编码与白介素-1β转换酶相关的人Tx和Ty蛋白的DNA序列的制作方法

专利名称：编码与白介素-1β转换酶相关的人Tx和Ty蛋白的DNA序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码一种新的与白介素-1β转换酶相关的人Tx蛋白的DNA序列，Tx蛋白，它们的生产方法，含有它的药用组合物和它们做为药物的用途。
白介素-1β(IL-1β)是一种包含在多种急性或慢性炎症疾病如风湿性关节炎、肠炎或败血性休克致病过程中的促炎症细胞因子(Dinarello等.，1992免疫学评论，127，119-146)。
人单核细胞和巨噬细胞合成31kD(pIL-1β)的非活化前体形式的IL-1β。pIL-1β不含常规信号序列并且只有在116位和天冬氨酸117位丙氨酸之间断裂之后才可由细胞有效地分泌。这个产生17kDa活性形式的IL-1β的断裂，是由一种特定的称为白介素-1β转换酶(ICE)的特定酶进行的(Thornberry等.，1992自然，356，768-774；Cerretti等.，1992，科学，256，197-100)。该酶已在人和小鼠中被表征描述和克隆了(Nett等.，1992，免疫学杂志，149，3254-3259；Molineaux等.，美国国家科学院院刊，90，1809-1813)。它是一个与其它已知的硫羟基蛋白酶无同源性的单半胱氨酸蛋白酶。它还具有对一些pIL-1β的Asp-X肽键的特定的特异性。
该ICE酶由20kDa(p20)和10kDa(p10)的两个亚基组成，它们的缔合对于酶活是必需的。这些亚基来自45kDa(p45)酶原的蛋白裂解。ICE酶本身能裂解其p45前体或不含酶源的N末端119位氨基酸的30kDa的p30形式，成为p20加p10的活性形式。已对p45的cDNA以及氨基酸进行了全序列描述(Thornberry等，已被引用过)。人ICE基因的特征已有描述(Cerretti等.，1994，Genomic，120，468-473)。
最近的工作发现ICE可能在调节程序化细胞死亡或细胞凋亡中起作用(Yuan等.，1993，细胞，75，641-652)。事实上，ICE与Ced-3；一种包含于细胞凋亡中的C.elegans蛋白有28％的同源性并且在大鼠成纤维细胞中小鼠ICE的超表达引起细胞凋亡(Miura等.，1993，细胞，75，653-660)。而且，蛋白crm A，一种抑制病毒丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpine)在转染小鸡神经节细胞(ganglioneurons)中的表达可保护这些细胞免于由抑制生长因子(神经生长因子)诱导的细胞凋亡形式的死亡(Gahliardlin等.，1994，科学，263，826-828)。这些观察结果表明ICE或其同源蛋白调节程序化细胞死亡中起作用，特别是在所观察的退变性神经疾病如艾尔氏海默症或帕金森氏症以及大脑局部缺血中的程序化细胞死亡中有用(Barinaga，M，科学，259,762，1993)。
与在IL-1β的成熟或细胞凋亡中起作用的ICE相关的新的蛋白的发现有助于发展与IL-1β或细胞凋亡相关疾病的治疗或诊断性新药剂。
本发明涉及一种新的人Tx蛋白，它与人ICE前体p45有大约52％同源性并且不允许IL-1β前体成熟为活性细胞因子。Tx蛋白具有两个预料之外的功能一方面，它是一种蛋白酶并特别可以将ICE前体p30裂解为p10和p20亚基，而另一方面它可在例如转染的Cos细胞中诱导细胞凋亡。
这些生物特征使Tx蛋白可预期用于与IL-1β相应疾病时的治疗或用于有细胞凋亡发生的病理时的治疗。
本发明还涉及一种新的与Tx蛋白有大于70％同源性的人TY蛋白可在例如转染的Cos细胞中诱导的细胞凋亡。TY蛋白是一种能以一种分子内方式自身断裂的蛋白。
因此本发明的目标是一种DNA序列，它含有编码一种具有蛋白酶活性的人多肽的DNA序列并具有序列SEQ ID No.1的核苷酸序列GCTCTTTCCA ACGCTGTAAA AAAGGACAGA GGCTGTTCCC T ATG GCA GAA GGC 53Met Ala Glu Gly1AAC CAC AGA AAA AAG CCA CTT AAG GTG TTG GAA TCC CTG GGC AAA GAT101Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser Leu Gly Lys Asp5 10 15 20TTC CTC ACT GGT GTT TTG GAT AAC TTG GTG GAA CAA AAT GTA CTG AAC149Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln Asn Val Leu Asn25 30 35TGG AAG GAA GAG GAA AAA AAG AAA TAT TAC GAT GCT AAA ACT GAA GAC197Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala Lys Thr Glu Asp40 45 50AAA GTT CGG GTC ATG GCA GAC TCT ATG CAA GAG AAG CAA CGT ATG GCA245Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys Gln Arg Met Ala55 60 65GGA CAA ATG CTT CTT CAA ACC TTT TTT AAC ATA GAC CAA ATA TCC CCC293Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp Gln Ile Ser Pro70 75 80AAT AAA AAA GCT CAT CCG AAT ATG GAG GCT GGA CCA CCT GAG TCA GGA341Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro Pro Glu Ser Gly85 90 95 100GAA TCT ACA GAT GCC CTC AAG CTT TGT CCT CAT GAA GAA TTC CIG AGA389Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu Glu Phe Leu Arg105 110 115CTA TGT AAA GAA AGA GCT GAA GAG ATC TAT CCA ATA AAG GAG AGA AAC437Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Glu Arg Asn120 125 130AAC CGC ACA CGC CTG GCT CTC ATC ATA TGC AAT ACA GAG TTT GAC CAT485Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr Glu Phe Asp His135 140 145CTG CCT CCG AGG AAT GGA GCT GAC TTT GAC ATC ACA GGG ATG AAG GAG533Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr Gly Met Lys Glu150 155 160CTA CTT GAG GGT CTG GAC TAT AGT GTA GAT GTA GAA GAG AAT CTG ACA581Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu Glu Asn Leu Thr165 170 175 180GCC AGG GAT ATG GAG TCA GCG CTG AGG GCA TTT GCT ACC AGA CCA GAG629Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala Thr Arg Pro Glu185 190 195CAC AAG TCC TCT GAC AGC ACA TTC TTG GTA CTC ATG TCT CAT GGC ATC677His Lys Ser Ser Asp Sar Thr Phe Leu Val Leu Met Ser His Gly Ile200 205 210CTG GAG GGA ATC TGC GGA ACT GTG CAT GAT GAG AAA AAA CCA GAT GTG725Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys Lys Pro Asp Val215 220 225CTG CTT TAT GAC ACC ATC TTC CAG ATA TTC AAC AAC CGC AAC TGC CTC773Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn Arg Asn Cys Leu230 235 240AGT CTG AAG GAC AAA CCC AAG GTC ATC ATT GTC CAG GCC TGC AGA GGT821Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln Ala Cys Arg Gly245 250 255 260GCA AAC CGT GGG GAA CTG TGG GTC AGA GAC TCT CCA GCA TCC TTG GAA 869Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro Ala Ser Leu Glu265 270 275GTG GCC TCT TCA CAG TCA TCT GAG AAC CTG GAG GAA GAT GCT GTT TAC 917Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu Asp Ala Val Tyr280 285 290AAG ACC CAC GTG GAG AAG GAC TTC ATT GCT TTC TGC TCT TCA ACG CCA 965Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser Ser Thr Pro295 300 305CAC AAC GTG TCC TGG AGA GAC AGC ACA ATG GGC TCT ATC TTC ATC ACA 1013His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser Ile Phe Ile Thr310 315 320CAA CTC ATC ACA TGC TTC CAG AAA TAT TCT TGG TGC TGC CAC CTA GAG 1061Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys Cys His Leu Glu325 330 335 340GAA GTA TTT CGG AAG GTA CAG CAA TCA TTT GAA ACT CCA AGG GCC AAA 1109Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr Pro Arg Ala Lys345 350 355GCT CAA ATG CCC ACC ATA GAA CGA CTG TCC ATG ACA AGA TAT TTC TAC 1157Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr Arg Tyr Phe Tyr360 365 370CTC TTT CCT GGC AAT TGAAAATGGA AGCCACAAGC AGCCCAGCCC TCCTTAATCA 1212Leu Phe Pro Gly Asn375ACTTCAAGGA GCACCTTCAT TAGTACAGCT TGCATATTTA ACATTTTGTA TTTCAATAAA 1272AGTGAAGACA AAAAAAAAA1291以及一种包含编码一种能诱导细胞凋亡的人多肽的DNA序列的并具有上述SEQ ID No.1序列的核苷酸序列的DNA序列。
本发明的具体目标是编码一种具有蛋白酶活性并能诱导细胞凋亡的人多肽并具有上面序列SEQ ID No.1的核苷酸序列的DNA序列。
上述编码具有377个氨基酸的蛋白质的DNA序列是一种cDNA序列，它可用PCR从LPS激活的单核细胞或人多核细胞或胎盘的RNA开始扩增而获得，由于以前鉴定了ICE序列的寡核苷酸衍生物和同源基因的序列，根据操作条件进一步给出了详细描述。
对蛋白酶活性的发现以及诱导细胞凋亡的能力在实验部分进行了进一步描述。
本发明的更具体的目标是编码一种具有蛋白酶活性并能诱导细胞凋亡的具有序列SEQ ID No.1从42位核苷酸开始到1172位核苷酸结束的序列的DNA序列以及可与之杂交并具有相同功能的DNA序列。
在可杂交的序列之中，包括可在严谨条件下杂交并编码具有同样活性的多肽的DNA序列。严谨杂交条件包括例如根据Maniatis等.，分子克隆，冷泉港实验室出版社出版，1989，报道的杂交条件在5×SSPE，10×Denhardt；100μg/ml DNAss；1％SDS溶液中在65℃杂交18小时，接着用2×SSC；0.05％SDS洗3次，每次5分钟，然后在65℃1×SSC；0.1％SDS中洗3次，每次15分钟。
本发明的相当具体地目标是具有序列SEQ ID No.1从42位核苷酸开始到1172位核苷酸结束的序列的DNA序列。
序列SEQ ID No.1的知识可用例如已知的化学合成方法或用已知杂交技术用合成的寡核苷酸探针筛选基因文库或cDNA文库产生本发明。
本发明还涉及具有蛋白酶活性并能诱导细胞凋亡并具有序列SEQID No.2的氨基酸序列的人多肽Met Ala Glu Gly Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser1 5 10 15Leu Gly Lys Asp Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln20 25 30Asn Val Leu Asn Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala35 40 45Lys Thr Glu Asp Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys50 55 60Gln Arg Met Ala Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp65 70 75 80Gln Ile Ser Pro Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro85 90 95Pro Glu Ser Gly Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu100 105 110Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile115 120 125Lys Glu Arg Asn Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr130 135 140Glu Phe Asp His Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr145 150 155 160Gly Met Lys Glu Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu165 170 175Glu Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala180 185 190Thr Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met195 200 205Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys210 215 220Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn225 230 235 240Arg Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln245 250 255Ala Cys Arg Gly Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro260 265 270Ala Ser Leu Glu Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu275 280 285Asp Ala Val Tyr Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys290 295 300Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser305 310 315 320Ile Phe Ile Thr Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys325 330 335Cys His Leu Glu Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr340 345 350Pro Arg Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr355 360 365Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn370 375以及该序列的等位基因或其类似物。
在等位基因和类似物中，包括由替换，缺失或增加一个或多个氨基酸以使这些产物保留同样的功能的修饰的序列。
本发明的具体目标是具有序列SEQ ID No.2的氨基酸序列并称为Tx蛋白的多肽。
本发明的一个方面还涉及根据本发明在宿主细胞中表达编码序列SEQ ID No.2的氨基酸序列的DNA而获得的多肽。
当通过在宿主细胞中表达而获得本发明的多肽时，可根据已知遗传工程和细胞培养方法进行。
表达可在原核细胞例如大肠杆菌中进行或者在真核细胞例如Cos细胞中表达，该细胞包含编码本发明多肽的由合适的启动子启始的DNA序列。
本发明特别涉及由在真核宿主细胞中表达而获得的本发明的多肽。
本发明相当具体地涉及本发明的其蛋白酶活性相应于IL-1β转换酶成熟能力的多肽。进一步描述了测定该特定蛋白酶活性的实施例。
本发明还有一个目的是一个表达载体以及用上面载体转化的宿主细胞，其中表达载体含有编码一种具有蛋白酶活性并能诱导细胞凋亡的人多肽的DNA序列。
表达载体是已知的允许在合适的启动子的控制之下表达蛋白质的载体。对原核细胞来说，启动子可以是例如是lac启动子，trp启动子，tac启动子，β乳糖酶启动子或pL启动子。对酵母细胞来说，启动子可以是例如pGK启动子或AD启动子。对哺乳动物来说，启动子可以是例如SV40启动子或腺病毒的启动子。也可用杆状病毒类型的载体在昆虫细胞中进行表达。
宿主细胞是例如原核细胞或真核细胞。原核细胞有例如大肠杆菌、芽孢杆菌属或链霉菌属菌。真核宿主细胞包括酵母以及高等生物的细胞，如哺乳动物细胞或昆虫细胞。哺乳动物细胞有例如仓鼠CHO或BHK细胞和猴Cos细胞等成纤维细胞。昆虫细胞有例如SF9细胞。
本发明涉及包括在用编码序列SEQ ID No.2的氨基酸序列的DNA转化的宿主细胞中表达Tx蛋白的方法以及特别是其中宿主细胞是真核细胞的方法。
本发明的目标还有抗本发明的多肽的抗体。
可根据已知的方法制备本发明的多克隆或单克隆抗体并且可用于例如Tx蛋白的测试，例如在ELISA测试中，并可做为诊断剂。
如进一步所给出的结果所表明的，本发明的新Tx蛋白具有显著地生物学特征，尤其是蛋白酶活性，值得注意地是成熟IL-1β转换酶的能力以及诱导细胞凋亡的能力。
根据本发明的Tx蛋白的这些生物学特征使其可用于例如其中包含IL-1β的自身免疫疾病的治疗，伤口愈合或对放射性治疗副作用的减轻，或用于例如其中包含细胞凋亡的癌症和感染领域。
因此本发明的一个目标即是将本发明的多肽用做药物。
本发明涉及包含将上述的药物用做活性组分的药用组合物以及特别涉及调节IL-1β的产生或调节细胞凋亡的药用组合物。
在上述药用组合物的制备中活性组分可与常规赋形剂一起被掺入。该组合物可通过非胃肠道，口服或局部途径给药。
由本发明的多肽可以设想由这些多肽的抑制剂组成的新治疗剂以及它们做为药物的用途，例如用于治疗自身免疫疾病相关的炎症，败血性休克或神经退变性疾病。
本发明还有一个目标是与从序列SEQ ID No.1的42位核苷酸开始到1172位核苷酸结束的DNA序列杂交并具有同样功能的DNA序列。
杂交反应可在例如含1×SSC，0.1％SDS的缓冲液中60℃洗2次，每次30分钟。
本发明特别涉及编码具有蛋白酶活性并能诱导细胞凋亡的多肽以及具有序列SEQ ID No.22的核苷酸序列的DNA序列，和更特别涉及序列SEQ ID No.22从104核苷酸开始到1195位核苷酸结束的序列。
上面的编码具有364个氨基酸的蛋白的DNA序列SEQ ID No.22，是一种可由例如在Tx cDNA序列(SEQ ID No.1)的寡核苷酸衍生物的基础之上，从人脾脏或胎盘的cDNA用PCR扩增而来的cDNA序列。在实验部分给出了详细制备实例。序列SEQ ID No.22的知识使之可用例如已知的化学合成或通过使寡核苷酸探针的杂交技术筛选基因文库或cDNA文库的方法实现本发明。
本发明还有一个目的是一种人多肽，它具有蛋白酶活性并能诱导细胞凋亡并具有序列SEQ ID No.23的氨基酸序列并被称为TY蛋白。
本发明的一个方面还涉及一种根据本发明的多肽，它是由在宿主细胞中表达编码序列SEQ ID No.23的氨基酸序列的DNA而得到的。
本发明还包括为获得TY蛋白而表达所需的宿主细胞和表达载体，以及已在上文出示的表达Tx蛋白的实施例。
本发明还涉及一种方法，它包括在用编码序列SEQ ID No.23的氨基酸序列的DNA转化的宿主细胞中表达TY蛋白。
本发明还包括抗TY蛋白的多克隆抗体或单克隆抗体。
本发明还涉及包含TY蛋白做为药物的药用组合物。
附图出示本发明的一些方面

图1代表用Southern印迹在来自用限制酶BglII(曲线A)；PstI(曲线B)；HindIII(曲线C)；BamHI(曲线D)消化的pBMC人基因组DNA中对ICE同源序列的检测。检测是通过与32P标记的ICE外显子6探针的杂交而实现的。
图2代表基因T2外显子6的核苷酸序列(SEQ ID No.5)。
图3代表Tx cDNA的核苷酸序列(SEQ ID No.1)和相应的氨基酸序列(SEQ ID No.5)。
图4代表在如下组织中用Northern印迹对Tx mRNA的检测脾脏(曲线A)；胸腺(曲线B)；前列腺(曲线C)；精巢(曲线D)；卵巢(曲线E)；小肠(曲线F)；结肠(曲线G)；外周白细胞(曲线H)。检测是通过与32P标记的“Tx外显子6”探针的杂交实现的。
图5代表在Cos-1细胞中成熟IL-1β的分泌，其中该细胞组成性含有pIL-1β并与不含DNA的对照培养基相比(曲线1)被含ICE(曲线2)或Tx(曲线3)的载体pcDL-SRα296；单独地载体pCD4-SRα296(曲线4)，载体pcDNA/Amp单用(曲线5)，载体pcDNAI/Amp含Tx(曲线6)或ICE p30(曲线7)转化。用ELISA(A温育16小时；B温育24小时)测定细胞上清中成熟IL-1β的量(pg/ml)。
图6代表ICE p30前体在Cos-1细胞中的裂解，其中Cos-1细胞被载体pcDL-SRα296单独(曲线A)或含标记的突变T7-ICEp30C对5S(曲线B)的该载体转染或被含标记的突变体T7-ICEp30C285S的载体pcDL-SRα296和含ICE p30(曲线C)或ICE p45(曲线D)或Tx(曲线E)的载体共转染。以被含单独的Tx的载体pcDL-SRα296转染检验为对照，用抗T7抗体通过Western印迹进行检测(曲线F)。
图7代表在Cos-1细胞相对于不含DNA的对照培养(A)被载体pcDL-SRα296单独(7B)或含Tx(7C)或含ICE p45(7D)转染22小时培养后Tx蛋白在细胞中诱导的细胞凋亡(放大倍数×400)。
图8代表相对于无DNA的对照培养物(A)被含ICE p45(曲线B)或Tx(曲线C)或载体自己(曲线D)的载体pcDL-SRα296转染的Cos-1细胞的DNA。在琼脂糖凝胶上迁移之后用BET染色后进行检测，以HindIII消化的λ噬菌体(M1)DNA和HindIII消化的φx174噬菌体DNA(M2)为DNA大小标准。
图9代表在Cos-2细胞中突变TY蛋白(T7TYΔ67C245S)的裂解，该细胞被载体pcDL-SRα296单独(曲线B)或载体pcDNA I/Amp单用(曲线C)或载体p T7TYΔ67C245S(曲线F；23小时和曲线G；43小时)共转染。相对无DNA的对照培养物(曲线A)和分子量标记(曲线D；不可检测)通过Western印迹进行检测。
下面的实施例用于说明但不限制本发明。实施例I序列Tx的鉴定A-人ICE同源基因的发现用相应于ICE基因外显子6的DNA探针通过Southern印迹对ICE同源基因进行鉴定。a)外显子6 ICE探针的制备人ICE外显子6的界限以及完整的人ICE基因内含子/外显子的构造已有描述(Cerretti等，已引用)。外显子6(235bp)相应于所述ICEp45 cDNA序列G35-868位的核苷酸(Thornberry等，已引用)。
用下面的寡核苷酸通过PCR扩增法制备外显子6 ICE探针。ICE 6.5ACATGACTAC AGAGCTGGAG (SEQ ID No.3)ICE 6.3CACCACGGCA GGCCTGGATG (SEQ ID No.4)该寡核苷酸是通过应用公开数据(Thornberry等，已引用)选择，合成并用RT-PCR扩增用RNATM试剂盒提取和纯化的来源自人血单核细胞的RNA，扩增条件如下酶Biotaq(Bioprobe)；30个循环(94℃，1mn；60℃，1mn；72℃，1mn)；PCR设备Perkin-Elmer(GeneAmp PCR System 9000)。
将得到的DNA外显子6在Spin X柱(Costar)离心纯化并用寡核苷酸标记试剂盒(Pharmacia Biotech)通过随机引物技术用32P标记b)基因组DNA的杂交Southern印迹将得到的放射性标记外显子6 ICE探针用做人基因组DNA的杂交探针。
用TurboGen试剂盒(Invitrogen)从外周血单核细胞(PBMC)出发制备的人基因组DNA，然后分别用限制酶BglII，PstI，HindIII或BamHI(Boenringer Mannheim)切割，迁移在1×TAE 0.9％琼脂糖凝胶上，转移到尼龙GeneScheen Plas膜上(NEN Dupont)，然后与外显子6 ICE探针杂交。
杂交条件如Maniatis等所述(已引用过)在5×SSPE，10×Denhart，100μg/ml DNAss，1％SDS，65℃过夜，接着用连续在2×SSC，0.05％SDS，30分钟环境温度洗涤膜，然后是在1×SSC，0.1％SDS，30mn 65℃洗膜，这些是高度严谨的。用下面的贮液制备洗膜缓冲液。20×SSC；3M NaCl水溶液，0.3M柠檬酸钠。10％SDS十二烷基磺酸钠水溶液。洗过之后，将膜对Hyperfilm MP胶片(Amersham)曝光。
如图1所示，对每种限制酶来说可看到对应于不同大小的DNA片段的3-4条带，其中对它们当中的一些对应于ICE高度同源的基因但却与后者不同，因为在与对应于单个外显子的探针的杂交中，一个基因只能产生一条或至多两条独立的带。B-ICE同源基因的克隆a)ICE同源的基因组序列的克隆为了对上述得到的不同的DNA片段进行鉴定，根据Maniatis等所描述的各种(已引用过)，将从外周血单核细胞(PBMC)提取而来的并用HindIII酶(Boehringer Monnheim)消化的人基因组DNA片段在1×TAE，1.5％琼脂糖凝胶制备电泳上进行分离。将相应于分子量小于2.3kb的部分切成20等份，然后对从每一部分中洗脱下来的DNA用上述的寡核苷酸ICE 6.5(SEQ ID No.3)和ICE 0.3(SEQ ID No.4)进行扩增，扩增条件如下94℃，1mn；55℃，1mn；72℃，1mn；30个循环；BioTaq聚合酶。
在上面的20个部分当中，保留了用PCR进行最大扩增的8个部分。用7A克隆试剂盒(Invitrogen)根据生产商的说明用T4DNA连接酶在载体pCR II中对扩增物质进行克隆，并用Macrophor电泳设备材料(Pharmacia System)应用测序酶通过Sanger技术进行测序。将得到的序列用GCG软件进行分析(Deveraux等，核酸研究12，387-395(1984))。
在得到的核苷酸序列中，已鉴定了一个与ICE外显子6的序列有92％的核苷酸同源性的称为T2的序列。
如图2所示核苷酸序列T2具有覆盖全部外显子6(SEQ ID No.5)的开放可读框，这就试图编码T2蛋白的信使RNA进行鉴定并试图对对应于T2的cDNA进行克隆。b)ICE同源cDNA的克隆从LPS活化18小时的单核细胞，或胎盘，或从外周血分离的多核细胞中用RNATM试剂盒(Bioprobe)提取和纯化RNA。根据生产商的说明应用Gene Amp RNA PCR试剂盒(Perkin Elmer)使用多聚dT聚核苷酸和反转录酶合成相应的cDNA并用下面的两个寡核苷酸进行PCR扩增。T2.ACTACAGAGCTGGAGGCATTTGCT(SEQ ID No.6)选自编码T2外显子6的序列，以便特异地扩增T2类型的序列而不是ICE序列，和ICE45.3 TTAATGTCCTGGGAAGAGGTAGAA(SEQ ID No.7)选自ICE cDNA引端编码区的序列(互补链)。
从3个RNA制品中分别得到了大约600碱基对的片段，扩增条件如下94℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；30个循环，使用GeneAmpRNA PCR试剂盒(Perkin Elmer)。如上所示用7A克隆试剂盒(Invitrogen)对该片段进行克隆和测序。这样确定的核苷酸序列不是对应于期望的T2cDNA而是我们称为Tx的新的cDNA。C-Tx cDNA的鉴定a)Tx cDNA连续序列的确定使用来自胎盘的cDNA通过锚式PCR技术获得Tx cDNA的5′和3′末端的核苷酸序列。
应用5′Race-Ready cDNA试剂盒(人快速克隆cDNA)(Clontech)和下面的寡核苷酸对Tx cDNA的5′端进行扩增。
TxPCR5AGAGGCAGTTG CGGTTGTTGA A(SEQ ID N°8)TxPCR5BCTCTGACCCA CAGTTCCCCA C(SEQ ID N°9)应用3′RACE System试剂盒(Gibco-BRL)和下面的扩增寡核苷酸对Tx cDNA引端进行扩增。
TxAAACTGTGCAT GATGAGA(SEQ ID N°10)TxBAGATGCTGTG TACAAGACC (SEQ ID N°11)这两个独立的引物对来自上面所得到的Tx的部分序列。
然后如上所述用7A克隆试剂盒(Invitrogen)对得到的入增片段进行克隆和测序。
由于使用了上面的TxA寡核苷酸(SEQ ID No.10)和TxB寡核苷酸(SEQ ID No.11)和下面的寡核苷酸而确定了该核苷酸序列TxCGCCTGGACAA TGATGAC(SEQ ID N°12)TxDTGATGAAGAT AGAGCCC(SEQ ID N°13)Tx1CGGGTCATGG CAGACTC(SEQ ID N°14)Tx2GTTTGAAGAA GCATTTG(SEQ ID N°15)Tx3CCTGAGTCAG GAGAATC(SEQ ID N°16)Tx4AGTCTCAGGA ATTCTTC(SEQ ID N°17)Tx5AGCTGACTTT GACATCA(SEQ ID N°18)Tx6GCGCTGACTC CATATCC(SEQ ID N°19)
这些寡核苷酸选自编码Tx的序列(编码链或互补链)。
将所有得到的序列排序即得到了如图3所示的Tx cDNA的连续核苷酸序列。这样确定的序列包括带有多聚腺苷酸化尾部的1291个核苷酸。它具有一个从42位核苷酸甲硫氨酸启动子开始到1172位核苷酸终止密码子结束的开放可读框。结果是一个编码具有377氨基酸的蛋白的1131个核苷酸的开放可读框。b.Tx cDNA编码区的克隆用下面的寡核苷酸从单核细胞，或多核细胞或胎盘的总RNA出发通过RT-PCR扩增Tx cDNA的编码区(SEQ ID No.1)TxP5CGCGGATCCACCATGGCAGAAGGCAACCACAGA (SEQ ID N°20)TxP3GGCTCTAGACTCGAGTTATCAATTGCCAGGAAAGAGGTA(SEQ ID N°21)根据前述确定的Tx cDNA连续序列(或互补链)而选择和合成了这些扩增引物，并分别给寡核苷酸TxP5和XbaI添加了BamHI和NcoI克隆位点和给寡核苷酸TxP3添加了XhoI克隆位点。
将上面得到的约1150碱基对的扩增产物用BamHI和XbaI酶(Boehringer Mannheim)消化并应用Amersham连接试剂盒，在用同样的限制酶BamHI和XbaI预先消化的载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)中克隆。用上面的寡核苷酸TxA、TxB、TxC、TxD、Tx1、Tx2、Tx3、Tx4、Tx5和Tx6对两条链的克隆产物全部测序。
对所用的每个起始RNA来说，所得到的寡核苷酸序列都与上面的编码Tx cDNA连续序列的序列(SEQ ID No.1)相一致。因此在所用的来自不同个体的不同组织之间看不到差异。
Tx cDNA的编码区编码Tx蛋白，其所来源的氨基酸序列如图3所示(SEQ ID No.2)。Tx蛋白包含377个氨基酸，计算分子量为43.26kDa。通过在序列的排列中导入不连续性，从氨基酸方面来说Tx蛋白的序列与ICE p45前体的序列在同源性上有最多52％一致性。在载体pcDNAI/Amp(Tx cDNA/pcDNAI·13/07/94)中包含编码TxcDNA(SEQ ID No.1)的区域的大肠杆菌XL-1兰(E.coli XL-1 blue)样品被保藏在国立微生物保藏中心(CNCM)，日期1994年7月29日，保藏号I-1462。c-在不同人组织中Tx mRNA的表达对8个不同组织中编码Tx蛋白的mRNA的表达进行了研究，这是通过应用相应于与ICE外显子6(“Tx外显子6”)相一致的Tx部分的DNA探针通过Northern印迹进行的。该探针对应于序列SEQ ID No.1的595～811位核苷酸。
通过从含Tx cDNA的质粒开始用上面的寡核苷酸T2A(SEQ IDNo.6)和TxC(SEQ ID No.12)为引物扩增该序列而制备探针“Tx外显子6”。
通过随机引物法用寡核苷酸标记(oligolabelling)试剂盒(Phermacia BioTech)进行32P标记，然后根据生产商提供的杂交条件对在Multiple Tissue Worthern B1ot II膜(Clontech)上的含不同人组织的2μg RNA poly At的Tx mRNA进行杂交检测。
如图4所示，在大多数用可变强度检测的组织中检测到了mRNA信号。外周血白细胞(H)产生了最强的信号。脾脏(A)，小肠(F)，胸腺(B)和卵巢(E)产生中等的信号。前列腺(C)和结肠(G)产生了很弱的信号并最后在精巢mRNA中(D)检测不到任何信号。
因此编码Tx蛋白的mRNA可在多种组织特别是血细胞中表达。实施例2对Tx蛋白功能的研究A-IL-1β前体的断裂在带有表达载体pcDNAI/Amp和pcDL-SRα296之一或其载体的真核细胞转染系统中检测Tx蛋白任意切割人IL-1β前体的能力。
首次在真核表达载体pcDNA/Amp(Invitrogen)的BamHI和XbaI位点对Tx cDNA的编码区(SEQ ID No.1)进行了克隆。在用BamHI和XbaI消化之后，分离并纯化了一个约1150碱基对的插入。用T4DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)将限制性末端补齐。将得到的cDNA用连接试剂盒(Amershem)在XbaI酶打开的载体pcDL-SRα296(Takebe等.，分子和细胞生物学， Vol.8，466，1988)中亚克隆并用T4DNA聚合酶末端补齐。在用质粒Maxi试剂盒(QIAGEN)纯化之后，即得到了在两个载体之中的Tx质粒DNA制品。
用于转染的真核细胞是组成性表达pIL-1β的Cos-1细胞系，它是由含人pIL-1β的基因的质粒转染得到的。通过将细胞培养在含0.5mg/ml G-418硫酸盐，10％FCS，谷氨酰胺，P/S，丙酮酸，HEPES的DMEM培养基中，可维持在该细胞系中pIL-1β的合成。
将3×106Cos-1细胞在37℃潮湿空气5％CO2下培养在佩特里培养碟中并用15μg质粒转染，该质粒DNA在加入培养碟之前预先与200μl DEAE-DEXTRAN混合并用4ml PBS稀释。在37℃培养30分钟并向其中加入8ml 80μm的溶于不含血清的DMEM中的氯醌溶液之后，将细胞培养2.5小时。然后吸去上清液并将细胞在无血清DMEM中以10％DMSO处理2分钟。在用无血清培养基洗涤之后，加入10ml上面的完全培养基。培养之后，在16到45小时之间不同时间点收集转染细胞的上清液。
应用可对成熟IL-1β进行特异检测的ELISA IL-1β测试(R&D Systems)对上清液中的成熟IL-1β进行测定。
将插入到上面两个载体中之一的Tx cDNA编码区的转染与分别含ICE p45或ICE p30的cDNA编码区的转染以及做为对照的用不含质粒的只有对应载体的转染相比较进行。
如图5所示，ICE p45(柱2)或p30(柱7)cDNA的转染赋予细胞分泌成熟IL-1β的能力。相反，当在相同条件下用Tx cDNA转染时(柱3和6)，相对于对照转染(柱1、4、5)未观察到IL-1β的分泌。不管培养时间如何，用两个载体转染有类似的结果(16h图5A；24h图5B；29h和直到44h)。
蛋白质Tx不具有IL-1β转换酶特征。B-Tx蛋白的蛋白酶活性ICE的30kDa前体的裂解对Tx蛋白的可任意裂解ICE的30kDa前体(ICE p30)的能力进行了测定，这是在同时导入了含Tx cDNA(SEQ ID No.1)编码区的载体和含编码修饰的ICE蛋白的DNA导入Cos-1细胞中共转染系统进行的，每种DNA被分别插入到上面的表达载体pcDL-SRα296中。
蛋白ICE被两次修饰一方面，为了可在Tx蛋白的存在下对蛋白ICE进行特异的检测，将一个小的T7肽融合到蛋白ICE p30的N末端。因此该蛋白被标记了或者可用T7肽的单克隆抗体检测其成熟产物(Tsui等.，美国国家科学院院刊.，89，8864，1992)。另一方面以一种不能诱导其自身成熟的形式表达该酶，使用了一种突变的ICE p30，活性位点的半胱氨酸，Cys 285被丝氨酸取代(Wilson，K.P.等，自然，370，1994年7月28日，270-275)。因此该酶是非活化的并且不能诱导其自身的成熟或pIL-1β的裂解。用TransformerTM定点突变试剂盒(Clontech)和合适的寡核苷酸通过定点突变制备突变体。对得到的序列进行彻底验证。由此得到了标记的和突变的称为T7-ICE p30C285S的ICE p30。
根据上面的操作条件，用含T7-ICE p30C285S的载体pcDL-SRα296或含Tx的载体pcDL-SRα296转染Cos-1细胞转染，或用上面两个载体共转染。在培养22小时之后，收集细胞并洗涤，以及在含10mM NaCl，10mM Hepes，pH7.4，1mM EDTA，50mM NaF，0.2％Triton X-100，1μg/ml Leupeptin，20U/μl aprotinin和1mMPMSF的缓冲液中溶解。将细胞溶解产物在400g 4℃离心，然后用SDS-PAGE 16％聚丙烯酰胺凝胶上对上清进行电泳。然后将凝胶上蛋白转移到硝酸纤维素膜上并用抗T7小鼠单克隆抗体(Novagen)在环境温度下温育2小时。洗膜然后用偶联了碱性磷酸酶的小鼠抗免疫球蛋白羊抗体温育1小时。然后用碱性磷酸酶底物(promega)显示固定于膜上的抗体。
用同样的方式用含T7-ICE p30C285S的pcDL-SRα296载体和含用以代替Tx的ICE p30或ICE p45的载体pcDL-SRα296进行共转染。
如图6所示，当突变的蛋白ICE p30(T7-ICE p30C285S)单独在转染的Cos细胞中表达时，可检测到T7-p30形式的酶(表观分子量35kDa)(曲线B)。对于p20形式的带的缺乏表明突变酶自身不能裂解。当细胞含ICE p30酶(曲线C)或p45酶(曲线D)的载体共转染时，可观察到对于由活性酶产生的T7-p20的裂解产物的表观分子量为29kDa的带。当细胞被含Tx(曲线E)的载体共转染时，也观察到了表观分子量20kDa带的出现并伴随着两条次要的约31和28kDa的带。不同的带对应于在细胞中表达的Tx蛋白对ICE p30形式的裂解产物。
这些结果表明，一方面Tx蛋白在转染的Cos细胞中表达，而另一方面其具有蛋白酶活性。另外，Tx蛋白能裂解ICE 30kDa前体并因此可引起在体内ICE原酶的成熟并产生活性形式的酶。C-Tx蛋白对细胞凋亡的诱导通过在Cos细胞中的转染以及培养细胞的形态检验对Tx蚤白诱导细胞凋亡的能力进行检测。
对在不同细胞类型中ICE的转染导致这些细胞以细胞凋亡形式死亡已有报道(Miura等，已引用)。
如上所述用含Tx cDNA(SEQ ID No.1)编码区的载体以及含ICE p45的载体pcDL-SRα296对Cos-1细胞进行转染。在培养22小时后对细胞的形态进行观察。
对图7所示，在ICE cDNA(7D)转染的Cos细胞培养物中观察到了从支持物上脱离下来的圆形细胞的出现以及细胞凋亡的特征的细胞的形态初现。在Tx cDNA转染的Cos细胞培养物(7C)中观察到了同样的形态改变。
当上面的载体pcDNAI/Amp被用于在转染Cos-1细胞得到了同样的形态结果。
这些结果由从转染的Cos-1细胞在转染后培养40小时的分离的DNA的观察结果得到了确证。用micro TurboGen试剂盒(Invitrogen)制备细胞DNA，在1.5％琼脂糖凝胶上迁移并用BET染色。
如图8所示，在用ICE p45(曲线B)和Tx(曲线C)转染细胞的DNA具有凋亡细胞“梯状”特征表型出现。
用无DNA(7A和8A)或不含cDNA(7B和8D)的载体都不具有凋亡细胞的DNA形态。
这些结果表明Tx蛋白包含在细胞凋亡的诱导之中。实施例3TY序列的鉴定A-Tx同源基因的克隆将从外周血单核细胞提取的人基因组DNA用HindIII酶消化(Boehringer Mannbeim)，然后在1％琼脂糖，1×TAE凝胶根据已引用过的Maniatis等所描述的条件进行制备电泳以分离片段。将对应于分子量大于1.9kb的克隆孔区域的凝胶切成24等份，然后用从每个部分洗脱下来的DNA应用已描述过的T2A(SEQ ID No.6)和TxC(SEQID No.12)寡核苷酸进行PCR扩增，扩增条件如下94℃，30秒；55℃，30秒；72℃，1mn；30个循环；BioTaq聚合酶(Bioproke)。
在上面的24部分之中，保留了用PCR产生最大扩增的10个部分。在琼脂糖凝胶上对扩增物质进行纯化并用7A克隆试剂盒(Invitrogen)在pCRII载体进行克隆并应用Macrophor电泳系统(PharmaciaSystem)使用测序酶通过Sanger技术(2.0版本DNA测序试剂盒)进行测序。如实施例1所指明的用GCG软件对确定的序列进行分析。
将与Tx cDNA序列(SEQ ID No.1)的核苷酸有94.9％-致性的核苷酸序列称为TY并试图克隆其对应的TYcDNA。B-TYcDNA的克隆和鉴定a)TYcDNA连续序列的确定用锚式PCR技术分别从人脾脏和胎盘的cDNA获得了TYcDNA的5′和3′末端核苷酸序列。
用3′RACE System试剂盒(Gibco-BRL)和下面的扩增寡核苷酸对TYcDNA的3′末端进行了扩增。
Ty 3.2CATGTCTCATGGCATCCTA (SEQ ID N°24)和Ty 3.1CTGCGGAACTGCGCATAAAA(SEQ ID N°25).
这两个引物是从上面得到的TY序列外显子6的部分序列出发确定。如上所述对扩增片段在琼脂糖凝胶上进行纯化，在载体pCRII中进行了克隆以及进行测序。将得到的序列进行排序使得可对TYcDNA 3′部分编码区以及非编码3′区进行了确定。
应用人脾脏5′-RACE-Ready cDNA试剂盒(Clontech)和下面的扩增寡核苷酸扩增了TYcDNA 5′末端Ty5A1GGCTCTAGACTCGAGGTGCTCTTTGATGTTGACAG (SEQ ID N°26)和Ty5A4CTTCTCCTCGTGGATCTTGC (SEQ ID N°27).
通过添加TY5A1的限制位点XbaI和XhoI而从上面得到的TYcDNA3′区确定了这两个引物。如上所述应用7A克隆试剂盒(Invitrogen)对扩增片段进行克隆以及如上所述进行了测序。
应用上面的TY5A2(SEQ ID No.26)和Ty 3.1(SEQ ID No.25)寡核苷酸和下面的寡核苷酸进行了确证
Ty 2AGATGTTCTTCATGGT (SEQ ID N°28)Ty 4CTTCTCAATATGGACCA (SEQ ID N°29)Ty 5CCTGGCTCTCATCATAT (SEQ ID N°30)Ty 6ATTTGCTGCCAGACCAGA (SEQ ID N°31)Ty 7GCCTGCAGAGGTGAAAAAC(SEQ ID N°32)Ty 8GCTCCATCTTCATTACGGA(SEQ ID N°33)Ty 0GATTTCTGTACCTTCCG (SEQ ID N°34)Ty ATTTATGCGCAGTTCCG (SEQ ID N°35)Ty BGTCATAGTGAGCCCCATT (SEQ ID N°36)Ty CCTTCACGAGGACAAAGT (SEQ ID N°37)Ty DTCGCAAAGAGTCTACCA (SEQ ID N°38)这些寡核苷酸选自TY的编码序列(编码链或互补链)。
将所有得到的序列排序即产生了TYcDNA(SEQ ID No.22)的连续核苷酸序列。b)TYcDNA编码区的克隆用相应的5′-RACE-Ready cDNA试剂盒(Clontech)，上面的寡核苷酸TY5A1(SEQ ID No.26)和下面的寡核苷酸从人脾脏或胎盘的cDNA开始用PCR扩增TYcDNA(SEQ ID No.22)的编码区。TYP5CGCGGATCCAAGATGTTGGAATACCTGGGCAAA(SEQ ID No.39)这些扩增引物的选择是根据上面确定的TYcDNA(SEQ ID No.22)连续序列为TYP5添力BamHI克隆位点而得到的。
如上所示将已被扩增并在琼脂糖凝胶上纯化的具有大约1100碱基对的产物用限制酶BamHI和XbaI消化，然后如实施例1所描述的载体pcDNAI/Amp中进行了克隆并如上指出那样进行了测序。用上面所定义的寡核苷酸SEQ ID No.28到SEQ ID No.38对上面两条链的克隆产物全部进行了测序。
获得了一个与TYcDNA(SEQ ID No.22)连续序列的编码序列的等同序列。TYcDNA的编码与实施例1获得的Tx cDNA的编码序列有84％的核苷酸的一致性。
TYcDNA编码区编码具有衍生的SEQ ID No.23的氨基酸序列的TY蛋白。蛋白序列含304个氨基酸，计算分子量41.8kDa。
TY蛋白与实施例1获得的Tx蛋白序列同源性有76％的氨基酸一致性。
在载体pcDNAI/Amp(TYcDNA/pcDNAI/Amp 30/6/95)中含TYcDNA的编码区的大肠杆菌XL-1 blue样品被于1994年7月5日保藏在国立微生物保藏中心，保藏号I-1068。实施例4TY蛋白的生物活性A-诱导细胞凋亡根据实施例2所表明的操作方法并应用由含TYcDNA(SEQ IDNo.22)的编码区的称为pcDL-TY的载体pcDL-SRα296转染的Cos-1细胞检测了TY蛋白诱导细胞凋亡的能力，并且根据实施例2描述的条件对Tx cDNA的亚克隆进行了制备。
在培养了23小时和43小时之后对细胞的形成形态进行了观察并在培养43小时之后对其分离的DNA进行了观察。
与用含Tx或ICE p45编码区的载体转染的细胞相比，所得到的结果与实施例2中图7和图8所示的结果相一致。
这些结果证明在诱导细胞凋亡中包含像Tx蛋白一样的TY蛋白。B-TY蛋白的蛋白酶活性在真核细胞共转染系统中对TY蛋白以分子内方式自身裂解的能力进行了测试，这是在如实施例2中Tx蛋白对ICE前体裂解的相似条件中，通过向Cos-1细胞中同时导入含TYcDNA(SEQ ID No.22)编码区的载体和含修饰的TY蛋白的编码DNA载体而进行的，其中如实施例2中所述每种DNA被分别导入表达载体pcDL-SRα296和载体pcDNAI/Amp中。
TY蛋白被修饰两次，通过“重叠”PCR方法将Cys 245密码子突变成Ser密码子；另一方面表位标签(Tag)T7(MASMTGGQQMG)被导入对应于序列SEQ ID No.23的68-304残基的TY片段的N末端。
下面的引物对被用于扩增TYcDNA基体。a)一方面，T7TYCGCGGATCCACCATGGCTTCTATGACAGGAGGTCAACAAATGGGACAAAAGATCACCAGTGTAAAACC (SEQ ID N°40)
它们是选自TY的编码序列并通过在编码标签T7的编码序列之后添加Bam HI限制性位点而合成的。TYC245SRATGTTTTTCACCTCTGGAGGCCTGGACAATGATGAC (SEQ ID N°41)其选自带有位点17C→G突变的TY编码序列(互补链)，b)另一方面，TYC245SGTCATCATTGTCCAGGCCTCCAGAGGTGAAAAACAT (SEQ ID N°42)其选自带有20位点G→C突变的TY编码序列和上面的TY5A1(SEQ ID No.26)并应用下面的扩增条件94℃，1mn；60℃，1mn；72℃，1mn；30个循环；Vent聚合酶(Biolabs)。这两个分别得到的扩增产物是分别用上面的扩增条件和用T7Ty和TY5A1引物通过PCR联合和扩增。
将扩增产物用限制酶BamHI和XbaI消化，然后在预先用同样的限制消化的载体pcDNAI/Amp中克隆。
如上所示制备的表达载体pcDL-SRα296在其中进行TYcDNA序列(SEQ ID No.22)的亚克隆，并被命名为质粒pcDL-TY。
将Cos-1细胞根据实施例2的操作条件用载体pT7TYΔ67C245S转染，或该质粒和质粒pcDL-TY共转染，然后培养23小时或43小时，裂解并在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，用小鼠抗T7单克隆抗体进行Western印迹，但其中小鼠抗免疫球蛋白羊抗体是与辣根过氧化物酶偶联的，而不是与碱性磷酸酶偶联的。然后用放射自显影通过Western检测系统(Amershem)显示与膜相连接的抗体。
以单独用载体pcDL-SRα296和载体pcDNAI/Amp同样的方式进行共转染并将细胞培养23小时。
如图9所示，当突变TY蛋白单独在转染的Cos细胞中表达时，可检测到T7TY形式(表观分子量30kDa)(曲线E)。低分子量的带的缺乏表明突变TY蛋白不能自身裂解。当细胞被含TY(曲线F&G)的载体共转染时，在表观分子量20kDa的地方观察到了主要带的出现，这是与突变的TY蛋白的裂解产物相对应的。
这些结果表明一方面TY蛋白在转染的Cos细胞中表达，并且另一方面其具有蛋白酶活性，以及特别是它能分子内方式自身裂解。
序列表(1)一般的信息(i)申请人(A)姓名ROUSSEL UCLAF(B)街道102，Route de Noisy(C)城市ROMSINVILLR(E)国家FRANCE(F)邮政编码93230(G)电话49.91.49.91(H)传真49.91.46.10(ii)发明题目编码与白介素-1β转换酶相关的人Tx蛋白的DNA序列，Tx蛋白，生产方法，药用组合物及其用途(iii)序列数42(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM 兼容PC(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatertIn Release #1.0版本#1.3(EPO)+Corrections in WORDPERFECT 5.1 forSEQ ID No.22(ix)(vi)在先申请数据(A)申请号FR 9409567(B)提交日02-AUG-1994(2)SEQ ID No.1的信息(i)序列特征(A)长度1201碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(vi)来源(A)生物体人类(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置42..1172(xi)序列描述SEQ ID No.1GCTCTTTCCA ACGCTGTAAA AAAGGACAGA GGCTGTTCCC T ATG GCA GAA GGC 53Met Ala Glu Gly1AAC CAC AGA AAA AAG CCA CTT AAG GTG TTG GAA TCC CTG GGC AAA GAT 101Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser Leu Gly Lys Asp5 10 15 20TTC CTC ACT GGT GTT TTG GAT AAC TTG GTG GAA CAA AAT GTA CTG AAC 149Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln Asn Val Leu Asn25 30 35TGG AAG GAA GAG GAA AAA AAG AAA TAT TAC GAT GCT AAA ACT GAA GAC 197Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala Lys Thr Glu Asp40 45 50AAA GTT CGG GTC ATG GCA GAC TCT ATG CAA GAG AAG CAA CGT ATG GCA 245Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys Gln Arg Met Ala55 60 65GGA CAA ATG CTT CTT CAA ACC TTT TTT AAC ATA GAC CAA ATA TCC CCC 293Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp Gln Ile Ser Pro70 75 80AAT AAA AAA GCT CAT CCG AAT ATG GAG GCT GGA CCA CCT GAG TCA GGA 341Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro Pro Glu Ser Gly85 90 95 100GAA TCT ACA GAT GCC CTC AAG CTT TGT CCT CAT GAA GAA TTC CTG AGA 389Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu Glu Phe Leu Arg105 110 115CTA TGT AAA GAA AGA GCT GAA GAG ATC TAT CCA ATA AAG GAG AGA AAC 437Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Glu Arg Asn120 125 130AAC CGC ACA CGC CTG GCT CTC ATC ATA TGC AAT ACA GAG TTT GAC CAT 485Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr Glu Phe Asp His135 140 145CTG CCT CCG AGG AAT GGA GCT GAC TTT GAC ATC ACA GGG ATG AAG GAG 533Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr Gly Met Lys Glu150 155 160CTA CTT GAG GGT CTG GAC TAT AGT GTA GAT GTA GAA GAG AAT CTG ACA 581Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu Glu Asn Leu Thr165 170 175 180GCC AGG GAT ATG GAG TCA GCG CTG AGG GCA TTT GCT ACC AGA CCA GAG 629Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala Thr Arg Pro Glu185 190 195CAC AAG TCC TCT GAC AGC ACA TTC TTG GTA CTC ATG TCT CAT GGC ATC 677His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met Ser His Gly Ile200 205 210CTG GAG GGA ATC TGC GGA ACT GTG CAT GAT GAG AAA AAA CCA GAT GTG 725Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys Lys Pro Asp Val215 220 225CTG CTT TAT GAC ACC ATC TTC CAG ATA TTC AAC AAC CGC AAC TGC CTC 773Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn Arg Asn Cys Leu230 235 240AGT CTG AAG GAC AAA CCC AAG GTC ATC ATT GTC CAG GCC TGC AGA GGT 821Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln Ala Cys Arg Gly245 250 255 260GCA AAC CGT GGG GAA CTG TGG GTC AGA GAC TCT CCA GCA TCC TTG GAA 869Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro Ala Ser Leu Glu265 270 275GTG GCC TCT TCA CAG TCA TCT GAG AAC CTG GAG GAA GAT GCT GTT TAC 917Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu Asp Ala Val Tyr280 285 290AAG ACC CAC GTG GAG AAG GAC TTC ATT GCT TTC TGC TCT TCA ACG CCA 965Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser Ser Thr Pro295 300 305CAC AAC GTG TCC TGG AGA GAC AGC ACA ATG GGC TCT ATC TTC ATC ACA 1013His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser Ile Phe Ile Thr310 315320CAA CTC ATC ACA TGC TTC CAG AAA TAT TCT TGG TGC TGC CAC CTA GAG1061Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys Cys His Leu Glu325 330 335 340GAA GTA TTT CGG AAG GTA CAG CAA TCA TTT GAA ACT CCA AGG GCC AAA1109Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr Pro Arg Ala Lys345 350 355GCT CAA ATG CCC ACC ATA GAA CGA CTG TCC ATG ACA AGA TAT TTC TAC1157Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr Arg Tyr Phe Tyr360 365 370CTC TTT CCT GGC AAT TGAAAATGGA AGCCACAAGC AGCCCAGCCC TCCTTAATCA1212Leu Phe Pro Gly Asn375ACTTCAAGGA GCACCTTCAT TAGTACAGCT TGCATATTTA ACATTTTGTA TTTCAATAAA 1272AGTGAAGACA AAAAAAAAA 1291(2)SEQ ID No.2的信息(i)序列特征(A)长度377氨基酸(B)类型氨基酸(D)构型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.2Met Ala Glu Gly Asn His Arg Lys Lys Pro Lau Lys Val Leu Glu Ser1 5 10 15Leu Gly Lys Asp Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln20 25 30Asn Val Leu Asn Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala35 40 45Lys Thr Glu Asp Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys50 55 60Gln Arg Met Ala Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp65 70 75 80Gln Ile Ser Pro Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro85 90 95Pro Glu Ser Gly Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu100 105 l10Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile115 120 125Lys Glu Arg Asn Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr130 135 140Glu Phe Asp His Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr145 150 155 160Gly Met Lys Glu Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu165 170 175Glu Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala180 185 190Thr Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met195 200 205Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys210 215 220Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn225 230 235 240Arg Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln245 250 255Ala Cys Arg Gly Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro260 265 270Ala Ser Leu Glu Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu275 280 285Asp Ala Val Tyr Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys290 295 300Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser305 310 315 320Ile Phe Ile Thr Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys325 330 335Cys His Leu Glu Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr340 345 350Pro Arg Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr355 360 365Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn370 375(2)SEQ ID No.3的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(x)公开信息(A)作者Thornberry，Nancy A.
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Molineaux，Susan M.
Weidner，Jeffrey R.
Aunins，John(B)题目在单核细胞的白介素-1β加工过程中需要一种新的异二聚体半胱氨酸蛋白酶(C)杂志自然(D)卷356(F)页码768-774(G)日期30-APRIL-1992(K)SEQ ID No.3 1到20中相关残基(xi)序列描述SEQ ID No.3ACATGACTAC AGAGCTGGAG 20(2)SEQ ID No.4的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(A)位置互补链(1..20)(x)公开信息(A)作者Thorbberry，Nancy A.
Bull，Herbert G.
Calaycay，Jimmy R.
Chapman，Kevin T.
Howard，Andrew D.
Kostura，Matthew J.
Miller，Douglas K.
Molineaux，Susan M.
Weidner，Jeffrey R.
Aunins，John(B)题目在单核细胞的白介素-1β加工过程中需要一种新的异二聚体半胱氨酸蛋白酶
(C)杂志自然(D)卷356(F)页码768-774(G)日期30一APRIL-1992(xi)序列描述SEQ ID No.4CACCACGGCA GGCCTGGATG20(2)SEQ ID No.5的信息(i)序列特征(A)长度235碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双(D)构型线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)来源(A)生物体人类(xi)序列描述SEQ ID No 5GAAATGACTA CAGAGCTGGA GGCATTTGG TCACCGCCCAG AGCACAAGAC CTCTGACAGC60ACCTTCCCGG TCTTCTTGTC TCATGGTGTT CGGGAAGGCA TTTGTGGGAA GAAATACTCT120GAACAAGTCC CTGATATATT ACAATTCAAT GAAATATTTA AAATGTTGAA TAGCAAGAAC180TGCCCAAGTT TGAAGGACAA ACCCAAGGTG ATCATCTTCG AGGCCTGCTG TGGTG 235(2)SEQ ID No.6的信息(i)序列特征(A)长度23碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..23)
(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.5从8到30”(xi)序列描述SEQ ID No.6CTACAGAGCT GGAGGCATTT GCT 23(2)SEQ ID No.7的信息(i)序列特征(A)长度24碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/dese＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(A)位置互补链(1..24)(x)公开信息(A)作者Thornberry，Nancy A.
Bull，Herbert G.
Calaycay，Jimmy R.
Chapman，Kevin THoward，Andrew D.
Kostura，Matthew J.
Miller，Douglas K.
Molineaux，Susan M.
Weidner，Jeffrey R.
Aunins，John(B)题目在单核细胞的白介素-1β加工过程中需要一种新的异二聚体半胱氨酸蛋白酶(C)杂志自然(D)卷356(F)页码768-774(G)日期30-APRIL-1992(xi)序列描述SEQ ID No.7
TTAATGTCCT GGGAAGAGGT AGAA 24(2)SEQ ID No.8的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..21)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从753到773”(xi)序列描述SEQ ID No.8GAGGCAGTTG CGGTTGTTGA A21(2)SEQ ID No.9的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/dese＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..21)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从829到849”(xi)序列描述SEQ ID No.9CTCTGACCCA CAGTTCCCCA C 21(2)SEQ ID No.10的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对
(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..17(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从659到711”(xi)序列描述SEQ ID No.10AACTGTGCAT GATGAGA 17(2)SEQ ID No.11的信息(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..9(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从905到913”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置11..19(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从915到923”(xi)序列描述SEQ ID No.11AGATGCTGTG TACAAGACC 19(2)SEQ ID No.12的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对
(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从795到811”(xi)序列描述SEQ ID No.12GCCTGGACAA TGATGAC 17(2)SEQ ID No.13的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从995到1011”(xi)序列描述SEQ ID No.13TGATGAAGAT AGAGCCC 17(2)SEQ ID No.14的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸
(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..17(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从204到220”(xi)序列描述SEQ ID No.14CGGGTCATGG CAGACTC 17(2)SEQ ID No.15的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从249到265”(xi)序列描述SEQ ID No.15GTTTGAAGAA GCATTTG 17(2)SEQ ID No.16的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..17
(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从330到346”(xi)序列描述SEQ ID No.16CCTGAGTCAG GAGAATC 17(2)SEQ ID No.17的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从375到391”(xi)序列描述SEQ ID No.17AGTCTCAGGA ATTCTTC 17(2)SEQ ID No.18的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..17(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从503到519”(xi)序列描述SEQ ID No.18AGCTGACTTT GACATCA 17(2)SEQ ID No.19的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/dese＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从587到603”(xi)序列描述SEQ ID No.19GCGCTGACTC CATATCC 17(2)SEQ ID No.20的信息(i)序列特征(A)长度33碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/dese＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置13..33(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从42到62”(xi)序列描述SEQ ID No.20CGCGGATCCA CCATGGCAGA AGGCAACCAC AGA 33(2)SEQ ID No.21的信息(i)序列特征(A)长度39碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单
(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(19..39)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.1从1155到1175”(xi)序列描述 SEQ ID No.21GGCTCTAGAC TCGAGTTATC AATTGCCAGG AAAGAGGTA39(2)SEQ ID No.22的信息(i)序列特征(A)长度1310碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置104..1195(xi)序列描述SEQ ID No.22GAACAACGTG GCTGGACAAA CATCTATCCA GACCCTAGTA CCTAATACGG ATCAAAAGTC60GACCAGTGTA AAAAAAGACA ACCACAAAAA AAAAACAGTT AAG ATG TTG GAA TAC 115Met Leu Glu Tyr1CTG GGC AAA GAT GTT CTT CAT GGT GTT TTT AAT TAT TTG GCA AAA CAC 163Leu Gly Lys Asp Val Leu His Gly Val Phe Asn Tyr Leu Ala Lys His5 10 15 20GAT GTT CTG ACA TTG AAG GAA GAG GAA AAG AAA AAA TAT TAT GAT GCC 211Asp Val Leu Thr Leu Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala25 30 35AAA ATT GAA GAC AAG GCC CTG ATC TTG GTA GAC TCT TTG CGA AAG AAT 259Lys Ile Glu Asp Lys Ala Leu Ile Leu Val Asp Ser Leu Arg Lys Asn40 45 50CGC GTG GCT CAT CAA ATG TTT ACC CAA ACA CTT CTC AAT ATG GAC CAA 307Arg Val Ala His Gln Met Phe Thr Gln Thr Leu Leu Asn Met Asp Gln55 60 65AAG ATC ACC AGT GTA AAA CCT CTT CTG CAA ATC GAG GCT GGA CCA CCT 355Lys Ile Thr Ser Val Lys Pro Leu Leu Gln Ile Glu Ala Gly Pro Pro70 75 80GAG TCA GCA GAA TCT ACA AAT ATA CTC AAA CTT TGT CCT CGT GAA GAA 403Glu Ser Ala Glu Ser Thr Asn Ile Leu Lys Leu Cys Pro Arg Glu Glu85 90 95 100TTC CTG AGA CTG TGT AAA AAA AAT CAT GAT GAG ATC TAT CCA ATA AAA 451Phe Leu Arg Leu Cys Lys Lys Asn His Asp Glu Ile Tyr Pro Ile Lys105 110 115AAG AGA GAG GAC CGC AGA CGC CTG GCT CTC ATC ATA TGC AAT ACA AAG 499Lys Arg Glu Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr Lys120 125 130TTT GAT CAC CTG CCT GCA AGG AAT GGG GCT CAC TAT GAC ATC GTG GGG 547Phe Asp His Leu Pro Ala Arg Asn Gly Ala His Tyr Asp Ile Val Gly135 140 145ATG AAA AGG CTG CTT CAA GGC CTG GGC TAC ACT GTG GTT GAC GAA AAG 595Met Lys Arg Leu Leu Gln Gly Leu Gly Tyr Thr Val Val Asp Glu Lys150 155 160AAT CTC ACA GCC AGG GAT ATG GAG TCA GTG CTG AGG GCA TTT GCT GCC 643Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Val Leu Arg Ala Phe Ala Ala165 170 175 180AGA CCA GAG CAC AAG TCC TCT GAC AGC ACG TTC TTG GTA CTC ATG TCT 691Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met Ser185 190 195CAT GGC ATC CTA GAG GGA ATC TGC GGA ACT GCG CAT AAA AAG AAA AAA 739His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Ala His Lys Lys Lys Lys200 205 210CCG GAT GTG CTG CTT TAT GAC ACC ATC TTC CAG ATA TTC AAC AAC CGC 787Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn Arg215 220 225AAC TGC CTC AGT CTA AAG GAC AAA CCC AAG GTC ATC ATT GTC CAG GCC 835Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln Ala230 235 240TGC ACA GGT GAA AAA CAT GGG GAA CTC TGG GTC AGA GAC TCT CCA GCA 883Cys Arg Gly Glu Lys His Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro Ala245 250 255 260TCC TTG GCA CTC ATC TCT TCA CAG TCA TCT GAG AAC CTG GAG GCA GAT 931Ser Leu Ala Leu Ile Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Ala Asp265 270 275TCT GTT TGC AAG ATC CAC GAG GAG AAG GAC TTC ATT GCT TTC TGT TCT 979Ser Val Cys Lys Ile His Glu Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser280 285 290TCA ACA CCA CAT AAC GTG TCC TGG AGA GAC CGC ACA AGG GGC TCC ATC1027Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Arg Thr Arg Gly Ser Ile295 300 305TTC ATT ACG GAA CTC ATC ACA TGC TTC CAG AAA TAT TCT TGC TGC TGC1075Phe Ile Thr Glu Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Cys Cys Cys310 315 320CAC CTA ATG GAA ATA TTT CGG AAG GTA CAG AAA TCA TTT GAA GTT CCA1123His Leu Met Glu Ile Phe Arg Lys Val Gln Lys Ser Phe Glu Val Pro325 330 335 340CAG GCT AAA GCC CAG ATG CCC ACC ATA GAA CGA GCA ACC TTG ACA AGA1171Gln Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Ala Thr Leu Thr Arg345 350 355GAT TTC TAC CTC TTT CCT GGC AAT TGAAAATGAA ACCACAGGCA GCCCAGCCCT 1225Asp Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn360CCTCTGTCAA CATCAAAGAG CACATTTACC AGTATAGCTT GCATAGTCAA TATTTGGTAT 1285TTCAATAAAA GTAAAGACTG TATCT1310(2)SEQ ID No.23的信息(i)序列特征(A)长度364氨基酸(B)类型氨基酸(D)构型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID No.23Met Leu Glu Tyr Leu Gly Lys Asp Val Leu His Gly Val Phe Asn Tyr1 5 10 15Leu Ala Lys His Asp Val Leu Thr Leu Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys20 25 30Tyr Tyr Asp Ala Lys Ile Glu Asp Lys Ala Leu Ile Leu Val Asp Ser25 40 45Leu Arg Lys Asn Arg Val Ala His Gln Met Phe Thr Gln Thr Leu Leu50 55 60Asn Met Asp Gln Lys Ile Thr Ser Val Lys Pro Leu Leu Gln Ile Glu65 70 75 80Ala Gly Pro Pro Glu Ser Ala Glu Ser Thr Asn Ile Leu Lys Leu Cys85 90 95Pro Arg Glu Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Lys Asn His Asp Glu Ile100 105 110Tyr Pro Ile Lys Lys Arg Glu Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Ile Ile115 120 125Cys Asn Thr Lys Phe Asp His Leu Pro Ala Arg Asn Gly Ala His Tyr130 135 140Asp Ile Val Gly Met Lys Arg Leu Leu Gln Gly Leu Gly Tyr Thr Val145 150 155 160Val Asp Glu Lys Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Val Leu Arg165 170 175Ala Phe Ala Ala Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu180 185 190Val Leu Met Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Ala His195 200 205Lys Lys Lys Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile210 215 220Phe Asn Asn Arg Asn Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile225 230 235 240Ile Val Gln Ala Cys Arg Gly Glu Lys His Gly Glu Leu Trp Val Arg245 250 255Asp Ser Pro Ala Ser Leu Ala Leu Ile Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn260 265 270Leu Glu Ala Asp Ser Val Cys Lys Ile His Glu Glu Lys Asp Phe Ile275 280 285Ala Phe Cys Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Arg Thr290 295 300Arg Gly Ser Ile Phe Ile Thr Glu Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr305 310 315 320Ser Cys Cys Cys His Leu Met Glu Ile Phe Arg Lys Val Gln Lys Ser325 330 335Phe Glu Val Pro Gln Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Ala340 345 350Thr Leu Thr Arg Asp Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn355 360(2)SEQ ID No.24的信息(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..19(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从685到703”(xi)序列描述SEQ ID No.24CATGTCTCAT GGCATCCTA19(2)SEQ ID No.25的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..20(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从712到731”(xi)序列描述SEQ ID No.25CTGCGGAACT GCGCATAAAA20(2)SEQ ID No.26的信息(i)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(16.35)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从1229到1248”(xi)序列描述SEQ ID No.26GGCTCTAGAC TCGAGGTGCT CTTGATGTT GACAG35(2)SEQ ID No.27的信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征
(B)位置互补(1..20)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从939到958”(xi)序列描述SEQ ID No.27CTTCTCCTCG TGGATCTTGC20(2)SEQ ID No.28的信息(i)序列特征(A)长度16碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..16(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从124到139”(xi)序列描述SEQ ID No.28AGATGTTCTT CATGGT 16(2)SEQ ID No.29的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..17(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从290到306”(xi)序列描述SEQ ID No.29CTTCTCAATA TGGACCA 17(2)SEQ ID No.30的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..17(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从427到488”(xi)序列描述SEQ ID No.30CCTGGCTCTC ATCATAT 17(2)SEQ ID No.31的信息(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..18(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从634到651”(xi)序列描述SEQ ID No.31ATTTGCTGCC AGACCAGA18(2)SEQ ID No.32的信息(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸
(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..19(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从813到851”(xi)序列描述SEQ ID No.32GCCTGCAGAG GTGAAAAAC19(2)SEQ ID No.33的信息(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..19(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从1020到1038”(xi)序列描述SEQ ID No.33GCTCCATCTT CATTACGGA 19(2)SEQ ID No.34的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从1094到1110”(xi)序列描述SEQ ID No.34GATTTCTGTA CCTTCCG 17(2)SEQ ID No.35的信息(i)序列特征(A)长度16碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..16)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从715到730”(xi)序列描述SEQ ID No.35TTTATGCGCA GTTCCG16(2)SEQ ID No.36的信息(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..18)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从521到538”(xi)序列描述SEQ ID No.36GTCTTAGTGA GCCCCATT 18(2)SEQ ID No.37的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从385到401”(xi)序列描述SEQ ID No.37CTTCACGAGG ACAAAGT17(2)SEQ ID No.38的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..17)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从237到253”(xi)序列描述SEQ ID No.38TCGCAAAGAG TCTACCA 17(2)SEQ ID No.39的信息(i)序列特征
(A)长度33碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置10..33(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从101到124”(xi)序列描述SEQ ID No.39CGCGGATCCA AGATGTTGGA ATACCTGGGC AAA 33(2)SEQ ID No.40的信息(i)序列特征(A)长度68碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/dese＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置46..68(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从305到327”(xi)序列描述SEQ ID No.40CGCGGATCCA CCATGGCTTC TATGACAGGA GGTCAACAAA TGGGACAAAA 50GATCACCAGT GTAAAACC 68(2)SEQ ID No.41的信息(i)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核苷酸
(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(1..16)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从838到853”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置互补(18..36)(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从818到836”(xi)序列描述SEQ ID No.41ATGTTTTTCACCTCTGGAGG CCTGGACAAT GATGAC36(2)SEQ ID No.42的信息(i)序列特征(A)长度36碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单(D)构型线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“寡核苷酸”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置1..19(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从818到836”(ix)特征(A)名称/键misc特征(B)位置21..36(D)其它信息/提示＝“SEQ ID No.22从838到853”(xi)序列描述SEQ ID No.42GTCATCATTG TCCAGGCCTC CAGAGGTGAA AAACAT 3权利要求
1.包含编码一种具有蛋白酶活性的人多肽具有序列SEQ ID No.1的核苷酸序列的DNA序列。GCTCTTTCCA ACGCTGTAAA AAAGGACAGA GGCTGTTCCC T ATG GCA GAA GGC53Met Ala Glu Gly1AAC CAC AGA AAA AAG CCA CTT AAG GTG TTG GAA TCC CTG GGC AAA GAT 101Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser Leu Gly Lys Asp5 10 15 20TTC CTC ACT GGT GTT TTG GAT AAC TTG GTG GAA CAA AAT GTA CTG AAC 149Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln Asn Val Leu Asn25 30 35TGG AAG GAA GAG GAA AAA AAG AAA TAT TAC GAT GCT AAA ACT GAA GAC 197Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala Lys Thr Glu Asp40 45 50AAA GTT CGG GTC ATG GCA GAC TCT ATG CAA GAG AAG CAA CGT ATG GCA 245Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys Gln Arg Met Ala55 60 65GGA CAA ATG CTT CTT CAA ACC TTT TTT AAC ATA GAC CAA ATA TCC CCC 293Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp Gln Ile Ser Pro70 75 80AAT AAA AAA GCT CAT CCG AAT ATG GAG GCT GGA CCA CCT GAG TCA GGA 341Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro Pro Glu Ser Gly85 90 95 100GAA TCT ACA GAT GCC CTC AAG CTT TGT CCT CAT GAA GAA TTC CTG AGA 389Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu Glu Phe Leu Arg105 110 115CTA TGT AAA GAA AGA GCT GAA GAG ATC TAT CCA ATA AAG GAG AGA AAC 437Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Glu Arg Asn120 125 130AAC CGC ACA CGC CTG GCT CTC ATC ATA TGC AAT ACA GAG TTT GAC CAT 485Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr Glu Phe Asp His135 140 145CTG CCT CCG AGG AAT GGA GCT GAC TTT GAC ATC ACA GGG ATG AAG GAG 533Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr Gly Met Lys Glu150 155 160CTA CTT GAG GGT CTG GAC TAT AGT GTA GAT GTA GAA GAG AAT CTG ACA 581Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu Glu Asn Leu Thr165 170 175 180GCC AGG GAT ATG GAG TCA GCG CTG AGG GCA TTT GCT ACC AGA CCA GAG 629Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala Thr Arg Pro Glu185 190 195CAC AAG TCC TCT GAC AGC ACA TTC TTG GTA CTC ATG TCT CAT GGC ATC 677His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met Ser His Gly Ile200 205 210CTG GAG GGA ATC TGC GGA ACT GTG CAT GAT GAG AAA AAA CCA GAT GTG 725Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys Lys Pro Asp Val215 220 225CTG CTT TAT GAC ACC ATC TTC CAG ATA TTC AAC AAC CGC AAC TGC CTC 773Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn Arg Asn Cys Leu230 235 240AGT CTG AAG GAC AAA CCC AAG GTC ATC ATT GTC CAG GCC TGC AGA GGT 821Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln Ala Cys Arg Gly245 250 255 260GCA AAC CGT GGG GAA CTG TGG GTC AGA GAC TCT CCA GCA TCC TTG GAA 869Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro Ala Ser Leu Glu265 270 275GTG GCC TCT TCA CAG TCA TCT GAG AAC CTG GAG GAA GAT GCT GTT TAC 917Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu Asp Ala Val Tyr280 285 290AAG ACC CAC GTG GAG AAG GAC TTC ATT GCT TTC TGC TCT TCA ACG CCA 965Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser Ser Thr Pro295 300 305CAC AAC GTG TCC TGG AGA GAC AGC ACA ATG GGC TCT ATC TTC ATC ACA1013His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser Ile Phe Ile Thr310 315 320CAA CTC ATC ACA TGC TTC CAG AAA TAT TCT TGG TGC TGC CAC CTA GAG 1061Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys Cys His Leu Glu325 330 335 340GAA GTA TTT CGG AAG GTA CAG CAA TCA TTT GAA ACT CCA AGG GCC AAA 1109Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr Pro Arg Ala Lys345 350 355GCT CAA ATG CCC ACC ATA GAA CGA CTG TCC ATG ACA AGA TAT TTC TAC 1157Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr Arg Tyr Phe Tyr360 365 370CTC TTT CCT GGC AAT TGAAAATGGA AGCCACAAGC AGCCCAGCCC TCCTTAATCA 1212Leu Phe Pro Gly Asn375ACTTCAAGGA GCACCTTCAT TAGTACAGCT TGCATATTTA ACATTTTGTA TTTCAATAAA 1272AGTGAAGACA AAAAAAAAA 1291
2.包含编码一种能诱导细胞凋亡的人多肽并具有序列SEQ IDNo.1的核苷酸序列的DNA序列。GCTCTTTCCA ACGCTGTAAA AAAAGGACAGA GGCTGTTCCC T ATG GCA GAA GGC 53Met Ala Glu Gly1AAC CAC AGA AAA AAG CCA CTT AAG GTG TTG GAA TCC CTG GGC AAA GAT101Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser Leu Gly Lys Asp5 10 15 20TTC CTC ACT GGT GTT TTG GAT AAC TTG GTG GAA CAA AAT GTA CTG AAC149Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln Asn Val Leu Asn25 30 35TGG AAG GAA GAG GAA AAA AAG AAA TAT TAC GAT GCT AAA ACT GAA GAC197Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala Lys Thr Glu Asp40 45 50AAA GTT CGG GTC ATG GCA GAC TCT ATG CAA GAG AAG CAA CGT ATG GCA245Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys Gln Arg Met Ala55 60 65GGA CAA ATG CTT CTT CAA ACC TTT TTT AAC ATA GAC CAA ATA TCC CCC293Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp Gln Ile Ser Pro70 75 80AAT AAA AAA GCT CAT CCG AAT ATG GAG GCT GGA CCA CCT GAG TCA GGA341Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro Pro Glu Ser Gly85 90 95 100GAA TCT ACA GAT GCC CTC AAG CTT TGT CCT CAT GAA GAA TTC CTG AGA389Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu Glu Phe Leu Arg105 110 115CTA TGT AAA GAA AGA GCT GAA GAG ATC TAT CCA ATA AAG GAG AGA AAC437Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Glu Arg Asn120 125 130AAC CGC ACA CGC CTG GCT CTC ATC ATA TGC AAT ACA GAG TTT GAC CAT485Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr Glu Phe Asp His135 140 145CTG CCT CCG AGG AAT GGA GCT GAC TTT GAC ATC ACA GGG ATG AAG GAG533Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr Gly Met Lys Glu150 155 160CTA CTT GAG GGT CTG GAC TAT AGT GTA GAT GTA GAA GAG AAT CTG ACA581Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu Glu Asn Leu Thr165 170 175 180GCC AGG GAT ATG GAG TCA GCG CTG AGG GCA TTT GCT ACC AGA CCA GAG629Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala Thr Arg Pro Glu185 190195CAC AAG TCC TCT GAC AGC ACA TTC TTG GTA CTC ATG TCT CAT GGC ATC677His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met Ser His Gly Ile200 205 210CTG GAG GGA ATC TGC GGA ACT GTG CAT GAT GAG AAA AAA CCA GAT GTG725Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys Lys Pro Asp Val215 220 225CTG CTT TAT GAC ACC ATC TTC CAG ATA TTC AAC AAC CGC AAC TGC CTC773Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn Arg Asn Cys Leu230 235 240AGT CTG AAG GAC AAA CCC AAG GTC ATC ATT GTC CAG GCC TGC AGA GGT 821Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln Ala Cys Arg Gly245 250 255 260GCA AAC CGT GGG GAA CTG TGG GTC AGA GAC TCT CCA GCA TCC TTG GAA 869Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro Ala Ser Leu Glu265 270 275GTG GCC TCT TCA CAG TCA TCT GAG AAC CTG GAG GAA GAT GCT GTT TAC 917Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu Asp Ala Val Tyr280 285 290AAG ACC CAC GTG GAG AAG GAC TTC ATT GCT TTC TGC TCT TCA ACG CCA 965Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser Ser Thr Pro295 300 305CAC AAC GTG TCC TGG AGA GAC AGC ACA ATG GGC TCT ATC TTC ATC ACA 1013His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser Ile Phe Ile Thr310 315 320CAA CTC ATC ACA TGC TTC CAG AAA TAT TCT TGG TGC TGC CAC CTA GAG 1061Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys Cys His Leu Glu325 330 335 340GAA GTA TTT CGG AAG GTA CAG CAA TCA TTT GAA ACT CCA AGG GCC AAA 1109Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr Pro Arg Ala Lys345 350 355GCT CAA ATG CCC ACC ATA GAA CGA CTG TCC ATG ACA AGA TAT TTC TAC 1157Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr Arg Tyr Phe Tyr360 365 370CTC TTT CCT GGC AAT TGAAAATGGA AGCCACAAGC AGCCCAGCCC TCCTTAATCA 1212Leu Phe Pro Gly Asn375ACTTCAAGGA GCACCTTCAT TAGTACAGCT TGCATATTTA ACATTTTGTA TTTCAATAAA1272AGTGAAGACA AAAAAAAAA1291
3.DNA序列，它含有编码一种具有蛋白酶活性并可诱导细胞凋亡的人多肽的DNA序列以及具有序列SEQ ID No.1的核苷酸序列。GCTCTTTCCA ACGCTGTAAA AAAGGACAGA GGCTGTTCCC T ATG GCA GAA GGC 53Met Ala Glu Gly1AAC CAC AGA AAA AAG CCA CTT AAG GTG TTG GAA TCC CTG GGC AAA GAT101Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser Leu Gly Lys Asp5 10 15 20TTC CTC ACT GGT GTT TTG GAT AAC TTG GTG GAA CAA AAT GTA CTG AAC149Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln Asn Val Leu Asn25 30 35TGG AAG GAA GAG GAA AAA AAG AAA TAT TAC GAT GCT AAA ACT GAA GAC197Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala Lys Thr Glu Asp40 45 50AAA GTT CGG GTC ATG GCA GAC TCT ATG CAA GAG AAG CAA CGT ATG GCA245Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys Gln Arg Met Ala55 60 65GGA CAA ATG CTT CTT CAA ACC TTT TTT AAC ATA GAC CAA ATA TCC CCC293Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp Gln Ile Ser Pro70 75 80AAT AAA AAA GCT CAT CCG AAT ATG GAG GCT GGA CCA CCT GAG TCA GGA341Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro Pro Glu Ser Gly85 90 95 100GAA TCT ACA GAT GCC CTC AAG CTT TGT CCT CAT GAA GAA TTC CTG AGA389Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu Glu Phe Leu Arg105 110115CTA TGT AAA GAA AGA GCT GAA GAG ATC TAT CCA ATA AAG GAG AGA AAC437Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile Lys Glu Arg Asn120 125 130AAC CGC ACA CGC CTG GCT CTC ATC ATA TGC AAT ACA GAG TTT GAC CAT485Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr Glu Phe Asp His135 140 145CTG CCT CCG AGG AAT GGA GCT GAC TTT GAC ATC ACA GGG ATG AAG GAG533Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr Gly Met Lys Glu150 155 160CTA CTT GAG GGT CTG GAC TAT AGT GTA GAT GTA GAA GAG AAT CTG ACA 581Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu Glu Asn Leu Thr165 170 175 180GCC AGG GAT ATG GAG TCA GCG CTG AGG GCA TTT GCT ACC AGA CCA GAG 629Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala Thr Arg Pro Glu185 190 195CAC AAG TCC TCT GAC AGC ACA TTC TTG GTA CTC ATG TCT CAT GGC ATC 677His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met Ser His Gly Ile200 205 210CTG GAG GGA ATC TGC GGA ACT GTG CAT GAT GAG AAA AAA CCA GAT GTG 725Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys Lys Pro Asp Val215 220 225CTG CTT TAT GAC ACC ATC TTC CAG ATA TTC AAC AAC CGC AAC TGC CTC 773Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn Arg Asn Cys Leu230 235 240AGT CTG AAG GAC AAA CCC AAG GTC ATC ATT GTC CAG GCC TGC AGA GGT 821Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln Ala Cys Arg Gly245 250 255 260GCA AAC CGT GGG GAA CTG TGG GTC AGA GAC TCT CCA GCA TCC TTG GAA 869Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro Ala Ser Leu Glu265 270 275GTG GCC TCT TCA CAG TCA TCT GAG AAC CTG GAG GAA GAT GCT GTT TAC 917Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu Asp Ala Val Tyr280 285 290AAG ACC CAC GTG GAG AAG GAC TTC ATT GCT TTC TGC TCT TCA ACG CCA 965Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser Ser Thr Pro295 300 305CAC AAC GTG TCC TGG AGA GAC AGC ACA ATG GGC TCT ATC TTC ATC ACA 1013His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser Ile Phe Ile Thr310 315 320CAA CTC ATC ACA TGC TTC CAG AAA TAT TCT TGG TGC TGC CAC CTA GAG 1061Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys Cys His Leu Glu325 330 335 340GAA GTA TTT CGG AAG GTA CAG CAA TCA TTT GAA ACT CCA AGG GCC AAA1109Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr Pro Arg Ala Lys345 350 355GCT CAA ATG CCC ACC ATA CAA CGA CTG TCC ATG ACA AGA TAT TTC TAC1157Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr Arg Tyr Phe Tyr360 365 370CTC TTT CCT GGC AAT TGAAAAATGGA AGCCACAAGC AGCCCAGCCC TCCTTAATCA 1212Leu Phe Pro Gly Asn375ACTTCAAGGA GCACCTTCAT TAGTACAGCT TGCATATTTA ACATTTTGTA TTTCAATAAA 1272AGTGAAGACA AAAAAAAAA 1291
4.DNA序列以及与之杂交并且具有相同功能的DNA序列，其中该DNA序列编码一种具有蛋白酶活性并能诱导细胞凋亡的人多肽并且它具有序列SEQ ID No.1从42位核苷酸开始并在1172位核苷酸终止的序列。
5.权利要求4的DNA序列，它具有序列SEQ ID No.1的从42位核苷酸开始并在1172位核苷酸终止的序列。
6.人多肽，它具有蛋白酶活性并能诱导细胞凋亡并且具有序列SEQID No.2以及该序列的单位基因和类似物的氨基酸序列。Met Ala Glu Gly Asn His Arg Lys Lys Pro Leu Lys Val Leu Glu Ser1 5 10 15Leu Gly Lys Asp Phe Leu Thr Gly Val Leu Asp Asn Leu Val Glu Gln20 25 30Asn Val Leu Asn Trp Lys Glu Glu Glu Lys Lys Lys Tyr Tyr Asp Ala35 40 45Lys Thr Glu Asp Lys Val Arg Val Met Ala Asp Ser Met Gln Glu Lys50 55 60Gln Arg Met Ala Gly Gln Met Leu Leu Gln Thr Phe Phe Asn Ile Asp65 70 75 80Gln Ile Ser Pro Asn Lys Lys Ala His Pro Asn Met Glu Ala Gly Pro85 90 95Pro Glu Ser Gly Glu Ser Thr Asp Ala Leu Lys Leu Cys Pro His Glu100 105 110Glu Phe Leu Arg Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu Ile Tyr Pro Ile115 120125Lys Glu Arg Asn Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile Ile Cys Asn Thr130 135 140Glu Phe Asp His Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp Phe Asp Ile Thr145 150 155 160Gly Met Lys Glu Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser Val Asp Val Glu165 170 175Glu Asn Leu Thr Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu Arg Ala Phe Ala180 185 190Thr Arg Pro Glu His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe Leu Val Leu Met195 200 205Ser His Gly Ile Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val His Asp Glu Lys210 215 220Lys Pro Asp Val Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gln Ile Phe Asn Asn225 230 235 240Arg Ash Cys Leu Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val Ile Ile Val Gln245 250 255Ala Cys Arg Gly Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp Ser Pro260 265 270Ala Ser Leu Glu Val Ala Ser Ser Gln Ser Ser Glu Asn Leu Glu Glu275 280 285Asp Ala Val Tyr Lys Thr His Val Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys290 295 300Ser Ser Thr Pro His Asn Val Ser Trp Arg Asp Ser Thr Met Gly Ser305 310 315 320Ile Phe Ile Thr Gln Leu Ile Thr Cys Phe Gln Lys Tyr Ser Trp Cys325 330 335Cys His Leu Glu Glu Val Phe Arg Lys Val Gln Gln Ser Phe Glu Thr340 345 350Pro Arg Ala Lys Ala Gln Met Pro Thr Ile Glu Arg Leu Ser Met Thr355 360 365Arg Tyr Phe Tyr Leu Phe Pro Gly Asn370 375
7.权利要求6的多肽，它具有序列SEQ ID No.2的氨基酸序列并被称为Tx蛋白。
8.具有蛋白酶活性并能诱导细胞凋亡的人多肽，它是由编码SEQID No.2的氨基酸序列的DNA在宿主细胞内的表达而获得的。
9.由在真核宿主细胞内的表达而获得的权利要求8的多肽。
10.权利要求6-9任一项的多肽，其蛋白酶活性对应于IL-1β转换酶的成熟程度。
11.含权利要求1到5任一项的DNA序列的表达载体。
12.用权利要求11的载体转化的宿主细胞。
13.包括在宿主细胞中表达Tx蛋白的方法，其中宿主细胞是用编码序列SEQ ID No.2的氨基酸序列的DNA转化的。
14.权利要求13的方法，其中宿主细胞是真核细胞。
15.抗权利要求6到10任一项的多肽的抗体。
16.用做药物的权利要求6到10任一项的多肽。
17.包含权利要求16的药物做为活性组分的药用组合物。
18.权利要求17的调节IL-1β的产生的药用组合物。
19.权利要求17的调节细胞凋亡的药用组合物。
20.根据权利要求4的DNA序列，它与SEQ ID No.2序列的42位核苷酸开始并在1172位核苷酸终止的DNA序列杂交并具有相同功能。
21.DNA序列，它编码一种具有蛋白酶活性并能诱导细胞凋亡的多肽并具有SEQ ID No.22的核苷酸序列。
22.根据权利要求21的DNA序列，该序列从SEQ ID No.22序列的104位核苷酸开始并在1195位核苷酸终止。
23.人多肽，它具有蛋白酶活性并能诱导细胞凋亡并具有SEQ IDNo.23的氨基酸序列并被称为TY蛋白。
24.由在宿主细胞中表达编码序列SEQ ID No.23的氨基酸序列的DNA而获得的人多肽。
25.包括在宿主细胞中表达TY蛋白的方法，其中宿主细胞是用编码序列SEQ ID No.23的氨基酸序列的DNA转化的。
全文摘要
发明公开了与白介素-1β转换酶相关的为具有蛋白酶活性并能诱导细胞凋亡的人多肽编码的DNA序列。
文档编号A61P25/28GK1158639SQ9519520
公开日1997年9月3日 申请日期1995年8月1日 优先权日1994年8月2日
发明者A·迪奥, C·浮乔, T·埃森特, J·L·拉拉尼, D·J·利温斯顿, M·S·-S·苏 申请人:鲁索-艾克勒夫公司