专利名称：用作自身免疫性疾病治疗剂的肽的制作方法
自身免疫性疾病(类风湿性关节炎，多发性硬化，溃疡性结肠炎，自身免疫性眼色素层炎和许多其它疾病)是自身的防御系统(免疫系统)不再耐受自身器官的结构而象对待侵入的病原体一样进行攻击疾病。从而损伤或甚至破坏自身组织且因此发生疼痛和身体缺陷(例如，在类风湿性关节炎中关节僵硬；在多发性硬化中一般性运动受阻，失禁，语言障碍；在溃疡性结肠炎中严重腹泻，营养缺陷和有致病后果的肠穿孔；在眼色素层炎中损伤视觉分辨力，并甚至能导致失明)。
眼色素层炎与虹膜，睫状体，玻璃体，视网膜和/或脉络膜的眼内炎症有关。炎症使虹膜常发生疼痛并能通过与其前面的角膜和/或与其后面的晶状体发生虹膜粘连而导致封闭瞳孔反应。在角膜和内侧的晶状体的细胞沉淀物以及在眼前房和玻璃体的细胞渗入物有时接着形成混浊的膜，它象一层帘子伸展玻璃体或贴在视网膜上，从而损伤视力。视网膜和脉络膜发炎出现水肿，细胞渗入物和在晚期的萎缩病变。涉及发炎的视网膜管也不少见。视神经乳突的水肿性肿胀可能进一步导致由光刺激引起的神经加工障碍。尽管以上描述的现象是部分可逆的，但因为视网膜结构的破坏是一种不可逆事件，它导致视力的持久损伤并甚至失明。
所述的眼色素层炎症状可能是其它自身免疫性疾病伴随症状，例如，风湿性或类感染疾病发生后的病症。炎症由免疫系统起动，并在其进一步过程中还有其它细胞参与炎症反应。
在大多数情况下自身免疫疾病是慢性的，要么复发，要么持续恶化。已被免疫系统破坏的组织能再生的情况很少。如果涉及神经组织如在多发性硬化或眼色素层炎中，再生是绝不可能的。这些自身免疫性疾病产生的原因在很大程度上是未知的，猜测在有些情况下是感染，由此误导免疫系统。
常规引入的治疗免疫疾病措施涉及的不仅免疫系统的自身反应(自身攻击)部分，而且抑制普通免疫反应细胞，这些细胞本来应该应用于防御侵入的病原体或肿瘤细胞。除了损伤一般的免疫防御和可能形成肿瘤外，常规的免疫抑制剂诸如甾类化合物，环孢菌素A和细胞抑制药也经常不具有免疫性且有时会有威胁生命的副作用。
对于许多(自身免疫性)疾病，根据疾病与某些组织相容性抗原(HLA，起初描述为移植抗原)的统计学相关性猜测是遗传诱因。作为一种机制，假设免疫系统混淆了病原体抗原(细胞，病毒)与自身HLA抗原。
在过去的一些年中进行了许多尝试来干扰免疫系统的调节，以便重建自身耐受性与病原体防御间的正常平衡。在其它方面，已进行了许多尝试通过机体的“免疫学特许”位点(“immun-privilegierte”Bereiche)诱导免疫耐受性。一个特许位点的例子是哺乳动物消化道，可用于诱导对蛋白质分子(“抗原”)的耐受性(“口服耐受性”)。这一机制假设持续引起对消化的食物的免疫反应抑制。因此口服“自身抗原”(自身蛋白质，在自身免疫性疾病的情况下诱导抗该蛋白质的攻击性免疫反应)能诱导耐受性，即对自身组织的非反应性，即使自身攻击位点它是受攻击的组织在空间上远离消化道。口服耐受性诱导是一种免疫抑制形式，它具有高度特异性，即免疫反应仅影响涉及的抗原。因此预期不会有与那些一般免疫抑制相比的副作用。在自身抗原的口服应用中尚未观察到且预期不会有不期望的药理-毒理学影响。
在有些自身免疫性疾病中自身抗原是已知的，因此可用于特异性治疗。在有些情况下，诱导的免疫反应仅针对一种抗原(在类风湿性关节炎中是胶原II，在糖尿病中是胰岛素)，在自身免疫性眼色素层炎的例子中，已知来自眼光感受器层的两种蛋白质能在动物模型中诱导眼色素层炎，并且在眼色素层炎病人中可检测到针对它们的免疫反应。
它们是视网膜S-抗原和光感受器内视网膜结合蛋白(IRBP)。此外在这些蛋白质内的某些特定部分(抗原决定基)如果作为肽使用也能诱导眼色素层炎。如果口服利用S-抗原，IRBP或由此衍生的(口服耐受性)时可抑止由这些物质诱导的实验性眼色素层炎(例如参见Thurau，S.R.，Chan，C.-C.，Suh，E.，Nussenblatt，R.B.；Induction of oral tolerance toS-antigen induced experimental autoimmune uveitis by a uveitogenic 20merpeptide.J.Autoimm.4.507-516(1991))。
蛋白质抗原的供应是主要的困难。而且有许多缺点1)一般来说该抗原必须从天然组织中分离。在这一过程中可能出现感染(病毒、类病毒、细菌)或用(逆转录)病毒或细菌DNA的转染。
2)该抗原最好用耗资巨大的遗传技术合成。
3)在不同情况下，蛋白质如蛋白质抗原的长期贮存是困难的。在不利情况下，即使昂贵的保存条件仅能在短期内保证蛋白质的稳定性，活性和效力。
4)由于细胞表面交联的出现形成象食物过敏或接触过敏的过敏反应的危险随蛋白质抗原而增加。这在自身免疫性疾病病人中尤其重要，因为过敏反应的病人数增加。
这些问题构成本发明的基础，并设法解决。
该问题将以权利要求书中所述的肽来解决。
一方面本发明涉及具有下列序列的由7到30个氨基酸残基组成的肽A-Leu-B-Ser-C-Thr-Ala-Ala-D，其中B和C各为一个氨基酸或多个氨基酸，A和D各为单聚体的或多聚体的有机基团。
而且还表明与上述核心序列Leu-B-Ser-C-Thr-Ala-Ala-相比羧基末端延伸两个氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)的肽也具有显著的治疗特性。
因此本发明的另一权利要求是由具有下列序列的9到30个氨基酸组成的肽A-Leu-B-Ser-C-Thr-Ala-Ala-Asp-Glu-D，其中B和C也是各为一个氨基酸或多个氨基酸，A和D各是单聚体的或多聚体的有机基团。
在研究过程中可证实根据本发明的肽与T-细胞受体和HLA(人白细胞抗原)的结合不连续地分布于核心序列内的几个氨基酸上。在这些结合所必须的氨基酸之间有些位点是不参与结合的残基，因此可以替换。看来连续的氨基酸序列对功能是非决定性的。但同时与T细胞受体和HLA抗原相互作用的肽内的单个位置是决定性的。
因此，分别在具有7或9个氨基酸的核心序列前和后(位置A或位置D)以及在核心序列内(位置B和C)，氨基酸交换不会丢失主要的生物学功能。
可变位置B和C位于7或9个残基长的核心序列内，代表1个或几个氨基酸。此变化仅限于毗邻范围内，因为核心序列内的空间条件对核心序列的单个位置与HLA分子和T细胞受体的生物学有关相互作用起关键性作用。我们的研究表明B和C优选分别代表单个氨基酸。
特别是本发明涉及根据上述特征的肽，其中B代表丝氨酸或苏氨酸。在实验中已反复证实，核心序列中位置B的氨基酸可替换。在研究过程中还表明，用精氨酸替代基团B不产生治疗活性肽。
根据本发明的肽的优选形式中，C指苏氨酸，色氨酸，谷氨酸或丝氨酸。但在这种情况下，也可在核心序列的该位置导入其它氨基酸而不明显改变治疗效果。因此，在根据本发明的肽的位置C中的氨基酸似乎对HLA-肽-T细胞受体-复合物内的结合并非十分重要。
当根据本发明的肽整合进HLA-肽-T细胞-受体复合物时，关于核心序列的氨基和羧基末端的基团A和D似乎位于结合位点外面，因此几乎不具有生物学功能的意义。因此许多不同长度和不同位阻的基团可位于该位置而不明显影响该肽的治疗效力。
例如单体或多聚体的有机基团A和D各自独立地包含一个或几个氨基酸，有机脂肪族基团，特别是饱和的或不饱和的脂肪酸基团或还有脂多糖。
如果A和D是氨基酸残基，那么权利要求1的序列的氨基和羧基末端残基数根据下列规律来计算氨基末端基团A为0到23个氨基酸，氨基末端基团D为0或高达最大值(23-氨基末端基团A的氨基酸数)的氨基酸残基。
对于根据权利要求9的其核心区序列在羧基末端延伸两个氨基酸的肽来说，氨基和羧基末端残基的数目根据下面规律来计算氨基末端基团A为0到21个氨基酸，羧基末端基团D为0或高达最大值(21-氨基末端基团A的氨基酸数)的氨基酸残基。
根据本发明，术语肽还涉及那些出现了N-末端和C末端取代的氨基酸链。用于取代的例子有乙酰化，用脂肪酸酯化，用糖连接，用C1到C12烷基或烷酰基烷基化。
以上定义的根据本发明肽优选包括7或9到20个氨基酸的残基，特别是8或9到16个氨基酸残基。
该肽优选包含下面的序列Am-Ala-Leu-Asn-Glu-Asp-Leu-Ser-Ser-Trp-Thr-Ala-Ala-Asp-Thr-Dn，其中A和D是一个或几个氨基酸，m和n代表根据下面公式的氨基酸残基数m＝0到16，n＝0或高达最大值(16-m)。
可鉴别一个肽，它不是来自视网膜蛋白，但关于其治疗效力比前面描述的视网膜S-抗原衍生物有效得多。如果口服用药，这一具有序列Ala-Leu-Asn-Glu-Asp-Leu-Ser-Ser-Trp-Thr-Ala-Ala-Asp-Thr的本发明的14聚体肽在抑制眼色素层炎中最有效。到目前为止，这种肽尚未以任何方式与眼色素层炎有着功能性联系，无论是该疾病的诱导，还是其治疗。
这种肽的另一具体特征是当口服给药时，它既抑制S-抗原特异性免疫反应的能力，又降低蛋白质化学上与IRBP无关的反应性。
本发明的主题是本发明的肽在制备用于治疗自身免疫性疾病和具体用于治疗眼色素层炎的治疗组合物中的应用。
本发明的另一主题是根据本发明的肽在制备用于针对视网膜S-抗原，针对光感受器内视网膜结合蛋白(IRBP)和/或针对人白细胞抗原进行免疫的药物中的应用，所述肽含有序列Ala-Leu-Asn-Glu-Asp-Leu-Ser-Ser-Trp-Thr-Ala-ALa-Asp-Thr。
根据本发明生产的上述药物组合物可作为溶液，悬液或压缩形式使用。在这些情况下，除活性成份之外通常加入添加剂和载体。
施用药物后，可经口服途径诱导耐受性。应每日施用每千克体重10μg到10mg肽的剂量。
根据本发明的肽的效力基于对与其它自身抗原交叉反应的免疫系统的调节效力。因此本发明的肽可期望应用于多种自身免疫性疾病的治疗。
在本文中免疫系统的反应性并不局限于血液淋巴细胞。体液免疫反应(抗体)，巨噬细胞和免疫系统的其它细胞也可以是根据本发明的肽的可能靶点。
在动物实验中已证实了治疗效力。用肽B27PD，相应的视网膜蛋白(视网膜S-抗原(S-Ag)或IRBP)，视网膜S-抗原的肽(形式P35PDSAg的截短等价物)，不相关对照蛋白质(鸡蛋卵清蛋白(OVA))，不相关对照肽(B7PD)或生理盐水溶液(PBS)饲喂几组8-16只Lewis大鼠(年龄6-8周，体重大约200克)。
上述肽B27PD，PDSAg和B7PD的氨基酸序列如下，以一个字母代码给出氨基酸命名B27PDA-L-N-E-D-L-S-S-W-T-A-A-D-TPDSAgF-L-G-E-L-T-S-S-E-V-A-T-E-VB7PD A-L-N-E-D-L-R-S-W-T-A-A-D-T。
这些肽中，B27PD和PDSAg是致眼色素层炎的，即用这些肽免疫受试者后它们将患眼色素层炎。与此相反B7PD不具有任何致眼色素层炎特征。
以每次200μg剂量肽，1mg剂量的蛋白，溶于PBS的剂量隔日口服使用这些肽。经过第三次和最后分别施用蛋白质或肽2天后，经过用视网膜抗原(S-抗原或IRBP，分别为35或20μg/动物在佐剂中乳化)免疫诱导眼色素层炎，这在大鼠模型中诱导眼色素层炎是众所周知的。
未口服耐受的对照动物，在免疫后10到14天出现疾病。出于动物的保护原则，在阳性对照组中最后动物发病后2到4天终止实验。
口服施用抗原的保护效果表现为疾病的好转过程或临床症状完全消失，这经过组织学检查得以证实。组织学评价包括组织发炎症状和视网膜的破坏分级，临床分级涉及明显可见的眼结膜和前面部分的发炎症状，并且不必与视觉分辨率相联系。
在上述动物模型实验中获得的结果描绘于下面图中。
图1显示了口服施用不同抗原(口服耐受性)后S-抗原诱导的眼色素层炎的强度。
图2显示了口服施用不同抗原(口服耐受性)后IRBP诱导的眼色素层炎的强度。
图1证实在用S-抗原诱导的情况下，通过口服B27PD(PDSAg9％，S-Ag41％)与饲喂对照蛋白质(卵清蛋白)的组相比临床症状可减少到16％。
另一组织学评价揭示在B27PD饲喂的动物组中与卵清蛋白的饲喂的对照组相比眼色素层炎减轻57％，饲喂S-抗原后，眼色素层炎也减轻57％，饲喂S-抗原肽后，眼色素层炎仅减轻14％。
图2显示，在用IRBP PBS，S-抗原和对S-抗原有活性的PDSAg诱导无治疗特性。然而与在PBS饲喂组中获得的最大病症相比，经B27PD饲喂可将临床症状减少到75％，饲喂IRBP本身后，眼色素层炎的临床强度减轻到25％。
可证实肽B27PD发生多种改变而不明显损失其效力，这些改变包括1)可在N末端和C末端延长该肽。
2)可在N末端和C末端将肽截短一些(高达6个)氨基酸残基。
权利要求
1.一种7到30个氨基酸的肽它具有序列A-Leu-B-Ser-C-Thr-Ala-Ala-D，在此B和C各自为1个氨基酸或各个氨基酸，A和D各自为单体的或多聚体的有机基团。
2.权利要求1的肽，其中B是丝氨酸或苏氨酸。
3.权利要求1或2的肽，其中C是苏氨酸，色氨酸，谷氨酸或丝氨酸。
4.权利要求1至3之一的肽、其中单体的或多聚体的有机基团A和D彼此独立地包含一个或几个氨基酸，有机脂肪族残基或脂多糖。
5.权利要求4的肽，其中A和/或D是饱和的或不饱和的脂肪酸残基。
6.权利要求1至5之一的肽，它包含7到20个氨基酸。
7.权利要求6的肽，它包含8到16个氨基酸。
8.权利要求1的肽，它具有序列Am-Ala-Leu-Asn-Glu-Asp-Leu-Ser-Ser-Trp-Thr-Ala-Ala-Asp-Thr-Dn，此处A和D是一个或几个氨基酸，m和n代表根据下式的氨基酸数m＝0到16，n＝0或高达最大值(16-m)。
9.一种9到30个氨基酸的肽，它具有序列A-Leu-B-Ser-C-Thr-Ala-Ala-Asp-Glu-D，此处B和C分别为一个氨基酸或几个氨基酸，A和D分别为单体或多聚体有机基团。
10.权利要求9的肽，其中B是丝氨酸或苏氨酸。
11.权利要求9或10的肽，其中C是苏氨酸、色氨酸、谷氨酸或丝氨酸。
12.权利要求9到11之一的肽，其中单体的或多聚体的有机基团A和D彼此独立地包含一个或几个氨基酸残基，有机脂肪族基团或脂多糖。
13.权利要求12的肽，其中A和/或D是饱和的或不饱和的脂肪酸残基。
14.权利要求9至13之一的肽，它包含9到20个氨基酸。
15.权利要求14的肽，它包含9到16个氨基酸。
16.根据权利要求1至15之一的肽在治疗自身免疫性疾病或治疗眼色素层炎中的应用。
17.权利要求1至15之一的肽在抗视网膜S-抗原的免疫，抗光感受器内视网膜结合蛋白质(IRBP)的免疫，或抗人白细胞抗原的免疫中的应用，所述肽含有序列Ala-Leu-Asn-Glu-Asp-Leu-Ser-Ser-Trp-Thr-Ala-Ala-Asp-Thr。
全文摘要
本发明涉及一种包含7到20个氨基酸的肽，它具有序列A-Leu-B-Ser-C-Thr-Ala-Ala-D，此处B和C各为一个氨基酸或多个氨基酸，A和D各为单体或多聚体的有机基团，特别是其中B是丝氨酸、苏氨酸或亮氨酸和/或其中C是苏氨酸、色氨酸、谷氨酸或丝氨酸。特别是单体或多聚体有机基团可互相独立地包含一个或几个氨基酸残基，有机脂肪族残基，特别是脂肪酸或脂多糖。根据本发明的肽优选用于制备治疗自身免疫性疾病，特别是治疗眼色素层炎的药物组合物。优选地在本文中根据本发明的肽用于制备抗视网膜S-抗原或光感受器内视网膜结合蛋白的免疫中的药物组合物。
文档编号A61P27/02GK1146208SQ95192646
公开日1997年3月26日 申请日期1995年4月21日 优先权日1994年4月21日
发明者格希尔德·韦尔纳, 斯蒂芬·图劳 申请人:格希尔德·韦尔纳, 斯蒂芬·图劳