位的酶，反应体积为20μl缓冲液；为分离DNA片段用于构建质粒的目的，典型地，在较大体积中用20-250单位酶消化5-50μg DNA。对特定限制性酶的合适的缓冲液和底物由厂商提供。通常使用37℃1小时的温育时间，但可根据供应商的指示而变化。消化后，将反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所需片段。
裂解片段的大小分离是根据Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，84057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行。
“寡核苷酸”是指可化学合成的单链聚脱氧核苷酸或两个互补的聚脱氧核苷酸链。这种合成的寡核苷酸没有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸则不能与另一寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸将与没有经过脱磷酸化的片段连接。
“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，etal.，Id.，p.146)。除非另有说明，连接可以采用公知的缓冲液，在每0.5μg约等摩尔的待连接DNA片段使用10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)的条件下进行。
除非另有说明，使用Graham，F.and Van der Eb.A.，Virology，52456-457(1973)的方法进行转化。实施例1 Ckβ-4的细菌表达和纯化用对应于加工的Ckβ-4蛋白(减去推测的信号肽序列)的5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码Ckβ-4的DNA序列，ATCC#75848。将对应于Ckβ-4的附加的核苷酸分别加入到5’和3’序列。5’寡核苷酸引物序列为5’-CCCGCATGCAAGCAGCAAGCAACTTT-3’，其含有一SphI限制性酶位点(黑体字处)，后接起自编码成熟蛋白序列的第二个核苷酸的17个Ckβ-4编码序列的核苷酸(下划线处)。ATG密码子包含在SphI位点内，ATG后的下一个密码子，其第一个碱基来自SphI位点，剩下两个碱基对应于推定的成熟蛋白的第一个密码子的第二个和第三个碱基。结果，此密码子的第一个碱基与原序列相比由G变成C，结果导致在重组蛋白中E由Q取代。3’序列为5’-AAAGGATCCCATGTTCTTGACTTTTTTACT-3’，其含有互补于BamHI位点的序列(黑体字处的)，后接21个在终止密码子前的基因特异性序列的核苷酸。限制性酶位点对应于细菌表达载体pQE-70(Qiagen，Inc.9259Eton Avenue，Chatsworth，OA，91311)上的限制性酶位点。pQE-70编码抗生素抗性(Ampr’)，一个细菌复制点(ori)，一个IPTG可调控启动子操纵子(P/O)，一个核糖体结合位点(RBS)，一个6-组氨酸标记(6-His)及限制性酶位点。用SphI和BamHI消化pQE-70。将扩增序列连到pQE-70中并插入有编码6-组氨酸标记的序列及RBS的框架中。图8示出此排列图解。然后通过Sambrook，J.et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)所述步骤，用连接混合物转化E.coli菌株(来自Qiagen，商标M15/rep4)。M15/rep4含有多拷贝的表达1acI阻遏物并赋予卡那霉素抗性(Kanr’)的质粒pREP4。在LB平板上鉴别转化子并筛选氨苄青霉素/卡那霉素抗性克隆。分离质粒DNA并经限制性分析确定。在补加Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的液体LB培养基中将含有所需构建物的克隆培养过夜(O/N)，O/N培养物以1∶100-1∶250的比例接种到大体积培养基中。培养细胞至光密度600(0.D.600)为0.4-0.6。随后加入IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导激活P/O，使基因表达水平提高。再培养细胞3-4小时，随后离心收集细胞。将细胞沉淀溶解到离液剂6M盐酸胍中，澄清后，在使得与含6-His标记的蛋白质紧密结合的条件下，通过镍-鳌合柱层析(Hochuli，E.et.，J.Chromatography 411177-184(1984)，从溶液中纯化溶解的Ckβ-4。在6M盐酸胍pH5.0中从柱中清脱Ckβ-4(纯度＞98％)。蛋白质由GnHCl中复性出来可以各种方案进行(Jaenicke，R.and Rudolph，R.，Protein Strueture-APractical Approach，IRL Press，New York(1990)。首先使用透析步骤以除去GnHCl。或者从镍-鳌合柱中分离出的纯化的蛋白质结合到第二个柱中，在第二个柱中具有下降的线性GnHCl梯度。在结合到柱中时使蛋白质复性，随后用含250mM咪唑，150mM氯化钠，25mM Tris-HCl pH7.5及10％甘油的缓冲液洗脱。最后，将溶解的蛋白质对含5mM碳酸氢铵的贮存缓冲液透析。实施例2 Ckβ-10的细菌表达和纯化用对应于加工的Ckβ-10蛋白(减去信号肽序列)的5’和3’序列和Ckβ-10基因3’的载体序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码Ckβ-10的DNA序列，ATCC#75849。将对应于Ckβ-10的附加的核苷酸分别加入到5’和3’序列。5’寡核苷酸引物序列为5’-CCCGCATGCAGCCAGATGCACTCAACG-3’，其含有一SphI限制性酶位点(黑体字处)，后接起自编码成熟蛋白序列的19个Ckβ-10编码序列的核苷酸(下划线处)。ATG密码子包含在SphI位点内。3’序列为5’-AAAGGATCCAGTCTTCAGGGTGTGAGCT-3’，其含有互补于BamHI位点的序列(黑体字处的)，后接19个在终止密码子前的基因特异性序列的核苷酸。限制性酶位点对应于细菌表达载体pQE-70(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，Chatsworth，OA，91311)上的限制性酶位点。pQE-70编码抗生素抗性(Ampr’)，一个细菌复制点(ori)，一个IPTG可调控启动子操纵子(P/O)，一个核糖体结合位点(RBS)，一个6-组氨酸标记(6-His)及限制性酶位点。用SphI和BamHI消化pQE-70。将扩增序列连到pQE-70中并插入有编码6-组氨酸标记的序列及RBS的框架中。图10示出此排列图解。然后通过Sambrook，J.et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)所述步骤，用连接混合物转化E.coli菌株(来自Qiagen，商标M15/rep4)。M15/rep4含有多拷贝的表达lacI阻遏物并赋予卡那霉素抗性(Kanr’)的质粒pREP4。在LB平板上鉴别转化子并筛选氨苄青霉素/卡那霉素抗性克隆。分离质粒DNA并经限制性分析确定。在补加Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的液体LB培养基中将含有所需构建物的克隆培养过夜(O/N)，O/N培养物以1∶100-1∶250的比例接种到大体积培养基中。培养细胞至光密度600(0.D.600)为0.4-0.6。随后加入IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导激活P/O，使基因表达水平提高。再培养细胞3-4小时，随后离心收集细胞。将细胞沉淀溶解到离液剂6M盐酸胍中，澄清后，在使得与含6-His标记的蛋白质紧密结合的条件下，通过镍-鳌合柱层析(Hochuli，E.et.，J.Chromatography 411177-184(1984)，从溶液中纯化溶解的Ckβ-10。在6M盐酸胍pH5.0中从柱中清脱Ckβ-10(纯度＞98％)。蛋白质由GnHCl中复性出来可以各种方案进行(Jaenicke，R.and Rudolph，R.，Protein Strueture-A Practical Approach，IRLPress，New York(1990)。首先使用透析步骤以除去GnHCl。或者从镍-鳌合柱中分离出的纯化的蛋白质结合到第二个柱中，在第二个柱中具有下降的线性GnHCl梯度。在结合到柱中时使蛋白质复性，随后用含250mM咪唑，150mM氯化钠，25mM Tris-HClpH7.5及10％甘油的缓冲液洗脱。最后，将溶解的蛋白质对含5mM碳酸氢铵的贮存缓冲液透析。然后在SDS-PAGE凝胶上分析蛋白质。实施例3重组Ckβ-4在COS细胞中的表达衍生自载体pcDNAI/Amp(Initrogen)的表达质粒Ckβ-4HA含有1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)E.coli复制起点，4)CMV启动子，后接多接头区、SV40内含子和多腺苷酸化位点。编码完整Ckβ-4前体和在框内融合到其3’末端的HA标记的DNA片段被克隆至载体的多接头区，从而重组蛋白质直接在CMV启动子下表达。HA标记对应于衍生自前述流感血凝集素蛋白的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell 37，767)。HA标记与靶蛋白质融合使得用识别HA表位的抗体很容易检测重组蛋白质。
下面阐述质粒构建策略使用两种引物在原始的EST由PCR构建编码Ckβ-4的DNA序列，ATTC.#____，5’引物序列为5’-GGAAAGCTTATGTGCTGTACCAAGAGTTT-3’，其含有一Hind III位点，后接20个起自起始密码子的Ckβ-4编码序列的核苷酸；3’序列为5’CGCTCTAGATTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAACATGGTTCCTTGACTTTTT-3’，其含有互补于XbaI位点的序列，转译终止密码子、HA标记及Ckβ-4编码序列的后20个核苷酸(不包括终止密码子)。因此PCR产物含有一HindIII位点，Ckβ-4编码序列，后接框内融合的HA标记，HA标记后的转译终止密码子及XbaI位点。将PCR扩增的DNA片段和载体，pcDNAI/Amp，用Hind III和XabI限制性酶消化并连接。用连接混合物转化E.coli菌体SURE(得自Strategene Cloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037)，在氨苄青霉素培养平板上培养转化的培养物并筛选抗性克隆。从转化子中分离出质粒DNA并用限制性分析检测正确的片段的存在。为表达重组Ckβ-4，将COS细胞通过DEAE-DEXTRAN方法用表达载体转染(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Manictis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1987)。用放射标记和免疫沉淀法检测Ckβ-4HA蛋白的表达(E.Harlw，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，(1988)。转染二天后，将细胞用35S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养物培养基，用去污剂(RIPA缓冲液(150mM氯化钠，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5)。(Wilson，I.et al.，Id.37767(1984))将细胞裂解，将细胞裂解物和培养基用HA特异性单克隆抗体沉淀。将沉淀的蛋白质用SDS-PAGE分析。实施例4 重组Ckβ-10在COS细胞中的表达衍生自载体pcDNAI/Amp(Initrogen)的表达质粒Ckβ-10 HA含有1)SV40复制起点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)E.coli复制起点，4)CMV启动子，后接多接头区、SV40内含子和多腺苷酸化位点。编码完整Ckβ-10前体和在框内融合到其3’末端的HA标记的DNA片段被克隆至载体的多接头区，从而重组蛋白质直接在CMV启动子下表达。HA标记对应于衍生自前述流感血凝集素蛋白的表位(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell 37，767)。HA标记与靶蛋白质融合使得用识别HA表位的抗体很容易检测重组蛋白质。
下面阐述质粒构建策略使用两种引物在原始的EST由PCR构建编码Ckβ-10的DNA序列，ATTC.#75849，5’引物序列为5’-GGAAAGCTTATGAAAGTTTCTGCAGTGC-3’，其含有一Hind III位点，后接19个起自起始密码子的Ckβ-10编码序列的核苷酸；3’序列为5’CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAAGTCTTCAGGGTGTGAGCT-3’，其含有互补于XbaI位点的序列，转译终止密码子、HA标记及Ckβ-10编码序列的后19个核苷酸(不包括终止密码子)。因此PCR产物含有一HindIII位点，Ckβ-10编码序列，后接框内融合的HA标记，HA标记后的转译终止密码子及XbaI位点。将PCR扩增的DNA片段和载体，pcDNAI/Amp，用Hind III和BamHI限制性酶消化并连接。用连接混合物转化E.coli菌体SURE(得自Strategene CloningSystems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037)，在氨苄青霉素培养平板上培养转化的培养物并筛选抗性克隆。从转化子中分离出质粒DNA并用限制性分析检测正确的片段的存在。为表达重组Ckβ-10，将COS细胞通过DEAE-DEXTRAN方法用表达载体转染(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Manictis，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Laboratory Press，(1987)。用放射标记和免疫沉淀法检测Ckβ-10HA蛋白的表达(E.Harlw，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，(1988)。转染二天后，将细胞用35S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养物培养基，用去污剂(RIPA缓冲液(150mM氯化钠，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mMTris，pH7.5)。(Wilson，I.et al.，Id.37767(1984))将细胞裂解，将细胞裂解物和培养基用HA特异性单克隆抗体沉淀。将沉淀的蛋白质用SDS-PAGE分析。实施例5用杆状病毒表达系统克隆并表达Ckβ-10编码全长Ckβ-10蛋白质的DNA序列，ATCC#75849，是使用对应于基因的5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增的5’引物序列为5’-CGCGGGATCCTTAACCTTCAACATGAAA，其含有一BamHI限制性酶位点(黑体字处)，后接12个代表在真核细胞中转译起始的有效信号的核苷酸(J.Mol.Biol.1987，196，947-950，Kozak，M.)，紧接其后是Ckβ-10编码序列的前6个核苷酸(划线处是转译起始密码子ATG)。
3’引物序列为5’-CGCGGGTACCTTAACACATAGTACATTTT，其含有限制性内切酶Asp781的裂解位点及19个互补于Ckβ-10基因的3’非转译序列的核苷酸。使用商购的试剂盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)将扩增的序列从1％琼脂糖凝胶中分离出。然后用内切酶BamHI和Asp781消化该片段，随后再次用1％琼脂糖凝胶纯化。该片段命名为F2。
载体pRG1(pVL941载体的修饰物，见下述)通过使用杆状病毒表达系统(综述参见Summers，M.D.and Smith G.E.1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养程序方法手册，德克萨斯农业实验站通报No.1555)用于Ckβ-10蛋白质的表达。该表达载体含有苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子，后接限制性内切酶BamHI和Asp781的识别位点。猴病毒(SV)40的多腺苷酸位点用于有效地多腺苷酸化。为易于筛选重组病毒，以与多角体蛋白启动子相同的方向插入E.coli的β-半乳糖苷酶基因，后接多角体蛋白基因的多腺苷酸信号。多角体蛋白序列的两侧由病毒序列旁侧，以用于共转染的野生型病毒DNA的细胞介导的同源重组。许多其它的杆状病毒载体如pAc373，pVL941和pAcIMl，可用于代替pRGl(Luckow，V.A.and Summers，M.D.，Virology，17031-39)。
用限制性酶BamHI和Asp781消化质粒，然后通过本领域人员已知程序使用牛肠磷酸酶脱磷酸。将DNA从1％琼脂糖凝胶中分离出，这一载体DNA称为V2。
用T4DNA连接酶将F2片段和去磷酸化的V2质粒连接。然后转化E.coli HB101细胞，用BamHI和Asp781鉴别含带有Ckβ-10基因的质粒(pBacCkβ-10)的细菌。克隆片段的序列用DNA测序证实。
使用脂转染法(Felgner et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847413-7417(1987))将5μg pBacCkβ-10质粒与1.0μg商购的线性杆状病毒(“Baculo GoldTM杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)共转染。
在含50μl无血清Grace’s培养基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的微滴定板的无菌孔中将1μg BaculoGoldTM病毒DNA和5μg pBacCkβ-10质粒混合。随后加入10μl Lipofectin和90μl Grace’s培养基，混和并在室温下温育15分钟。然后将转染混合物滴加到种植在含1ml无血清的Grace’s培养基的35mm组织培养平板上的Sf9昆虫细胞中(ATCC CRL 1711)。将平板前后摇动以混合新加入的溶液。然后在27℃温育此平板5小时。5小时后，从平板中除去转染物溶液，加入补充有10％胎牛血清的1mlGrace’s昆虫培养基。将平板放回温育器在27℃下继续培养四天。
四天后收集上清，进行类似如Summers和Smith(前述)所述的空斑分析。使用带“Blue Gal”的修饰的琼脂糖凝胶(Life Technologies Inc.Gaithersburg)，其能较易分离出蓝染的空斑(“空斑分析”的详细描述见于Life Technologies Inc.，Gaithersbury为昆虫细胞培养和杆状病毒学分发的使用手册的第9-10页。)将病毒的连续稀释液加入细胞中四天后，用一Eppendorf吸量管的尖头挑出蓝染的空斑。将含重组病毒的琼脂重悬在一个含200μl Grace’s培养基的Eppendorf管中。经短暂的离心除去琼脂，含重组杆状病毒的上清用于感染种在35mm平皿中的Sf9细胞。四天后收集这些培养皿中的上清，在4℃下贮藏。
Sf9细胞在补加10％热失活的FBS的Grace’s培养基中生长。然后用重组杆状病毒V-Ckβ-10以感染复数(MOI)＝2感染该细胞，六小时后除去培养基，置换入不含蛋氨酸和半胱氨酸的SF900 II培养基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)。42小时后加入5μCi的35S-蛋氨酸和5μCi35S-半胱氨酸(Amersham)。温育该细胞16小时后，离心收集并通过SDS-PAGE和放射自显影观察标记的蛋白质。
依据上述教导对本发明可做各种修改及变动，因此在权利要求范围内本发明可以与具体描述的不同方法实施。序列表(1)一般信息(i)申请人LI，ET AL。(ii)发明名称人趋化因子多肽(iii)序列数4(iv)联系地址(A)联系人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART&OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新泽西州(E)国家美国(F)邮编07068(v)计算机可读形式(A)媒介类型3.5寸软盘(B)计算机IBM PS/2(C)操作系统MS-DOS(D)软件WORD PERFECT 5.1(vi)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)在先申请资料(A)申请号(B)申请日(viii)律师/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)注册号36,134(C)案号/文档号325800-183(viii)通讯信息(A)电话201-994-1700(B)传真201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度291碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGTGCTGTA CCAAGAGTTT GCTCCTGGCT GCTTTGATGT CAGTGCTGCT ACTCCACCTC 60TGCGGCGAAT CAGAAGCAGC AAGCAACTTT GACTGCTGTC TTGGATACAC AGACCGTATT120CTTCATCCTA AATTTATTGT GGGCTTCACA CGGCAGCTGG CCAATGAAGG CTGTGACATC180AATGCTATCA TCTTTCACAC AAAGAAAAAG TTGTCTGTGT GCGCAAATCC AAAACAGACT240TGGGTGAAAT ATATTGTGCG TCTCCTCAGT AAAAAAGTCA AGAACATGTA A 291(3SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度96氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val-20 -15 -10Leu Leu Leu His Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ala Ser Asn Phe-5 1 5Asp Cys Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His Pro Lys Phe10 15 20Ile Val Gly Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys Asp Ile25 30 35Asn Ala Ile Ile Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala40 45 50Asn Pro Lys Gln Thr Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser55 60 65Lys Lys Val Lys Asn Met70(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度297对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3ATGAAAGTTT CTGCAGTGCT TCTGTGCCTG CTGCTCATGA CAGCAGCTTT CAACCCCCAG 60GGACTTGCTC AGCCAGATGC ACTCAACGTC CCATCTACTT GCTGCTTCAC ATTTAGCAGT120AAGAAGATCT CCTTGCAGAG GCTGAAGAGC TATGTGATCA CCACCAGCAG GTGTCCCCAG180AAGGCTGTCA TCTTCAGAAC CAAACTGGGC AAGGAGATCT GTGCTGACCC AAAGGAGAAG240TGGGTCCAGA ATTATATGAA ACACCTGGGC CGGAAAGCTC ACACCCTGAA GACTTGA 29权利要求
1.分离的多核苷酸，选自由下述组成的一组a)一种编码具有图1的推导的氨基酸序列的Ckβ-4多肽或所述多肽的片段，类似物或衍生物的多核苷酸；b)一种编码具有由ATCC保藏号75848所含的cDNA编码的氨基酸序列的Ckβ-4多肽或所述多肽的片段，类似或衍生物的多核苷酸；c)一种编码具有图2的推导的氨基酸序列的Ckβ-10多肽或所述多肽的片段，类似物或衍生物的多核苷酸；以及d)一种编码具有由ATCC保藏号75849所含的cDNA编码的氨基酸序列的CDβ-10多肽或所述多肽的片段，类似物或衍生物的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中多核苷酸是DNA。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其中多核苷酸是RNA。
4.如权利要求1所述的多核苷酸，其中多核苷酸是基因组DNA。
5.如权利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有图2的推导的氨基酸序列的Ckβ-4。
6.如权利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有图3的推导的氨基酸序列的Ckβ-10。
7.如权利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码由ATCC保藏号75848的cDNA编码的Ckβ-4多肽。
8.如权利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码由ATCC保藏号75849的cDNA编码的Ckβ-10多肽。
9.如权利要求1所述的多核苷酸，其具有图1所示的Ckβ-4编码序列。
10.如权利要求1所述的多核苷酸，其具有图2所示的Ckβ-10编码序列。
11.如权利要求2所述的多核苷酸，其具有由ATCC保藏号75848保藏的Ckβ-4编码序列。
12.如权利要求2所述的多核苷酸，其具有由ATCC保藏号75849保藏的Ckβ-10编码序列。
13.一种含有权利要求2所述DNA的载体。
14.用权利要求13所述载体遗传工程化的宿主细胞。
15.一种生产多肽的方法包括用权利要求14所述的宿主细胞表达由所述DNA编码的多肽。
16.生产能表达多肽的细胞的方法，包括用权利要求13所述的载体对细胞进行遗传工程化。
17.可与权利要求2所述的DNA杂交并编码具有Ckβ-4活性的多肽的分离的DNA。
18.可与权利要求2所述的DNA杂交并编码具有Ckβ-10活性的多肽的分离的DNA。
19.一种多肽，选自由下述组成的一组(i)一种具有图1的推导的氨基酸序列的Ckβ-4多肽及其片段、类似物和衍生物；(ii)由ATCC保藏号75848的cDNA编码的Ckβ-4多肽及所述多肽的片段、类似物及衍生物；(iii)具有图2的推导的氨基酸序列的Ckβ-10多肽及其片段、类似物及衍生物；(iv)由ATCC保藏号75849的cDNA编码的Ckβ-10多肽及所述多肽的片段、类似物及衍生物。
20.如权利要求19所述的多肽，其中多肽是具有图1的推导的氨基酸序列的Ckβ-4。
21.如权利要求19所述的多肽，其中多肽是具有图2的推导的氨基酸序列的Ckβ-10。
22.抗权利要求19所述的多肽的抗体。
23.抗权利要求19所述的多肽的拮抗剂。
24.治疗需要Ckβ-4的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求19所述的多肽。
25.治疗需要抑制Ckβ-4的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求23所述的拮抗剂。
26.治疗需要Ckβ-10的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求19所述的多肽。
27.治疗需要抑制Ckβ-10的患者的方法，包括给予患者治疗有效量的权利要求23所述的拮抗剂。
28.一种药物组合物，包括权利要求19所述的任一种多肽及一种药物学可接受的载体。
29.如权利要求24所述的方法，其中通过提供给患者编码所述多肽的DNA并在其体内表达所述的多肽而给予治疗有效量的多肽。
30.如权利要求26所述的方法，其中通过提供给患者编码所述多肽的DNA并在其体内表达所述的多肽而给予治疗有效量的多肽。
全文摘要
本发明公开了人趋化因子多肽，编码趋化因子多肽的DNA(RNA)及通过重组技术生产此多肽的方法。也公开了使用趋化因子多肽治疗白血病、肿瘤、慢性感染、自身免疫疾病、纤维性疾病、伤口愈合和银屑病的方法。本发明还公开了抗趋化因子多肽的拮抗剂及其作为治疗剂治疗风湿性关节炎，自身免疫炎症和慢性炎症及感染性疾病，变态反应，前引腺素不依赖型发热及骨髓机能低下症的应用。
文档编号A61K38/19GK1164193SQ94195184
公开日1997年11月5日 申请日期1994年8月23日 优先权日1994年8月23日
发明者李浩东, 马克·D·亚当斯 申请人:人体基因组科学有限公司