专利名称：制备棘酸的方法和含有棘酸的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于制备棘酸(acanthoic acid)((-)-海松-9(11)，15-二烯-19-酸)的方法和含有该酸的药物组合物，所述药物组合物用于治疗由白细胞介素-1(下文中称为“IL-1”)或肿瘤坏死因子-α(下文中称为“TNF-α”)的过量产生引起的疾病。
背景技术：
韩国五茄属Nakai(Acanthopanax koreanum Nakai)(五茄科)上生土长于韩国的Cheju岛，惯常用作为治疗神经痛，瘫痪，腰痛等等的药物。已经从其根皮分离出包括下列通式(A)的棘酸的各种有用成份(Kim，Y.H.和Chung，B.S.，J.Nat.Pro.，51，1080(1988))。 已经有人报道棘酸具有各种药理作用，例如，止痛和消炎活性，这种活性是由于其能够抑制白细胞的迁移和前列腺素E2(PGE2)合成引起的，并且显示了非常低的毒性，例如，施用到大鼠时最低致死剂量(MLD)为1000mg/kg(Lee，Y.S.，“(-)-海松-9(11)，15-二烯-19-酸)，韩国五茄属Nakai的一种成份的药理研究”，博士论文，韩国汉城大学，药学系，1990)。
正如公知的，IL-1是一种参与宽范围的人类防御和免疫机理的调节因子(参见，例如，Dinarello，D.A.，FASEB J.，2，108(1988))。最初发现IL-1是由活化的巨噬细胞产生的，现在已经用各种细胞，例如，成纤维细胞，角质化细胞，T细胞，B细胞和脑的星形细胞产生和分泌IL-1；并且已经有人报道它具有各种功能包括刺激CD4＋T细胞的增殖(Mizel，S.B.，Immunol..Rev.，63，51(1982))；通过与T细胞受体(TCR)结合刺激胸腺Tc细胞的细胞致死作用(McConkey，D.J.，等人，J.Biol.Chem.，265，3009(1990))；诱导各种参与炎性机理的物质，例如，PEG2，磷脂酶A2(PLA2)，和胶原酶的产生(Dejana，E.，等人，Bolid，69，695-699(1987))；诱导肝中急性期蛋白质的产生(Andus，T.，等人.，Eur.J.Immnol.，123，2928(1988))；升高血管系统的血压(Okusawa，S.，等人，J.Clin.Invest.，81，1162(1988))；诱导其它细胞因子例如，IL-6和TNF的产生(Dinarello，C.A.，等人，J.Immunol.，139，1902(1987))等等。
正如已经报道的，IL-1涉及各种免疫疾病，例如，类风湿性关节炎(Nouri，A.M.，等人，Clin.Exp.Immunol.，58，402(1984))，肾脏移植后的排斥机理(Mauri和Teppo，Transplantation，45，143(1988))，和败血病(Cannon，J.G.，等人，LymphokineRes.，7，457(1988))。还有人报道当以大剂量施用到人体时IL-1可以诱导发热和疼痛(Smith，J.，等人，Am.Soc.Clin.Oncol.，9，710(1990))。
已经有人报道最初在用BCG(BacilleCalmette-Guerin)或LPS(脂多糖)治疗的动物血清中发现的TNF-α(Carswell，E.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，72，3666(1975))，可由各种细胞产生，例如，活化的巨噬细胞和成纤维细胞产生。此外，有人报道TNF-α具有下列功能杀死纤维肉瘤L929细胞(Espevik和NissenMeyer，J.Immunol.Methods，95，99(1986))；刺激成纤维细胞的增殖(Sugarman，B.J.，等人，Science，230，943(1985))；诱导参与炎性应答的PGE2，花生四烯酸等等的产生(Suttys，等人，Eur.J.Biochem.，195，465(1991))；诱导IL-6或其它生长因子的产生(Van Hinsbergh，等人，Blood，72，1467(1988))等等。
已经有人报道TNF-α直接或间接地与各种疾病有关；所述疾病的例子是由锥虫，疟原虫属菌株等等传播的传染病(Cerami，A.，等人，Immunol.Today，9，28(1988))；类似系统性红斑狼疮(SLE)和关节炎的自身免疫疾病(Fiers，W.，FEBS，285，199(1991))；AIDS(Mintz，M.，等人，Am.J.Dis.Chlld.，143，771(1989))；败血症(Tracey，K.J.，等人，Curr.Opin.Immunol.，1，454(1989))；和感染(Balkwill，F.R.1989，Cytokines in CancerTherapy，Oxford University Press)。
这些观察资料支持了调节IL-1和TNF-α的产生对于维持人体免疫系统的自身稳定和对于相关疾病的治疗和预防的重要性。
因此，已经有人建议了许多调节白细胞介素产生的方法。例如，有人报道通过利用天然存在的IL-1受体抑制剂(IL-1 Ra)抑制IL-1与其受体的结合可以降低动物模型中败血症，关节炎，炎症等等的发生(Dinarello，C.A.和Thomopson，R.C.，Immunol.Today，12，404(1991))，和已经有人建议了利用特定的抗体抑制IL-1活性的方法(Giovine，D.F.S.和Duff，G.W.，Immunol.Today，11，13(1990))。对于IL-6，通过利用抗IL-6的或IL-6受体的抗体已经抑制了患有由于IL-6的过量分泌引起的骨髓瘤的患者的骨髓细胞的增殖(Suzuki，H.，Eur.J.Immuno.，22，1989(1992))。
但是，没有人报道特异性抑制IL-1和TNF-α产生的物质或方法，因此，需要继续努力发现抑制IL-1和TNF-α产生的特异性抑制剂。
发明概述因此，本发明的一个目的是提供用于从韩国五茄属Nakai的根皮制备棘酸的方法。
本发明的另一个目的是提供含有治疗有效量的棘酸和药物可接受的载体的药物组合物，该药物组合物可用于治疗由于IL-1或TNF-α的过量产生引起的免疫疾病。
附图简述结合附图根据本发明的描述显而易见地知道本发明的上述和其它目的和特征，其中
图1显示棘酸对人单核细胞和巨噬细胞的细胞毒性；图2描述了棘酸对人单核细胞和巨噬细胞中IL-1的产生的抑制作用；图3提供了棘酸对人单核细胞和巨噬细胞中TNF-α的产生的抑制作用；图4表示了棘酸对大鼠肺泡巨噬细胞和淋巴细胞中TNF-α的产生的抑制作用；图5证实了棘酸对人单核细胞和巨噬细胞中的反应氧类产生的抑制作用；图6表示了棘酸对NIH3T3成纤维细胞增殖的抑制作用；图7表示棘酸对大鼠肺成纤维细胞中胶原的产生的抑制作用；图8反映了棘酸对大鼠肺组织中胶原的产生的抑制作用；图9显示棘酸对大鼠肝硬变的抑制作用；图10证实了棘酸对患有诱发性肝硬变的大鼠血清中的GOT和GPT含量的作用；以及图11记录了棘酸对鼠肝硬变的作用。
发明的详细说明本文所引用的全部参考文件这里都把它们的全文作为参考。
按照本发明，已经发现了从韩国五茄属Nakai提取的棘酸具有特异性抑制IL-1或TNF-α产生的能力；所以，含有有效量的棘酸可用于治疗各种由IL-1或TNF-α过量产生引起的免疫疾病。
所述棘酸可以使用各种有机溶剂如甲醇，二乙醚，或其混合物等等从韩国五茄属Nakai根皮提取。特别是，可按照本发明描述的下文中的优选实施例制备棘酸。
向1千克的韩国五茄属Nakai于燥根中加入1-3升，优选2升甲醇；在20-60℃温度，优选的是室温下把该混合物加热至少10小时，优选的是12小时，并过滤。重复上述步骤，优选重复三次，在减压下浓缩合并的滤液获得甲醇提取物。
用200-400毫升，优选300毫升水和200-400毫升，优选300毫升二乙醚萃取100克所述甲醇提取物。从中分离出二乙醚部分并减压浓缩获得二乙醚提取物。利用己烷和乙酸乙酯的混合物作为洗脱剂进行硅胶柱层析纯化所述提取物而获得棘酸。
所述棘酸具有抗炎和抗纤维形成作用，抑制胶原合成和反应氧类产生并且降低血清中的GOT和GPT的含量。所以，可用于药物组合物治疗由于IL-1或TNF-α的过量产生引起的免疫疾病，如败血症，风湿性关节炎，炎症，肝硬变和矽肺。
本发明的药物组合物可以含有药物可接受的赋形剂，载体或稀释剂和作为活性成分的棘酸。可以采用任何常规方法制备该药物制剂。
在制备组合物中，最好把该活性成分用一种载体混合或稀释，或者用一种载体包埋，这种载体可以是胶囊，香囊或其他装载形式。当载体是稀释剂时，它可以是具有作为活性成分的载体，赋形剂或介质的固体，半固体或液体物质。所以，该组合物可以是片，丸，粉末，香囊，醑剂，悬浮液，乳浊液，溶液，糖浆，气雾剂，软和硬明胶胶囊，无菌注射液，无菌包装的粉末等等。
适当的载体，赋形剂或稀释剂的例子有乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯树胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，甲基羟基苯甲酸盐，丙基羟基苯甲酸盐，滑石，硬脂酸镁和矿物油。
该制剂中还可以加入润滑剂，湿润剂，矫味剂，悬浮剂，防腐剂等等。本发明组合物可以采用本领域所熟知的任何方法进行制备，以便在患者服用后提供快速，持续或缓慢释放活性成分。
该药物组合物能够通过各种途径如口，经皮，皮下，静脉和肌肉引入进行给药。通常活性成分的每日用量可以在1-500μg/kg体重，优选30-300μg/kg体重，并且能够一次或多次服用。但是，应当明白该活性成分的实际给药量必须取决于各种相关因素如待治疗状况，所选择的给药途径，不同患者的年龄和体重以及患者症状的严重程度；所以，上述剂量不是用于限定本发明的范围。
下面的制备例和实施例用来更详细地说明本发明但不限定其范围；除非有其他说明，本文下面实施例中所用的试验方法是按照给出的参考实施例进行实施的。
而且，除非作其他特别说明，下面所给出的固体和固体混合物，液体和液体以及固体和液体混合物的百分比是以wt/wt，vol/vol和wt/vol为准。
制备例棘酸的制备把1.7千克左右的己完全干燥的韩国五茄属Nakai根皮切细并用4升左右的甲醇在室温下提取24小时，然后过滤。把该提取步骤重复三次并减压浓缩合并的提取液，获得200克左右的甲醇提取物。
用600毫升的蒸馏水和600毫升的二乙醚萃取所有所述的甲醇提取物。分离出二乙醚层并减压浓缩，获得110克的二乙醚提取物。
利用己烷和乙酸乙酯(20∶1(v/v)-5∶1(v/v))进行硅胶柱层析纯化所有所述二乙醚提取物获得30克活性物质，产量为1.76％。
利用薄层层析(TLC)，与标准物相比，鉴定出活性物质为棘酸(Kim，Y.H.和Chung，B.S.，J.Nat.Pro.，51，1080(1988))，还可以进一步由1H-NMR，13C-NMR，MS和IR确定。
参考例1用于检测的细胞的分离(1)人单核细胞，巨噬细胞和嗜中性细胞的分离把正常人的外周血进行肝素处理并用等量的Hank氏平衡盐溶液(HBSS无Ca2+和Mg2+)稀释。把稀释的血液放入含有堆积在密度为1.119的Ficoll-Hypaque层上的密度为1.077的Ficoll-Hypaque(Sigma，St.Louis，MO，U.S.A.)层的离心管中，然后以700×g离心30分钟从密度为1.077的Ficoll-Hypaque层和血清层之间获得单核细胞，并且从密度为1.077的Ficoll-Hypaque层和密度为1.119的Ficoll-Hypaque层之间获得嗜中性细胞。使用4℃HBSS(无Ca2+和Mg2+)洗涤两次分离出的细胞并将其悬浮于含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，Utah，U.S.A.)的RPMI 1640培养基(Gibco，GrandIsland，NY，U.S.A.)中。把该悬浮液加入24孔培养平板(Costar，Cambridge，MA，U.S.A.)的孔中并在37℃温育2小时获得单核细胞，巨噬细胞和嗜中性细胞。
(2)成纤维细胞的分离使用如下对Phan，S.H.等在J.Clin.Invest.，76，241(1985)中所述的方法的改良方法从大鼠中分离成纤维细胞。
在无菌工作台上把大鼠用乙醚麻醉并分离肺。把肺切成2-4mm大小的小片并悬浮于含有胶原酶和0.5％胰蛋白酶的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，在37℃把该组织消化2小时。用无菌纱布过滤该悬浮液除去没消化的组织等等。使用PBS把分离出的细胞洗涤两次或三次并悬浮于含有10％胎牛血清(FBS，Hyclone，Logan，UT，U.S.A.)的RPMI1640培养基(Gibco，GrandIsland，NY，U.S.A.)中。把该悬浮液加入培养平板的孔中并在5％二氧化碳温育器(Lunaire Environ，Inc.，Pennsylvania，U.S.A.)中37℃下温育1-2天。使用RPMI 1640培养基洗涤该平板除去不能附着在平板上的细胞。向平板中加入新鲜的培养基并继续温育直到形成融合层。在下面试验中使用不超过5次传代培养的细胞。
在如上所述的相同条件下在含有10％FBS的RPMI 1640培养基中培养NIH3T3成纤维细胞(ATCC CRL 1658)。
(3)使用棘酸处理细胞以各种不同的浓度把棘酸加入5×105/ml上述步骤获得的细胞中，在5％二氧化碳温育器中把细胞在37℃下预温育1小时。然后，向其中加入硅石(100μg/ml)和含有2％FBS的RPMI 1640培养基各1毫升并且在如上述相同条件下把细胞培养48小时。收集培养物的上清液并在1,500rpm离心分离10分钟除去这些细胞和硅石。把所获得的上清液在PBS中进行透析并用0.2um的过滤注射器过滤，然后，把滤液贮存在-20℃下。
参考例2棘酸细胞毒性的测定采用下列步骤测定棘酸的细胞毒性。
按照参考例1(3)的步骤，分别使用在制备例中获得的并在相同条件下温育的0.1，1，10或100μg/ml的棘酸处理在实施例1(1)中所获得的各5×105个细胞/毫升的单核细胞和巨噬细胞。根据Alley，M.C.，等在CancerRes.，48，589(1988)中所描述的方法，把各培养物以1毫升/孔的量加入培养平板的孔中并向各孔加入0.5mg的3-4，5-二甲基噻唑-2，5-二苯基-四唑翁溴酸盐(MTT，Sigma)。在37℃下温育4小时后，把培养物离心分离除去上清液。把各100μl酸化异丙醇(0.04N HCl溶于异丙醇中)加入各孔的细胞中以洗脱由活细胞产生的甲，并且使用一台ELISA读数器(Titettek multiskan Mcc/340)在540nm测定光密度(O.D.)(图1)。
图1显示了当把没有用棘酸处理的对照组的光密度看作100％时，样品光密度与棘酸的浓度的相对值。当由于棘酸的细胞毒性，单核细胞和巨噬细胞的成活率下降时，能够引起光密度下降的甲的产生也在减少。直到棘酸的浓度达到10μg/ml，使用棘酸处理过的样品与对照组也没有显著性差异。所以，可以确认在低于10μg/ml的浓度下棘酸没有细胞毒性，本文以后全部试验都是在这个浓度范围内进行的。实施例1棘酸对入单核细胞和巨噬细胞中IL-1产生的抑制使用0.1-100μg/ml的棘酸温育参考例1(1)中获得的单核细胞/巨噬细胞1小时并使用100μg/ml的硅石处理48小时。把培养物离心分离获得上清液，然后，将上清液在PBS中透析。下面根据Grey描述于Cellular Immunology，64，293-303(1981)的方法测定透析液中IL-1的活性。
把悬浮于含有10％FBS的RPMI 1640培养液中的1×107细胞/ml的C3H/HeJ鼠胸腺细胞用1μg/ml的植物细胞血凝集素(PHA，Burroughs Wellcome，Research TrianglePark，NC，U.S.A.)处理，把该悬浮液各100μl加入一个96孔培养平板(Costar，平底)的孔中。向各孔中加入50μl所述透析液和含10％FBS的RPMI1640培养液。然后，在37℃5％二氧化碳下把平板温育72小时。在温育完成前16小时，以0.5μCi/孔将3H-胸苷加入孔中。温育完成后，把细胞收集在玻璃纤维滤器中并使用液体闪烁计数器(Beckman)测定掺入的3H-胸苷的量。
图2显示了当以没有使用棘酸处理的对照组的3H-胸苷掺入量看作100％时，掺入的3H-胸苷的量与棘酸的浓度的相对值。从图2可以看到，棘酸是以依赖于浓度的方式抑制人单核细胞/巨噬细胞中IL-1的产生的。
实施例2棘酸对人单核细胞和巨噬细胞中TNF-α产生的抑制根据实施例1中相同的方法用棘酸处理人单核细胞和巨噬细胞，并且根据如J.Biol.Chem.，260，2345(1985)描述的Aggarwal的方法采用细胞溶解检测法确定TNF-α的活性。
将TNF-α依赖性L929成纤维细胞(ATCC CCL1)悬浮于含有5％FBS的RPMI1640培养基中并且以3×104细胞/孔的量加入到96孔培养平板中。将该板在37℃温育2小时使细胞吸附到培养平板上。然后除去培养基并且向每个孔中加入1μg/ml的放线菌素D(Sigma)和50μl的实施例1获得的单核细胞和巨噬细胞的培养物透析液。将每个孔中FBS的最终浓度调至5％并且在37℃5％二氧化碳中将细胞温育24小时。
温育完成之后，除去培养基并且用PBS洗涤细胞二次，用溶于20％甲醇中的5％的结晶紫溶液染色5分钟。用PBS洗涤细胞三次并且干燥。然后，向每个孔中加入100μl的33％的乙酸使染料释放，然后利用ELISA读数器用570nm阅读滤光片和405nm的参照滤光片确定每个孔中获得的样品的O.D.值。根据相当于内部对照组，即rHu TNF-α(Genzyme)的O.D.值计算出释放染料的量。
如图3中所示的，3.5μg/ml或以上的棘酸抑制TNF-α的产生至少为90％。
实施例3棘酸对大鼠肺泡巨噬细胞和淋巴细胞中TNF-α产生的抑制作用把大鼠用氯胺酮麻醉并向大鼠的气管鳃中插入一只无菌的薄管再用一只30ml的注射器重复注射三次并吸取10mlRPMI 1640培养基获得大鼠的肺泡巨噬细胞和淋巴细胞。把所获得的细胞以400xg离心分离5分钟，悬浮于50ml含有10％的FBS的RPMI 1640培养基中，然后在37℃温育2小时使这些细胞粘着在培养平板上。用PBS把该平板洗涤两次除去肺泡漂浮的细胞获得肺泡巨噬细胞和淋巴细胞。
把肺泡巨噬细胞和淋巴细胞各以2×105个细胞/孔的量加入24孔培养平板的孔中并向每个孔中加入10μg/ml的棘酸。将细胞在37℃预培养1小时并且用100μg/ml的硅石处理3天。在PBS中透析该培养物。按照实施例2中所述的步骤使用TNF-α依赖性L929细胞系测定透析液中的TNF-α的活性。
正如从图4看到的，棘酸对大鼠肺泡巨噬细胞和淋巴细胞中TNF-α的产生也有抑制作用。在图4中，培养基，Si和Si+棘酸分别表示没有处理的对照组，硅石刺激的样品和棘酸处理又硅石刺激的样品。
实施例4棘酸对反应氧类产生的抑制作用我们知道炎性反应是包括从被各种刺激物刺激的免疫细胞中分泌各种细胞因子如IL-1；由该细胞因子刺激的其他免疫细胞产生磷脂酶A2，溶媒体酶，反应氧类等等；和由上述产物诱发的组织坏死这些串联反应(Pruzanski，W.和Vadas，P.，Immunol.Today，12，143(1991))。通过测定棘酸对反应氧类如H2O2和O2的抑制作用来证实棘酸阻断炎性反应的能力。
如下使用一台具有96孔微平板的微型测量器来测定H2O2的量。向含有RPMI1640培养基的各孔中加入5×105个嗜中性细胞，并且再向各孔中加入25μl的辣根过氧化物酶(500μg/ml；II型，Sigma)和75μl的酚红(1mg/ml)。此后，将细胞用10，20和50μg/ml的棘酸处理1小时，用10-7M的十四酰佛波乙酸酯(PMA)刺激细胞，然后在37℃培养60分钟。温育完成后，把3M的NaOH以25μl/孔的量加入这些孔中来终止反应并使用ELISA读数器(DynatechLab.Inc)测定620nm处的O.D.来判定与酚红氧化相关的颜色变化。使用由稀释的H2O2(Sigma)制得的标准曲线来测定H2O2的量。
为了测定所产生的O2-的量，把悬浮于RPMI 1640培养基中浓度为1×106个细胞/800μl的嗜中性细胞加入24孔平板的一部分孔中并向空余的孔中加入10μg/ml过氧化物歧化酶(SOD，Sigma)。把该平板在37℃下培养2分钟，并且把细胞色素C(3mg/ml，Sigma)以100μl/孔的浓度加入这些孔中。用10，20和50μg/ml的棘酸处理细胞1小时并加入10-7M的PMA促进剂在37℃下反应20分钟。向这些孔中加入1mM的N-乙基顺丁烯二酰亚胺(Sigma)来终止反应并在1,600xg把培养基离心分离10分钟获得上清液。使用一台紫外可见分光光度计(Kontron Instrument，Milano，Italy)测定550nm处的由细胞色素C的还原引起的上清液的颜色变化。所产生的O2-的量可以使用SOD的浓度来表示，SOD能够在20分钟抑制1×106个细胞的细胞色素C的还原，或者使用细胞色素C的消光系数(E550nm＝1.83×104mM-1cm-1)来表示。
从表I可以看到，50μg/ml的棘酸能够抑制85％的H2O2的产生，和72％的O2-的产生。这种结果表明棘酸对炎性反应具有强抑制活性。表I棘酸对人嗜中性细胞中反应氧类产生的抑制作用
另一方面，重复上述相同的步骤测定由5×105个人单核细胞和巨噬细胞所产生的H2O2和O2-的量，其中的人单核细胞和巨噬细胞使用10μg/ml的棘酸在37℃下处理了1小时，然后用100μg/ml的硅石进行刺激。从图5可以看到，棘酸处理并硅石刺激的单核细胞和巨噬细胞(Si+棘酸)与仅用硅石处理的对照组(Si+med)相比H2O2和O2-的量显著降低。
实施例5棘酸对成纤维细胞增殖的抑制作用成纤维细胞的增殖或胶原的合成大大地增加了纤维化的发生。为了证实棘酸对成纤维细胞的增殖的作用，用10μg/ml的棘酸处理人单核细胞和巨噬细胞并且按照参考例1(3)描述的方法培养。在PBS中透析该培养物，向培养平板的每个孔中加入50μl的透析液。向每个孔中加入5×103细胞的NIH3T3成纤维细胞(ATCC CRL 1658)并且在37℃，5％CO2中培养5天。向培养物中加入3H-胸苷之后，将细胞继续培养16小时。利用液体闪烁计数器确定细胞中掺入的3H-胸苷的量(图6)。正如从图6看到的，与仅用硅石处理的对照组(si+med)相比，在棘酸处理并硅石刺激的成纤维细胞(si+棘酸)中显著地抑制了成纤维细胞的增殖。已经有人推论这种抑制作用是由于棘酸降低了白细胞介素或其它引起纤维化的纤维形成生长因子的产生，或诱导抗纤维形成因子引起的。
实施例6棘酸对胶原合成的抑制我们已知IL-1和TNF-α是能够引起大鼠成纤维细胞的纤维发生和诱发成纤维细胞的胶原合成的细胞因子(Kang，H.S.等，Korean.J.Immunol.，14,193(1992))。为了证实棘酸对IL-1和TNF-α作用的抑制能力，测定它对大鼠肺成纤维细胞和肺泡组织中胶原合成的抑制作用。采用间接ELISA方法测定大鼠肺成纤维细胞的培养物中所产生的胶原量，通过测定羟脯氨酸的浓度并使用内部对照组的标准曲线计算其中胶原的量来决定肺泡培养物中所产生的胶原量。
为了测定大鼠肺成纤维细胞培养物中所合成的胶原量，把作为内部对照组的胶原(Sigma，I型)完全溶于含有1mg/ml胃蛋白酶的1M乙酸中，并使用包被缓冲液(0.05M碳酸盐，pH9.6)把该溶液以1μg-16pg的浓度范围连续稀释5倍。把稀释的溶液以100μl/孔的量加入平底微滴平板(Dynatech，Immulon 2)的孔中。
另一方面，使用快速真空干燥器(Savant，Hieksville，NY，U.S.A.)把1ml参考例1(2)中所获得的大鼠肺成纤维细胞的培养物上清液浓缩10-20倍并溶于100μl包被缓冲液(0.1M NaHCO3，0.02％NaN3；用Na2CO3把pH调节到9.6)，以100μl/孔的量把该溶液加入孔中，然后在4℃下包被过夜。
用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween 20，pH7.4)把平板洗涤三次，并且把1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma)以100μl/孔的量加入孔中。在室温下温育平板2小时来封闭没被包被的部分。用上述相同的缓冲液洗涤平板四次，然后以100μl/孔的量向孔中加入用稀释缓冲液(0.05M Tris-HCl，1mM MgCl2H2O，0.15M NaCl，0.02％NaN3，1％BSA，0.05％Tween20，pH8.1)稀释了1,000倍的碱性磷酸酶-结合的兔抗山羊IgG(Cappel，Durham，NC，U.S.A.)。
在37℃下温育平板2小时，然后用上述相同的缓冲液洗涤平板三次。以100μl/孔的量向孔中加入用底物缓冲液(0.05MNaHCO3，10mMMgCl2·6H2O，pH9.8)稀释的1mg/ml浓度的对硝基苯基磷酸盐，并且用一台ELISA读数器在405nm测定培养物的O.D.。由O.D.值与内部对照组的胶原量的关系计算出所产生的胶原量。
正如从图7看到的，用棘酸预处理的肺成纤维细胞培养物中合成的胶原量显著下降。在图7中，Si+PBS和Si+棘酸分别表示用硅石刺激的样品和棘酸处理又硅石刺激的样品。
而且，为了测定大鼠肺泡组织中所合成的胶原量，按照如下所述测定羟脯氨酸的量。
在一只Pyrex试管(Corning，Rochester，NY，U.S.A.)中把0.1-0.2g的大鼠肺泡组织与1ml的PBS混合，然后将其粉碎。用一台超声发生器(Heat system，W-380)破碎所获得的组织提取物，向其中加入1ml盐酸并把该混合物在120℃的干燥烘箱中干燥过夜。用冰箱冷冻所获得的物质，在冷冻干燥器(Labconco)中冻干并向其中加入1ml蒸馏水完全溶解。把50μl所获得溶液加入一只微量离心试管中并向其中加入50μl蒸馏水稀释该溶液。作为内部对照组，把顺式-γ-羟基-L-脯氨酸(Sigma)稀释到20μg-150pg的浓度范围内，并且把100μl的各种稀释溶液加入微量离心试管中。向试管中加入0.9ml的由1.41g的氯胺-T(N-氯-对甲苯氨磺酰钠)溶于10ml的正丙醇制得的溶液和10ml蒸馏水，将其在室温下贮存20分钟。然后，向所获得的混合物中加入1ml醛/高氯酸溶液，该溶液是由15g对二甲基氨基苯甲醛溶于62ml正丙醇，然后向其中加入26ml60％的高氯酸使总体积为100ml而制成，把所获得的溶液完全混合，将该微量离心试管放入65℃的水浴15分钟使显色，在650nm测定样品的O.D.，使用内部对照组的标准曲线计算样品中羟脯氨酸的量。
从图8的结果可以看到，当把正常大鼠肺泡组织(正常)所产生的胶原量当作100％时，只用硅石处理(Si+PBS)或用硅石和二甲亚砜处理(Si+DMSO)的大鼠肺泡组织中所合成的胶原量显著升高，同时，用硅石，DMSO和棘酸(Si+棘酸)处理的大鼠肺泡组织中所合成的胶原量下降50％。上述结果表明棘酸具有抗纤维产生的能力。
实施例7棘酸对IL-6产生的抑制作用为了证实棘酸的体内抗纤维形成活性，建立试验矽肺模型并且确定给药后棘酸对矽肺模型的作用。
根据如下如Am.J.Pathol.，109，27-36(1982)描述的Lugamo的方法通过从其中除去污染物例如三氧化二铁而精炼硅石。将硅石粉(Sigma，St.Louis，MO；直径为5μm的颗粒的含量为至少80％)悬浮于1N HCl中并且加热该悬浮液，用蒸馏水洗涤。通过在200℃干加热2小时将得到的物质灭菌，然后用于下面的试验。
通过腹膜内注射2-5毫克氯酮胺使7-8周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠和5周龄的雌性ICR小鼠麻醉。利用一个1ml注射器将溶于0.5ml无菌PBS中的50毫克硅石注射到大鼠的小支气管中，将溶于0.1ml无菌PBS中的2mg硅石注射到小鼠中。从硅石注射第二天，给大鼠和小鼠口服10毫克的棘酸，每周2次，共给药12-18周。
此后，根据常规方法，将大鼠和小鼠的肺分离出来，并在10％中性福尔马林中固定，铺开成4mm厚包埋于石蜡中。将包埋的组织切成5mm厚的片，用苏木精曙红，Masson′s三色和羟基链霉素染色，然后用显微镜观察(图9)。
正如从图9看到的，对于用硅石和DMSO(A)给药的大鼠的肺，观察到许多显示过量的纤维化和相连组织的形成，过量的单核细胞浸润，纤维化和透明化的连合肉芽肿，而在用硅石，DMSO和棘酸(B)给药的大鼠的肺观察到仅有互相不联合和稍微的纤维化的尺寸较小的肉芽肿。这些结果显示棘酸能够抑制试验矽肺。
实施例8棘酸对肝硬变的抑制肝硬变(肝硬化)的特征是整个肝脏纤维化，纤维间隔把肝脏的实质细胞全部破碎以及再生瘤形成。它们多数源于慢性肝炎或慢性酒精中毒，准确的原因还不清楚。在肝硬变患者中，细胞因子如参与发炎和纤维产生的TNF-α处于增多状态；所以，通过抑制TNF-α的活性可以测定棘酸对肝硬变的抑制。
为了在四周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠诱发试验性肝硬变，采用Nakataukasa，H.，等，J.Clin.Invest.，85，1833-1843(1990)的方法，给大鼠一周两次腹膜内注射1.0ml/100g体重的四氯化碳溶液(50％四氯化碳+50％玉米油)，并且在注射四氯化碳的同时给大鼠一周两次口服各0.2ml的韩国五茄属Nakai的甲醇提取物和棘酸。开始试验13周后，把每只大鼠用乙醚麻醉并从心脏中获得血液样品来测定血清谷氨酸草酰乙酸转氨酶(sGOT)值和血清谷氨酸丙酮酸转氨酶(sGPT)值(图10)。
从图10可以看到，当与从使用CCl4，DMSO和作为对照组的PBS处理的大鼠中获得的血液样品进行比较时，从使用韩国五茄属Nakai的甲醇提取物(CCl4+A.M.)和棘酸(CCl4+棘酸)处理的大鼠中获得的血液样品的sGOT值分别降低20％和30％。但是，从使用棘酸(CCl4+棘酸)处理的大鼠中获得的血液样品的sGOT值下降40％以上。
为了对上述大鼠分离出的肝脏进行病理组织学检查，把肝脏在10％的中性福尔马林水溶液中固定，切成4mm厚，然后包埋在石蜡中。把包埋的组织切成5mm厚的片，用苏木精曙红和Masson氏三色染色，然后在显微镜下观察(图11)。
从图11可以看到，在只使用四氯化碳的大鼠(B，C和D)的肝脏中，有变厚纤维带的肝小叶的瘤的形成比正常肝脏(A)更明显。在使用四氯化碳和韩国五茄属Nakai的甲醇提取物(E)给药的大鼠的肝脏中，尽管表现出了肝硬变的症状，但是，肝小叶瘤周围的纤维带比从只使用四氯化碳处理的大鼠中获得的肝脏的肝小叶瘤周围的纤维带更薄，与从只使用四氯化碳处理的大鼠中获得的肝脏的瘤相比，许多瘤形成不完整，并且与从只使用四氯化碳处理的大鼠中获得的肝脏的肝细胞的再生变化相比，肝细胞的再生变化下降。在使用四氯化碳和棘酸(F)的大鼠的肝脏中，对肝硬变的抑制作用低于E组。
下列制剂例仅用于详细说明而不是对本发明范围的限定。
制剂例使用下列组分制备硬明胶胶囊用量(mg/胶囊)活性成分 20干淀粉160硬脂酸镁 20总量 200mg把上述组分混合并以每个单位胶囊200mg的量填充到硬明胶胶囊中。
在上述具体实施例描述本发明的同时，我们应该清楚可以作出的各种改良和变化并且它们也属于下列权利要求所限定的本发明保护范围内。
权利要求
1.一种药物组合物，含有治疗有效量的棘酸和药物可接受的载体，用于治疗由白细胞介素-1或肿瘤坏死因子-α过量产生引起的免疫疾病。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述免疫疾病是由胶原合成、反应氧类过量产生、成纤维细胞增殖或血清中GOT和/或GPT水平增加引起的。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述疾病是败血症，炎症，类风湿性关节炎，肝硬化或矽肺。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述棘酸是从韩国五茄属Nakai提取的。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述棘酸是用有机溶剂提取的。
6.一种用于制备棘酸的方法，包括下列步骤向韩国五茄属Nakai根皮中加入甲醇；在20-60℃温度下把该混合物加热2-8小时或在室温下加热至少10小时，过滤该被加热的混合物获得滤液；浓缩滤液获得甲醇提取物；用水和二乙醚萃取所述甲醇提取物获得二乙醚组分；浓缩获得二乙醚组分获得浓缩液；利用己烷和乙酸乙酯的混合物作为洗脱剂进行硅石胶柱层析纯化所述浓缩液。
全文摘要
用于制备(-)-海松-9(11)，15-二烯-19-酸(棘酸)的方法和含有该酸的药物组合物，所述药物组合物用于治疗由白细胞介素-1或肿瘤坏死因子-α的过量产生引起的疾病。
文档编号A61P11/00GK1150758SQ95193619
公开日1997年5月28日 申请日期1995年6月7日 优先权日1994年6月13日
发明者边光浩, 崔仁杓, 姜馨植, 李晶埈, 金荣镐 申请人:韩国科学技术研究院