专利名称：淡水鱼类暴发性传染病二联疫苗的制备及免疫方法
技术领域：
本发明涉及水生动物疫苗的制备及免疫方法，特别涉及养殖鱼类暴发性传染病(即细菌出血性败血病)疫苗的制备和免疫方法。
1989年以来，我国接连发生前所未有的淡水养殖鱼类暴发性传染病。发病范围波及全国20多个省、市，罹病鱼的品种有鲢鱼、鳙鱼、鲫鱼、(包括白鲫、异育银鲫和本地鲫鱼)、鳊鱼、鲮鱼、银鲴、草鱼、鲤鱼以及各种野杂鱼，甚至还有泥鳅、河蚌等。据不完全统计，1990年遭此病致死的数量，湖北省高达500多万公斤，京津地区80多万公斤，上海市、江苏省200多万公斤，浙江省100多万公斤，全国损失金额约11亿元。
研究该病和相关病害的主要背景技术文件如下中国专利文献1、分类号A61K03578，公告号CN1071336A，申请号91109470.9，申请日期91.10.10申请人中国水产科学研究院长江水产研究所，项目名称广谱性防治鱼、虾、贝、蟹暴发病药物的制作、施用方法。该专利提供了一种广谱性防治鱼、虾、贝、蟹暴发病药物的制作、施用方法。该药的核心部分约七种中草药，可以制成药饵，也可以直接泼洒于水体之中，进行生态防治。
中国非专利文献1、CRM5/20，文献号#7，分类号S943.113，题名水库暴发性鱼病及其防治技术研究I病原菌的分离，菌株的致病性及其生化特性，作者高汉娇，陈昌福，出处水利渔业，1995(2)9-10，出版年1995，该文献报道了从安徽、湖北两省8座水库中发生暴发性传染病的鲢鱼上分离的病原菌的致病力和生化特性测试结果，根据对5个具有较强致病力的菌株的生化特性分析并与标准菌株比较，初步认为水库中鲢鳙鱼暴发性传染病的病原菌是嗜水气单胞菌。2、CRM3/20，文献号#3，分类号5941.4，题名淡水养殖鱼类暴发性传染病防治研究，出处水产科技情报，1991，18(1)20-21，出版年1991。3、NM6/20，文献号#8，分类号S941，题名沙市地区暴发性传染病病原研究，作者；贺路、左文功等，出处淡水渔业，1992(3)13-16，出版年1992。以上3篇文献，对鱼类暴发性传染病病原进行了分离、鉴定，但仅分离出嗜水气单胞菌。4、CRM8/20，文献号#10，分类号S943.1，题名白鲫、鲢、鳊等养殖鱼类暴发性鱼病病原研究初报，作者俞宁宁、毛云红，出处鱼类病害研究，1991，13(2)17-19，出版年1991，此文献报道分离到一种病原菌，未肯定病原菌的分类位置。5、CRM11/20，文献号#14，分类号S948，题名养殖鱼类细菌性败血病的菌苗和试用取得较大进展，作者陈月英，出处鱼类病害研究，1994，16(2)28，出版年1994，此文仅就暴发病的嗜水气单胞菌疫苗进行了报道。
国外非专利文献1、Pal R N，Tr ipathi S D.
Use of Terramycin for Fish Diseases in Carp and Catfish Culturein Indian Waters.
J.Inland Fish.Soc.India，1978，10166-168.
对鲢鱼红斑病作了报道，但未作病原的分离、鉴定以及疫苗研究。2、Biosco E G，Amaro C.
Sidarphores and Related Outer Membrane Proteins in Vibrio Spp.Which are Potential Pathogens of Fish and Shellfish.
J.Fish Dis.，1991，14249-263.
作者报道了河弧菌I、II型生物变种并通过菌细胞中铁结合配位体和胞外膜蛋白的测定，认为与其它致病弧菌一样，仅对鱼类具有潜在致病能力。此外，没有报道制备细菌疫苗。3、Karunasagar I，Rosaolind G & Karunasagar I.
Immunological Response of the Indian Major Carps to AeromonasHydriohila VaccineJ.Fish Dis.，1991，14413-417.4、Santos Y，Bandin I，Nunez S，Gravningen K & Toranzo A E.
Protection of Turbot，Scophthalmus Maximus(L.)，and Rainbow Trout，Oncorhynchus Mykiss(Richardson)，Against Vibrosis Using TwoDifferent VaccinesJ.Fish Dis.，1991，14407-411.
综合以上国内外背景技术文件，淡水鱼类暴发性传染病是八十年代末以来出现于我国广大淡水养殖地区的一种新的病害，国外未见对该病的研究报道，国内的研究亦尚不充分，对其病原菌的分离、纯化及研究仅气单胞菌一种，在疫苗的制备研究上也仅限于单一菌的疫苗，对有效地防治鱼类暴发性传染病存在一定的局限。
本发明的目的是研究淡水鱼类暴发性传染病的病原体，在此基础上设计出一种高效细菌二联疫苗的制备工艺程序及其对鱼体免疫的方法。
为实现发明目的，其总体技术方案和发明点是1、从罹病鱼中分离、筛选、纯化，确定了暴发性传染病的主要致死的两种病原体，即河弧菌CCTCC M96016和点状产气单胞菌CCTCC M96015。
河弧菌CCTCC M96016与Blosco E G，Amaro C(见前述背景文献)所描述的河弧菌I、I型不同43℃能生长；发酵水杨苷产酸；利用D-葡糖酸钙、腐胺；不能利用戊二酸、D-葡糖醛酸；从D-葡萄糖产气；DNA中的G+C％为47(Tm)，故鉴定为河弧菌生物变种II(新生物变种)Vibrio fluvialisBiovar III.Blovar nov.。
点状产气单胞菌CCTCCM96015为产气单胞菌属中的运动性嗜中温产气单胞菌，按照国际细菌命名法规优先律应为点状产气单胞菌(Aeromonas Punctata)。
2、河弧菌CCTCC M96016和点状产气单胞菌CCTCC M96015二联疫苗的制备。
3、免疫方法浸泡接种将鱼置于盛有二联疫苗及佐剂的容器中，通过鱼体吸收接种。
注射接种逐条鱼注射二联疫苗接种。
本发明有以下显著效果1、免疫保护率75％-80％，免疫保护期达一年。
2、直接对鱼体免疫接种，费用省，且不污染水体。
3、疫苗无刺激、无味、无毒，对人畜无害，安全可靠。
4、制备工艺较简单，易于工厂化生产。
5、使用方便，易于操作。
实施本发明的程序与步聚1、河弧菌CCTCC M96016疫苗和点状产单胞菌CCTCC M96015疫苗的制备。
A、取河弧菌CCTCC M96016冷冻干燥菌种，接种于10毫升肉汤培养基内，28℃培养12小时；B、取A程序2毫升河弧菌菌液接种到1升肉汤培养基内，28℃培养12小时；
C、取B程序1升河弧菌液接种到30肉汤培养基内，28℃培养12小时；D、添加20％葡萄糖500毫升，继续培养10-12小时；E、加入100毫升福尔马林灭活；F、收获河弧菌疫苗。
点状产气单胞菌CCTCC M96015疫苗制备程序和步聚与河弧菌CCTCC M96016疫苗制备相同。
肉汤培养基配方蛋白胨10克；牛肉膏5克；NaCl 3克；K2HPO42克；蒸馏水1000毫升PH7.2-7.42、二联疫苗的制备方法取含菌体湿重1％-2％浓度的河弧菌CCTCC M96016疫苗和含菌体湿重1％-2％浓度的点状产气单胞菌CCTCC M96015疫苗按容量3∶2的比例混合、摇匀，收获。置一20℃以下储存。
3、对鱼体免疫接种(1)浸泡接种取二联疫苗于容器内加池塘水稀释400倍，加水稀释前加入茛菪佐剂，茛菪加入量为终浓度0.01毫克/毫升，搅匀后将鱼浸入疫苗稀释液中浸泡接种15-30分钟。浸泡鱼的数量以不造成鱼缺氧窒息为度。已接种的鱼，放入养殖水体中。
(2)注射接种将二联疫苗用0.85％无菌生理盐水稀释5倍，加入茛菪佐剂，使茛菪佐剂在注射液中的终浓度为0.01毫克/毫升，溶解摇匀后，用于鱼体腹腔注射，用量10-13公分鱼种0.1-0.2毫升/尾，接种后将鱼放入养殖水体中。
经生产鱼池养殖试验，使用二联疫苗采用浸泡接种方式免疫的3口鱼池(每口7亩)，没有发生暴发性传染病，养殖存活率高达90-95％；而未经免疫的鱼池鱼类暴发性传染疫严重发生，死亡率达40％。
实验室试验结果显示，对二联疫苗鱼体，采用注射接种效果优于浸泡接种，使用者可根据具体情况选择接种方式。
权利要求
1.淡水鱼类暴发性传染病二联疫苗的制备及免疫方法其特征在于A、疫苗的抗原是该传染病的两种病原细菌，河弧菌CCTCC M96016和点状产气单胞菌CCTCC M96015；B、用二联疫苗对鱼体浸泡接种、注射接种免疫。
2.根据权利要求1所述的二联疫苗制备其特征在于A、取河弧菌冷冻干燥菌种，接种于肉汤培养基内，28℃培养12小时，经扩大培养后，接种到30升肉汤培养基，28℃培养12小时，添加20％葡萄糖液500毫升继续培养10-12小时，用福尔马林灭活，收获疫苗。取点状产气单胞菌CCTCC M96015冷冻干燥菌种，以河弧菌CCTCC M96016疫苗制备的同样程序制备点状产气单胞菌疫苗。B、取含菌体湿重1％-2％浓度的河弧菌CCTCC M96016和菌体湿重1％-2％浓度的点状产气单胞菌CCTCC M96015疫苗按容量3∶2的比例混合，收获，置-20℃以下储藏。
3.根据权利要求1所述的免疫方法其特征在于可选择浸泡接种或注射接种浸泡接种，取二联疫苗于容器中，加入茛菪佐剂，再加入池塘水， 使疫苗稀释400倍，茛菪加入量为终浓度0.01毫克/毫升，搅匀后将鱼投入容器内浸泡接种疫苗15-30分钟。注射接种，将二联疫苗用0.8 5％无菌生理盐水稀释5倍，加入茛菪佐剂，使其终浓度为0.01毫克/毫升，溶解摇匀后，用注射器向鱼体腹腔注射，用量为10-13公分的鱼种0.1-0.2毫升/尾。
全文摘要
淡水鱼类暴发性传染病二联疫苗的制备及免疫方法。本发明主要包括用菌体湿重1-2％浓度的河弧菌CCTCC M96016疫苗和菌体湿重1-2％浓度的点状产气单胞菌CCTCC M96015疫苗按3∶2比例混匀制成二联疫苗以及在使用前加入莨菪佐剂对鱼体进行浸泡和注射接种的两种免疫方法。二联疫苗制备工艺简单，易操作，不污染水体，对人畜无害；免疫保护期一年，免疫保护率75-80％。
文档编号A61K39/106GK1156625SQ9611966
公开日1997年8月13日 申请日期1996年10月24日 优先权日1996年10月24日
发明者徐伯亥, 李伟, 殷战, 蔡桃珍, 吴玉深 申请人:中国科学院水生生物研究所