信号蛋白质和肽的渐进修饰，超激动剂与拮抗剂的制作方法

专利名称：信号蛋白质和肽的渐进修饰，超激动剂与拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明的科学领域本发明涉及生物活性蛋白质和肽的化学修饰技术的领域。特别是关于应用化学修饰以得到具有优良的性质或具有新的甚至拮抗性质的蛋白质或肽。且，本发明还涉及一种用渐进化学修饰，一种生物原则，作结构-功能分析的新方法，也就是信号肽的催化活性及成功的消除导致为一种很有效的急性骨髓性白血病细胞的抑制剂。
如所说明，但并非作为局限，我们出示人类IL-3的化学修饰，一种经修饰后也具实质的治疗价值的蛋白质。本专利说明书也包括本发明治疗范围内的特定实例。应用的方面有两个对一发明来说是重要的可能应用方面一个方面是具有优良性质的IL-3(超激动剂)或另一方面是具有相反作用或新的性质的IL-3(拮抗剂)。在本专利说明书中超激动剂为例如一种具有低抗原性和/或较高生物活性和/或较高稳定性的IL-3。
IL-3超激动剂的可能应用为-脊髓切除治疗后，如骨髓移植诱导治疗后或放射意外事故后的红细胞相减少。
-具有IL-3受体的细胞同步细胞周期的诱导，例如白血病的化学治疗。
-从细胞的数量和细胞的活性两方面增强依赖IL-3的细胞后代的诱导，用于治疗疾病如蠕虫感染，结核病真菌感染和某些病毒感染。
-选择性的向除淋巴细胞外的含核细胞派生骨髓，例如用于烧伤和非同源的皮肤移植。
一些，但非所有的，信号物质拮抗剂(具有拮抗或细胞抑制活性)的应用实例，特别是IL-3，为-骨髓移植中骨髓细胞的抑制和/或中和(neutralization)。
-自动免疫疾病，癌症和造血器官中的髓抑制，如镰刀细胞贫血和地中海贫血(thallisemia)。
-治疗涉及具有IL-3受体细胞的所有癌症，特别是几乎所有类型的急性骨髓性白血病或慢性骨髓性白血病，B-细胞淋巴癌，和被IL-3刺激的其他类型的癌，例如某些滤泡细胞癌。
-向自动免疫性疾病如关节炎，风湿性关节炎和中枢神经系统疾病的组织通过抑制或消除含有IL-3受体的淋巴细胞来诱导自身耐受性。这也能导致效应器细胞如嗜酸性粒性白细胞的生成减少和消除。最后，与这些细胞的直接相互作用使其直接治疗嗜酸性细胞综合症也是可能的。这在蠕虫感染急性期和例如对医药的过敏性反应也是非常重要的。
-例如用杀死效应器细胞或抑制其数目治疗嗜酸性细胞综合症如嗜酸性细胞胃炎和肠炎，肋膜炎，肉芽肿，窦炎，肺炎，哮喘，Churg Strauss综合症和其他脉管炎休克综合症的处治。
-消除或抑制具有IL-3受体的细胞，如淋巴细胞和/或效应器细胞如嗜酸性粒性白细胞，以治疗过敏症。在这些情况下抑制过敏，和诱导对抗原的耐受性两者都是可能的。
-其他涉及IL-3作用的过敏性反应。
-处治以阻止由IL-3调节的粘连刺激的转移。
-处治传染性疾病，例如抑制在血流中有过量生长因子存在的急性期。
-由抑制B-细胞和B-细胞抗体的产生(它们保护HIV-病毒对抗宿主细胞的抵抗)治疗HIV-感染和/或AIDS。
对其它生长因子，如其它白细胞介素1-8，GM-CSF，TNF和γ-IFN，上述这些应用的一种或多种也可以提述，这些生长因子也是按照本发明修饰的良好候选物。以此“IL-3”将被其他信号物质所代替。因为各种不同物质在各种疾病中的相互作用模式可以因物质而不同，也可发生一些协同的效应。所以这些也包括在本发明中。最后，可以增加或特指下列的应用。
-抑制IL-1以抑制IL-1刺激的黑素瘤的转移和肺癌的形成。
-抑制IL-1以抑制阿尔茨海默疾病。
-抑制IL-2以抑制毛细血管破裂综合症。
-抑制IL-2以抑制牙周炎。
-抑制IL-4以抑制牙周炎。
-抑制IL-4以抑制IL-4刺激的病毒，例如小鼠的放射白血病病毒。
-抑制IL-5以抑制IL-5刺激的呼吸道感染。
-抑制IL-6以抑制风湿性关节炎。
-抑制IL-10抑制分枝杆菌感染。
体内的实例表明存在有效地抑制AIDS-病毒感染的可能性。这种抑制是基于减低抗体水平，这是由抑制产生抗体的B-细胞而达到的。这种能导致有效的抑制AIDS的事实可归因于下列的原因(1)HIV-病毒感染间质(hystiocytic)细胞(巨噬细胞样细胞)，这种感染优选的是经抗体的调理素作用。趋巨噬细胞性和这些间质细胞感染的必要性以持续感染已在AIDS Res.and Human Retroviruses 9669(1993)和参考文献中加以描述。减少抗体水平，这种类型的感染可被抑制。(2)拮抗体能够保护HIV和/或HIV-感染的细胞，抵抗细胞的免疫性。这解释了HIV感染无症状期的总体抵抗力的缺陷，尽管在体外中和抗体水平很高并显示出细胞的抵抗力。如实例中所说明的，抗体水平的降低能造成有效的细胞免疫性以对抗病毒和病毒感染的细胞并甚至消除病毒。因此，例如以拮抗剂抑制B-细胞，能导致HIV感染的治疗。
因为也可由分子生物学产生修饰的信号蛋白质，因此这些突变的蛋白质，DNA-组建和它们的用途也被认为在本发明的范围之内，应是可以理解的。以此，可以包括含有这种肽和/或蛋白质密码组建的基因治疗。基因治疗的用途在于产生和排泄超激动剂或拮抗剂的细胞。所以，在一个实例中也有关于组建具有减低稳定性的生长因子可能性的细致工作。这特别能够用于与拮抗作用的联合，形成一种选择性给药，因此，拮抗剂的高速降解能将作用限制在很局部的环境中。这在实体肿瘤的基因治疗中特别有兴趣，如果有这样一个细胞在肿瘤中或靠近肿痛，特别是此肿瘤将经受最大效应的暴露。如果产生的信号肽有附加的不稳定性，那么肽的效应会非常受局限，则可期望其产生很少的副反应。在实例中有一个是说明产生低稳定性的信号肽是可能的。因为这种肽也能用缺失和/或取代突变产生，因此这种基因治疗的应用和基因治疗组建也被认为是包括在本发明应用的范围之内的。
本专利说明书在化学修饰的应用，蛋白酶处理和质谱法方面也详细说明。这种方法可应用于每一种肽或蛋白质的每一个修饰，只要它能够特异性地例如用蛋白酶断裂。本说明书的定量的结构-功能分析部分包括渐进化学修饰，蛋白酶处理，激光解吸质谱法与生物测定成功的联合应用。所以，此方法应用于任何能被修饰的，特异性断裂的和具有生物活性的肽和/或蛋白质的分析，也被认为是在本发明的范围之内。也可能应用其他的质谱分析技术如电子喷射质谱法，这种方法特别适合于例如用外蛋白酶(exoprotease)处理后。
最后，本发明的说明书也公开了带有多于一价电荷的金属离子，特别是锌离子的重要性，其重要性特别表现在催化活性和随之而来的效用方面。因此由控制(局部)金属离子的浓度来影响生长因子的作用是可能的。因为一般金属离子浓度的效应有最适宜值，所以任何低于或超出此适宜值的浓度均导致生长因子效用的降低。这可以控制生长因子的效用。用这种方法也可用金属，优选的为锌离子，达到间接治疗的效果。这可用油膏的形式治疗皮肤疾病，如Wrath′s。使用吸入喷雾剂型用于治疗肺部疾患也是可能的。本发明的背景人类白细胞介素-3白细胞介素-3，首次由T-细胞中分离出来，为一种糖蛋白，表明作用于骨髓细胞。已经表明在有或没有其他生长因子的情况下，可以由这些骨髓细胞诱导各种血液细胞的形成。人类IL-3在1987年被Dorssers等人克隆，它们应用人类cDNA库并与小鼠DNA探针杂交(Gene 55115(1987))。人类白细胞介素-3的结构-功能关系已经发表了一些关于人类白细胞介素-3的结构-功能关系的文章(J.Biol.Chem.26621310(1991)；J.Clin.Invest.901879(1992)；J.Immunol.14683(1991)；EMBO J.102125(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8911842(1992))。
在他们的研究中，他们全都使用分子生物学技术，如缺失和取代突变的生成。在应用取代突变时，选择是基于IL-3与其他种类(小鼠，罗猴，猴，长臂猿)氨基酸的同源性，或基于慎重改变极性或结构。缺失突变时是通过除去蛋白质的各部分，考察其生物活性的重要性。因为涉及突变蛋白质(突变蛋白)精制的实际问题，这些突变蛋白质均未核对其主结构的变化。这是一个主要的问题，因为这些结构的变化通常是会发生。如所描述的，有时它们甚至是有意引入的。结果，关于涉及各种氨基酸与生物活性的关系，只能在有最大的保留的情况下才能说明。
本发明用不同的途径。天然的IL-3用为起始原料。使用逐步渐进地增加修饰，在化学反应中引入超选择性。与第一次生物活性变化同时发生的修饰可以用特异的蛋白酶和新形式的质谱法容易地定域。结果，重要的氨基酸残基可被快速的定位，同时最小的变化(因此最大的控制)可在引入或改变期望的性质中达到。不需要纯化修饰的物质因此也没有在精制中损失的问题。这也能使二级结构的确认变得容易。因此本发明与分子生物技术比较是一种改进，这是因为本途径比分子生物的途径更方便，更好确认和更快。修饰的生长因子超激动剂经过对各种生长因子的许多结构-功能的研究，发现了具有改进活性的突变蛋白。例如在欧洲专利申请EP-131816中其叙述的目标为得到提高生物活性和/或低副反应的β-干扰素。也提供了许多化学修饰的各种例子例如欧洲专利申请EP-236987叙述IL-2的修饰得到一种低毒性和低免疫性的并具有改进的体内清除动力学的物质。专利申请EP-0442724叙述PEG化的IL-6，其为一种具有较长半留存期和增强了生物活性的产物。专利申请W088/01511叙述IL-2琥珀酰化，由此成功地提高了溶解度。在这些专利应用中除了使用误差学试验方法即随机适度地修饰，得到一种或几种分子的修饰外没有任何的修饰策略。况且，会发生精制中实质上的损失，在IL-6琥珀酰化的例子中也有这种情况，只得到10％收率的期望蛋白质。在这些发明中没有做过修饰定位的工作。
本发明中几乎没有损失并且能够很好地进行修饰定位。更且，渐进化学修饰甚至使在分子中一个位置进行一个氨基酸残基特定的修饰成为可能，正如实施例1和2所说明的。虽然大多数修饰是使用的非可逆的试剂，但也可以使用可逆的试剂，这也能进行其他残基的很特异的修饰。拮抗剂在欧洲专利申请EP-0413383A1中叙述了人类IL-3拮抗作用的突变体。然而在这个案例中只涉及保留的活性与其受体结合能力的比较关系，而并未显示真正的对天然IL-3的活性抑制。
在专利申请PCT/US93/11197和PCT/US93/11198中权利要求涉及所有种类的IL-3突变体，但在这些案例中也没有真正抑制活性的支持内容。加之，具有最低活性的突变体不可能也是最好的抑制剂，因为结构变形的机遇要比特定地消除其催化活性的机遇高的多。
有其他受体的真正拮抗剂的报道牛生长激素(Endocrinology 1302284(1992))，小鼠白细胞介素-2(EMBO J.113905(1992))，人肝细胞生长因子(Biochemistry319555(1995))，IL-1(Scand J.Immunol.3627(1992))和IL-4(J.Exp.Med.1782213(1993))。在所有这些出版物中没有叙述修饰的策略拮抗剂均为结构-功能分析研究的副产物。更且，达到明显抑制作用所需的抑制剂浓度平均要比天然生长因子的浓度高100倍。此浓度对这些拮抗剂的临床价值是有害的。
生成生长因子拮抗剂的仅有策略曾应用于人类的生长激素(Science2561677(1992))。这是基于破坏激素两个受体结合部位中的一个部位。同样，在此案例中受体结合能力降低系数为50，所以对比于生长因子需要使用成问题的过量抑制剂。
然而，用本发明可以得到可能应用于临床的抑制，甚至可能得到增强受体结合能力的抑制。这可用生长因子在与受体结合后显示其某种催化活性的假说来加以解释。此假设可由IL-3含有催化的锌离子的事实加以支持(Biochem.Biophgs.Res.Commun.187859(1992))。生长因子不必含有完整的催化中心。只有在生长因子-受体结合中使催化中心成为完整是完全可能的。所以，有关的化学修饰应尽可能特异性地指向那些直接或间接参与这种与锌结合和/或催化的残基而不使与受体的结合能力成为不正常。起始原料可以是任何含蛋白质或肽的物质。可是，因为锌离子能保护蛋白质不变性，或许需要使分子可逆地变性并加入螯合剂从分子中除去。做为一种说明，但不是作为对本发明的一种局限。叙述了IL-3用碘代-乙酸盐修饰。在有关的pH下此修饰是指向His-残基的烷基化。可是这中方法也可由本领域人员用其他的试剂容易地进行。关于其它参与催化活性和/或锌结合的氨基酸的修饰也可同样用所述的方法。这些残基也可以用其他化学方法或分子生物学方法，例如用缺失或取代突变，容易地修饰。更且这个仅只限于IL-3。在各种细胞因子超家族受体中具有明显的同源性例如白细胞介素2-7Epo和GM-CSF。在特异性锌结合上也发现IL-2 IL-6 GM-CSF和γ-IFN具有相同的作用。本发明可应用于更多的信号肽和/或蛋白质也是可以想象的，因为例如胰岛素，人类生长激素和催乳激素也具有特异的锌结合性质。更且，已经发现某些细胞系的IL-3可被例如胰岛素代替。最后，生长因子的烷基化在生成拮抗剂或细胞抑制剂方面也可能有其它的机制。所以，一般烷基化，优选的为碘代-乙酸盐被认为是本发明的独立途径。所以，所有上述的应用和/或修饰的物质和/或DNA-组建和它们的应用也在本发明的范围之内。抗AIDS治疗如已经讨论过的，本发明可能应用于对抗AIDS。必须提供比现行可能性更好的与AIDS对抗的方法
在Csatary等人的专利USA 5215745中叙述了一种免疫治疗抗AIDS的特异方法。在此案例中，鸟类副粘液病毒(avian paramyxovims)感染和/或鸟类轮状病毒(avianrotavims)的特异病毒感染方法用来增加CD4正性细胞的数量。这能在最大限度的导致延缓疾病，因为新生成的CD4正性细胞在短时间后将被HIV感染。相反，我们的发明导致有效的细胞免疫-应答，以对抗逆转录病毒(retroviruses)。
Berzofsky等人的专利USA 5081226是以特异免疫一应答对抗逆转录病毒进行治疗。在此案例中，例如产生抗HIV糖蛋白160/120复合物的抗体。在我们的相当本发明的研究中，这种途径可导致保护HIV和它在间质细胞(histiocytic cells)中结合，因此甚至可促进疾病。结果此方法不能说明是有效的。
为此，专利USA 5256767叙述一种无包膜病毒亚单位疫苗。这种方法的倒退是基于这种事实，即亲脂性的核部分不能在很低浓度下在MHC中最好地表达，所以不能提供有效的保护。
疫苗是基于结合上述两个专利的目的的灭活病毒。
与上述问题相反，在我们的实施例7中我们叙述了在体内HTL
(AIDS Researchand Reference Reagent Program Catalog，NIH Publication No．91-1536，Bethesda，MD，USA)在低水平的抗体下在体内被消除。在正常条件下，已知寡克隆密集HTL
引起持续的逆转录病毒感染。这也从John Moore组内的一同工作的人因针意外事故被
感染来说明(AIDS.Res.Hum.Retrovir.6:307(1990)和J.Clin.Invest.91:1987(1992))。相反，从我们的例子可以推论如果抗体水平低，这些病毒能被消除。B-细胞的产生和随之而来的抗体产生能被各种生长因子所刺激(例如IL-1-7和IL-11)。所以，用这些生长因子的拮抗剂来完成抗AIDS的治疗是符合逻辑的。如此，AIDS的治疗也被认为是本发明的一个应用。化学修饰乙酸，二氧杂环己烷，赖氨酸盐酸盐和MES得自Sigma，修饰剂自Fluka得到。
缓冲剂乙酸盐/NaOH用于pH5.0的修饰，MES/NaOH用于pH5.5，6.0和6.5的修饰。pH7.0用NaH2PO4/NaOH缓冲液。制备10倍浓度的贮备液，用0.22微米的过滤器直接过滤。
反应混合物包括50mM缓冲液，2mg/ml hIL-3和分别为3mM的乙酸酐或琥珀酸酐。10倍浓度的贮备液在实验当天新鲜配制。hIL-3的修饰在30℃进行过夜。修饰后用SDS-电泳测定，说明IL-3未被降解。生物活性的测定MO-7细胞为Dr.I.P.Touw(Erasmus University of Rotterdam，荷兰)赠送的礼品，RPM1培养基得自Gibco(Paisly，UK)，补料小牛血清得自Hyclone(Logan，Utah，USA)。细胞培养基由带10％牛血清的RPM1组成。在正常细胞组织培养中也加入100ng/ml的IL-3。
首先制备10倍的贮备液；在细胞培养基中含有从10μg/ml到1ng/ml范围，以3倍连续稀释制备，完全混匀后，25微升的贮备液加入到225微升的细胞培养基中，随后在37℃培养。六天组织培养用2×105MO7细胞/ml，10天组织培养用4×103MO7细胞/ml。在组织培养后，过夜用氚标记胸苷掺入测定生物活性。从至少二个独立的生长-应答曲线测定出50％最大刺激浓度的平均值(和范围)。修饰物的相对活性分别以修饰物的50％浓度和天然IL-3的50％浓度比值([IL-3修饰]50％/[IL-3天然]50％)测定。天然IL-3在第6天的标准活性为1.0百万单位/mg蛋白质(n＝10，σ(n-1)＝20％)。在第10天为0.2百万单位/mg蛋白质(n＝10，σ(n-1)＝30％)。结果关于按照组平均数的更精确特性的所有结果，特异性和在分子中修饰的位置将在本专利说书明的以后部分叙述。生物测定的结果如表1所示表1乙酰化IL-3的相对生的活性乙酰化的pH 组织培养的平均相对活性(和活性范围)6天后 10天后pH＝5.01.5(1.4-2.1)1.4(0.8-1.5)pH＝6.00.9(0.8-1.0)0.9(0.7-1.1)pH＝6.50.5(0.4-0.6)0.2(0.2-0.3)pH＝7.00.9(0.9-0.9)0.6(0.6-0.6)从上表可以得出结论，即在pH6.5和pH7.0修饰后6天与10天间相对活性有显著的差别。所以可以设想，这表明产生了稳定性显著降低的物质。在pH5时可能有增强的生物活性。更多的方面将在实施例5和6中讨论。实施例2IL-3以琥珀酸酐的渐进化学修饰产生一种具有增强活性和稳定性的改进IL-3。化学修饰乙酸，二氧杂环己烷，赖氨酸盐酸盐和MES得自Sigma，修饰试剂得自Fluka。
缓冲剂乙酸盐/NaOH用于pH5.0的修饰，MES/NaOH用于pH5.5，6.0和6.5的修饰，在pH7.0用NaH2PO4/NaOH缓冲液。制备10倍浓度贮备液，用0.22微米的过滤器直接过滤。
反应混合物包含50mM缓冲液，2mg/ml hIL-3和分别为3mM的乙酸酐或琥珀酸酐。10倍浓度的贮备液是在实验当天新鲜制备的。hIL-3的修饰在30℃进行过夜。修饰后用SDS-电泳测定说明IL-3来被降解。结果关于按照组平均数的更精确特性的所有结果，特异性和在分子中修饰的位置将在本专利说明书的以后部分叙述。生物测定的结果(按实施例1进行)如表2所示表2 琥珀酰化IL-3的相对活性琥珀酰化的pH 组织培养的平均相对活性(和活性幅度)6天后 10天后pH＝5.01.7(1.6-2.0)1.6(1.3-2.5)pH＝6.01.4(1.2-1.8)1.3(1.3-1.4)pH＝6.50.4(0.4-0.5)0.4(0.4-0.5)pH＝7.00.3(0.3-0.3)0.3(0.2-0.3)从表2可以得出结论即在pH5琥珀酰化导致活性的显著增强同时在pH＝＞6琥珀酰化导致较低的活性。实施例3生物活性肽或蛋白质化学修饰生成蛋白质或肽拮抗剂的方法。材料和方法尿素，EDTA，MES和NaOH得自Sigma，碘代乙酸钠得自Fluka。缓冲液MES/NaOH用于pH6.0的修饰。10倍浓度贮备液制备成含8M尿素，并在此后直接用0.22微米过滤器过滤灭菌。反应混合物含50mM缓冲液，5.5M尿素和50mM EDTA。由这些试剂配制的10倍浓度在8M尿素中的贮备液在实验当天新鲜配制。1.hIL-3的适度化学修饰碘代乙酸盐以3，10和30mM的浓度加入。IL-3的浓度为2mg/ml。修饰在37℃进行24，48和72小时，随后以非变性电泳研究。2天后和30mM碘代乙酰盐为最大的修饰，修饰的物质没有条带的严重扭曲(分子严重变性的指示)。在这种情况下，留下的超始原料少于2％。因为在这种情况下期望得到没有发生蛋白质严重变性的最低的生物活性，此样品用于进一步的实验。随后，SDS电泳用于说明修饰后分子没有降解。2.部分化学修饰为了使修饰的hIL-3有适当的抑制能力也进行部分修饰。为此目的1mg/ml IL-3用10，30和100mM碘代乙酸盐在37℃修饰18小时。在非变性电泳后考巴斯染色，100mM样品得到最大的修饰时，凝胶带没有过量的扭曲，大约仍存在5％的起始原料。因为只有这个样品在活性测试中显示出抑制活性，此样品用于进一步的实验。3.活性和抑制分析活性测试按实施例1叙述的进行。对照和烷基化的IL-3生长应答曲线((n＞＝2)是从1000至1ng/ml的范围以10倍连续稀释做成的。烷基化的IL-3的抑制活性是以与对照IL-3相同的滴定进行的，但现在是在3ng/ml烷基化的IL-3存在下进行的。
为了测定具有最大受体结合能力部分修饰的IL-3在有3ng/ml天然IL-3存在下以连续7倍稀释来滴定。滴定范围为15μg/ml至0.1ng/ml，同时滴定仅在4000 MO7/细胞/ml下进行以排除饥饿现象。结果

图1显示修饰的IL-3能够以10-100因数抑制对照的IL-3。更且3ng/ml的修饰IL-3能够抑制30-100ng/ml对照IL-3胸苷掺入的80～90％。所以，修饰的IL-3不是只有抑制活性，它也具有增强的受体结合能力。这在部分修饰IL-3的滴定中也加以肯定(图2)只需0.1ng的部分修饰的IL-3就足够抑制3ng/ml天然IL-3活性的几乎50％。实施例4为产生具有改变的稳定性和/或活性的修饰IL-3使用的渐进酶性外蛋白酶处理的方法。材料和方法外蛋白酶处理是用得自Boehringer的组织蛋白酶-C(Cathepsine-C)和羧肽酶-Y(Carboxypeptidase-Y)进行的。1mg/ml的IL-3在37℃在蛋白酶存在下孵育18小时。组织蛋白酶-C是以1/2至1/128mg/ml的范围连续两倍稀释加入。其他反应条件如制造者所述。
生物活性按实施例1所述测定。结果此方法导致表3中的结果。表中未显示修饰未导致生物活性的改变表3渐进外蛋白酶处理后活性的变化蛋白酶处理 [蛋白酶] 组织培养的平均相对活性(和范围)(mg/m1) 6天后 10天后羧肽酶Y 1/40 0.6 (0.5-0.7)1.0 (0.7-1.5)1/20 0.08 (0.07-0.10) 0.2 (0.13-0.21)1/10 ＜0.05(＜0.05) ＜0.05(＜0.05)组织蛋白酶C 1/322(2-6)1.0 (0.7-1.5)1/165(3-6)1.0 (0.9-1.1)1/8 3(2-4)1.3 (0.9-1.7)1/4 3(2-4)1.3 (0.9-2.1)从此表可得出结论，即用羧肽酶Y处理，在浓度为1/40和1/20时生成一种具有在第6天的相对活性低于在第10天的物质。所以这表明与天然IL-3比较，此物质的稳定性较高。
从表中也可以得出结论，即组织蛋白酶C在第6天显著增强了活性而不是在第10天。所以此物质也有较低的稳定性。实施例5用蛋白酶处理和质谱法结合在肽或蛋白质的定位修饰。材料和方法蛋白酶处理对于修饰残基的定位修饰的物质用适当的缓冲剂透析并随后用Endo Glu-C或Endo-Lyy-C裂解，如制造者所述(Boehringer Mannheim，Germany)。2mg/ml hIL-3蛋白质与蛋白酶的比例为30，在37℃孵育过液。激光解吸质谱法(LDMS)预处理
2，5二羟基苯甲酸(DHB，Mr＝154.12；10g/l)溶于milli Q水的溶液是在每次实验前新鲜配制的。修饰和未修饰的IL-3溶液和它们的消化液稀释成0.1mg/ml。这些稀释的溶液0.5μl与0.5μl DHB溶液在靶上混合。随后此靶在室温和慢的空气流中干燥。质谱法矩阵辅助的激光解吸质谱法是在装有脉冲氮气激光(337nm，脉冲宽度3ns)的Finnegan MAT Vision 200激光解吸质谱仪进行的。样品在刚达到解离阈(106-107W/cm2)以上时即离去。加速电压6.5kV。离子为了电子放大，在10kV的转换倍增器电极进行后加速。标准精确度约为0.05％，但由于实验条件此值可恶化到0.1-0.2％。结果尽管是较高的分子量，但因为LDMS的信号是足够的，使所有修饰的定位成为可能。给出两个例子1、以Endo Lys-C处理和LDMS用琥珀酸酐修饰(pH5.0)的定位在pH＝5.0琥珀酸酐修饰随后Endo Lys-C消化，一个峰从1085d位移至1185d，1108d峰(1085+23L来自Na+)也位移至1208d。基于蛋白酶的特导性和氨基酸序列，此1085d峰只能相当于Ala1-Lys10。因为若在Lys10上修饰则将使此氨基酸的消化成为不可能，也就是不会有任何的Ala1-Lys10片段。所以，被修饰的氨基酸残基是末端Ala1的氨基。
2、用Endo Glu-C处理随后用LDMS和Endo Lys-C处理随后用LDMS两者对以乙酸酐修饰Lys28的测定在pH7以乙酸酐修饰，随后Endo Glu-C处理，1598d峰位移至1640d。此位移准确相当于1个乙酰基的质量。同样，在此情况下，氨基酸序列使其定位于Ile23-Asp36。因为Lys28是这个片段的唯一氨基残基，可以推论这就是被修饰的残基。这又被用Endo Lys消化所肯定，在此消化中出现了5815d片段。此片段只能解释为若Lys28为修饰的残基则使在此残基后的消化成为不可能。
其他修饰已用相似方法分析，列于表4表4IL-3修饰的定位修饰的pH 修饰后被修饰基团的号数用乙酸酐用琥珀酸酐5.0Ala1 ＞90％ Ala1 ＞90％6.0Ala1 ＞90％ Ala1 ＞90％Lys28 ±45％ Lys18 ±45％Lys66 ±20％ Lys66 ±20％Lys100±40％ Lys100±25％Lys116±40％ Lys116±40％6.5Ala1 ＞90％ Ala1 ＞90％Lys28 ±70％ Lys28 ±55％Lys66 ±50％ Lys66 ±40％Lys100±65％ Lys100±50％Lys116±80％ Lys116±90％7.0Ala1 ＞90％ Ala1 ＞90％Lys10 ±20％Lys28 ±55％ Lys28 ±70％Lys66 ±35％ Lys66 ±40％Lys100±65％ Lys100±70％Lys116±40％ Lys116±90％此表说明两种修饰在蛋白质中具有胡同的靶残基。仅有的不同为乙酸酐在pH＞＝5.5时修饰度稍高，同时在pH7时与琥珀酸酐修饰物相反，Lys10被部分地修饰。
表4也说明在pH 7时Lys116至少是部分被保护了的。因为在此pH时使用磷酸盐缓冲液，磷酸基结合在这个位置以此屏蔽了Lys116的修饰的可能性是存在的。为证实此假设，hIL-3在50mM、由MES和磷酸盐组成的缓冲物质中被修饰。在pH6.8用乙酸酐(分别为1，2和3mM)修饰，此pH正好在两种缓冲剂的缓冲范围之间。在有10mM或以上的磷酸盐存在时，有1个基团Lys116被保护。在磷酸盐浓度低于1mM时此保护并不存在。因为10mM为生理磷酸盐浓度，可以设想，现有的定位方法说明生物显著的磷酸结合和定位是可能的。所以很可以想象使磷酸结合变形，可以产生拮抗性或细胞生长的抑制剂。因此，这也被认为是在本发明的范围之内。也可以说明Lys28和Lys66残基也有被磷酸轻微的保护，提示在3-D结构中它们是紧密靠近的。因此，这种方法甚至可以提供结构信息。
最后，也可以说明渐进化学修饰可以在这样最低程度上进行，即可实现特异性，不只局限于一些类型的残基，不只限于氨基残基，甚至能在整个分子的一个氨基残基，如Ala1上进行。所以此特异性也包括在权利要求之中。实施例6用渐进化学修饰蛋白酶处理和激光解吸质谱法进行定量结构功能分析研究。材料和方法QSAR策略此实施例用hIL-3赖氨酸修饰加以说明。此策略由5步组成，其中第一步是涉及蛋白质的渐进化学修饰。虽然各种残基在3-D结构中的微环境是未知的，但可以预期仅在氨基酸序列中就有差别。其3-D结构可预料差别更大。
我们研究了hIL-3的乙酰化反应(步骤1)。由逐步增加修饰反应的pH使渐进化学修饰只发生在未带电荷的Lys残基上成为可能。
第二步是监测修饰反应。为了研究足够数目的可能条件以得到适宜的条件，一种温和和灵敏和监测方法是需要的。此法为非变性电泳(Electrophoresis 15251(1994))。然而，电子喷射质谱也能成为替代的方法。这可由图3说明在pH5-7琥珀酰化IL-3的电子喷射质谱。特别是两者的结合可说明氨基残基的完全特异性。
第三步是全部结构整体的确定。圆二色散光谱法可用于此目的(Electrophoresis 15251(1994))。虽然用此方法不能看出小的差别，但实质上的结构改变如变性可以清楚测出。
第四步是修饰残基的特征和定位，为此使用以下的技术用特异蛋白酶非变性消化，电泳，电子喷射质谱法，和LDMS。反应的特异性由非变性电泳和电子喷射质谱法联合测定。定位化用内蛋白酶和LDMS，如以前所述的例子进行。
第五步即最后一步是蛋白质的各种修饰形式的生物活性的测试。在此活性测定以后可以推论真正涉及各种定位的残基。结果化学修饰，结构确定和反应监测hIL-3用琥珀酸酐或乙酸酐的化学修饰和监测按以前叙述的方法进行。随后，用圆二色散光谱法发现琥珀酸酐修饰，在pH大于7时导致整个结构的改变(变性)。所以，在进一步的研究中只有pH或以下进行修饰。修饰的特性和定位见以前的例子。蛋白质各种修饰形式的活性测试和生物学上重要的残基的定位两种方法和生物活性测试的结果在实施例1和2中已经叙述。这些结果的配合和修饰残基的定位结果(表1和表2和前面的实例)能够说明一些残基的参与。以此，从未修饰的到在pH5修饰的是重要的变化，它伴随着活性的增强。其他重要的变化是从pH6到pH6.5(活性降低2个因数)和从6.5到7(活性增加2个因数)因为在pH5琥珀酸酐修饰时伴随着仅1个基团的修饰，即末端氨基(Ala1)，可以得出结论，即这个基团有某种限制或调节作用。活性的增强在用缺失突变的结构一功能研究中也曾发现过(J.Biol.Chem.266，21310(1991)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8911842(1992))，但从为指定只是第一个残基。
从pH6至pH6.5之间的差别看，有更复杂的模式对乙酸酐，活性降低2-4个因数是伴随以Lys28基团45％至70％的修饰，Lys66基团20％至50％的修饰和Lys100基团40％至65％的修饰。最后，发生在Lys116基团40％至80％的修饰，它与未修饰组对比活性降低60％至20差值为3个因数。因为这个差与活性的降低精确地相关，Lys116对生物活怀是最好的候选者。这被在pH7时修饰减低了因数3(与pH6.5比较)。而伴随着活性增加因数3所肯定。所以Lys116对生物活性是重要的。这也被用琥珀酸酐修饰全部肯定。在这种情况，当与pH6.5修饰的物质比较时，pH7修饰的物质在修饰上没有降低。伴随这种现象，活性也没有增强。
如此，已经说明即Lys116残基和末端氨基是生物显著的，而末端氨基似乎具有抑制和调节影响，Lys116对生物活性似乎是重要的。更且，Lys116也被磷酸保护，提示磷酸被这个残基结合。因为此残基对白细胞介素的生物活性也是重要的，这提示磷酸结合对IL-3的作用方式是重要的，同时如果这个过程对IL-3是重要的，它对于其他的肽和蛋白质也是重要的。
总结，本方法使生物重要的残基的定位成为可能，同时表明磷酸结合也使一种可能的重要生理过程的建立的定位成为可能。所以，本发明也包含一种蛋白质或肽的修饰，借助蛋白质或肽的磷酸结合方法引入一种新的，优选的是拮抗的活性。实施例7抗体的降低水平致体内有效的细胞抵抗力。材料和方法试验系统由人类嵌合的4周龄“X-连接免疫缺损(X-linked immunodeficient)”小鼠组成。嵌合是经整体辐射(total bosy irradiation，TBI)诱导和移植4百万人类外周血液淋巴细胞/克受体形成。CBA/N小鼠的TBI为9Gyγ射线。这些小鼠也接受0.5百万自身骨髓细胞静脉(iv)注射的血液支持处理。比较辐射，人血液和移植操作见Eur.J.Immunol 22197(1992)。小鼠每天腹腔注射(ip)10,000 I.U.的人类白细胞介素-2(Eurocetus，Amstelveen，Benelux)。感染是在移植人细胞后1小时以最低剂量的10倍经ip进行，是在“感染中心试验(infectious center test)”或ICT中的静止感染(still infectious)。
经处理的CBA/N小鼠以250微克单克隆抗体抗-HIV-1 GP13(抗CD4-结合部位)，或抗HTL VIIIBF58H3指向V3-环经ip预处理。
ICT是以CB15细胞双倍进行(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，893116(1992))。每孔一万细胞并在5-7天后对HIVp24蛋白(Organon Technica，Oss，荷兰)进行ELISA。通常在移植后两周处死动物以停止抗体的产生(未发表的数据)。在处死小鼠的这天细胞以含有肝素(Organon Technica，Oss，荷兰)的介质从腹腔中冲洗出来。对这些细胞在CB15细胞和100 I.U.人类白细胞介素-2/ml培养介质存在下进行ICT。滴定是从2.5百万至O的范围以连续5倍稀释双倍进行。5-7天后培养基上清液中HIV-p24蛋白进行ELISA-试验。CD4+细胞存在的对照FACScan分析是按Eur.J.Immunol.22197(1992)所述进行的。结果结果示于表5。表5 抗体对HIVIIIB病毒的保护抗体 1/IC×104移植后5天移植后8天平均值(范围) 平均值(范围)无 2(0.4-2) ＞200 ＞200GP13 4 (0.4-100)20 (2-50)F58H3 ＞200 (＞200)＝＞200 (0.5-＞200)表中所示HTLVIIIB在这些情况下持续5天。然而移植8天后甚至在丰富的CD4+细胞存在下似乎被消除了。这说明移植人T-细胞可消除病毒。然而，如果把任一特异的抗HIV-1抗体结药至嵌合小鼠，病毒仍归持续(表5)，说明HIV-感染的持续是由抗体造成的。
由此可以推论，降低HIV-感染的人的抗体水平可使T-细胞消除病毒。由此提供感染的治疗。可由抑制B-细胞降低这些抗体的水平。所以B-细胞的抑制是生长因子拮抗剂的有关兴趣的应用领域。
尚有其他抑制HIV感染的可能性也能单独使用1、血浆提出法(Plasmaphoresis)造成抗体水平的降低。通常的临床实践是血浆的完全取代。例如重症肌无力的实验治疗是所谓的选择性血浆复原。在这种情况下，病人的血浆在回到病人体内之前经过精制，除掉有害的抗体。在体外HIV-反应也可选择此法，特别是HIV-包膜活性受体。
2、白细胞除去法(Leukophoresis)，以降低B-细胞的数量。此法优选除去HIV-活性的B-细胞。白细胞可从HIV感染的人体内全部被除去。这种白细胞除去在临床实践中对其他疾病是常规的工作。然而对HIV感染的病人还从未叙述过。选择性地返回没有B-细胞的白细胞可以容易地做到。选择性也能包括T-细胞的正选择或其亚群。
3、体内耗竭抗体。本发明也包括选择性的，也可非选择性的形成免疫复合物，在体内耗竭抗体。非选择性的移除，优选的方法是经抗体-特异的抗体来做到的。选择性的移除优选的方法是用病毒，灭活病毒，病毒亚单位和/或病毒样或等同的蛋白质或肽来做到的。这些物质优先地与促进从体内清除的物质结合。
4、体内耗竭B-细胞。这种体内耗竭优选的方法是用B-细胞程序死亡诱导的抗体，非选择性地移除B-细胞特异性抗体来进行。这也能用双特异的抗体，优选地是CD19/CD3反应性组合来进行。此法已在Academic Hospital Utrecht(Utrecht，荷兰)用于B-细胞肿瘤病人的I期临床试验。此治疗导致B-细胞数量的很显著的降低(私人通信F.A.van Houton Academic Hospital Utrecht，荷兰)。选择性的移除B-细胞方法，优选的是以病毒，灭活病毒，病毒亚单位和/或病毒样或等同的蛋白质或肽，或者用抗体来达到。优选的是这些物质与促进B-细胞耗竭的物质相结合。
5、抑制体内抗体产生的其他方法。一个实例是用转化生长因子β(TGF-β)。
HIV和其他病毒在宿主基因组中整合成原病毒。所以它能在这些细胞中以潜伏状态存在一段较长的时间。因此，在本发明中，优选的是给宿主以IL-2，以活化这种原病毒。
HIV在间质细胞中持续存在，同时能产生低浓度的病毒，它可能逃脱宿主免疫系统的识别。因此最好是延长处治的期限至少至这些细胞的生命期。更且，最好是同时进行被动免疫治疗，优选的是用未被HIV感染的物体的免疫球蛋白。所以，此被动免疫治疗被认为是本发明的范围之内。
虽然本发明是基于对递转录病毒如HIV有限的知识的形式叙述的，它是很明显可以做某些修改而不脱离本发明的范围。
权利要求
1.一种人类白细胞介素-3的修饰方法，优选引入一种或多种的下列特点增强的生物活性，增强的稳定性，抑制的抗原性，获得的抵抗活性或细胞抑制活性。
2.按照权利要求1的方法，其中，修饰是渐进的修饰，优选的是在逐渐变化的条件下进行，其中变化下列条件的一种或多种pH5.0和7.0之间，优选的步长为0.5个pH单位，和/或时间，或试剂浓度。
3.一种按照前述权利要求的一项或多项的方法，其中，底物不是人类IL-3，而是一种或多种的下列优选人类的蛋白质或肽其他白细胞介素，造血生长因子，肽类激素或蛋白质激素，信号肽或信号蛋白质，生物活性蛋白质或肽。
4.一种按照前述权利要求的一项或多项的方法，其中，是以屏蔽由抗原应答诱导蛋白质或肽中氨基酸的相互作用来降低抗原性。
5.一种按照前述权利要求的一项或我项的方法，其中，因为屏蔽了形成蛋白酶的结合部位氨基酸的可能相互作用而改变了稳定性。
6.一种按照前述权利要求的一项或多项的方法，其中，通过屏蔽降低其受体结合的残基，而使肽或蛋白质的受体结合加强。
7.一种按照前述权利要求的一项或多项的方法，其中，通过引进一新的化学相互作用，优选的为电荷，最好是负电荷，而使肽或蛋白质的受体结合力加强。
8.一种按照前述权利要求的一项或多项的方法，其中，修饰特定于少数类型的氨基酸，一种形式的氨基酸，例如胺-残基和/或甚至肽或蛋白质中的一个胺-残基，例如N-末端。
9.一种按照前述权利要求的一项或多项的方法，其中，修饰特定于涉及催化活性的一个或多个残基，优选的为His-残基。
10.一种按照前述权利要求的一项或多项的方法，其中，修饰特定于涉及催化活性的一个或多个残基，优选的为His-残基，以引入抵抗的和/或细胞抑制活性。
11.一种用于蛋白质和肽的化学或非化学修饰方法，通过破坏磷酸结合以引入拮抗的和/或细胞抑制活性。
12.一种应用渐进化学修饰和可逆试剂对肽或蛋白质上选择的氨基酸作特异性化学修饰的方法。
13.一种用非变性电泳来测定电荷的变化，蛋白酶处理和质谱，优选的为激光解吸质谱法对化学修饰的氨基酸定位的方法。
14.一种用如前述权利要求所述的化学修饰，优选的为渐进的方式，非变性电泳，活性测定和修饰残基的定位来定位蛋白质或肽上生物学上重要的残基的方法。
15.一种如前述权利要求的一项或多项中所叙述的生物活性蛋白质或肽的渐进化学修饰方法，其中，修饰可用很特异的方式，通过用前述叙述的在蛋白质或肽上定位涉及生物活性残基的方法来进行。
16.仅在下列一个或多个残基上进行修饰的人类白细胞介素-3，即Ala1，His26，Lys28，Lys66，His95，His98，Lys100或Lys116。
17.含有按前述权利要求的一项或多项制备的一种修饰的肽或蛋白质(以混合形式或化学结合形式)的任何制剂。
18.一种修饰的信号物质，优选的为蛋白质激素，肽类激素，生长因子，造血生长因子，干扰素，白细胞介素和/或克隆刺激因子，其中，修饰是处在或紧靠近部分的或全部活性中心。
19.一种如前述权利要求的一项或多项所述的物质，其中，催化活性发生了改变。
20.一种如前述权利要求的一项或多项所述的物质，其中，修饰是处于或紧靠近金属结合中心，优选的为锌结合中心。
21.一种如前述权利要求的一项或多项所述的物质，其中，金属离子是处于或紧靠近催化中心。
22.一种如前述权利要求的一项或多项所述的物质，其中，金属离子在未修饰的物质中具有催化功能。
23.一种如前述权利要求的一项或多项所述的物质，其中，金属结合性质已被改变。
24.一种如前述权利要求的一项或多项所述的物质，其中，信号物质对受体的亲和力没有降低到大于因数10，保持相同的或甚至增加了亲和力。
25.一种如前述权利要求的一项或多项所述的物质，其中，其具有加强的生物活性，抵抗活性和/或细胞抑制活性。
26.一种如前述权利要求的一项或多项所述的物质，其中，修饰是修饰一个氨基酸，这可以是化学修饰，更优选的为烷基化和或酰化或是分子生物学的修饰，如缺失突变和/或取代突变。
27.一种如前述权利要求的一项或多项所述的物质，其中，修饰的氨基酸是涉及与金属离子结合的，优选的为组氨酸残基。
28.一种如前述权利要求的一项或多项所述的物质，其中信号肽为锌结合信号肽，优选的为下列的一种或多种IL-2，IL-3，IL-6，IFN-γ，生长激素，催乳素和/或胰岛素。
29.一种如前述权利要求的一项或多项所述的物质，其中，信号肽为生长因子，其受体来自相同的(细胞因子)超家族，作为IL-3的受体，优选为IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，GM-CSF和/或Epo。
30.一种如前述权利要求的一项或多项所述的物质，其中，该物质的稳定性得到改变，优选的为增强稳定性。
31.一种如前述权利要求的一项或多项所述的物质，其中，该物质具有降低的稳定性，优选的是结合有拮抗活性。
32.含有如前述权利要求的一项或多项所述的蛋白质和/或肽的基因密码的DNA-组建物。
33.含有如前述权利要求的一项或多项所述的或是按前述权利要求的一项和多项制备的一种或多种物质(混合形式或化学结合形式)的任何制剂。
34.如前述权利要求的一项或多项所述的任何制剂的应用。
35.如前述权利要求的一项或多项所叙述的任何制剂的应用，优选的为在本专利说明书中应用领域所叙述的一种或多种应用。
36.通过抑制由B-细胞产生的抗体和/或抑制B-细胞的产生和/或成熟，优选的是用前述权利要求的一项或多项所述的一种制剂以抑制和/或治疗HIV感染。
37.一种如前述权利要求一项或多项中所述的，或是它们的联合方法和/或产物，其中优选的是用血浆去除法，部分的或全部血浆复原或选择性的血清返回以降低抗体的水平。
38.一种如前述权利要求一项或多项中所述的，或是它们的联合方法和/或产物，其中在体外选择性的通过移除抗体，优选HIV-活性抗体，更优选的是HIV-包膜活性抗体。
39.一种如前述权利要求一项或多项中所述的，或是它们的联合方法和/或产物，其中，进行白细胞除去。
40.一种如前述权利要求一项或多项中所述的，或是它们的联合方法和/或产物，其中，达到了B-细胞数量的降低，优选的是抗HIV-抗体产生的B-细胞，更优选的是抗HIV-包被抗体产生的B-细胞。
41.一种如前述权利要求一项或多项中所述的，或是它们的联合方法和/或产物，其中，优选是在体内耗竭抗体，优选的是耗竭抗HIV抗体，更优选的是耗竭抗HIV-包膜抗体。
43.一种如前述权利要求一项或多项中所述的，或是它们的联合方法和/或产物，其中，例如用其它抗体，达到了在体内抗体的耗竭。
44.一种如前述权利要求一项或多项中所述的，或是它们的联合方法和/或产物，其中，双-特异性抗体的应用，优选的是直接对抗CD19/CD3和或CD20/CD3的结合。
45.一种如前述权利要求多项中叙述的方法和/或产物，其中，其为诱导B-细胞程序死亡的物质，优选的是APO-1的应用。
46.一种如前述权利要求一项或多项中所述的，或是它们的联合方法和/或产物，其中，其为其他B-细胞抗体产生抑制作用，优选的是用TGF-β的应用。
47.一种如前述权利要求一项或多项中所述的，或是它们的联合方法和/或产物，其中，以进行HIV感染的物体的原病毒的激活，优选的是给以生长因子，较优选的为细胞因子，更优选的是以IL-2激活。
48.一种如前述权利要求一项或多项中所述的，或是它们的联合方法和/或产物，其中，包括被动免疫治疗，优选的是用HIV-未感染物体的免疫球蛋白。
49.一种如前述权利要求一项或多项中所述的，或是它们的联合方法和/或产物，其中，其为金属离子的应用，优选的是锌，以得到如前述权利要求的一项或多项所述的效果和/或结果和/或应用。
50.包含如前述权利要求的一项或多项叙述的一种或多种方法的任何治疗。
51.按前述权利要求的一项或多项所述的任何制剂的应用，包括刺激干细胞的复制。
52.按前述权利要求的一项或多项的任何制剂与其他信号蛋白质和肽联合的应用。
53.任何前述权利要求的两项或多项的可想到的无论是导致或不导致协同活性的联合。
全文摘要
本发明涉及信号蛋白质和肽的特异的渐进修饰。以修饰及其定位，用蛋白酶处理和与新类型的质谱法相结合，可以达到蛋白质或肽的很特异修饰。这使得期望的生物活性变化，优选的是增强的活性，拮抗活性和/或细胞抑制活性的引入成为可能。用化学修饰，即有特异性的对His残基烷基化，这些残基位于或靠近人类白细胞介素3催化的和/或Zn结合中心，可以实现拮抗的或细胞抑制活性。本领域人员也可以容易地应用本发明来产生抑制剂和/或拮抗剂，优选的方法为用分子生物修饰，化学修饰和/或烷基化反应，优选的为用碘代-乙酸盐。优选的是这些修饰是直接对His残基，其它催化残基和/或Zn结合残基。从所附的结果和数据可以推论即本发明也可容易地应用于其他信号物质。此结果也可以DNA-组建很好的完成，其中也包括基因治疗。如此，提出的方法，得到的物质及其应用均包括在本发明之中。
文档编号A61K38/20GK1163620SQ95194849
公开日1997年10月29日 申请日期1995年8月30日 优先权日1995年8月30日
发明者维克托·斯米特, 威廉·胡佩斯 申请人:法玛基公司