抗银屑病的多肽及方法

专利名称：抗银屑病的多肽及方法
背景技术：
本发明涉及免疫系统，更为具体的是，涉及修饰银屑病中病理性免疫应答的方法。
高等生物的特征之一是具有一套免疫系统，保护它们抵抗那些潜在的有害物质或微生物的入侵。当某一称作抗原的物质进入体内，并被识别为外来物质时，免疫系统就会产生抗体介导的和细胞介导的两种免疫反应。被称为B淋巴细胞，或简称B细胞的免疫细胞，能产生特异性地识别并结合外来物质的抗体。另一类称为T淋巴细胞，或简称T细胞的淋巴细胞，既能影响也能调节由细胞介导的免疫反应以最终消除抗原。
多种T细胞参与细胞免疫反应。有些能诱导特定的B细胞克隆增殖并产生抗原的特异性抗体。其它的能识别并破坏那些表面存在外来抗原的细胞。某些T细胞靠刺激或抑制其它细胞来调节免疫反应。
尽管正常的免疫系统被严密调节，免疫反应的偏差并不少见。有时候，免疫系统作用不当，将宿主的成分当作外来者起反应。这样的反应导致自主免疫疾病，即宿主的免疫系统攻击宿主自身的组织。作为免疫系统的基本调节者，T细胞能直接或间接地引起这类自主免疫疾病。
银屑病以表皮角质细胞的过度增生为特征，并伴随有发炎性浸润。该病的致病机制尚不完全清楚。在该病的发生与/或延续过程中，T细胞的激活似乎起着决定性作用。正如所知，环孢菌素A有效地改善患者的病情。
治愈或改善银屑病病情的先进而有效的方法是很需要的。这种方法应该理想地控制T细胞的不当反应，而不仅仅是减轻症状。本发明就满足了这一需要并具备上述优点。发明描述本发明提供了在个体中防止或减轻银屑病恶化的方法，该方法是给予一种肽，该肽的序列基本上具有存在于介导银屑病的T细胞表面并能引起免疫系统反应以调节这些T细胞的一种T细胞受体的序列。
本发明提供了在个体中防止或减轻银屑病恶化的方法，该方法是给予一种肽，该肽基本上具有存在于介导银屑病的T细胞表面的一种T细胞受体的非保守区序列或其片段的序列，其中该肽或片段能引起免疫系统反应以调节这些T细胞。
本发明还提供了在个体中防止或减轻银屑病恶化的组合物，它含有一种肽，该肽基本上具有存在于介导银屑病的T细胞表面的一种T细胞受体的非保守区序列或其片段的序列，其中该肽或片段能引起免疫系统反应以调节这些T细胞。
在另一实施方案中，本发明还涉及在个体中防止与银屑病有关的T细胞增殖的方法，该方法包括确定存在于介导银屑病的T细胞表面的T细胞受体的T细胞受体结合配体(binding partner)，并对给予个体该T细胞受体结合配体。
根据另一实施方案，该方法依靠抑制T细胞受体与其TCR结合配体的结合来阻止与银屑病有关的T细胞的增殖，从而防止或减轻银屑病的恶化。
本发明还提供了其它防止或减轻银屑病的恶化的方法，这些方法是靠使与银屑病特异相关的T细胞与有效剂量的细胞毒素或细胞抑制剂接触并发生特异性的反应来抑制它们的活性。
本发明另外还提供了对银屑病嫌疑患者进行诊断或预测的方法，该方法是检测源于个体的样品中具有与银屑病有关的T细胞受体的T细胞，存在具有T细胞受体的T细胞的不正常表达则指示银屑病的症状或嫌疑。
本发明提供了通过防止与银屑病有关的T细胞受体与其结合配体的接触而在个体中防止或减轻银屑病恶化的方法。
本发明提供的在个体中参与防止或减轻银屑病恶化的另一种方法是给予该个体一种具有表达控制序列的载体，该序列与编码T细胞受体，或编码基本上具有存在于介导银屑病的T细胞表面上的T细胞受体的非保守区序列的肽或其片段的核酸相连接，其中肽或其片段能够引起免疫系统反应来调节这些T细胞。
本发明还提供一些载体，该载体上有表达控制序列，该序列与编码T细胞受体，或编码基本上具有存在于介导银屑病的T细胞表面上的T细胞受体的非保守区序列的肽的核酸相连接。附图的简要描述

图1显示了Vβ3(SEQ ID NO1)、Vβ13.1(SEQ ID NO2)、Vβ17(SEQ IDNO3)的可变区序列。下划线的部分是各Vβ链的高度可变区CDR1，CDR2和CDR4。CDR2和CDR4区之间的序列描述了这两个高度可变区间的重叠。发明详述本发明提供了防止或减轻银屑病恶化的组合物及方法。本发明源于在银屑病斑块损害(plaque lesion)中的某些特定T细胞受体的优势表达这一银屑病特征的发现。Vβ3、Vβ13.1、Vβ17尤其占有优势。根据本发明的方法的治疗提供了特殊的持续的改善并避免了其它可能治疗手段所带来的问题。
用于本文的“基本氨基酸序列”或“基本序列”，当所指是氨基酸序列时，意味着所述序列或其它有某些增加、缺失或置换的序列，但这些差别基本上不影响该序列引起免疫系统反应并调节具有所需T细胞受体的T细胞这一功能。这样的序列中通常有许多其它序列与所述序列相邻。
可以使用所述序列的部分或区段，只要其足以代表所需T细胞受体或其片段，由此引起免疫系统反应来调节那些带有所需T细胞受体的T细胞，但对那些没有所需T细胞受体的T细胞则不发生作用。这些序列上的突变能很容易地得到，例如合成一条替换序列。然后可以试验并验证替换序列的效果，例如通过给脊椎动物给药。
用于本文的“片段”意味着能引起免疫系统反应以调节T细胞的TCR的非保守氨基酸序列的亚序列。用于本文的术语“非保守区”指的是可变区和VDJ区。该术语可包括那些连接或结合有附加序列或部分的片段，如肽与其它氨基酸序列或与载体偶联。因此，“肽”和“片段”可以交换使用，因为一条肽可说是T细胞受体的最普通的片段。本发明中的每一片段都有发生改变的序列，正如上所称的“基本序列”。
在本文提到的T细胞受体的“片段”、“部分”或“区段”并不意味着这些化合物必须来源于完整的T细胞受体。这些“片段”、“部分”或“区段”可用本领域技术人员众所周知的各种方法来生产，例如，人工或自动的多肽合成、整个TCR的各种克隆或酶切消化等。
用于本文的短语“引起免疫系统反应以调节T细胞”是指因具有特异性T细胞受体的T细胞的配位体而引起免疫系统修饰其活性。此类影响可能包括整个或部分T细胞的反应。例如，某个自主反应T细胞的下游调节可能是该自主反应T细胞表面的MHC分子沟里的T细胞受体肽被调节性T细胞识别的结果。或者，调节效应可能因T细胞受体肽对T细胞受体与自主反应T细胞及其MHC/肽配位体之间的相互作用的干扰而引起。这类活性修饰可被靶组织发炎程度的改善所证明。引起该效应所需要的此类肽的量在种属与个体间因多种因素而有差别，但对本领域技术人员来说，还是能确定的。
用于本文的“结合配体”指的是与TCR反应的化合物。这种化合物通常是主要组织相容性抗原(MHC)，但也可以是任何当结合TCR时能直接或间接刺激T细胞激活或增殖的化合物。这种化合物还可以是结合到TCR上的超抗原结合位点上的超抗原。
用于本文的“超抗原”指的是在TCR β链上的特异性位点优先结合到T细胞上并以非常高的频率刺激T细胞的抗原或其片段。此类超抗原可为内源性或外源性的。“频率”指的是T细胞对抗原应答的比率，对于超抗原在约1/5～1/100之间。如此，超抗原可与传统的抗原相区别，后者的T细胞应答频率要低很多，在1/104～1/106之间。超抗原通过与特异性的Vβs结合来激活T细胞，不同TCRs的超抗原结合位点已与传统的高可变区(CDRs)区别开来。这些CDRs代表被认为负责结合与MHC复合的传统抗原的TCRs区域。
用于本文的“配位体”指的是任何与另一分子反应形成复合物的分子。
用于本文的“选择性结合”指的是某一分子结合于一类分子或相关的分子群，但基本上不与其它类型的分子结合。涉及到Vβs时，“选择性结合”指结合于含有特异性Vβ的TCRs或其片段而基本上与其它缺少特异性Vβ的TCRs没有交叉反应。
用于本文的“个体”指的是任一可能患银屑病的脊椎动物，包括人。
用于本文的“减轻银屑病的恶化”指的是改善银屑病损害的病情或是降低损害中具有优势T细胞受体的T细胞的百分比。
免疫系统是宿主(自体)抵抗潜在性毒剂(异体)的基本的生物防线。这些毒剂可能是病原体，例如细菌或病毒，也可能是修饰过的自体细胞，包括病毒感染的细胞，肿瘤细胞或其它异常的宿主细胞。总之，免疫系统的这些靶子被称为抗原。免疫系统对抗原的识别迅速启动免疫机制摧毁抗原，以此来保持宿主环境的完美无缺。
T细胞的抗原特异性应归功于细胞表面的T细胞受体(TCR)。TCR是一种杂二聚体形式的糖蛋白，由两条多肽链组成，每条链的分子量接近45KD。已鉴定出两种TCR，一种由一条α链和一条β链组成，而第二种由一条γ链和一条δ链组成。这四条TCR多肽链中的每一条由含有多个不连续基因区段的分离的基因座编码。这些区段包括可变(V)区基因区段，连接(J)区基因区段和恒定(C) 区基因区段。β链和δ链还含有另外的称作多变(D)区基因区段的单元。既然D区段和单元仅仅在某些TCR基因座和多肽链中发现，那么本文中D区段和单元将被括于括号中来表示这些区仅包含于适宜的TCR链中。因此，V(D)J既指含有D区的链的VDJ序列也指缺少D区的链的VJ序列。
对于β链的可变区，称作Vβ，用于本文的鉴别特异性的Vβs的命名是采用kimura等人(Eur.J.Immuno.，17375-383，1987)的用法。
在淋巴细胞成熟过程中，单个V，(D)和J基因区段重排形成决定细胞表达的TCR的氨基酸序列的功能基因。由于可重排的V，(D)和J基因的库是多成员的，又因为这些库的单个成员实际上可以任一组合方式重排，所以完成的TCR的组成是高度多样性的，并能特异性的识别并结合生物体可能遇到的多种排列方式的结合配体。然而，某一特定的T细胞将仅有一种TCR分子，并且该TCR分子即使不是单独决定也是在很大程度上决定着T细胞对它的结合配体的专一性。
动物模型对于弄清自身免疫疾病的免疫机制贡献巨大。一种这样的动物模型，实验性过敏脑脊髓炎(EAE)，就是一种能通过免疫髓鞘碱性蛋白(MBP)在小鼠和大鼠中诱发的中枢神经系统的自身免疫疾病。该疾病临床上的特征是瘫痪或轻度虚痨，组织学上的特征是血管周围的单核细胞渗入中枢神经系统实质。该病的发生是由对MBP有特异性的T细胞介导的。从患有EAE的动物中分离出了MBP特异性T细胞的多克隆并已连续培养传代。经过体外用MBP刺激后，转移到健康宿主体内，这些T细胞克隆能迅速诱发EAE。重要的是，这些诱发EAE的T细胞不仅对同样的抗原(MBP)是特异性的，而且通常对抗原上的某个单一决定蔟也具有特异性。这些观察指出自发聚集性T细胞的分散群落对EAE的病理发生负有责任。
对诱发EAE的T细胞的TCRs的分析揭示出与该病有关的受体结构中有限的不均一性。在有关33个MBP反应性T细胞的分析中，仅仅发现两个α链的V区基因区段和一个α链的J区基因区段。在此T细胞群落中还发现了类似的β链TCR基因的限制现象。只发现有两个β链的V区基因区段和两个β链的J区基因区段。更重要的是，将近80％的T细胞克隆具有跨过β链的V-D-J区的相同的氨基酸序列。这些发现确证了具有相似抗原特异性的T细胞有共同的TCR结构这一观点，指示在消除EAE发生的免疫疗法中TCR是有效的靶物。
还建议了另一种T细胞激活的机制，其中指出内源性和外源性超抗原介导T细胞刺激作用(White et al，Cell，5627-35，1989；Janeway，Cell，63659-661，1990)。
本发明提供了有效的对银屑病的免疫疗法，避免了以前所建议的治疗方法所带来的许多问题。靠给予本发明的肽而不是被动给予异种抗体，宿主自身的免疫系统能被启动抑制自发聚集的T细胞。因此，这种抑制是持久稳固的并能参与影响抑制的任一或全部免疫机制。这种多向抑制要比单向抑制更为有效，后者靠被动给予单克隆抗体或源于体内的调节性T细胞克隆产生，由于人类MHC的非均一性，为了避免针对宿主的错误反应，要求高度个别化的治疗方法。本发明的方法也比接种减毒后的诱病T细胞有效，因后者缺少对特定T细胞表面的保护性抗原的特异性以及对抗原的各种免疫诱导。另外，接种减毒后的诱病T细胞也象源于体内的调节性T细胞克隆一样需要进行个别地治疗，同样地被工作强度所困扰。
当涉及银屑病时，本发明的组合物包括从介导银屑病的特殊T细胞中得来的TCR片段。这些肽可以是从T细胞克隆中基本上纯化的整个TCRs，单条T细胞受体链(例如α，β等)或这类链的部分片段，既可是单独存在的也可是结合中的。组合物可以是同源的如单一种肽，或可由一种以上的肽组成，每种对应于TCR中的不同的部分。进一步的，这些肽可以来自于与银屑病有关的不同的TCRs。这些肽还可具有不定的长度只要它们能引发或影响调节反应。优选的长度在5～100个氨基酸之间，更优选的是6～25个氨基酸。
在另一具体的实施方案中，可给患银屑病的个体注射T细胞受体，整个T细胞，或者含有Vβ3、Vβ13.1或Vβ17的TCRs片段。在个体内产生的对免疫系统的效应可以抑制或杀死含有Vβ3、Vβ13.1或Vβ17的T细胞，因而防止或治疗这类具有Vβ的T细胞的有害效应。此外，根据Vβ3、Vβ13.1或Vβ17在致病性T细胞介导的自身免疫性疾病或一般自身免疫性疾病的T细胞受体中达到的普遍程度，这样的组合物对防止或减轻这些别的自身免疫性疾病的恶化也可能是有效的。
用于本文的“Vβ3”指的是一个特殊的人类β链可变区的家族。Vβ3具有如下的氨基酸序列DVKVTQSSRY LVKRTGEKVF LECVQDMDHE NMFWYRQDPGLGLRLIYFSY DVKMKEKGDI PEGYSVSREK KERFSLILES ASTNQTSMYL CASS(SEQ IDNO1).见Kimura et al，EUR.J.IMMUNOL.17375-383(1987).
用于本文的“Vβ13.1”指的也是一个特殊的人类β链可变区的家族。Vβ13。1具有如下的氨基酸序列NAGVTQTPKF QVLKTGQSMT LQCAQDMNHE YMSWYRQDPGMGLRLIHYSV GAGITDQGEV PNGYNVSRST TEDFPLRLLS AAPSQTSVYF CASS(SEQ IDNO2).见Li，Y.et a1.，J.EXP.MEDICINE，1741537-1547(1991).
用于本文的“Vβ17”指的是三种T细胞受体的人类β链可变区。Vβ17具有如下的氨基酸序列DGGITQSPKY LFRKEGQNVT LSCEQNLNHD AMYWYRQDPGQGLRLIYYSQ IVNDFQKGDI AEGYSVSREK KESFPLTVTS AQKNPTAFYL CASS(SEQID NO3).见Kimura et al，EUR.J.IMMUNOL.17375-383(1987).
高度可变区或连接区对本发明的组合物是有用的。在本发明中有用的高度可变区包括CDR，CDR2，CDR3和CDR4。Vβ3、Vβ13.1和Vβ17的CDR，CDR2和CDR4的氨基酸序列见图1所示。
CDR3，也称作V(D)J区，被用作本发明的组分是因为预期与该区对应的肽所引发的T细胞免疫性对特定抗原有高度专一性。因为V，D和J区基因在成熟前的重组，跨过这些区域的氨基酸序列对每一T细胞和它的克隆来说实际上是唯一的。
而作为细菌种系中的单元，CDR2区在银屑病中也是有用的。在银屑病研究中，结果指出在渗透过表皮的被激活的T细胞中有有限数量的Vβs。因此，与CDR2区对应的肽可被选择用作本发明中的组分。如Vβ3的CDR2区DPGLGLRLIYFSYDVKMKEK G(SEQ ID NO1的片段)，Vβ13.1的CDR2区DPGMGLRLIHYSVGAGITDQ G(SEQ ID NO2的片段)以及Vβ17的CDR2区DPGQGLRLIYYSGIVNKFQK G(SEQ ID NO3的片段)都可以使用。
对这些序列的修饰作用已被考虑并包括在TCR片段的定义中，这种修饰不会影响到受体或其片段作为免疫原刺激所需的对免疫系统的效应的能力。可变区可以连接TCR的任一D和J区段。而且，Vβ3、Vβ13.1和Vβ17的代表性片段也包括在“Vβ3”、“Vβ13.1”和“Vβ17”各自的定义之中。
在另一实施方案中，所用的肽与含有致病TCRs中保守的高度同源序列的Vβ区相对应。这些保守的同源区包括传统的CDRs，如CDR和CDR2，它们常见于含有同种Vβ的T细胞；还包括超抗原结合位点，它常见于含有不同Vβs的致病TCRs。还已知超抗原结合位点就存在于高度可变区CDR4之内或附近本发明的组合物包括长度不定的肽，该肽与能引起免疫系统反应的TCR或其片段相对应。这些肽可对应于使该种TCR与其它非致病TCRs相区别的区域。这些特殊的区域可位于各个TCR多肽链的可变区，如一小段跨越V(D)J连接处的序列，因此限制着免疫系统只对那些具有这个单一决定簇的T细胞起反应。
将这些组合物给予显现出银屑病症状或显现出银屑病危险倾向的个体。若临床上确诊为银屑病就允许给予与疾病有关的特殊的TCR组合物。在那些自身免疫机制先于临床表现的疾病中，用作预防是允许的。因此，具有家族病史并有可靠预兆指示处于危险中的个体就可以接受预防治疗，在自身免疫机制袭击之前制止住它。
TCR肽可经多种可能的制剂方式给药，再加上药物学上可接受的介质。在短肽的情况下，为了增加其引起免疫系统反应的能力，这些肽可以连接上一个载体，例如KLH。组合物可包括在一种佐剂中或与佐剂结合给药，这些佐剂中的几种已为本领域技术人员所熟知。在最初的接种免疫之后，进一步还可以增强免疫。组合物按传统方法给药，其剂量应足以引起免疫反应。这些剂量很容易由本领域技术人员确定。
用于给药的合适的肽可按如下方法确定。将与靶抗原反应的疾病诱导的T细胞克隆从已感染的个体中分离。这些T细胞最好从自发聚集活性的活跃部位如银屑病损害中获得。或者，这种T细胞可从感染个体的血中得到。随后测定从这些自发聚集的T细胞中得到的TCR基因的序列。对应于选择性地代表诱病T细胞(相对于非致病T细胞)的TCRs或其部分的多肽随后可被选作疫苗，如上所述制造和使用。一种分离致病T细胞的代替方法是Albertini提供的(PCT Publication No.WO88/10314，Published on Dec.29，1988)。
另外，组合物还可包括抗个体基因型抗体，它是上述肽的内部对应体，这种抗个体基因型疫苗的制造，挑选和给药的方法都是已知的技术。见Eichmann，et al，CRC Critical Reviews in Immunology 7193-227(1987)。
在本发明的另一方面中，还考虑了防止与银屑病有关的T细胞增殖的方法。该方法包括根据以上方法确定T细胞受体结合配体并以适当的方式给予有效剂量的这类结合配体来防止T细胞的增殖。例如，在自身免疫疾病的情形下，该方法可以用来建立对自身抗原的耐性。
本发明还涉及利用抑制T细胞受体与其TCR结合配体的结合来防止与银屑病有关的T细胞增殖，从而防止或减轻银屑病的恶化的方法。可以使用在T细胞受体和其结合配体的作用位点与它们发生反应因而抑制T细胞受体接触到结合配体的配位体。例如，这样的配位体可以是对T细胞受体或其结合配体有专一性的抗体。
本发明还提供了一种在个体中防止或减轻银屑病的恶化的方法，该方法包括在个体内对含有Vβ，特别是Vβ3、Vβ13.1和Vβ17的T细胞，进行细胞毒性或细胞抑制性处理。将含有Vβ的T细胞用能选择性结合到介导银屑病的T细胞受体的Vβ区上的细胞毒剂或细胞抑制剂处理。这类试剂可以是加上了放射性或化学治疗部分的抗体。这些附加的而且有效的试剂在现有技术中是已知的。例如参见Harlow，E.& Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory(1988)，引人本文作参考。
如上所述，本发明提供了被命名为Vβ3、Vβ13.1和Vβ17的3种TCRs的β链的特殊可变区与人类银屑病密切相关这一发现。该发现使得能用本发明所提出的方法来检测、防止以及治疗银屑病。
具体地，本发明提供了一种在个体中诊断银屑病和预测对银屑病的易感性的方法，包括在个体的样品中检测含有Vβ3、Vβ13.1和Vβ17中的β链可变区的T细胞，这种含有Vβ的T细胞的异常水平存在就指示病变或可疑病变。含有Vβ的T细胞可与正常个体中的该细胞进行定性或定量的比较。这样的诊断例如还可以靠检测一部分在非银屑病相关的β链的可变区T细胞受体中不产生的Vβs来完成。可以通过使Vβs与能专一性地结合个体的Vβs的一种可检测配位体接触来检测本发明的Vβs。现有技术已知许多种这样的可检测配位体，如一种酶联抗体。此外，与编码个体Vβ的核苷酸序列互补的核酸探针，也可以用来检测这些含有Vβ的T细胞。
本发明还提供了一种防止或减轻银屑病恶化的方法，包括防止含有Vβ3、Vβ13.1或Vβ17的T细胞受体与其结合配体接触。在一实施方案中，靠给Vβ3、Vβ13.1或Vβ17结合上一种配位体来防止这种接触。在另一实施方案中，利用给Vβ3、Vβ13.1或Vβ17结合配体结合上一种配位体来阻止这种接触。接触可被已知的方法防止，例如，给个体的Vβs或给它的结合配体结合上一个抗体，给接触造成物理阻碍。
本发明进一步涉及一种依靠基因治疗来防止或减轻银屑病恶化的方法。这种方法包括使用含有与编码多肽的核酸分子相连的表达控制序列的载体。核酸分子可是DNA也可是RNA。多肽可以是能引起免疫反应的TCR或其片段，或者是可在本发明中用作组分的一种抗个体基因型的抗体。这些DNA或RNA可用现有技术中的标准方法进行分离。然后将分离的核酸利用已知技术插入到合适的载体中。将一表达控制序列连接到核酸分子上，在合适的宿主细胞中指导该核酸分子的转录和翻译。它包括提供合适的起始和终止密码子。表达载体及其使用在现有技术中已众所周知。这些方法的描述见Sambrook et a1.，Molecular Cloning，----ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，(1989)，引入本文作参考。
载体随后直接给药到个体的组织中。优选是将载体注射到个体的骨骼肌中。例如，切开一个1.5cm的切口暴露出四头肌。含10～100μgDNA或RNA质粒及5～20％蔗糖的0.1ml溶液用1分钟时间注射到暴露的约0.2cm深的四头肌里，然后缝合皮肤。DNA或RNA载体的量为10～100μl低渗、等渗或高渗蔗糖溶液或者是含2mMCaCl2的蔗糖溶液。含质粒的溶液也可通过输液长时间给药，例如20分钟。目的基因的体内表达可以依靠确定所编码的多肽的增加的产量来验证。根据的方法见Wolff et al.，Science，2471465-1468(1990).
据信经处理的细胞将对DNA或RNA的直接注射作出反应，即表达所编码的多肽达至少约60天。因此，所希望的能引起免疫反应的TCR或片段，或是抗个体基因型抗体就能被个体的细胞有效地表达，从而可作为用这些多肽来接种的替代手段。
本发明还涉及基因治疗方法中所使用的载体，它们能用现有技术中的已知方法制备。也提供了含有这些载体和药物学上可接受的介质的组合物。药物学上可接受的介质中不应含有可能降解所要核酸的成分。
如下所述的实施例是为了说明本发明而不是限制之。实施例Vβ3、Vβ13.1和Vβ17在银屑病中的优势表达本研究中的所有银屑病患者都登记在Psoriasis Research Institute(Palo Alto，CA)。临床背景信息提供在表1中。在取样至少两周前，没有任何患者受到过任何局部药物处理。使用一个Castroviejo角膜刀(Storz InstrumentsInc.，St.Louis，MO.)在患者的背部、手臂或腹部上的临床表现活跃的损害上提取6平方厘米大的厚0.4mm的表皮刮削片。样品于4℃在含1％的人AB血清的RPMI中培养过夜。
皮肤样品用一把解剖刀切碎，用含0.1％的DNase的无酶细胞(No-zyme cell)分裂缓冲液(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)于37℃处理15分钟。未消化的碎片再用含0.1％DNase的0.25％胰蛋白酶溶液处理10分钟。分散的细胞离心后，重悬于用冰预冷的PBS(加有DNase〕中溶解角质细胞(Foster C.A.et al.，J.Exp.Med.，171997-1013(1990))。收集Ficoll-Hypa9ue梯度分离后的分界面里的细胞以进一步富集淋巴细胞。外周血液白细胞(PBLs)用制造商建议的FicollHypague分离。
富集的淋巴细胞群用鼠抗入CD4，CD8，CD25单克隆抗体染色后分拣于FACStar Plus(Becton-Dickinson，Moutain View，CA)。结合细胞色素的正常鼠免疫球蛋白作为对照抗体。将CD8+(或CD8+CD25+)，CD4+(或CD4+CD25+)细胞收集起来，离心，向沉淀中加入RNazol，样品颠倒混匀然后冻存于-70℃。
根据制造厂商的说明使用RNazol B(Biotecx Laboratories，Inc.，Houston，TX)分离总RNA。加入20微克(μg)糖元(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)共沉淀RNA。同时用不含核酸的模拟RNA管作为空白对照以保证没有试剂的污染。于-20℃沉淀过夜后14,000rpm离心25分钟收集RNA，用75％乙醇洗涤沉淀。等全部乙醇挥发完毕，将空气干燥的RNA沉淀重悬于DEPC水溶液以备用于cDNA合成。cDNA合成在10μl体积中进行，使用反义Cβ引物GCGGCTGCTCAGGCAGTA(SEQ ID NO4)，该引物在终浓度为100nM时与Jβ下游将近220位处的核苷酸结合。按厂商(BRL，Gaithersburg，MD)建议的方法用Superscript Preamplification System来合成所有的cDNA。由于如此少量的RNA不可能通过260nm的光吸收定量测定，所以血淋巴细胞RNA被平衡至含有相当于皮肤细胞的总RNA等价的量，以便比较在PCR中得到的相对信号。另外，RNA的提取及分析仅在至少含有1000个分拣的细胞的样品中完成。
皮肤和血液样品的cDNA的PCR扩增同时于同一组中使用Perkin Elmer CetusThermal cycler(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)进行。在PCR及全部预备程序中都包括“水空白”对照以确定没有污染。热循环的过程如下94℃5分钟使所有RNADNA杂合体解链变性，然后进行如下循环，94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟。循环数(平均值＝33)根据加入的模板的量而变化。使用AmpliWaxgems(Perkin Elmer Cetus)的热启动PCR以减少起始错误率。
22个个体的PCR反应建立于GeneAmp管(Perkin Elmer Cetus)中的50μl体系中，每一管内含有合适的Vβ专一的引物。大多数有义引物源于Chao，Y.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，868941-8945(1989)或Wucherpfeennig，K.W.，et al.，Science，2481016-1019(1990)(Vβs 1，11，15和19)，两篇文献引入本文作参考，其它少数作了如下改变(5′-3′)Vβ6-TCAGGTGTGATCCAATTTC(SEQ ID NO5)；Vβ8-TCTGGTACAG ACAGACCATG AT(SEQ ID NO6)；Vβ12-GATACTGACA AAGGAGAAGT CTCAGAT(SEQ ID NO7)；Vβ17-TCACAGATAG TAAATGACTT TCAG(SEQ ID NO8)。这些引物与先前公开过的那些引物有些改变，这是为了囊括所有的亚家族成员(如Vβ6，8)，也为了防止关系密切的亚家族成员(Vβ12和13关系密切)间的交叉起始。全部22种引物都经过深入的序列测定以确保它们仅对所需的亚家族有专一性。在3′-端，使用了一种33P-γATP末端标记的反义Cβ引物TTGGGTGTGG GAGATCTCTG C(SEQ IDNO9)，该引物与Jβ上游约55位处的核苷酸结合。
PCR反应完成时，每个PCR反应混合液中取15μl进行6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以分辨特异性的PCR产物。每个PCR产物的放射活性可用一套AmbisRadioanalytic System(Ambix，San Diago，CA)直接于干胶上扫描得出。每块胶上的所有Vβ的PCR产物的总cpms数相加并且去除每个个体的cpm值，得到对每个Vβ的用百分数表示的值。对皮肤和血液样品的处理尽可能相同(平衡的模板，相同的循环条件，许多情况下都相同的循环数)。通过这种研究对皮肤和血液中每种Vβ的百分数进行了相对的比较。
为了测定Vβ的PCR产物的序列，使用PUC18质粒并按厂家建议用ABI 373Sequencer(Applied Biosystems，Forster City，CA)完成双脱氧循环序列分析。所得的每个序列都通过PC Gene(Intelligenetics，Mountainview，CA)对已知的人Vβ和Jβ基因库进行扫描以确立同一性。每一核苷酸序列都被翻译成所预示的氨基酸序列。
为了检查在银屑病块状损害中是否有某一特定Vβ基因的优势表达，我们从银屑病表皮和PBL中都分离出CD8+T细胞，并按上述方法确定Vβ1到Vβ20的表达百分比。推论那些参与斑痕形成的T细胞应该在原位被皮肤成分中的抗原或超抗原所刺激。因此，皮肤中某种Vβ的优势表达的标准就是它至少占有皮肤总Vβs的10％并且皮肤对PBL的相对表达比至少为2。也包括那些在皮肤中的表达非常高(超过30％)的Vβs，尽管由于在PBL中的非同寻常的高效表达使得其皮肤对PBL的表达水平之比小于2。之所以要包括这些Vβs是因为不管对于超抗原的系统激活反应是否与银屑病相关，不包括它都将掩盖皮肤中高效表达的Vβ的显著性。
如表II中所示，在十三个进行了皮肤和PBL的TCR Vβ分析的银屑病患者中，总共11个患者的Vβ3或Vβ13.1具有优势表达，例如，3个患者仅有Vβ13.1，4个患者仅仅是Vβ3而另有4个患者Vβ3和Vβ13.1都有表达优势显示。在余下两个未显示Vβ3和Vβ13.1的表达优势的患者中，检测到共同的Vβ17的表达。在此应该说明，在某些患者中研究了CD8+CD25+T细胞，而在另一些患者中，由于样品显示出较低的双阳性细胞数(在FACS上)，因此为了得到足够(至少1000)供研究的细胞，决定只检出所有的CD8+T细胞进行研究。
为了确定这些具有TCR Vβ的细胞是否存留于这些慢性斑块中，4个表达Vβ13.1(不管是否表达Vβ3)的患者又取样进行第二次试验。第二次取样或在原来的损害或在不同的位点(见表I)，对于不同的患者第一次和第二次取样间隔的时间是不同的。这些重复取样的患者的分析结果在表III中给出。如所示，患者#5019，在首次取样中表达Vβ13.1(表II)，又显示出表达Vβ13.1。优势表达Vβ3和Vβ13.1的患者#5022和#5026，也再次显示出这两种Vβs的优势表达。首次试验中优势表达Vβ3和Vβ13.1的患者#5029，在第二次取样时，保留了Vβ3的表达。根据我们设立的标准，患者#5029的Vβ13.1没有得到优势表达，但表达的绝对百分比仍然高于10％。要在此说明的是，在重复所取的样品中，两个取于原来的损害(#5026，#5029)，两个取于不同的位点(#5019，#5022)。因此，这些数据不仅提示着这些Vβs在损害中的存留，而且也提示着它们在不同位点上的普遍存在。
对分离于两个特异反应性皮炎患者的CD8+CD25+T细胞的分析(见表IV)，没有表明有同PBL比较皮肤中的Vβ3或Vβ13.1的表达水平的升高。因此，在银屑病损害中Vβ3和Vβ13.1 TCR基因的升高的表达水平的重复发现，以及在特异反应性皮炎患者中没有这些发现，都指出在银屑病斑块中这些T细胞对皮肤抗原或超抗原的原位扩张。
为了回答抗原或超抗原是否在皮肤中被这些T细胞发现的问题，我们通过测定V-D-J连接区的序列分析了它们的克隆。如表V所示，在患者#5019和#5022中可观察到皮肤中具有Vβ13.1的CD8+T细胞的单克隆(或近乎单克隆)，在患者#5026和#5029可见到明显的寡克隆。在PBL中发现的Vβ13.1序列更多的是多克隆。这些结果强烈地暗示着，有限数目的抗原决定簇比超抗原更多地参与了对这些损害中的具有Vβ13.1的CD8+T细胞的刺激作用。皮肤中的Vβ3序列，除了在患者#5029中观察到近乎单克隆外，比Vβ13.1序列更少寡克隆。然而，对具有Vβ3的CD8+T细胞的原位扩张，皮肤抗原似乎比超抗原有更多的责任，因为超抗原还刺激具有Vβ的CD4+T细胞(Kotzin，B.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889161-9165，1991；Miethke T.，et al.，Int.J.Med.Microbiol.，275264-268，1991)，与我们的发现相反，如表VI所示。对于皮肤中具有Vβ13.1的CD4+T细胞，其在两个患者中有着与PBL相比较小的升高(与CD8+T细胞相比较而言)，序列分析(表V)显示，它们比具有Vβ13.1的CD8+T细胞有更多不同的连接序列。
皮肤中抗原对Vβ3和Vβ13.1 CD8+T细胞的刺激作用还被得之于重复取样患者的序列数据所支持。如表VII所示，在3个获得V-D-J连接区序列的重复取样患者中的两个(#5022和#5029)中，无论是于同一损害(患者#5029)还是在不同位点进行重复取样，都得到了相同的序列。具有相同抗原特异性(相同V-D-J序列)的T细胞在某一损害处的存留和它们在不同损害处的存在，都反映了皮肤抗原的选择性。
表I银屑病患者的临床史

<p>表II 银屑病患者皮肤和PBL CD8+T细胞中Vβ基因表达的百分比

*在皮肤中表达百分比高于10而且至少2倍于PBL中的表达水平的Vβs，或表达百分比等于或高于30的Vβs。
表II(续)银屑病患者皮肤和PBL CD8+T细胞中Vβ基因表达的百分比

*在皮肤中表达百分比高于10而且至少2倍于PBL中的表达水平的Vβs，或表达百分比等于或高于30的Vβs。
表III银屑病重复取样患者皮肤和PBL CD8+T细胞中TCR Vβ基因的表达

*见表II
表IV特异反应生皮炎患者皮肤和PBL CD8+T细胞中TCR Vβ基因表达<

>*见表II
表V从银屑病损害和PBL中分离的CD8+T细胞的β链序列分析

*特异性Vβ的PCR产物的放射活性除以给定样品的所有Vβ产物的放射活性表V(续)从银屑病损害和PBL中分离的CD8+T细胞的β链序列分析<

表VI银屑病患者皮肤和PBL中CD4+T细胞中的TCR基因的表达

*见表II
表VII重复取样的银屑病患者皮肤CD8+T细胞的β链序列分析

*见表VYes＝是No＝否虽然本发明已参照现今最好的实施方案作了描述，但是应该理解的是，在不脱离本发明的精神实质的情况下，尚可对其进行各种修改。相应地，本发明仅被如下的权利要求所限制。
权利要求
1.一种于个体内防止或减轻银屑病恶化的方法，包括给予一种肽，该肽基本上具有存在于介导银屑病的T细胞表面的T细胞受体的序列，其能引起免疫系统反应以调节T细。
2.一种于个体内防止或减轻银屑病恶化的方法，包括给予一种肽或其片段，该肽基本上具有存在于介导银屑病的T细胞表面的T细胞受体的非保守区序列，其中该肽或片段能引起免疫系统反应以调节这些T细胞。
3.权利要求2的方法，其中的肽基本上包括T细胞受体的β链的可变区。
4.权利要求3的方法，其中的β链的可变区基本上是Vβ3，Vβ13.1或Vβ17。
5.权利要求2的方法，其中的肽基本上包括T细胞受体的β链的可变区中的CDR1，CDR2或CDR4区的氨基酸序列。
6.权利要求5的方法，其中的β链的可变区基本上是Vβ3，Vβ13.1或Vβ17。
7.权利要求6的方法，其中的肽基本上包括Vβ3序列DPGLGLRLIYFSYDVKMKEK G(SEQ ID NO1的片段)或其片段。
8.权利要求6的方法，其中的肽基本上包括Vβ13.1序列DPGMGLRLIHYSVGAGITDQ G(SEQ ID NO2的片段)或其片段。
9.权利要求6的方法，其中的肽基本上包括Vβ17序列DPGQGLRLIYYSQIVNKFQ KG(SEQ ID NO3的片段)或其片段。
10.权利要求2的方法，其中的肽基本上包括β链的CDR3区。
11.权利要求10的方法，其中的β链包括Vβ3，Vβ13.1或Vβ17。
12.一种于个体内防止或减轻银屑病恶化的组合物，包括一种肽，该肽基本上具有包含Vβ13.1的T细胞受体的β链的非保守区序列，或其片段，该肽或片段能引起免疫系统反应以调节这些T细胞。
13.一种在个体中防止与银屑病有关的T细胞增殖的方法，包括确定介导银屑病的T细胞表面上存在的T细胞受体的T细胞受体结合配体，并给予个体这种T细胞受体结合配体，其中的肽或片段能引起免疫系统反应以调节这些T细胞。
14.权利要求13的方法，其中的T细胞受体β链包括Vβ3，Vβ13.1或Vβ17。
15.一种于个体内防止或减轻银屑病恶化的方法，包括抑制T细胞受体与其TCR结合配体的结合从而防止与银屑病有关的T细胞的增殖。
16.权利要求15的方法，其中的T细胞受体β链包括Vβ3，Vβ13.1或Vβ17。
17.一种于个体内防止或减轻银屑病恶化的方法，包括使与银屑病特异相关的T细胞接触一种有效剂量的能特异性地与这些T细胞反应并抑制其活性的细胞毒剂或细胞抑制剂。
18.权利要求17的方法，其中的T细胞含有具Vβ3，Vβ13.1或Vβ17的T细胞受体。
19.权利要求17的方法，其中的试剂是一种带有附加部分的抗体，该附加部分选自放射性部分，化疗部分和化学毒剂部分。
20.一种在个体中诊断或预示银屑病嫌疑的方法，包括在从该个体所取的样品中检测含有与银屑病有关的T细胞受体的T细胞，含有T细胞受体的T细胞的非正常表达的存在指示着银屑病的发生或有这种嫌疑。
21.权利要求20的方法，其中的T细胞受体有Vβ3，Vβ13.1或Vβ17。
22.一种于个体内防止或减轻银屑病恶化的方法，包括防止与银屑病有关的T细胞受体与其结合配体的接触。
23.权利要求22的方法，其中的T细胞受体有Vβ3，Vβ13.1或Vβ17。
24.一种于个体内防止或减轻银屑病恶化的方法，包括给予该个体一种载体，该载体包括一表达调控序列，该序列与编码具有介导银屑病的T细胞表面的T细胞受体的非保守区的基本序列的一种肽或其片段的核酸相连接，其中所述的肽或其片段能引起免疫系统反应以调节这些T细胞。
25.权利要求24的方法，其中的肽基本上包括T细胞受体的β链的可变区。
26.权利要求25的方法，其中的肽基本上包括Vβ3，Vβ13.1或Vβ17。
27.权利要求24的方法，其中的肽基本上包括T细胞受体的β链可变区的CDR，CDR2或CDR4区的氨基酸序列。
28.权利要求27的方法，其中的β链可变区是Vβ3，Vβ13.1或Vβ17。
29.权利要求28的方法，其中的肽基本上包括Vβ3序列DPGLGLRLIYFSYDVKMKEK G(SEQ ID NO1的片段)或其片段。
30.权利要求28的方法，其中的肽基本上包括Vβ13.1序列DPGMGLRLIHYSVGAGITDQ G(SEQ ID NO2的片段)或其片段。
31.权利要求28的方法，其中的肽基本上包括Vβ17序列DPGQGLRLIYYSQIVNKFQ KG(SEQ ID NO3的片段)或其片段。
32.权利要求24的方法，其中的肽基本上包括β链的CDR3区。
33.权利要求32的方法，其中的β链包括Vβ3，Vβ13.1或Vβ17。
34.一种载体，包括一表达调控序列，该序列与具有介导银屑病的T细胞表面的T细胞受体的非保守区的基本序列的一种肽或其片段相连接，其中的肽或其片段能引起免疫系统反应以调节这些T细胞。
全文摘要
本发明涉及于个体内防止或减轻银屑病恶化的方法。在一个实施方案中，所述的方法包括给予个体一种肽或其片段，该肽基本上具有存在于介导银屑病的T细胞表面的T细胞受体的非保守区序列，其中该肽或片段能引起免疫系统反应以调节这些T细胞。特别是所述的T细胞受体具有Vβ区Vβ3，Vβ13.1或Vβ17。在另一实施方案中，所述的方法涉及基因治疗。本发明还涉及通过确定银屑病优势T细胞受体的存在而诊断银屑病的方法。
文档编号A61K48/00GK1138865SQ95191213
公开日1996年12月25日 申请日期1995年1月13日 优先权日1994年1月14日
发明者珍妮·C·C·张, 史蒂芬·W·布劳史特夫, 丹尼斯·J·卡罗 申请人:免疫反应公司