专利名称：可促进肿瘤细胞分化的cDNA序列及其真核表达载体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有促进肿瘤细胞分化功能的cDNA序列及其真核表达载体，所述的cDNA是从维甲酸处理的人食管癌细胞系中分离得到的。
人体细胞一般都要经过增殖、分化、衰老和凋亡(apoptosis)几个时期，当细胞由于某种原因不能及时转入分化阶段而持续增殖时就会形成恶性肿瘤。长期以来细胞分化和恶性肿瘤始终是病理学者、临床医生和实验肿瘤学者共同关注的中心问题之一，而随着基因疗法的出现和发展，对恶性肿瘤进行基因治疗也成为一项重要的研究课题。已有不少资料表明，恶性肿瘤在体内或体外条件下有可能部分地或完全地转变为无害的分化细胞。近年来有许多实验室探索在体外条件下使癌细胞发生逆转(即转变为分化细胞)的条件和机制，并相继发现和分离到几种具有促进肿瘤分化功能的分化基因(又称抑癌基因)，例如成视网膜细胞瘤的RB基因(S.H.Friend et al.，Nature，323(1986)，p643-646；W.-H.Lee et al.，Science，235(1987)，p1394-1399；Y.-K.T.Fung et al.，Science，236(1987)，p1657-1661)；Wilms瘤的锌指基因(zinc-finger gene)(M.Gessler et al.，Nature，343(1990)，p774-778)。这些抑癌基因的发现为实现基因治疗肿瘤提供了理论上和实验上的依据。
因此，本发明的目的在于提供一种具有促进肿瘤细胞分化功能的cDNA序列，其对多种肿瘤细胞有明显的生长抑制作用。
本发明的另一个目的在于提供合有所述的cDNA序列的真核基因表达载体。
本发明的又一目的在于所述的cDNA序列在制备基因治疗肿瘤的制剂中的应用。
为完成上述发明目的，本发明采用如下技术方案本发明涉及一种具有促进肿瘤分化功能的cDNA序列(下文称为序列1)，其全长为3805bp，具有如下文序列表中序列标识号1所示的核苷酸序列。所述的cDNA序列是通过用全反式维甲酸诱导人食管癌细胞系EC8712使其发生分化，从其cDNA文库中分离得到。
本发明还涉及一种含有所述的cDNA序列的真核表达载体。
本发明还涉及所述的cDNA序列在制备基因治疗肿瘤的制剂中的应用。
本发明的序列1是一种能够促进肿瘤细胞分化进而凋亡的cDNA序列，体外实验表明转染序列1后的肿瘤细胞生长受到抑制，形态发生明显改变，并且逐渐脱落死亡。而初步的动物实验显示出所述的序列1在体内也有抑癌作用。因此，本发明的序列1基因在用于制备肿瘤的基因治疗的制剂方面有着潜在的广泛用途。附图的简要说明
图1为序列1的核苷酸测序策略及其限制性内切酶酶切图谱的示意图。
图2为本发明实施例中采用的真核表达载体质粒pCDV1的基因图谱。
图3为本发明实验例2中筛选到的由序列1转染的EC109细胞克隆(5倍光镜下)。
图4为本发明实验例2中筛选到的另一个由序列1转染的EC109细胞克隆(5倍光镜下)。
图5为本发明实验例2中采用的EC109细胞(5倍光镜下)。
已有报告指出维甲酸及其衍生物对癌细胞具有十分广泛和强力的生物学作用(S.Strickland et al.，Cell，1978，15(2)393-403；T.R.Breitman et al.，Blood，1981，571000-1004)，在体外它可抑制HL-60细胞，小细胞肺癌细胞的c-myc基因表达(J.Films etal.Cancer Res.1985，45822-825；G.p.Kalemkerian et al.1994，Cell Growth &Differentiation555-60)，其对人食管癌细胞系EC109也有抑制生长作用(Q.Q.Pan et al.1984，Acta.Acad.Med.Sin.6100-103)。基于维甲酸的促进肿瘤细胞分化的功能，本发明人设计了一种利用维甲酸促使肿瘤细胞体外分化，建立分化前后的cDNA文库并通过递减杂交技术从人食管癌细胞系中分离分化基因的策略，通过大量的工作，终于筛选到一种具有促进肿瘤细胞分化功能的cDNA序列，即序列1。
具体地，本发明涉及一种具有促进肿瘤分化功能的cDNA序列，即序列1，用双脱氧法对其进行单、双链序列测定，得知其全长为3805bp，具有如下文序列表中序列标识号1所示的核苷酸序列。序列1的核苷酸测序策略及限制性内切酶酶切图谱如图1所示。
计算机分析表明序列1没有合适的编码蛋白质的阅读框架，从1994年版的EMBL和Gene Bank数据库中查出序列1有两个不相连的区域与人和小鼠的c-myc癌基因第二和第三外显子有较高的互补同源性，两个同源区域共1540bp，约占基因总长的40％。第一同源区从第1224bp至1954bp，第二同源区从第2985bp至3805bp。
本发明的序列1是通过如下方法得到的用全反式维甲酸处理人食管癌细胞系EC8712(由中国医学科学院肿瘤研究所构建)，构建维甲酸处理前和处理五天后的EC8712细胞的两个cDNA文库，经过两个文库的递减杂交，从维甲酸处理后的cDNA文库中得到所述的序列1。详细方法见冯骆等人的文章(中国科学B辑，1991，101059-1067)。
本发明实质上还涉及一种含有所述的序列1的真核表达载体，本发明实施例中采用的是含有序列1的质粒pCDV1。pCDV1的基因图谱见图2。体外实验表明，以含有序列1的真核表达载体转染EC8712细胞、HL-60细胞和人肺腺癌细胞系，所述的序列1对三种细胞均有明显的抑制细胞生长及其恶性表型的作用，并同时降低了这些细胞系中c-myc癌基因的表达。而用小鼠为实验动物进行的初步体内实验也表明，注射有本发明的序列1的小鼠其癌症发病率明显低于未注射序列1的小鼠。因此，本发明的序列1在用于制备基因治疗肿瘤的制剂方面有着潜在的广泛用途。
含有本发明的序列1的质粒已于1995年1月29E在中国典型培养物中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCC M 95005，该质粒名称为RATS1。
以下结合附图和实施例进一步描述本发明。实施例1用全反式维甲酸(retinoic acid，RA)处理人食管癌细胞系EC8712参见冯骆等人的方法(中国科学B辑，第10期，1991年10月，1059-1067页)，该篇文章中所述的pRA538即为含有本发明的序列1的质粒pCDV1。
EC8712细胞系是中国医学科学院肿瘤研究所构建的人食管癌细胞系，病理诊断为鳞状细胞癌。
将EC8712细胞传代，培养液为M199(GIBCO)，内含20％小牛血清、1％青链霉素，用终浓度为10-5mol/l的全反式维甲酸处理EC8712细胞，每天换液，保持RA在培养液中的浓度。实施例2 EC8712细胞的cDNA文库的构建及递减杂交参见冯骆等人的方法(中国科学B辑，第10期，1991年10月，1059-1067页)。该篇文章中所述的pRA538即为含有本发明的序列1的质粒pCDV1。
从未经RA处理和经RA处理5天后的EC8712细胞中提取RNA，采用Okayama和Berg的克隆系统(H.Okayama & P.Berg，Mol.Cell.Biol.，2(1982)，161-170；H.Okayama & P.Berg，Mol.Cell.Biol.，3(1983)，280-289)构建细胞分化前后的两个cDNA文库，并经递减杂交法从后一文库中筛选具有促进肿瘤细胞分化功能的cDNA克窿，得到一个cDNA克隆，即所述的序列1。实施例3 序列1的核苷酸序列测定按照图1所示的测序策略对实施例2中的序列1进行核苷酸序列测定，其中分别进行双链测序及单链测序。测得的DNA序列如下文序列表中序列标识号为1的序列。
双链测序是利用序列1中已知的限制性内切酶位点将序列1切成大小不等的片段，将这些片段亚克隆至质粒pUC18和pUC19中，用pUC/M13通用引物以双脱氧中止法对此亚克隆进行测序。
单链测序是用限制性内切酶BamHI和XbaI从实施例2中得到的含有序列1的cDNA克隆中切下3.8kb的cDNA插入序列，再将其亚克隆至M13mp18和M13mp19中利用已知的序列合成引物测序，测序试剂盒为Pharmacia公司的T7 Sequencing Kit，测序方法是按照厂家的说明进行。实验例1 序列1的同源性分析用Beckman公司的Micro Genie分析软件，HITACHI公司的DNAsis分析软件对序列1进行编辑和分析，其中DNAsis软件中的EMBL和Gene Bank数据库为1994年版。同源比较的结果是，所述的序列1有两个区域与小鼠及人的c-myc原癌基因第二、第三外显子有相当高的互补同源性，两个同源区域共1540bp，约占基因总长的40％。第一同源区从第1224bp至1954bp，第二同源区从第2985bp至3805bp。实验例2 序列1的生物学功能的鉴定采用Lipofectin(GIBCO BRL，美国)方法将含序列1的真核表达载体pCDV1转染EC109细胞系(人食管癌细胞系，由中国医学科学院肿瘤研究所构建)，转染方法参照产品说明进行。
材料来源质粒pDORneo，英国皇家癌症研究基金会Morgenstern和Land博士惠赠；脂质体Lipofectin及新霉素G418，购自美国BRL公司；培养基M199为GIBCO-BRL产品。
实验组pCDV1-序列1与pDOR-neo共转染，DNA用量分别为15μg和3μg，Lipofectin 40μg；对照组只转染pDOR-neo DNA 3μg，Lipofectin 40μg；空白对照组不转染任何DNA及生物制剂。转染12小时后换含有20％胎牛血清的M199培养液，在含5％CO2培养箱内37℃培养48小时，然后加入终浓度为500μg/ml的G418筛选，当G418抗性克隆出现后改为用100μg/ml的G418维持。
转染序列1后的G418抗性克隆中有两类其细胞生长明显受到抑制，细胞形态发生明显变化，如图3和图4所示，图5为未转染序列1的EC109细胞。其中图3所示的细胞克隆其细胞体积较小，生长状态很差，细胞很快脱落死亡，形成的克隆很小；图4所示的细胞克隆其细胞体积变大，胞浆丰富且出现许多空泡，细胞边界不清，能形成克隆，但生长状态不好，在培养过程中细胞逐渐脱落死亡。由此证明本发明的序列1对肿瘤细胞有明显的抑制生长的作用，并诱导其发生终末分化与凋亡。
序列表序列标识号1序列长度3805bp链数单链分 子 型cDNA特征有两个区域与人和小鼠的c-myc原癌基因的第二、第三外显子有较高的互补同源性，其中第一同源区从1224bp-1954bp，第二同源区从2985bp-3805bp来源人性质具有促进肿瘤细胞分化功能的cDNAGGATCCTCTC GGGGAAACTG AGTTCCAGTG TCATGGGTGA ACAACAGAAG AGACTAGCTA 60ATTCTTGTAT ATCCCAGACC AAGCTGAAAG CTCCTCCCAC TTCACCCCTC ATCGTGATTG 120TTATCTATAA ATTTGATTGC ACAATGTTGC AGACCCCTGG GACTCCAGAT TGGCTGGGAG 180AGCCTTCCTG TGTTATGGTC AAGATCAGCC TGACTTTCTG GAAGGAAGCT GGCCGATGTC 240CTGTTTTCAG ACCATTCCCT GGCTTGGTAA AGCTGAGAAG TGCCCAGATA GGGAGCTGTG 300ATACTTCGAT TCCATCCCCA CAGCCAAATC TGAATCTCTA AACTTGTTTC CTGATCATTT 360GGAACAGGAG TTGTTTTCCT AATGAGGAAT GCTTTCCTCT ATTCTTTGGG CTTGCCTGGA 420CTGAGTGATT CAACCTAACA CCTTCCCAGG TCTCAAGTGA GTCACCCCAG GGCTGCACTC 480CAGCCTAGGC TCACAAAGGG GAAAAAGAGG GAACTATTTA AGAGCACCCC CTGCTCCCCC 540CTTTTGCTAA TCCTTTGAAC TACTCAAAGT ATTTCAAACT ACTACTGGGG TTTGTGTTTT 600CTTTTGAATG TAGGATAGAG GGTGTAACAG TTTGAAGCTG AGGGTGAGTC TAAAAGAGCC 660AAAAATAAGA TCAAAAACTA AATGTTAAAC GCTTCAATAG ATCATGGGGG GGGGGTGTCA 720AAGATAGTAA TTACTTATTG GTTTATGAAT GATGGTGAAT TAAAGTCCCA AAGACACTCC 780AGGATGCTAG AGACCTTCTC TGAGCAAATG GGGTCATTTA GGACATTTAG GGTACCTTTC 840TCCCTGGACT TTACCTACAT GTTTCAGTTT CTGGTTTGGA TTGTGGCTTT TCAGAGGCTT 900ATAATTAATA AGATACCTGT TCCAAAAGGC TTTCTCATGG GCCATTGATG AGCGTGTGTC 960ATGAGTGTGA GAAAGTGCTT GGGAGGAAGG CGAGCTTGCA ATTTCTAAAA TAATGACTCA1020TGTAAAACAA GGTTTTATTT TATGATCTGA CCAGTAGCAC TTCTAAACTG GCTTCTTCCC1080AGGAGCAAGC AGGGATCTGA TTTTAAAAAC TAAGTGGGTA AGGTAGGAGT GAGCTATGTG 1140CCTCTGAGTA CACACAACAC CCTCCACCCC AACCCCCCAA TCCACAAACA AGGAGGGGAA 1200CTGAAGTCTA CCAGTTCTTG AGTAGTCAAG CTTACAGTCC CAAAGCCCCA GCCAAGGTTG 1260TGAGGTTAGG CTTTGAGCAT GCATTTTAAT TCCAGCGCAT CAGTTCTGTC AGAAGGAACC 1320GTTCTCCTTA CTCTCACGAG AGATTCCAGC TCCTCCTCGA GTTAGGTCAG TTTATGCACC 1380AGAGTTTCGA AGCTGTTCGA GTTTGTGTTT CAACTGTTCT CGTCGTTTCC TCAATAAGTC 1440CTTTTCAGAG GTGAGCTTGT GCTCGTCTGC TTGAATGGAC AGGATGTAGG CGGTGGCTTT 1500TTTGAGGATC ACTACCTTGG GGGCCTTTTC GTTGTTTTCC AATTCAGGGA TCTGGTCACG 1560CAGGGCAAAA AAGCTGCGCT TCAGCTCGTT CCTCCTCTGA CGTTCCAAGA CGTTGTGTGT 1620CCGCCTCTTG TCGTTTCCTC CGTGTCTGAG GACCTGGGGC TGGAGCACTT GGGGTTGTTG 1680CTGATCTGCT TCAGGACCCT GCCACTGTCC AACTTGGCCC TCTTGGCAGC TGGATAGTCC 1740TTCCTTGTGG AGGGGGGTGC GGCGTAGTTG TGCTGGTGAG TGGAGACGTG GCACCTCTTG 1800AGGACCAGTG GGCTGTGCGG AGGTTTGCTG TGGCCTCGGG ATGGAGATGA GCCCGACTCC 1860GACCTCTTGG CAGGGGTTTG CCTCTTCTCC ACAGACACCA CATCAATTTC TTCCTCATCT 1920TCTTGCTCTT CTTCTGTAAG GGAGGAAGTG GAAGATCACA GTTAGCCACG CCTCCTGAAT 1980CCCGGAGCCT ATACATAGGA TTTGACCGAT GCTATCCAAA TACCAAGTTG GAAAGGGAAG 2040AAAGTAAGAA TCAGATCCAG ACACCATCTT CCCTTCTCCC AGAAAGGCAG ACAGGGTTAG 2100GGCACAGGTG AGAAATTACC ATGTACCAGG ATATGGTATC CTTGCCAATT CTTACCTAAG 2160ATTTAATGAG GCTTCAGACA CACCCAAAGC AAAGCACATT TCCCAAGCAC CTCCTATTTT 2220TAAGGGACTT TACCGAGAAC CTTTCAGGTC CCGTGAGGGA TAGCTGCAAA TCTCTTGCTA 2280TGACTTTAGC AACTCCCTAT TTTACTGGAA GCACAATTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2340GTCTTGCAGC TTTGCCAAAC GTCCTGGTGT TGGGGGAGTG TTGGGACGGG GGGAGAAGTC 2400CAAATTGAAC AGAATTTGCT TTGAAGTGTT CAAAAGAGGA CGAAAAAACA AAGCAAAACA 2460AAACACCCAA AAGAGCCCAG CTCTTCAATT CTTTAGGAAC TTTCACTAGT GCCTGGCTCT 2520AAGGCTATAA AGGCTATCCC AGCTTCTGTC ATTGCTTCTC TTGGGTCTTA GACAA CGTA 2580TCCATTAAAT TCAAATATTC TTCTGGCAGT CAAGAAAAGA AGCAGGTAAT TCACCCCCCT 2640CCAGATCAGT TCCTTTATCC TCATTCACAC CCTTCCCAGG GTAATTAAAA TGCTTAGGAG 2700GGGTAAAGGG AGTGGATGGA GCTGAAAGAT AAGCCAGAAG ATTTAAAAAC CCAAATGAAA 2760TTCCTGAGGG GTGGGAAGGG TGGGGGGTGG GGGTGACAAC CAGGGCGGTC TGGGGGGGGG 2820GGGGAGGGGA GGGAGGGATA GCTGAAGCAC GGGAATCCAG GGATGAAGAG CTCTTAGACA 2880GAAGGGAAAG AAAGGGGGAG CCCCGGAGGC CAATTGAATT AATGCCAATG AGTGGTGGAG 2940AAGGAGGTCC ATCCAACCTC TCGCTTCCTA CCCTGCTGTG AATGGGGTAG CTTACCAGAG 3000TCGCTGCTGG TGGTGGGCGG TGTCTCCTCA TGCAGCACTA GGGGCTCAGG GCTGGCCCGT 3060GGGGAGGACT CGGAGGACAG CAGCGAGTCC GAGGAAGGAG AGAAGGCCGT GGAATCGGAC 3120GAGGTACAGG ATTTGGGCGA GCTGCTGTCG TTGAGCGGGT AGGGAAAGAC CACTGAGGGG 3180TCAATGCACT CGGACGCGGC GGCGGTGAGG TCCTGCAGGT ACAGGCTGGA GGTGGAGCAG 3240ACGCTGTGCC CGCGGGCGGG GCTCAGGCTG GTGCTGTCTT TGCGCGCAGC CTGGTAGGAG 3300GCCAGCTTCT CCGAGACCAG CTTGGCAGCG GCTGAGAAAC CGCTCCACAT ACAGTCCTGG 3360ATGATGATGT TCTTGATGAA GGTCTCGTCG TCAGGATVGC AGATGAAGCT CTTGTTCACC 3420ATGTCTCCTC CAAGTAACTC GGTCATCATC TCCAGCTGAT GATCGGCGGT GGAGAAGTTG 3480CCACCGCCGC CGTCATCGTC TTCCCTTGGG GAGAAGGACG TAGCGACCGC AACATAGGAT 3540GGAGAGCAGA GCCCGGAGCG GCGGCTCGGG GACAGGGGCG GGGTGGGAAG CAGCTCGAAT 3600TTCTTCCAGA TATCCTCACT GGGCGCGGGC GGCTGCAGCT CGCTCTGCTG TTGCTGGTGA 3660TAGAAATTCT CTTCCTCGTC GCAGATGAAA TAGGGCTGTA CGGAGTCGTA GTCGAGGTCA 3720TAGTTCCTGT TGGTGAAGTT CACGTTGAGG GGCATCGTCG TGGCTGTCTG CTGGAGGGGG 3780CACAGCAAGG GAAGCAAGTC TAGAG380权利要求
1.一种具有促进肿瘤细胞分化功能的cDNA序列，其特征是所述的cDNA序列为GGATCCTCTC GGGGAAACTG AGTTCCAGTG TCATGGGTGA ACAACAGAAG AGACTAGCTA 60ATTCTTGTAT ATCCCAGACC AAGCTGAAAG CTCCTCCCAC TTCACCCCTC ATCGTGATTG 120TTATCTATAA ATTTGATTGC ACAATGTTGC AGACCCCTGG GACTCCAGAT TGGCTGGGAG 180AGCCTTCCTG TGTTATGGTC AAGATCAGCC TGACTTTCTG GAAGGAAGCT GGCCGATGTC 240CTGTTTTCAG ACCATTCCCT GGCTTGGTAA AGCTGAGAAG TGCCCAGATA GGGAGCTGTG 300ATACTTCGAT TCCATCCCCA CAGCCAAATC TGAATCTCTA AACTTGTTTC CTGATCATTT 360GGAACAGGAG TTGTTTTCCT AATGAGGAAT GCTTTCCTCT ATTCTTTGGG CTTGCCTGGA 420CTGAGTGATT CAACCTAACA CCTTCCCAGG TCTCAAGTGA GTCACCCCAG GGCTGCACTC 480CAGCCTAGGC TCACAAAGGG GAAAAAGAGG GAACTATTTA AGAGCACCCC CTGCTCCCCC 540CTTTTGCTAA TCCTTTGAAC TACTCAAAGT ATTTCAAACT ACTACTGGGG TTTGTGTTTT 600CTTTTGAATG TAGGATAGAG GGTGTAACAG TTTGAAGCTG AGGGTGAGTC TAAAAGAGCC 660AAAAATAAGA TCAAAAACTA AATGTTAAAC GCTTCAATAG ATCATGGGGG GGGGGTGTCA 720AAGATAGTAA TTACTTATTG GTTTATGAAT GATGGTGAAT TAAAGTCCCA AAGACACTCC 780AGGATGCTAG AGACCTTCTC TGAGCAAATG GGGTCATTTA GGACATTTAG GGTACCTTTC 840TCCCTGGACT TTACCTACAT GTTTCAGTTT CTGGTTTGGA TTGTGGCTTT TCAGAGGCTT 900ATAATTAATA AGATACCTGT TCCAAAAGGC TTTCTCATGG GCCATTGATG AGCGTGTGTC 960ATGAGTGTGA GAAAGTGCTT GGGAGGAAGG CGAGCTTGCA ATTTCTAAAA TAATGACTCA 1020TGTAAAACAA GGTTTTATTT TATGATCTGA CCAGTAGCAC TTCTAAACTG GCTTCTTCCC 1080AGGAGCAAGC AGGGATCTGA TTTTAAAAAC TAAGTGGGTA AGGTAGGAGT GAGCTATGTG 1140CCTCTGAGTA CACACAACAC CCTCCACCCC AACCCCCCAA TCCACAAACA AGGAGGGGAA 1200CTGAAGTCTA CCAGTTCTTG AGTAGTGAAG CTTACAGTCC CAAAGCCCCA GCCAAGGTTG 1260TGAGGTTAGG CTTTGAGCAT GCATTTTAAT TCCAGCGGAT CAGTTCTGTC AGAAGGAACC 1320GTTCTCCTTA CTCTCACGAG AGATTCCAGC TCCTCCTCGA GTTAGGTCAG TTTATGCACC 1380AGAGTTTCGA AGCTGTTCGA GTTTGTGTTT CAACTGTTCT CGTCGTTTCC TCAATAAGTC 1440CTTTTCAGAG GTGAGCTTGT GCTCGTCTGC TTGAATGGAC AGGATGTAGG CGGTGGCTTT 1500TTTGAGGATC ACTACCTTGG GGGCCTTTTC GTTGTTTTCC AATTCAGGGA TCTGGTCACG 1560CAGGGCAAAA AAGCTGCGCT TCAGCTCGTT CCTCCTCTGA CGTTCCAAGA CGTCGTGTGT 1620CCGCCTCTTG TCGTTTCCTC CGTGTCTGAG GACCTGGGGC TGGAGCACTT GCGGTTGTTG 1680CTGATCTGCT TCAGGACCCT GCCACTGTCC AACTTGGCCC TCTTGGCAGC TGGATAGTCC 1740TTCCTTGTGG AGGGGGGTGC GGCGTAGTTG TGCTGGTGAG TGGAGACGTG GCACCTCTTG 1800AGGACCAGTG GGCTGTGCGG AGGTTTGCTG TGGCCTCGGG ATGGAGATGA GCCCGACTCC 1860GACCTCTTGG CAGGGGTTTG CCTCTTCTCC ACAGACACCA CATCAATTTC TTCCTCATCT 1920TCTTGCTCTT CTTCTGTAAG GGAGGAAGTG GAAGATCACA GTTAGCCACG CCTCCTGAAT 1980CCCGGACGCT ATACATAGGA TTTGACCGAT GCTATCCAAA TACCAAGTTG GAAAGGGAAG 2040AAAGTAAGAA TCAGATCCAG ACACCATCTT CCCTTCTCCC AGAAAGGCAG ACAGGGTTAG 2100GGCACAGGTG AGAAATTACC ATGTACCAGG ATATGGTATC CTTGCCAATT CTTACCTAAG 2160ATTTAATGAG GCTTCAGACA CACCCAAAGC AAAGCACATT TCCCAAGCAC CTCCTATTTT 2220TAAGGGACTT TACCGAGAAC CTTTCAGGTC CCGTGAGGGA TAGCTGCAAA TCTCTTGCTA 2280TGACTTTAGC AACTCCCTAT TTTACTGGAA GCACAATTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 2340GTCTTGCAGC TTTGCCAAAC GTCCTGGTGT TGGGGGAGTG TTGGGACGGG GGGAGAAGTC 2400CAAATTGAAC AGAATTTGCT TTGAAGTGTT CAAAAGAGGA CGAAAAAACA AAGCAAAACA 2460AAACACCCAA AAGAGCCCAG CTCTTCAATT CTTTAGGAAC TTTCACTAGT GCCTGGCTCT 2520AAGGCTATAA AGGCTATCCC AGCTTCTGTC ATTGCTTCTC TTGGGTCTTA GACAAACGTA 2580TCCAATAAAT TCAAATATTC TTCTGGCAGT CAAGAAAAGA AGCAGGTAAT TCACCCCCCT 2640CCAGATCAGT TCCTTTATCC TCATTCACAC CCTTCCCAGG GTAATTAAAA TGCTTAGGAG 2700GGGTAAAGGG AGTGGATGGA GCTGAAAGAT AAGCCAGAAG ATTTAAAAAC CCAAATGAAA 2760TTCCTGAGGG GTGGGAAGGG TGGGGGGTGG GGGTGACAAC CAGGGCGGTC TGGGGGGGGG 2820GGGGAGGGGA GGGAGGGATA GCTGAAGCAC GGGAATCCAG GGATGAAGAG CTCTTAGACA 2880GAAGGGAAAG AAAGGGGGAG CCCCGGAGGC CAATTGAATT AATGCCAATG AGTGGTGGAG 2940AAGGAGGTCC ATCCAACCTC TCGCTTCCTA CCCTGCTGTG AATGGGGTAG CTTACCAGAG 3000TCGCTGCTGG TGGTGGGCGG TGTCTCCTCA TGCAGCACTA GGGGCTCAGG GCTGGCCCGT 3060GGGGAGGACT CGGAGGACAG CAGCGAGTCC GAGGAAGGAG AGAAGGCCGT GGAATCGGAC 3120GAGGTACAGG ATTTGGGCGA GCAGCTGTCG TTGAGCGGGT AGGGAAAGAC CACTGAGGGG 3180TCAATGCACT CGGACGCGGC GGCGGTGAGG TCCTGCAGGT ACAGGCTGGA GGTGGAGCAG 3240ACGCTGTGCC CGCGGGCGGG GCTCAGGCTG GTGCTGTCTT TGCGCGCAGC CTGGTAGGAG 3300GCCAGCTTCT CCGAGACCAG CTTGGCAGCG GCTGAGAAAC CGCTCCACAT ACAGTCCTGG 3360ATGATGATGT TCTTGATGAA GGCTTCGTCG TCAGGATCGC AGATGAAGCT CTTGTTCACC 3420ATGTCTCCTC CAAGTAACTC GGTCATCATC TCCAGCTGAT GATCGGCGGT GGAGAAGTTG 3480CCACCGCCGC CGTCATCGTC TTCCCTTGGG GAGAAGGACG TAGCGACCGC AACATAGGAT 3540GGAGAGCAGA GCCCGGAGCG GCGGCTCGGG GACAGGGGCG GGGTGGGAAG CAGCTCGAAT 3600TTCTTCCAGA TATCCTCACT GGGCGCGGGC GGCTGCAGCT CGCTCTGCTG TTGCTGGTGA 3660TAGAAATTCT CTTCCTCGTC GCAGATGAAA TAGGGCTGTA CGGAGTCGTA GTCGAGGTCA 3720TAGTTCCTGT TGGTGAAGTT CACGTTGAGG GGCATCGTCG TGGCTGTCTG CTGGAGGGGG 3780CACAGCAAGG GAAGCAAGTC TAGAG3805
2.如权利要求1所述的cDNA序列，其特征是所述的序列是从全反式维甲酸诱导的人食管癌细胞系EC8712中分离得到。
3.一种含有如权利要求1所述的cDNA序列的真核表达载体。
4.如权利要求5所述的真核表达载体，其中所述的真核表达载体是含有所述的cDNA序列的质粒RATS1，所述的质粒已在中国典型培养物中心保藏，保藏号为CCTCC M 95005。
5.一种如权利要求1所述的cDNA序列在制备基因治疗肿瘤的制剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其中所述的肿瘤的种类可以是鳞状细胞癌、白血病和腺癌。
全文摘要
本发明涉及一种具有促进肿瘤细胞分化功能的cDNA序列、含有该序列的真核表达载体以及该序列在制备基因治疗肿瘤的制剂中的应用。所述的cDNA序列是从由全反式维甲酸处理的人食管癌细胞系EC8712中分离得到。
文档编号A61K48/00GK1128798SQ9510129
公开日1996年8月14日 申请日期1995年2月7日 优先权日1995年2月7日
发明者吴旻, 冯骆, 王志华, 王秀琴 申请人:中国医学科学院肿瘤医院, 中国医学科学院肿瘤研究所