专利名称：含有喹唑啉酮的药物组合物及其使用方法
技术领域：
本发明涉及含有喹唑啉酮的组合物。更具体地讲，本发明涉及一种调节肾小球系膜细胞增殖组合物，其中其有效成分为喹唑啉酮类衍生物。
在1967年批准美国专利3,320,124中就有有关使用喹唑啉酮类衍生物治疗球虫病的描述及权利要求。
卤夫酮，也称7-溴-6-氯-3-{3-(3-羟基-2-哌啶)-2-氧代丙基}-4(3H)-喹唑啉酮是首先由AMERICANCYANAMID COMPANY在上述的专利中描述并做权利要求的，该化合物是上述专利优选的化合物，并且也是专利中描述及权利要求的衍生物中商品化的一种化合物。
随后，U.S.重新批准的专利26,833及U.S.专利4,824,847；4,855,299；4,861,758及5,215,993中都涉及卤夫酮治疗球虫病的特性，U.S.专利4,340,596还认为卤夫酮也可用来治疗泰累尔梨浆虫病。
1991年，本发明的其中一个发明者发表文章认为如按照治疗球虫病的剂量给家禽服用卤夫酮可见胶原合成减少，皮肤张力减低，并认为是皮肤损伤的重要成因。另外，在细胞水平还发现卤夫酮可通过影响禽类皮肤成纤维母细胞抑制胶原的合成[I.Granot，et al.，Poult.Sci.，Vol.70，pp.1559-1563(1991)]。
然而，在U.S.专利3,320,124中并没有谈到，认识或考虑到卤夫酮或者相关的喹啉唑酮类衍生物可有效地治疗纤维化疾病。
原发性或者继发性纤维化疾病包括有如系统性硬化症，移植物抗宿主疾病(CVHD)，肺及肝脏纤维化以及许多种类不同的自身免疫性疾病，这类疾病均有结缔组织过度增生，从而破坏正常组织结构及功能，这类疾病最好以细胞功能紊乱来解释，其中主要的表现为过多的胶原沉积。
目前认为，绝大多数有关纤维化疾病的治疗都是无效的，并且这些药物对于阻止病程进展效果甚微。为了减少细胞间隙胶原沉积已经进行了许多尝试。众所周知进行性的纤维增殖性疾病表现为结缔组织的过度生成，其结果是导致正常组织的结构及功能破坏。鉴于在纤维化疾病中胶原所起的关键作用，所以一直尝试着能发现可以抑制胶原聚集的药物[K.I.Kivirikko，Annals of Medicine，Vol.25，pp.113-126(1993)]。
这类药物可以通过调节前胶原多肽链的合成，或者抑制某些特异的翻译后反应来抑制细胞外胶原纤维的形成，或者改变胶原聚集的性质。尽管胶原在维持组织完整性及各种疾病的发病过程中起重要作用，但是抑制胶原合成的制剂却很少。
有研究使用细胞毒药物来试图减缓产生胶原纤维成纤维母细胞的增殖速度[J.A.Casas，et al.，Ann，Rhem.Dis.，Vol.46，p.763(1987)]，其中秋水仙碱可减缓胶原向细胞外基质的排泌[D.Kershenobich，et al.，N.Engl.J.Med.，Vol.318，p.1709(1988)]，另外还有胶原代谢反应中一些关键酶的抑制剂[K.Karvonen，et al.，J.Biol.Chem.，Vol.265，p.8415(1990)and C.J.Cunliffe，et al.，J.Med.Chem.，Vol.35，p.2652(1992)]。
但不幸的是，这些胶原抑制剂为非特异性，所以可因抑制其它类型的活性胶原分子的合成，如经典补体途径中的Clq，神经-肌肉结合终末板处的乙酰胆碱酯酶，胶固素及肺表面活性脱辅蛋白质而具有较严重的毒副作用。
抑制胶原合成的其它药物，如硝苯吡啶及苯妥英，也可抑制其它蛋白质的合成，并非特异性地对胶原合成阻断。[T.Salo，et al.，J.OralPathol.Med.，Vol.19，p.404(1990)]。
胶原交联抑制剂，如B-氨基-丙腈，虽然也用来作为抗纤维化制剂，但也是非特异的。由于弹性蛋白，另一种结缔组织纤维蛋白，也是互相交联的，所以长期使用这类制剂可引起山黧豆中毒综合症并干扰弹性组织。另外交联的抑制作用只是次要的，而且胶原的过度生成也要大于胶原酶对其的降解。
在最近的专利申请中，编号为08/181,066的U.S.专利申请对一种治疗患有纤维化疾病病人的治疗方法进行了描述并做了权利要求，该方法包括给病人服用一种有药理有效量的式I药理活性化合物
其中R1为一组含有氢，卤素，硝基，苯并，低级烷基，苯基及低级烷氧基基团；R2为一组含有羟基，乙酰氧基，及低级烷氧基基团；R3一组含有氢，及低级链烯氧-羰基基团；上述的化合物可抑制I型胶原的合成。
经过进一步的研究和发展，已经发现卤夫酮可以被用来调节肾小球系膜细胞的增殖。另外，在U.S.专利3,320,124中所描述并做权利要求的其它喹唑啉酮类衍生物也有类似的特性。
这样，依照本发明，现提供了一种组合物，其可用来调节肾小球系膜细胞的增殖，该组合物包括有一定量的式I的化合物
其中R1为一组含有氢，卤素，硝基，苯并，低级烷基，苯基及低级烷氧基基团；R2为一组含有羟基，乙酰氧基，及低级的烷氧基基团；R3一组含有氢，及低级链烯氧-羰基基团；上述化合物可有效地调节肾小球系膜细胞的增殖。
本发明提供了一种治疗患有肾小球系膜细胞增殖性疾病的方法，该方法主要是给病人服用一种药理有效量的式I药理活性化合物
其中R1为一组含有氢，卤素，硝基，苯并，低级烷基，苯基及低级烷氧基基团；R2为一组含有羟基，乙酰氧基，及低级烷氧基基团；R3一组含有氢，及低级链烯氧-羰基基团；上述化合物可有效地调节肾小球系膜细胞的增殖。
在本发明优选实施方案中，所述化合物为卤夫酮。
在编码为08,181,066的U.S.专利申请中已明确地证实了本发明所述的化合物可有效地治疗纤维化疾病，如硬皮病及移植物抗宿主疾病。这也排除了一些没有根据的怀疑，诸如化合物在起效前可能已经失活；化合物可能到达不了靶区域；或者也可能因为化合物的其它特性使其不适合用于体内。然而，上述的这些可能性已被下述的事实完全排除，即同一种化合物可有效地治疗两种因胶原过多沉积所致的纤维化疾病如硬皮病及GVHD，这样上述的U.S.专利申请的结论将做为文献加到本文中。
有关本发明的新发现，局部和阶段性的肾小球硬化症(FSGS)只是一种肾小球损伤的组织学描述，这种疾病通常伴有蛋白尿及进行性的肾功能减退[see，e.g.，H.G.Rennke and P.S.Klein，“Pathogeneses andSignificance of Nonprimary Focal and Segmental Glomerulosclerosis，”Am.J.Kid.Dis.，Vol.13，pp.443-46(1989)]。
起初，FSGS仅是在死于末期肾衰的病人中有描述。近年来发现，FSGS是一系列全身性及肾脏疾病在肾小球上表现的最终的共同途径。这些情况包括正常的老化及糖尿病性肾病。许多不相关的损伤刺激均可引起FSGS，开始为小球系膜肿胀及肾小球硬化，在经过很长时间发展成为肾死亡，对于研究肾脏疾病的发展，FSGS损伤的动物模型是非常重要的也是使用最多的。
FSGS损伤与动脉粥样硬化的许多方面都有相似之处[see.e.g.，J.R.Diamond and M.J.Karnovsky，“Focal and SegmentalGlomerulosclerosisAnalogies to Atherosclerosis，”Kid.In.，Vol.33，pp.917-924(1988)]。在两者中参与的细胞均为血管内皮细胞及其下面的血管平滑肌细胞(VSMC)，或者肾脏相应的细胞球系膜细胞。后者的细胞类型从起源上，镜下解剖结构上，及组化特性上都是密切相关的。此外，这些细胞在功能上也具有类似的特性，其中包括有血管紧张素II受体；对一些介质的钙依赖收缩反应，及对血小板和巨噬细胞衍化产物增殖性反应。正象M.Kashgarian和R.B.Sterzel在“The Pathobiology ofthe Mesangium，”Am.，J.Kid.Dis.，Vol.41，pp.524-529(1992)中所述的肾及血管硬化的发展都受高血压及血管刺激，高脂血症，以及凝血链锁反应激活的影响。
如上所述，现已发现卤夫酮为一种人类肾小球系膜细胞增殖的强有力的抑制剂，有关这方面下面还将做进一步地阐述。
现以知道，肾小球系膜构成了肾小球的轴向空间，其由系膜细胞-即肾小球细胞群中的第三种类型的细胞群(其它两种细胞的类型分别为内皮细胞及上皮细胞)，和系膜基质组成。系膜细胞的位置并不固定，其可通过网状内皮细胞与肾小球毛细血管腔相接触。这样系膜始终被分子及滤过的残余物充满。这些残余物可有致炎免疫复合物或者激活系膜细胞增殖及改变有关产生基质的分泌表型的循环细胞因子。系膜细胞外基质增多所致的系膜增殖可以早于或者伴随肾小球硬化的过程[see，e.g.，A.El Nahas Meguid，“Growth Factors and Glomerular Sclerosis，”Kid.Int.，Vol.41，pp.s15-s20(1992)；J.Floege，et al.，“Regulation ofMesangial Cell Proliferation，”Am.J.Kid.Dis.，Vol.17，pp.673-676(1991)]。
此外，系膜细胞的增殖及/或者系膜基质的增多是诸如狼疮型肾炎，IgA型肾病，Hennoch-Schoenlein紫癜，以及膜增殖型的肾小球肾炎这类疾病的主要特征。人们期望可以调节系膜细胞的增殖以阻止因局灶阶段性的FSGF组织病理损伤所致的终末期肾脏疾病的进展，进而将其作为一种治疗方法治疗以系膜增生为特点的上述肾脏疾病。FSGS的发病机理包括有细胞外基质(ECM)中的系膜细胞(MC)异常增殖[see H.G.Rennke，et al.，ibid.；J.R.Diamond，et al.，ibid.]。
在生理条件下，大多数肾脏Mcs都停留在Go期，并且细胞的生长受内原性促生长因子及抑制增殖的分子调控。作为对损伤刺激的反应，释放血小板及非血小板衍化生长因子和其它细胞因子并刺激MC增殖。在这些生长因子中有血小板衍化生长因子(PDGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及白介素-1(IL-1)。干预这些生长因子的生长促进活性可以调节肾小球硬化的进程。其中有肝素类[see J.Floege，et al.，“Heparin Supresses Mesangial Cell Proliferation and Matrix Expansionin Experimental Mesangioproliferative Glomerulonephritis，”Kid.Int.，Vol.43，pp.369-380(1993)；A.Wolthuis，et al.，“Heparins ModulateExtracellular Matrix and Protein Synthesis in Rat Mesanglial Cells，Virchows Arch B，”Cell Pathol.，Vol.63，pp.181-189(1993).]，并且多为硫酸乙酰肝素[see A.Schmidt，et al.，“The Antiproliferative Activity ofArterial Heparan Sulfate Resides in Domains Enriched with 2-0-Sulfated Uronic Acid Residues，”J.Biol.Chem.，Vol.267，pp.19242-19247(1992)]及其它聚阴离子分子[see M.Benezra，et a1.，“Antiproliferative Activity to Vascular Smooth Muscle Cells andReceptor Binding of Heparin-Mimicking Polyaromatic AnionicCompounds，”Arterioscler.Thromb。Vol.14(December 1994)，in press；F.Pugliese，et al.，“Regulation of Gultured Human Mesanglial CellGrowth by lonized Macromolecules，”J.Am.Soc.Nephrol.，Vol.2，PP.595-599(1992)]。
本发明将以下述的实例的一些优选实施方案进行说明，以便可以更好地理解并评价本发明的有关方面，但这些说明并不是要将本发明局限于这些特定的具体形式。相反地，正如附加的权利要求所说明地这些实例是要把所有变化的，修改过的及类似的东西都包括在本发明的范围内。所以，包括有申请具体形式的下述实例将用于说明本发明的应用，通过实例了解本发明的细节并仅仅用来说明本发明已申请的具体形式，下面给出的例子是用来更好地理解本发明的原则及概念，另外还有有关实验步骤的说明。
下面将对实验结果参照附图做进一步地说明。
图1为增加卤夫酮浓度后对系膜细胞增殖抑制作用的特征性曲线；图2为卤夫酮不同浓度(10-75μg/ml)及不同培养天数抗系膜细胞增殖作用的特征性曲线，图2A为在第一天加入卤夫酮后所起的作用，图2B为在第一天和第四天加入卤夫酮后所起的作用；图3为0.05μg/ml的卤夫酮对肾小球系膜细胞的可逆抗增殖作用的特征性曲线；图4为比较增加卤夫酮及肝素浓度对肾小球系膜细胞的数量(图4A)及生长速度(图4B)影响特征性曲线。
实例I.实验步骤细胞按照已经描述过的方法，从分离的大鼠肾小球获取系膜细胞进行原代培养[see A.Amore，et al.，“Functional Consequences of the Binding ofGliadin to Gultured Rat Mesangial CellsBridging Immunoglobin A toCells and Modulation of Eicosanoid Synthesis and Altered CytokineProduction，”Am.J.Kid.Dis.，Vol.23，pp.290-301(1994)]。
简单地讲，通过解剖将大鼠肾皮质从髓质及肾上腺分离出来，碾磨成膏状，并轻轻挤压使其通过-106mm的不锈钢滤网，最后将其混悬于PBS溶液中。将此混悬液用尼龙筛网经过一系列地筛分后分离得到肾小球。将冲洗过的肾小球再混悬于PRMI中，并且IV型胶原酶在37℃条件下消化5分钟，以除去上皮细胞。重新混悬后，将肾小球细胞放到塑料培养皿中。待细胞接近长满时进行传代。实验所用的细胞为第3至第4代以后的细胞。
肾小球系膜细胞系(SV40，MES13)来自于ATCC。细胞培养液为比例为3∶1的DMEM与Ham’s F-12的混合液，其中含有5％胎牛血清及14mM HEPES。
SV40 MES 13细胞系建立于1986年，该细胞系来自于7到10周的猴病素40(SV40)早期区域的转基因C57B1/6J X SJL/J小鼠。分离，胰酶消化并克隆肾小球系膜细胞。在整个肾小球系膜细胞的胞浆内经过对肌动蛋白染色可见非常突出的平行排列的纤维状骨架结构，并且在10-6M的血管紧张素II存在的条件下可见细胞收缩。已有报道在加入5％胎牛血清的琼脂中培养上述细胞，经过26小时的双倍时间可以形成克隆。在培养中细胞呈无限的生命周期并且可进行大T抗原染色。该细胞系的细胞角蛋白及因子VIII相关抗原为阴性。尽管SV40 MES 13细胞系表型已经转化，但该细胞系仍保持着正常肾小球系膜细胞许多特性，故其对于研究肾小球细胞的生物学也是非常有益的[see L.J.Striker，etal.，“Glomerular Epithelial，Mesanglial and Endothelial Cell Lines fromTransgenic Mice，”Kid.Int.，Vol.33，pp.677-684(1988)]。
细胞增殖A.3H-胸腺嘧啶的掺入将细胞置于加有10％FCS的DMEM上(4×104细胞/16mm孔)。接种24小时后，更换培养液，该培养液含0.2％的FCS，48小时后向此培养液中加入生长刺激物及3H-胸腺嘧啶(1 Ci/孔)，之后再培养24-28小时。DNA的合成是通过测定掺入到三氯乙酸不溶性物质的放射活性来测得[see M.Benezra，et al.，“Thrombin-Induced Release ofActive Basi Fibroblast Growth Factor-Heparan Sulfate Complexes fromSubendothelial Extracellular Matrix，”Blood，Vol.81，pp.3324-3332(1993)]。
B.生长速度将细胞(1.5×104细胞/孔)接种于24孔培养板上，并且象上述的那样向其中加入培养刺激物。接种一至六天后，以溶于PBS的2.5％甲醛固定细胞。将培养板浸入0.1M的硼酸盐缓冲液(pH8.5)，并且以亚甲蓝(以0.1M的硼酸盐缓冲液配成1％的浓度)染色(1小时，24℃)，之后再用水冲洗四次。这一步骤实际上去除了所有未与细胞结合的染料，以0.5ml的0.1N HCL(1小时，25℃)溶解已掺入亚甲蓝的特殊细胞，并于620nm处测定吸光值。细胞数则通过与细胞计数密切相关的分光光度计吸光值来测定[see R.Glodman and Z.Bar-shavit，“Dual Dffect toNormal and Stimulated Macrophages and Their Conditioned Media onTarget Cell Proliferation，”J.Natl.Cancer Inst.，Vol.63，pp.1004-1016(1979)]。
选择开始的接种细胞密度以保证在实验结束时细胞数与吸光值呈线形关系。每次实验在加入测试化合物测定初始的平均吸光值之前固定三个孔。利用该值通过下面的公式可计算出对照及经药物处理过的细胞的双倍时间(DT)，该公式为DT＝In 2/IN[ODt/ODc)/h ]其中DT＝以小时表示的双倍时间；Odt＝实验结束时测试孔的光密度；Odc＝实验开始时对照孔的光密度；h＝以小时表示的培养时间。
可以通过用对照双倍时间除以药物处理过的细胞的双倍时间来计算出生长速度[A.Horowitz.，et al.，“In vitro Cytotoxicity of Liposome-Encapsulated DoxorubicinDependence on Liposome Composition andDrug Release”，Biochim.Biophys.Acta，Vol.1109，pp.203-209(1992)]。
C.细胞数量以5×103个细胞/孔的密度将细胞接种于24孔培养板上。接种后的不同时间，用0.05％胰蛋白酶，0.01M磷酸钠(pH7.4)及0.02％EDTA(STV)将细胞悬浮起来，并以Coulter计数器给细胞计数(CoulterElectronic Ltd.)。
II.细胞增殖卤夫酮对肾小球系膜细胞的抗增作用。
A.生长速度将稀少接种的肾小球MC(1.5×104个细胞/孔)在有或没有浓度不断升高的卤夫酮存在下暴露于10％FCS中。接种五天后，将STV与STV偶联并计数。如图1所示在25μg/ml的浓度下可对MC的增殖产生60-70％的抑制，而在50μg/ml的浓度下则可几乎完全抑制细胞的增殖。在另一个相似的实验中，在有或没有浓度不断增加的卤夫酮存在下的接种细胞于接种后若干天内与STV偶联并计数。在75μg/ml的浓度下可完全抑制细胞的增殖(图2A)。如在第一天和第四天两次加入卤夫酮，则可见到更强的抗增殖作用。该药物在低浓度的情况下可以更好地证实这一作用(图2B)。
B.可复性在另一个实验中，向MC的培养液中加入卤夫酮培养48小时，随后去除药物并在常规生长培养液中生长。如图3所证实的，去除药物后导致生长速度加速，其速度与未经药物处理的MC相似。当细胞以低浓度(500和1000个细胞/孔)接种时也可得到类似的结果的，并且在加有及未加有卤夫酮的情况下使用实验步骤中所描述的公式以亚甲蓝染色来测定生长速度。在75μg/ml卤夫酮存在的条件下，可几乎完全抑制细胞生长(图4)。在同样的条件下肝素则不起作用(图4)。
C.3H-胸腺嘧啶的掺入将亚融合的MC肾小球维持培养在含有10％FCS的培养液中，在不加入及加入越来越高浓度卤夫酮的情况下将其暴露于3H-胸腺嘧啶中(48小时37℃)。在卤夫酮的浓度为0.035μg/ml时，可观察到DNA合成被完全抑制，而当浓度降低到0.025μg/ml时则仅可观察到50％的抑制(未图示)。
D.对bFGF引起的细胞增殖的作用将静止的，不生长的肾小球MC培养在含有0.5％FCS的培养液中，并以低浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激其增殖。加入卤夫酮(0.050μg/ml)可几乎完全抑制静止细胞因bFGF导致的胸腺嘧啶的掺入(未图示)。这一结果提示卤夫酮可有效地拮抗bFGF的促生长活性。
E.其它化合物的作用据报道肝素对肾小球MC有抗增殖的作用[see J.Floege，et al.，ibid；A.Wolthius，et al.，ibid.]。在我们的实验中，即使在肝素的浓度为15μg/ml时也没有或者有很小的抑制作用，在肝素的浓度为50μg/ml时约有25％的抑制作用。无论测定细胞数量(图4A)还是生长速度(图4B)，都可得到相似的结果。
III.目前方法的优点目前抑制肾小球MC增殖方法是使用肝素[see Floege，et al.，ibid.]，低Mr肝素，苏拉明[see Pugliese，et al.，ibid]，钙通道阻止剂[i.e.，amlodipine；see P.J.Shultz and L.Raii，“Effect of Amlodipine onMesanglial Cell Proliferation and Protein Synthesis，”Am.J.Hypertens.，Vol.5，pp.912-914(1992)]及胆固醇合成抑制剂[see M.P.O’Donnell，et al.，“Lovastatin Retards the Progression of Established Glomerular Diseasein Obese Zucker Rats，”Am.J.Kid.Dis.，Vol.22，pp.83-89(1993)]。肝素为一很强的抗凝剂，但其抗增殖作用相对较弱，并且由于来源及生产公司的不同有较大的差别。苏拉明在有效剂量时毒性很大，而氨氯地平及乐瓦停则在体外实验时作用相对较弱，并且改变不了人肾脏疾病的病程进展。
本发明的方法是使用一种非常有效的，价廉的及无毒的化合物，该化合物可抑制包括bFGF的各种生长因子的活性，并且可抑制肾小球MC自分泌形式的生长。另外，卤夫酮为低分子量化合物，所以基本上可经口服给药。该化合物已经FDA被批准可以用来治疗农场动物疾病。以上特点使卤夫酮成为抑制肾脏疾病发展的非常有希望的，有临床价值的药物。
卤夫酮为一种无毒化合物，该化合物可有效地抑制肾小球MC的增殖，这一特点使得寻找一种可有效抑制以系膜增殖为主要病理生理改变的病灶阶段性肾小球硬化及其它肾脏疾病的治疗方法成为可能。
应明确本发明并不只局限于上述用于说明的实例，其还应包含基本特性相同的其它特殊形式，所以上述的实例只是用于解释而并非局限于这些实例，介绍是用来说明附加的权利要求，并且希望与权利要求内容类似和在权利要求范围内的所有变化都包括在其中。
权利要求
1.用于调节系膜细胞增殖的组合物，其包含一定量的式I化合物
其中R1为一组含有氢，卤素，硝基，苯并，低级烷基，苯基及低级烷氧基基团；R2为一组含有羟基，乙酰氧基，及低级烷氧基基团；R3一组含有氢，及低级链烯氧-羰基基团；上述化合物可有效地调节肾小球系膜细胞的增殖。
2.依照权利要求1的组合物，其中所述的化合物为卤夫酮。
3.为治疗患系膜细胞增殖病人的一种方法，其中包括给病人服用一种有药理活性剂量的式I药理活性化合物
R1为一组含有氢，卤素，硝基，苯并，低级烷基，苯基及低级烷氧基基团；R2为一组含有羟基，乙酰氧基，及低级烷氧基基团；R3一组含有氢，及低级链烯氧-羰基基团；上述化合物可有效地调节肾小球系膜细胞的增殖。
4.依据权利要求3，其中所述的化合物为卤夫酮。
全文摘要
本发明为一种用来调节肾小球系膜细胞的增殖的组合物,该组合物包括在一定剂量式Ⅰ的化合物,其中:R
文档编号A61P43/00GK1176601SQ95196904
公开日1998年3月18日 申请日期1995年12月21日 优先权日1994年12月22日
发明者A·纳格勒, S·斯拉温, I·乌洛达吾斯基, M·皮尼斯 申请人:以色列农业部农业研究组织, 哈达西特医药研究服务与发展公司