专利名称：新型的“非突发的”持续释放聚(丙交酯/乙交酯)的微球的制作方法
I.政府的权利这里描述的发明可以被制造，许可和用于政府目标而不给我们付任何费用。
II.交叉参考本申请是美国专利申请系列No.08/446,149(1995年5月22日提交)的部分继续申请。
III.本发明的领域本发明涉及提供在至多100天期间内在水性生物环境中生物可包容并可生物降解的按非突发程序持续释放包括多肽在内的生物活性药物的新型微球。
IV.本发明的背景有多个申请和专利可用于从可生物降解聚合物、特别是聚(丙交酯/乙交酯)(PLGA)中持续释放活性药物。用于控制释放多肽的PLGA的以前的应用已涉及到使用分子量大于20000的丙交酯/乙交酯(L/G)的摩尔比为75/25到100/0。进一步，现有的PLGA制剂是在内部水层使用填料或添加剂，以便改善稳定性和包裹的效率，和/或增加水层的粘滞度，从而调节聚合物的水解以及调节生物活性药物或多肽的释放。
此外，PLGA共聚物的现有使用工艺是封端的，即封断末端羧基基团。在这些封端的共聚物中，微胶囊制剂置于水性生理环境后的头24小时包裹的多肽释放约10-40％，显示低到中等程度的突发性释放。这些特性一部分是由于在内部水相使用了填料。此外，已知由于使用分子量小于20000的75/25PLGA共聚物，多肽可释放1个月。
一直在进行的控制释放研究目标是用聚(丙交酯/乙交酯)聚合物得到生物活性药物或多肽1至2个月的释放系统。然而，大多数这类系统具有1个或多个下列问题包裹有效性差和大的“突发性释放”，接着出现中间的“不释放”或“停滞阶段”，直到聚合物降解。通常，药物从这些聚合物中释放的周期为大约4周到大约几个月。此外，为了达到这样的释放使用分子量大于30000的50/50共聚物或分子量大于10000的75/25共聚物，这种做法经常造成释放活性药核很久以后残留的聚合物仍停留在给药位点上。
V.本发明概述本发明提供了生物可包容的和可生物降解的微胶囊，该胶囊是为新型的在水性生理环境中非突发性，可程序化，可持续至多100天释放包括多肽的生物活性药物设计的。
与目前已有的依赖于使用填料/添加剂，例如依赖于使用明胶、白蛋白，葡聚糖，果胶，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇，蔗糖等等仍然有低的包裹有效性和“突发作用”倾向的释放系统不同，本发明不使用任何添加剂便可达到高的包裹效率和“非突发”的释放。在本发明中，通过使用分子量范围在2000到60000道尔顿未封端和封端形式的聚(丙交酯/乙交酯)聚合物的独特混合物，达到非突发，可程序化持续释放的目的。
通常，本发明描述的微胶囊用独特的乳化技术制备，该乳化技术中，内部的油包水(W/O)乳化液是通过分散在含乳化稳定剂的溶剂-饱和的水相中而稳定，然后将上述W/O乳化液在外面预先冷却的含O/W乳化剂的水溶液相中乳化，形成三元W/O/W乳化液。实质上，内部的W/O乳化液是由含大约2％到大约20％(w/w)的被包裹的活性药物的水层和含有浓度范围从大约5％到大约50％(w/w油相)的聚(丙交酯/乙交酯)共聚物的油层组成。共聚物包括分子量范围从2000到大约60000道尔顿，丙交酯/乙交酯的摩尔组成从90/10到40/60，以及它们的未封端和封端形式的比例为100/0到1/99的混合物。根据聚合物的分子量和结构形式可达到大约80％至100％的非常高的包裹率。
通过审慎地选择方法参数，例如选择聚合物的浓度，多肽的浓度以及水相/油相的比例，可达到活性药核在1-100天期间内的不同周期和程序化释放。
本发明特别适合于分子量范围为1,000到大约250,000道尔顿的多肽，以及其它的生物活性药物的高包裹率和非突发的、连续地程序化在1-100天期间释放。本发明的独特性是当使用未封端和封端的聚合物100/0的混合物时，活性药核释放的最终阶段与聚合物完全溶解为无害成分，例如，溶解为乳酸和乙醇酸，同时进行。这一点显著优于目前已有的30天释放系统，有关机构对该系统的主要关注点是活性药核释放以后很久，给药部位残留聚合物的毒性问题。
本发明描述的微胶囊适合于通过多种途径给药，例如适用于非肠道给药(肌内、皮下)，口服，局部给药，经鼻给药，直肠和阴道给药。
VI.图的简要描述
图1说明了药物从常规释放系统释放与从控释系统释放的比较。说明了常规给药系统造成的峰水平和谷水平，从而与控释给药系统造成的稳定治疗水平形成对照。
图2说明了用本发明中描述的方法(用分子量8-12K道尔顿的50/50未封端的聚合物)制备的PLGA微球的扫描电子显微镜图，说明了优良的球体形态学，球体的完整性，以及窄小的颗粒分布。
图2a说明了用蒸发溶剂的常规方法，用分子量8-12K道尔顿的50/50 12K未封端的聚合物制备的PLGA微球的扫描电子显微镜图。
图3说明了从PLGA微球中累积Histatin的释放，其中由数批释放系统的释放图采用50/50未封端的聚合物(分子量为8-12K道尔顿)制备的释放系统，其中变更了方法参数以便将释放调整在1-35天之间。
图4说明了用50/50封端聚合物(分子量为30-40K道尔顿)按本发明的方法制备的表面光滑PLGA微球体的固体的扫描电子显微镜图。
图5说明了从PLGA微球中累积Histatin的释放，其中由数批释放系统的释放图采用分子量30-40K道尔顿的50/50未封端和封端聚合物制备的释放系统，其中变更了方法参数以便将释放调整在28-60天之间。
图6说明了从PLGA微球中累积Histatin的释放，其中由数批释放系统的合并释放图采用分子量8-40K道尔顿的50/50未封端和封端聚合物制备的释放系统，其中变更了方法参数以便将释放调整在1-60天之间。
图7说明了从用分子量8-12K道尔顿未封端聚合物制备的PLGA微球中LHRH的累积百分释放率。
本发明的详细描述本发明涉及设计释放周期至多100天的新型的，程序化持续释放包括多肽在内的生物活性药物的药物释放系统，在水性生理环境中，该微球释放系统具有生物可包容性和生物可降解性，药物释放时极少或根本没有突发释放。
与现有的依赖于使用填料/添加剂，例如依赖于使用的明胶，白蛋白，葡聚糖，果胶，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇，蔗糖等，并且仍然显示低的包裹有效性和“突发作用”倾向的药物释放体系不同，本发明不使用任何添加剂便可达到高的包裹效率和“非突发”释放。在本发明中，通过使用聚(丙交酯/乙交酯)聚合物的“未封端”和封端形式的独特的混合物，达到非突发的，可程序化的持续释放。
“未封端”形式是指“含游离羧基端基的”聚(丙交酯/乙交酯)，与常规的用封端形式比较，它使聚合物更具有亲水性。目前用的“封端”的聚合物水合物在4-12周之间造成中间的“不释放”或“停滞阶段”，具体周期取决于分子量。未封端聚合物水合物在5-60天之间，具体周期取决于分子量，因而没有停滞阶段连续释放它的药核。小心混合两种形态和合适的分子量以及适合的L/G比例，可以造成在1-100天之间连续释放。此外，通过审慎地选择方法参数，例如聚合物的浓度，多肽的浓度及水相/油相的比例，在该时间内的释放便可是程序化的。
本发明的共聚物包括的分子量范围为2000到60000道尔顿，丙交酯/乙交酯的比例为90/10到40/60及混合物中未封端/封端形式的比例为100/0的比例为100/0到1/99。多肽的分子量范围为1000到250000道尔顿，而其它生物活性药物的分子量范围可为100到100000道尔顿。
本发明描述的微胶囊用独特的水性乳化技术制备，该技术已被开发用于未封端的聚合物，以便提供优良的球体形态，球体的完整性，及窄小颗粒分布。该微胶囊的制作是这样完成的，首先将聚合物与有机溶剂例如与二氯甲烷的溶液和生物活性药物的水溶液混合，制备内部的油包水(W/O)乳化液。随后将该W/O乳化液在含有O/W乳化剂例如含聚乙烯醇的溶剂-饱和水溶液中稳定化。然后用W/O乳化液在含与上面相同的乳化剂，浓度范围为0.25-1％(w/v)的外水相中将W/O乳化液乳化，形成三元乳化液。蒸除溶剂，洗净残留的乳化剂，冷冻干燥使微胶囊硬化。在第一次乳化(W/O乳化液形成)时和在形成最终的W/O/W乳化液时都用低温，使得到稳定的乳化液和优良的球体性质。
在本发明的上下文中，生物活性药物是指任何水溶性的激素药物，抗生素，抗肿瘤药物，抗炎症药物，退烧药，止痛药，镇咳药，祛痰药，镇静药，肌肉松弛剂，抗癫痫药，抗溃疡药，抗抑郁药，抗过敏药，强心剂，抗心律失常药，血管舒张药，抗高血压药，利尿药，抗凝药，抗麻醉药等等。
更精确地说，申请人发明了具有下面详细列出特征的药物组合物及制备方法。
1.周期为1-100天，用于非突发的，持续地、程序化释放生物活性药物的控释微胶囊药物制剂，该控释微胶囊包括活性药物以及未封端和封端的生物可降解的聚(丙交酯/乙交酯)的混合物。
2.条款1的药物制剂，其中可生物降解的聚(丙交酯/乙交酯)是未封端和封端形式的混合物，比例范围为100/0到1/99。
3.条款1或2的微胶囊，其中未封端和封端的聚合物的共聚物(丙交酯/乙交酯L/G)的比例为52/48到48/52。
4.条款1或2的微胶囊，其中未封端和封端的聚合物的共聚物L/G的比例为90/10到40/60。
5.条款1或2或3或4的微胶囊，其中共聚物的分子量在2000-60000道尔顿之间。
6.条款1或2或3或4或5的微胶囊，其中生物活性药物是肽或多肽。
7.条款6的微胶囊，其中所述多肽是由12个氨基酸组成的、具有分子量为1563的histatin。
8.条款1或2或3或4或5或6的微胶囊，该胶囊的特征是未封端和封端的聚(丙交酯/乙交酯)的100/0的混合物的L/G比例为48/52到52/48，分子量小于15000时，在水性生理环境中1-35天内完全释放histatin。
9.条款1或2或3或4或5或6的微胶囊，该胶囊的特征是用100/0的未封端和封端的聚(丙交酯/乙交酯)的混合物的L/G比例为48/52到52/48，分子量的范围为28000-40000道尔顿时，在水性生理环境中18-40天期间内完全释放histatin。
10.条款1或2或3或4或5或6的微胶囊，该胶囊的特征是用0/100的未封端和封端的聚(丙交酯/乙交酯)的混合物的L/G比例为48/52到52/48，分子量范围为10000-40000道尔顿时，在水性生理环境中在28-70天期间内释放至多90％的histatin。
11.条款1或2或3或4或5或6的微胶囊，该胶囊的特征是用0/100的未封端和封端的聚(丙交酯/乙交酯)的混合物的L/G比例为75/25，分子量小于15000道尔顿时，在水性生理环境中在50-100天期间内释放至多80％的histatin。
12.条款7或8或9或10或11的微胶囊，该胶囊含有histatin的类似物，该类似物的链长为11-24个氨基酸，分子量为1500-3000道尔顿，具有下列结构特征1. DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY2. KRHHGYKRKFHEKHHSHRGYR3. KRHHGYKRKFHEKHHSHR4. RKFHEKHHSHRGYR5. AKRHHGYKRKFH6.*AKRHHGYKRKFH7. KRHHGYKRKF*D-氨基酸13.条款1或2或3或4或5的微胶囊，其中生物活性药物是多肽促黄体生成激素释放激素(LHRH)，这是一个分子量为1182，以醋酸盐形式存在的十肽，具有下述结构p-EHWSYGLRPG14.条款6或7或8或9或10或11或12或13的分子量为1000-250000道尔顿的微胶囊。
15.条款6或7或8或9或10或11或12或13或14的微胶囊，其中未封端和封端的微球以各种量混合为鸡尾酒使达到各种释放速率和持续时间。
16.条款6或7或8或9或10或11或12或13或14的微胶囊，其中未封端和封端的聚合物以不同的比例混合在相同的微球内以便达到各种释放速率和持续时间。
17.条款6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16的微胶囊，其中包裹的多肽是任何抗肠毒性大肠杆菌(ETEC)，例如CFA/I，CFA/II，CS1，CS3，CS6和CS17及其它ETEC-相关的内毒素的疫苗药物。
18.条款6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17的微胶囊，其中包裹的多肽是由分子范围为大约800-5000道尔顿的多肽抗原组成，用于免疫抵抗肠毒性大肠杆菌(ETEC)。
19.条款1或2或3或4或5的微胶囊，其中所述生物活性药物选自分子量范围为100至100000道尔顿的水溶性激素药物，抗生素，抗肿瘤药，抗炎症药，退烧药，止痛药，镇咳药，祛痰药，镇静药，肌肉松弛剂，抗癫痫药，抗溃疡药，抗抑郁药，抗过敏药，强心剂，抗心律失常药，血管舒张药，抗高血压药，利尿药，抗凝药，抗麻醉药。
20.条款1或2或3或4或5或6或7或8的微胶囊，其中所述的生物可降解的聚(丙交酯/乙交酯)在油相中存在的量为大约1％-50％(w/w)。
21.条款1或2或3或4或5或6或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17的微胶囊，其中活性药物的浓度范围为0.1％到大约60％(w/w)。
22.条款1或2或3或4或5或6或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17的微胶囊，其中内部水与油相的比例为大约1/4到1/40(v/v)。
23.制备特征为非突发地，持续地，程序化释放生物活性药物的控释胶囊制剂的方法，该方法包括将生物可降解的未封端形式聚(丙交酯/乙交酯)溶解在二氯甲烷中，将生物活性药物或活性药核溶解在水中；将水层加到聚合物溶液中，并使之乳化得到内部的油包水(W/O)乳化液；在含有水包油(O/W)乳化剂的溶剂-饱和水溶液相中稳定W/O乳化液；将所述的W/O乳化液加到含有水包油乳化剂的外部水层中形成三元乳化液；将得到的水包油包水(W/O/W)乳化液搅拌足够的时间，除去所述的溶剂，用水洗净硬化的微胶囊，并冷冻干燥所述的硬化的微胶囊。
24.制备特征为非突发的，持续地程序化释放生物活性药物的控释微胶囊的方法，该方法包括将封端形式生物可降解的聚(丙交酯/乙交酯)溶解在二氯甲烷中，将生物活性药物或活性药核溶解在水中，将水溶液相加到聚合物溶液中，乳化得到内部的油包水乳化液；在含有水包油(O/W)乳化剂的溶剂-饱和水溶液相中稳定该W/O乳化液，将所述的W/O乳化液加到含有水包油乳化剂的外部水溶液相中形成三元乳化液，将得到的水包油包水(W/O/W)乳化液搅拌足够的时间，以便除去溶剂，用水洗涤硬化的微胶囊；冷冻干燥所述的硬化胶囊。
25.条款23或24的方法，其中在加外部水溶液层之前加溶剂-饱和的外部水溶液相，以便乳化内部的W/O乳化液，使得到体积分布范围为0.05-500μm的微胶囊。
26.条款23或24的方法，其中在制备内部的W/O乳化液期间用大约0-4℃的低温，在制备W/O/W乳化液期间用大约4-20℃的低温，以便得到稳定的乳化液和高的包裹效率。
27.各条款的方法，其中使用100/0的未封端和封端的聚合物的混合物，以便使活性药核以连续和持久及没有停滞阶段的方式释放。
28.条款6的微胶囊，其中当包裹的多肽在低pH时有活性时，例如LHRH，促肾上腺皮质激素，表皮生长因子，降钙素，那么释放的多肽就具有生物活性。
29.条款6或7或8或9或10或11的微胶囊，其中当包裹的多肽，例如histatin在低pH值没有活性时，就将无机盐类pH-稳定化剂加到内部的水溶液相中，以便保持释放的多肽的生物活性。
30.条款6或7或8或9或10或11的微胶囊，其中当包裹的多肽，例如histatin在低pH时没有活性时，那么就将非离子表面剂，例如将聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯(吐温80，吐湿60和吐温20)和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronics)加到内部的水溶液相中，以便保持释放的多肽的生物活性。
31.条款29的微胶囊，其中同时给予载有pH-稳定化剂的安慰球和载有多肽的球，以便保持微胶囊周围溶液的pH和维持某些情况中释放的多肽的生物活性，所述的情况是，为了成功地包裹对酸性pH敏感的多肽，不希望在内部的水相中加pH稳定剂。
32.条款30的微胶囊，其中载有非离子表面活性剂的安慰球和载有多肽装的球同时给药，以便保持释放的多肽的生物活性，需要这样给药的场合是，为了成功地包裹对酸性pH敏感的多肽，不希望在内部的水相中加非离子表面剂。
33.条款1或2或3或4或5或6或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17的微胶囊，该微胶囊包含未封端和封端的聚合物的混合物，其中共聚物完全溶解，在给药部位没有残留的聚合物，包裹的药物同时完全释放。
34.通过非肠道途径，例如经过肌内和皮下给药途径给人服用条款1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20的微胶囊的方法。
35.通过局部给药途径给人服用条款1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20的微胶囊的方法。
36.通过口服给药途径给人服用条款1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20的微胶囊的方法。
37.通过鼻、经皮的、直肠和阴道途径给人服用条款1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20的微胶囊的方法。多肽生物活性的保存由于聚合物迅速降解，伴随在微环境中释放可溶解的寡聚物，pH急剧下降这可能影响对酸性pH敏感的多肽/蛋白质的生物活性。在这些情况中，通过在共溶了多肽的内水相中加无机盐或缓冲剂可以保持生物活性。
下面独特的优势是本发明的特征1.在水性生理环境中，药核中不加添加剂，非突发性，长时间和持续释放多肽和生物可包容的和生物可降解的微胶囊，持续时间至多100天。
2.用不同的分子量和不同的共聚物比例的未封端和封端的聚合物的混合物，及控制方法参数，使在1-100天的不同周期内程序化地释放活性药核。
3.活性药核的完全释放与载体聚合物完全溶解为无害组分，例如乳酸和乙二醇酸同时发生，尤其是在用100/0的未封端/封端的聚合物的混合物时是这样。这一特点非常有意义，因为目前用的大多数生物可降解的聚合物在1-30天释放，在设想的释放期间结束时不完全降解，这样引起管理机构对给药部位残留的聚合物的影响严重关注。
4.以各种剂量形式，通过几种途径，例如通过非肠道的(肌肉和皮下)，口服，局部的，经鼻，阴道等等途径该微胶囊给药方便。
以D，L-丙交酯和乙交酯为基础的亲水的均聚物和共聚物含有亲水调节的有游离羧基末端基的均聚物和共聚物，并有下述通式特征聚(D，L-丙交酯-共聚-乙交酯)50∶50
(C3H4O2)n(C2H2O2)mn∶m＝1∶1其中Z＝分子量/130；例如分子量为12000时Z＝92，分子量为34000时Z＝262。
尽管丙交酯与乙交酯的摩尔比可以变化，但最优选丙交酯共聚物与乙交酯共聚物的比例为50∶50。
现在介绍图1，该图是血药浓度对时间作图，表明了使用一系列剂量的常规给药与理想的控释系统的比较。不幸的是，许多药物都有治疗范围，高出该范围就有毒性，低于该范围就无效。系统给药后常常观察到的振荡式药物水平引起了无效和毒性的交替周期。正如图1中的治疗范围中指出的那样，持续释放的包裹的生物活性药物或多肽制剂理想地是一次给药就可以保持药物处于期待治疗范围，图1中给出了控释的理想情况。
图2是分子量为12K道尔顿50/50未封端聚合物制备的PLGA微球的扫描显微电镜图。该未封端的聚合物具有固定、光滑的球面，并适合于提供“非突发”释放系统。
表I总结了制备多肽系统(Histatin肽)的微球方法，该系统可以控制多肽在1至100天内释放。
审慎地将未封端的聚合物和封端的聚合物在分开的微球中混合或在同一微球中混合可以调节药物释放情况。表1列出了从微球制剂1至21的释放，各释放是独立发生的，因而从这些制剂的制剂中的累积释放具有加和性。将数种未封端的微球制剂和封端的微球制剂混合，那么任何期待持续时间的释放曲线都可以设计。此外，根据未封端聚合物和封端的聚合物释放特性，在单一制剂中包括不同比例未封端聚合物和封端聚合物的两种形态的混合物将明显影响聚合物的水化作用，并因此影响活性药核释放，由此便可以提供任何期待模式的释放曲线。造成活性核释放改变的聚合物水化和降解的操作可通过往封端的聚合物中加未封端的聚合物来达到，加入的量少至1％至100％。表1含Histatin多肽的微胶囊组合物
接上页表格
略语L/G比例(丙交酯/乙交酯)共聚组分DCM二氯甲烷Mw分子量，以道尔顿为单位A无乳化稳定中间阶段的W/O/W乳化B有乳化稳定中间阶段的W/O/W乳化U未封端的聚合物参照表1与图3的联系时可以看到，由几批用50/50和75/25未封端的和封端的聚合物制备的PLGA微球累积释放的Histatin，通过变更方法参数，调节了药物在1至100天之间的释放情况。封端的50/50在1-35天释放，封端的50/50在18-56天释放，封端的75/25在56-100天释放。
图4是设计用分子量为30-40K道尔顿的封端的多聚体制备的1-2个月释放系统的PLGA微球的扫描电镜图。
图5说明了由PLGA微球累积释放的Histatin，其中的释放状况来自数批用50/50未封端和封端的高聚体制备的微球，并变更方法参数，以便将释放调节在28至60天。
图6描述了由PLGA微球累积释放Histatin，这些合并的释放来自数批用50/50未封端和封端高聚物制备的微球，并变更了方法参数以便调节在1-60天之间释放药物。
在本发明的上下文中，生物活性药物是任何水溶性抗菌素、抗肿瘤药物、解热镇痛药、抗炎药、镇咳药、祛痰药、镇静药、肌肉松驰药、抗癫痫药、抗溃疡物、抗抑郁药、抗过敏药、强心药、抗心率不齐药、舒血管药、抗高血压药、利尿药、抗凝药、激素、抗麻醉药等等。
一般说来，在本发明的上下文中用90/10至40/60摩尔比和100/0至1/99比例的未封端高聚物和封端高聚物比率便可完成生物活性药物从PLGA微球中“非突发”持续释放体系。
一般说来，设计生物活性药物包裹到未封端的微球中和未封端/封端结合的PLGA微球中的方法和这些包裹物的特性简要叙述如下1.按图2和A所示，用50/50未封端和封端、分子量为大约8-40K道尔顿的聚合物提供表面形态的PLGA微球。
2.图3和图5是多肽Histatin在体外从用分子量为大约8至40K道尔顿和摩尔比为50/50至75/25的未封端和封端聚合物制备的PLGA微球中释放的情形。
例如，设计1-12周生物活性化合物释放系统可以用具有以下特性的PLGA来实现1.高聚物的分子量大约2-60K道尔顿2.共聚物的摩尔比(L/G)大约90/10至40/603.高聚物末端基未封端和/或封端并且在以下参数中审慎地组合方能实现上述设计4.高聚物浓度5％至50％5.内部水对油相的比例1∶5至1∶20(v/v)6.多肽的负载2％至大约40％(w/w高聚体)并通过使用本发明中描述的独特水性乳化方法。
本发明的独特和创新性一般可以总结如下1.使用未封端的高聚(丙交酯/乙交酯)以便达到在1-100天里非突发、连续、持久、程序化释放生物活性药物。
2.使用独特的水性乳化系统以便达到诸如一致的球形态学和窄小的体积分布的高级微球特性。
3.在内核中不使用添加剂，在水性生理环境中，在至多100天里，多肽和其它生理活性药物从生物可包容的和生物可降解的微球中便可非突变，长时程及持续释放。
4.通过使用不同分子量、不同共聚物比例的未封端和封端的高聚体的共混物和处理方法参数，在1-100天里的不同周期活性核的释放可程序化。
5.特别是当使用100/0的未封端/封端高聚体混合物时，随着载体多聚体完全溶解为诸如乳酸和乙醇酸一类的无毒组分，活性核同时完全释放。由于目前用于1-30天释放的大部分可生物降解的高聚体在期待的释放周期之末不完全降解引起主管的权力机关对给药部位残留的高聚体的影响严重关注，所以这一条优点具有极大的意义。
6.以各种剂形和经各种途径，例如非肠道(肌内和皮下)给药、口服、局部给药、经鼻给药及阴道给药等，这种微球都容易实现。
下述实施例用于解释但不限制本发明制备的微囊剂型。
实施例1用独特的水性乳化技术制备聚丙交酯/乙交酯(PLGA)微囊，所述的技术已被开发用于未封端高聚体，以便提供超级的球图形学，球完整性和窄小的体积分布(见于图1a和1b)。制备过程是，将高聚体溶到二氯甲烷一类的卤代烃中，将生物活性药物溶于水中。用超声法将高聚物和活性药物的溶液混合形成W/O乳化液，该乳化液然后在含聚乙烯醇的溶剂饱和的水溶液中稳定化。在含聚乙烯醇(0.25％-1％w/v)的外部事先冷却的水相中将W/O乳化，形成三元乳化液。蒸去溶剂使微囊硬化，淋洗除去任何残留的乳化剂，然后冷冻干燥。
表1列出了这样制备的微囊制剂号1-21，这些制剂含生物活性多肽Histatin(含12个氨基酸残基，分子量为1563)和比例为100/0至1/99未封端及封端高聚体的混合物，混合高聚体的丙交酯/乙交酯的比例为90/10至40/60，分子量范围为2000至60000道尔顿。
实施例2按实施例1叙述的方法制备微囊制剂，其中共聚物L/G比例为48/52至52/48，未封端高聚物/封端高聚物比例为100/0。活性药核为Histatin(Mw1563)，高聚物的分子量小于15000，高聚物的浓度由7％变至大约40％(w/w)。制剂1，2，4，12-14和16-18列入表1。
在水性生理环境中，例如在磷酸盐缓冲的生理盐水中，pH为7.0，保持37±1℃，活性药核从制剂中释放的图以累积释放百分数对时间的曲线表示，表现在图2中。
非突发，由1-35天的可变释放通过将油相中的高聚物浓度从7％变至40％来达到。
实施例3按实施例2中描述的方法制备微囊制剂，其中水相/油相比例由1/4变至1/20(v/v)。制剂1，2，4和12列入表1。
在实施例2中描述的水性生理环境中，活性药核从制剂中释放的图以累积释放百分数对时间的曲线表示，表现在图2中。
具有不同的起始和完成时间的非突发，1-35天连续释放，通过在内核中选择不同的W/O比例来达到。
实施例4按实施例2中描述的方法制备微囊制剂，其中高聚物的分子量为28000-40000，高聚物的浓度由5％变至15％(w/w)。制剂19-21列入表1。
在实施例2中描述的水性生理环境中，活性药核从制剂中释放的图以累积释放百分数对时间的曲线表示，表现在图3中。
通过改变高聚物浓度来达到非突发，18-40天的可变释放。
实施例5按照实施例2中描述的方法制备微囊制剂，其中未封端/封端高聚物的比例为1/99，高聚物的浓度在5％至12％(w/w/)之间变化。制剂10和11列入表1。
在实施例2中描述的水性生理环境中，活性药核从制剂中释放的图以累积释放百分数对时间的曲线表示，表现在图2中。
非突发，28-70天的可变释放通过改变油相中高聚物浓度来达到。
实施例6按实施例5中描述的方法制备微囊制剂，其中高聚物的分子量为28000至40000，高聚物的浓度在5％至12％(w/w)之间变化。制剂5和6列入表1。
在实施例2中描述的水性生理环境中，活性药核从制剂中释放的图以累积释放百分数对时间的曲线表示，表现在图3中。
非突发，28-70天的可变释放通过改变高聚物的浓度来达到。
实施例7按实施例6中描述的方法制备微囊制剂，其中水/油比例在1/5至1/25(v/v)之间变化。制剂3和7列入表1。
在实施例2中描述的水性生理环境中，活性药核从制剂中释放的图以累积释放百分数对时间的曲线表示，表现在图3中。
非突发，28-70天的可变释放通过改变水/油比例来达到。
实施例8按实施例5中描述的方法制备微囊制剂，其中共聚物的比例为75/25，高聚物的浓度在5％至大约25％(w/w)之间变化。制剂8和9列入表1。
在实施例2中描述的水性生理环境中，活性药核从制剂中释放的图以累积释放百分数对时间的曲线表示，表现在图2中。
非突发，56-90天可变的释放通过改变油相中高聚物的浓度来达到。
实施例9实施例2中描述的微囊制剂，其中活性药核为促黄体生成激素释放激素(LHRH，分子量为1182的十肽)，高聚物的浓度为大约40％(w/w)。在实施例2中描述的水性生理环境中，活性药核从制剂中释放的图以累积释放百分数对时间的曲线表示，表现在图4中。
与乙酸Histatin类似在35天内达到非突发连续并完全释放。
实施例10按实施例2中描述的方法制备微囊，其中往内部的水相中加一种钠盐(碳酸钠或碳酸氢钠)一类的添加剂，添加剂的浓度为1％至10％(w/w)，以便保持释放的多肽的生物活性。
与实施例2和3类似地达到非突发、1-28天可变地释放，由于存在钠盐释放的多肽直至30天都有生物活性。
实施例11按实施例2中描述的方法制备微囊制剂，其中将非离子型表面活性剂一类的添加剂，聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物(普鲁兰尼克F68和F127)或加到内部油相或水相，添加剂的浓度为10％至100％(w/w)，以便保持释放的多肽的生物活性。
与实施例2和3类似地达到非突发、1-35天连续释放，由于存在表面活性剂，释放的多肽有生物活性。
实施例12从实施例1至11的微囊制剂中累积Histatin释放，图2和3中表示的释放图显示了在1-100天的不同周期里多肽非突发、程序化释放。如同这些图所示的那样，审慎地混合数种制剂，在100天的周期内最终可以达到任何模式的累积释放。
权利要求
1.用于周期为1-100天，非突发地，持续地程序化释放生物活性药物的控释微胶囊药物制剂，该控释微胶囊包括活性药物以及未封端和封端的生物可降解的聚(丙交酯/乙交酯)的混合物。
2.权利要求1的药物制剂，其中生物降解的聚(丙交酯/乙交酯)是未封端和封端形式的混合物，比例范围为100/0到1/99。
3.权利要求1或2的微胶囊，其中未封端和封端的聚合物的共聚物(丙交酯/乙交酯L/G)的比例为52/48到48/52。
4.权利要求1或2的微胶囊，其中未封端和封端的聚合物的共聚物L/G的比例为90/10到40/60。
5.权利要求3的微胶囊，其中共聚物的分子量在2000-60000道尔顿之间。
6.权利要求1的微胶囊，其中生物活性药物是肽或多肽。
7.权利要求6的微胶囊，其中所述多肽是由12个氨基酸组成的，具有分子量为1563的histatin。
8.权利要求7的微胶囊，该胶囊的特征是用未封端和封端的聚(丙交酯/乙交酯)的100/0的混合物，L/G比例为48/52到52/48，分子量小于15000，在水性生理环境中1-35天内完全释放histatin。
9.权利要求7的微胶囊，该胶囊的特征是用100/0的未封端和封端的聚(丙交酯/乙交酯)的混合物，L/G比例为48/52到52/48，分子量的范围为28000-40000道尔顿，在水性生理环境中18-40天期间内完全释放histatin。
10.权利要求7的微胶囊，该胶囊的特征是用0/100的未封端和封端的聚(丙交酯/乙交酯)的混合物，L/G比例为48/52到52/48，分子量范围为10000-40000道尔顿，在水性生理环境中28-70天期间内可释放至多90％的histatin。
11.权利要求7的微胶囊，该胶囊的特征是用0/100的未封端和封端的聚(丙交酯/乙交酯)的混合物，L/G比例为75/25，分子量小于15000道尔顿，在水性生理环境中在50-100天期间内释放至多80％的histatin。
12.权利要求7或8或9或10或11的微胶囊，该胶囊含有histatin的类似物，该类似物的链长为11-24个氨基酸，分子量为1500-3000道尔顿，具有下列结构特征1. DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY2 KRHHGYKRKFHEKHHSHRGYR3 KRHHGYKRKFHEKHHSHR4 RKFHEKHHSHRGYR5. AKRHHGYKRKFH6.*AKRHHGYKRKFH7. KRHHGYKRKF*D-氨基酸
13.权利要求6的微胶囊，其中生物活性药物是多肽促黄体生成激素释放激素(LHRH)，这是一个分子量为1182，以醋酸盐形式存在的十肽，具有下述结构p-EHWSYGLRPG
14.权利要求6的分子量为1000-250000道尔顿的微胶囊。
15.权利要求6或7或8或9或10或11或13或14的微胶囊，其中未封端和封端的微球以各种量混合为鸡尾酒使达到各种释放速率和持续时间的释放曲线。
16.权利要求6或7或8或9或10或11或13或14的微胶囊，其中未封端和封端的聚合物以不同的比例混合在相同的微球内以便达到各种释放速率和持续时间的释放曲线。
17.权利要求6或7或8或9或10或11或13或14的微胶囊，其中包裹的多肽是任何抗肠毒性大肠杆菌(ETEC)，例如CFA/I，CFA/II，CS1，CS3，CS6和CS17及其它ETEC-相关的内毒素的疫苗药物
18.权利要求6或7或8或9或10或11或13或14的微胶囊，其中包裹的多肽是由分子范围为大约800-5000道尔顿的多肽抗原组成，用于免疫抵抗肠毒性大肠杆菌(ETEC)。
19.权利要求1或2或3或4或5的微胶囊，其中所述生物活性药物选自分子量范围为100至100000道尔顿的水溶性激素药物，抗生素，抗肿瘤药，抗炎症药，退烧药，止痛药，镇咳药，祛痰药，镇静药，肌肉松弛剂，抗癫痫药，抗溃疡药，抗抑郁药，抗过敏药，强心剂，抗心律失常药，血管舒张药，抗高血压药，利尿药，抗凝药，抗麻醉药。
20.权利要求1或2或3或4或5或6或7或8的微胶囊，其中所述的生物可降解的聚(丙交酯/乙交酯)在油相中，存在的量为大约1％50％(w/w)。
21.权利要求1或2或3或4或5或6或8或9或10或11或13或14的微胶囊，其中活性药物的浓度范围为0.1％到大约60％(w/w)。
22.权利要求1或2或3或4或5或6或8或9或10或11或13或14的微胶囊，其中内部水与油相的比例为大约1/4到1/40(v/v)。
23.制备特征为非突发的，持续的，程序化释放生物活性药物的控释微胶囊制剂的方法，该方法包括将生物可降解的未封端形式聚(丙交酯/乙交酯)溶解在二氯甲烷中，将生物活性药物或活性药核溶解在水中；将水层加到聚合物溶液中，并使之乳化得到内部的油包水(W/O)乳化液；在含有水包油(O/W)乳化剂的溶剂-饱和水溶液相中稳定WO乳化液；将所述的W/O乳化液加到含有水包油乳化剂的外部水层中形成三元乳化液；将得到的水包油包水(W/O/W)乳化液搅拌足够的时间，除去所述的溶剂，用水洗净硬化的胶囊，并冷冻干燥所述的硬化的微胶囊。
24.制备特征为非突发的，持续地程序化释放生物活性药物的控释微胶囊的方法，该方法包括将封端形式的生物可降解的聚(丙交酯/乙交酯)溶解在二氯甲烷中，将生物活性药物或活性药核溶解在水中，将水溶液相加到聚合物溶液中，进行乳化，得到内部的油包水乳化液；在含有水包油(O/W)乳化剂的溶剂-饱和水溶液相中稳定W/O乳化液；将所述的W/O乳化液加到含有水包油乳化剂的外部水溶液相中形成三元乳化液，将得到的水包油包水(W/O/W)乳化液搅拌足够的时间，以便除去上述溶剂，用水洗涤硬化的微胶囊；冷冻干燥所述的硬化胶囊。
25.权利要求23或24的方法，其中在加外部水溶液层之前加溶剂-饱和的外部水溶液相，以便乳化内部的W/O乳化液，使得到窄体积分布范围为0.05-500μm的微胶囊。
26权利要求23或24的方法，其中在制备内部的W/O乳化液期间用大约0-4℃的低温，在制备W/O/W乳化液期间用大约4-20℃的低温，以便得到稳定的乳化液和高的包裹效率。
27.权利要求23的方法，其中使用100/0的未封端和封端的聚合物的混合物，以便使活性药核以连续和持久及没有停滞阶段的方式释放。
28.权利要求6的微胶囊，其中当包裹的多肽，例如LHRH，促肾上腺皮质激素，表皮生长因子，降钙素在低pH时有活性时，那么释放的多肽就具有生物活性。
29.权利要求6或7或8或9或10或11的微胶囊，其中当包裹的多肽，例如histatin在低pH时没有活性时，就将无机盐类pH-稳定剂加到内部的水溶液相中，以便保持释放的多肽的生物活性。
30.权利要求6或7或8或9或10或11的微胶囊，其中当包裹的多肽，例如histatin在低pH时没有活性时，那么就将非离子表面活性剂，例如将聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯(吐温80，吐湿60和吐温20)和聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronics)加到内部的水溶液相中，以便保持释放的多肽的生物活性。
31.权利要求29的微胶囊，其中同时服用载有pH-稳定剂的安慰球和载有多肽的球，以便保持微胶囊周围溶液的pH并维持某些情况中释放的多肽的生物活性，所述的情况是，在内部的水相中加pH稳定剂对成功地包裹对酸性pH敏感的多肽是不可取的。
32.权利要求30的微胶囊，其中载有非离子表面活性剂的安慰球和载有多肽的球同时给药，以便保持释放的肽的生物活性，需要这样给药的场合是在内部的水相中加非离子表面活性剂对成功地包裹对酸性pH敏感的多肽是不可取的。
33.权利要求1或2或3或4或5或6或8或9或10或11或13或14的微胶囊，该微胶囊包含未封端和封端的聚合物的混合物，其中共聚物完全溶解，在给药部位没有残留的聚合物，并且同时实现包裹药物的完全释放。
34.通过非肠道途径，例如经过肌内和皮下给药途径给人服用权利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或13或14的微胶囊的方法。
35.通过局部给药途径给人服用权利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或13或14的微胶囊的方法。
36.通过口服给药途径给人服用权利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或13或14的微胶囊的方法。
37.通过鼻、经皮的、直肠和阴道途径给人服用权利要求1或2或3或4或5或6或7或8或9或10或11或13或14的微胶囊的方法。
全文摘要
新型的非突发性的,持续释放生物可包容的和生物可降解的微胶囊,该微胶囊可以程序化地将它们的活性药核在1—100天的不同期间释放到水性生理环境中。该微胶囊包括包在聚(丙交酯/乙交酯)共聚物基质内的多肽或其它生物活性物质的药核,该共聚物为未封端(游离羧基端基团)和封端形式的比例范围为100∶0到1∶99的混合物。
文档编号A61K47/30GK1188408SQ96194768
公开日1998年7月22日 申请日期1996年11月18日 优先权日1996年1月24日
发明者R·耶亚思, J·F·范哈莫特, P·弗里登, R·H·雷德, F·D·罗伯特, C·E·麦奎, J·A·瑟特尔斯特罗姆 申请人:美国政府陆军部