专利名称：鉴定或分离分子的方法和由此鉴定的分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴定所需分子的方法。在特别优选的实施方案中，本发明涉及鉴定与病变现象如癌(如黑素瘤或肾癌)，霍奇金病，自体免疫疾病等相关的分子。本发明还包括作为本发明的方法的结果发现的分离分子如提呈的肽。这些分子特别包括，含蛋白质的分子，编码它们的分离的核酸分子，和与含蛋白质的分子特异结合的抗体。为方便起见，将本文描述的方法称为“血清学钓取法”。
背景和现有技术已经十分肯定的是许多病变现象如感染，癌，自我免疫紊乱等等其特征为某些分子的不适当的表达，所以这些分子可作为特殊病变或不正常现象的“标记”。除了它们作为诊断“靶”，即，待鉴定材料以便诊断这些不正常现象的作用，这些分子还可作为用于生产诊断剂和/或治疗剂的试剂。一个非限制性的例子是利用癌标记生产特异于特定标记的抗体。另一个非限制性的例子是利用与MHC分子复合的肽产生抗不正常细胞的胞溶性T细胞。
当然，这些材料的制备以用于产生它们的试剂的来源为先决条件。离开某些这样做的方法，从细胞中纯化是费力的。另一个优选的方法是分离编码特定标记的核酸分子后利用分离的编码分子表达所需的分子。
目前，已经利用两套计划检测在如人肿瘤中的这些抗原。这些方案被称为遗传途径和生化途径。如引入本文作为参考的DePlaen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852275(1988)例举了遗传途径。在该途径中，将几百个从肿瘤得到的cDNA文库的质粒库转染进受体细胞如，COS细胞，或转染进测试特异抗原的表达的肿瘤细胞系的抗原阴性突变体。引入本文作为参考的Falk等，自然学351290(1991)，和Kawakami等，自然学36969(1994)例举的生化途径是根据在酸洗脱与肿瘤细胞的MHC-I分子结合的肽后进行反相高效液相色谱(R-HPLC)。在与缺失抗原加工能力和诱导胞溶性T-淋巴细胞的特异反应的突变细胞系的空MHC-I分子结合后，鉴定抗原性肽。这些反应包括在MTT测定方法或51Cr释放测定方法中可测量的CTL增殖，TNF释放，和靶细胞的溶解。
对抗原的分子鉴定的这两套途径有下面的缺点首先，它们是非常麻烦，耗时和昂贵的；其次，它们依赖于建立具有预定特异性的胞溶性T细胞系(CTLs)；第三，由于不仅从患有有关疾病的病人，而且从健康的个体，依据它们的T细胞的全部组成，都可以得到有关的CTL，所以还没有证明体内它们与相关病理或疾病的发生的关系。
至今，两种方法只成功地鉴定了人肿瘤中的极少数新抗原的事实最好地证实了抗原的鉴定和分子鉴定的两套已知途径内在的问题。参见如，van der Bruggen等，科学2541643-1647(1991)；Brichard等，实验医学杂志178489-495(1993)；Coulie等，实验医学杂志18035-42(1994)，Kawakami等，美国科学院院刊913515-3519(1994)。
如人所愿的有效的方法是不仅能用于检测与肿瘤相关的抗原，而且能测定与任何不正常或病变现象相关的分子。这样的方法应简化这些分子的鉴定，从而使它们能用于如抗体，胞溶性T细胞等的生产。
所以本发明的目的是开发简单检测和分子鉴定在人组织，特别是肿瘤细胞中的抗原的方法和试剂，这些方法和试剂可用于疾病的分子诊断和/或感染的和自体免疫的和恶性的疾病的免疫治疗和基因治疗。在下面的公开物中描述了本发明。
附图的简要说明
图1显示了本发明的途径的原理。
图2显示了带有与1∶100稀释度的病人血清反应的来自肾细胞明显的癌的cDNA衍生的阳性克隆的硝酸纤维膜。
图3显示了肾细胞癌，正常肾和其它人组织中的HOM-RCC-313克隆的Northern印迹分析图。
图4显示了编码HOM-RCC-313的基因的翻译区。
优选实施方案的详细说明下面的公开内容描述了称为血清学钓取法的方法。其中，从患有病变现象的个体中获取细胞样品。优选地，该细胞是病变的例子。例如，如果个体有黑素瘤，细胞是黑素瘤细胞。如果个体患了如神经紊乱，那么优选地细胞是患病细胞的样品。这条途径是有理由的，因为患病细胞最可能是所需的含蛋白质的分子，即，与所需的病变现象有特异关系的分子的最好来源。
应该注意到代表病变现象的细胞不是可用于本发明的方法的唯一细胞。例如，非常重要的是，如，测定那些与细胞分化和成熟相关的细胞“标记”。可想到的例子是生血干细胞。同样，本发明涉及如特异配体的受体分子的分离。事实上，利用该方法可以测定任何所需分子的存在。
然后将选择的细胞用于制备互补DNA(即，“cDNA”)文库。该方法是熟练技术人员所熟知的，不需要在这里重复说明。当然这是根据测定的事实即，如果细胞表达蛋白质，那么必须存在信使RNA(mRNA)。这些mRNA分子不能长时间存在，是不稳定的，所以利用它们操作是不可行的。利用cDNA时带给分子以稳定性对本方法是非常有帮助的。
一旦制备了cDNA，就可用于构建载体文库。简要地说，处理载体，如切割和拼接，以使其接受cDNA分子。载体的选择可以变化，如熟练技术人员熟知的许多这样的例子。
特别优选的是基于病毒的载体。在真核细胞中，基于逆转录病毒和腺病毒的载体是优选的。这样的载体含有所有或部分病毒基因组，如长末端重复(“LTRs”)，启动子(如，CMV启动子，SV40启动子，RSV启动子)，增强子等。当宿主细胞是原核细胞，则细菌病毒即噬菌体是优选的。这样的载体的例子有基于如λ噬菌体的载体。在任何情况下，载体可包括超过一个病毒的元件。
将得到的载体转染或转化进宿主细胞，宿主细胞可以是真核的或原核的。
在本方案中可以利用任何通常用于转染或转化的细胞。优选的材料包括大肠杆菌菌株，CHO细胞如CHO-1，COS细胞如COS-7等。同样，酵母细胞，如糖酵母属菌株，假单胞菌属菌株如绿脓杆菌，芽孢杆菌，已知的昆虫宿主细胞草地粘虫等都可以利用。
一旦受体细胞接受载体，便培养它们，以便表达外源的含蛋白质的分子。本文使用“含蛋白质”是因为原核细胞只表达蛋白质，而众所周知真核细胞具有翻译后修饰蛋白质的能力以便产生如糖蛋白，脂蛋白。同时必须记住的是本文所用的“含蛋白质”也包括肽，如以MHC分子提呈的肽。
下面描述的方法独立于上面描述的方法而发生，在本发明的这两个方面没有时间关系。
在如癌和如自体免疫疾病的病变现象中，存在一些针对与病变相关的分子的免疫反应。这一反应可以包括抗体应答，B细胞增殖，特异T细胞亚群的增殖，细胞因子生产的增加等。在个体的体液如血清中，可以发现与应答相关的分子和细胞。不管所需分子是重组地或是自体产生，免疫效应器都将与其反应。问题在于发现它们，正如实施例显示，这以唯一的途径进行，首先，将体液或其它所需的样品与用于转染或转化的同样的宿主细胞样品反应，在这第一步中，宿主细胞没有被转染或转化，它的结果是去掉任何特异于宿主细胞而不是靶分子的免疫原性结合配体。这一步是必须的，因为正如上面指出的，宿主细胞可以是在一些点上个体已经发展了针对其的免疫应答的细胞，这首先的去杂(stripped)步骤除去了这些免疫成分。
然后进行第二个去杂步骤。在这一步中，将前面去杂的样品与如上所述同样的宿主细胞的样品反应，这时宿主细胞已经用缺少来自个体的cDNA的载体转染或转化。这第二个去杂步骤的原因是本发明人之一所做的观察，在以前面的文献中没有报道。用作载体的材料如噬菌体病毒等是有用的，因为它们天然地感染细胞。所以，λ噬菌体感染寄生在人的较下部的消化道的大肠杆菌。过去没有考虑对大肠杆菌的免疫应答包括这些感染原的应答。所以，通过进行两个去杂步骤，申请人已经获得除去干扰免疫成分到没有先例的程度的惊人能力。正如注意到的，首先是针对未转染或未转化的宿主细胞，其次是针对用不携带cDNA的载体转染或转化的宿主细胞，其中的载体与如上所述用于携带cDNA的载体的免疫学等价。
特别优选的是利用一些相似的但不同的方法进行这些去杂步骤的每一步。例如下面的实验，显示吸收于固体柱，然后吸收于硝酸纤维滤纸。关于为什么利用两个相似但不同的方法得出本文描述的结果，申请人不希望受任何理论的限制。在下文中，应该注意到，本文不论何时用到“接触样品”，它不仅局限于一个接触步骤，而且指超过一个的，优选地是不同的，设计用来从样品中除去干扰结合配体的接触方案。
应该理解的是这些去杂步骤可以完全独立于用于制备cDNA文库的步骤来做。例如，如果在“0”天做抗原的测试，样品的去杂可以在这天之前，一个星期之前等进行。也可以“储存”来自供体或个体的去杂样品为了将来使用。
使用的样品优选地是血清，但不是必须的，任何含有免疫原性结合配体的样品可以这样使用。
在本方法的下一步，将携带cDNA和表达异质蛋白质的裂解的转染细胞与两次去杂处理的样品接触。这一样品应该只含有特异于异质蛋白质并与其结合的免疫成分。如果通过与如活化滤膜，固体柱等等接触已经固定了细胞裂解物，有助于这一结合。但是固相结合不是必要的，因为本领域测定地认为许多可变的测定形式可用于鉴定所需分子。
一旦免疫成分与靶分子结合，进行另一个步骤是如人所愿的，但不是必须的。这一附加步骤包括利用第一个免疫成分的一些结合配体，如携带可鉴定标记的抗-IgG。标记可以是染料，酶，金颗粒，放射性标记，或任何用于免疫测定的标准标记。
一旦进行鉴定，除去免疫成分，留下靶分子。然后利用本领域的任何标准方法研究靶分子。
技术人员将注意该方法也导致与所需分子结合的免疫成分的分离。所以，在本发明的另一个方面，可以分离抗体，如，所需分子的特异结合配体。
根据本发明可以鉴定和分离的另一种免疫成分是胞溶性T细胞(下文中的“CTL”)，该T细胞特异于来自已鉴定分子的肽和与这些肽结合形成复合物的MHC分子的复合物。普遍认可的是CTL应答包括用循环的T细胞表面的T细胞受体(“TCRs”)鉴定MHC分子和肽，通常约为8-12个氨基酸长，最优选为9或10个氨基酸长的复合物。通过与这些“在运动中固定”的复合物结合，TCR发生反应，包括特异于这些复合物的CTL的增殖的一系列反应。利用本发明的方法，加另外的步骤可以生产和/或分离这样的CTL。
正如下面的实施例以及一般的公开物中指出的，可以容易地鉴定编码所需抗原的cDNA。一旦cDNA被鉴定，可以利用它转染在表面已经存在需要的MHC分子的宿主细胞或已经用编码这些MHC分子的DNA转染的宿主细胞。表达所需分子的cDNA，加工该分子成以MHC分子如HLA分子提呈的抗原性肽。从淋巴细胞如自体淋巴细胞得到抗该复合物的CTL。然后由已知的有限稀释技术从应答细胞群得到长寿命的CTL克隆。一旦观察到阳性CTL应答，利用已测定的方法例如，筛选前面鉴定的CTL克隆的特异性的方法，可以鉴定提呈给CTL的特异肽。或者，可以利用更新描述的方法，研究所需分子的序列，鉴定潜在的MHC-结合基序，然后分析这些肽，首先分析与相关MHC分子的结合，然后，如果MHC结合为阳性，分析它们产生识别肽MHC复合物的CTL的能力。当然，利用已知的技术也可以从细胞中洗脱肽并作序列分析。
熟练技术人员也将注意到，可以将所需分子的表达与表达其的特定的宿主细胞联系起来。在这样做的时候，可以提取出表达所需分子的cDNA，将其测序等。该方法的这一方面是本发明的另一特征。
在下面的实施例中将看到本发明的特异实施方案。图1大概地描述了通用的方法。实施例1为了从人组织建立cDNA文库，根据引入本文作为参考的Chomzynski，分析生物化学杂志162156-159(1987)的方法从0.5μg肾清晰的细胞癌得到和确立了总RNA。用寡聚-dT-纤维素从总RNA提取mRNA。利用RNase H和DNA聚合酶I，用Gubler和Hoffmann，基因25263(1983)描述的方法完成了第一条链cDNA的合成。为了适应cDNAKlenow酶，用T4 DNA连接酶将带有EcoRI限制酶位点的衔接头连接到cDNA的末端(Ferretti L和Sgamerella V，核酸研究，93695(1981))。在用酶XhoI限制酶消化后，用Sephacryl 400分离不同长度的cDNA分子并转染进入λZAPII噬菌体载体(Short等人，核酸研究167583(1988))。在与包装提取物连接后，将重组噬菌体DNA包装成噬菌体并用于转染大肠杆菌。对文库滴定得到1.8×106个重组初级克隆。将总的cDNA文库转染进大肠杆菌并扩增，扩增后的cDNA文库的效价是每毫升1011个噬菌斑形成单位(Pfu/毫升)。将这些转染细胞用于下面的实验。实施例2根据本发明上面所述，利用已经完全耗尽了抗来源于天然和裂解性λ噬菌体转染的大肠杆菌的抗原的抗体的人血清完成免疫原性物质的鉴定。为此，如下所述，通过吸收，血清被“去杂”。
在50毫升LB培养基中过夜培养大肠杆菌菌株XL1-Blue的细菌。在光密度OD600＝1.0后，通过离心沉淀细菌。重悬浮于5m毫升磷酸缓冲盐(PBS)中，并用超声波处理形成裂解物。将细菌裂解物结合到活化的琼脂糖的基质上，然后将琼脂糖基质装入柱中，并用于人血清的吸收。将血清在柱中流过10次。
用离心将指数生长期的大肠杆菌XL1-Blue细菌培养物沉淀，用106个没有重组插入物的λZAPII噬菌体在0.01M硫酸镁中转染，并在5毫升LB培养基中温育4小时。以同样于未转染细菌的方式，利用转染的细菌的裂解物使人血清如上所述再通过柱10次。
为了完全耗尽血清，在琼脂平板上培养来自裂解噬菌体转染的大肠杆菌细菌的干扰抗体(10小时，37℃)，并在这一培养步骤后将它们的蛋白质影印到硝酸纤维膜上。之后，将根据上面步骤已经预吸收的血清转移到影印的硝酸纤维膜上并重复吸收过程五次。按照本发明加工的血清中基本上去除了抗来自大肠杆菌和噬菌体的抗原的抗体。实施例3在这些实验中，通过下面步骤鉴定了特异于肾癌的抗原。用来源于所述的cDNA文库的重组噬菌体转染大肠杆菌菌株XL1-Blue，并以每个含有异丙基硫代吡喃型半乳糖苷(“IPTG”)LB培养基的平板有4-5×103个噬菌斑形成单位(PFU)的密度铺板。在37℃温育12小时后，在培养物的顶部放上硝酸纤维膜，再温育培养平板4小时。接着，在有5％奶粉的Tris-缓冲盐(TBS)中温育硝酸纤维膜1小时。在TBS中洗硝酸纤维膜3次后，在TBS/0.5％奶粉(w/v)中以1∶1000稀释根据实施例2得到的去杂的人血清，并温和摇动温育过夜。在与硝酸纤维膜一起温育后，取出血清，保留用于其它试验。在与血清温育后，在TBS中洗涤硝酸纤维膜3次，并与多克隆的碱性磷酸酶缀合的山羊抗人IgG温育1小时。之后，用TBS/0.01％吐温20(v/v)重复洗涤硝酸纤维膜。用溶解于TBS的氮蓝四唑氯化物和溴氯-吲哚-磷酸显色反应，人抗体与表达的蛋白质的结合变成可见的沉积于硝酸纤维膜上的环状的蓝色沉积物。血清的有效预吸收使得能在37℃下显色膜几个小时而不会使由于抗大肠杆菌和噬菌体抗原的抗体引起的背景反应性影响试验的质量。
将阳性克隆定位于琼脂平板上，转移到转染缓冲液中，并用于第二轮转染和亚克隆。总共对1.8×106个重组克隆进行了筛选，鉴定了5个不同的阳性反应克隆。实施例4通过转染以及检测与加工的人血清的反应性的重复循环将按照实施例3得到的阳性克隆，即那些具有来源于加工的人血清结合抗体的克隆，进行亚克隆形成单克隆。通过从λZAPII噬菌体载体体内切除克隆带有相关cDNA插入物的P-bluescript噬菌粒(Hay和Short，Strategies 516-19，1992)并用于转染大肠杆菌SOLR菌株。在修改的Birnboim和Doly，核酸研究杂志71513(1979)的方法中，在用NaOH碱裂解后，从细菌分离质粒。利用M13正向和M13反向寡核苷酸，根据Sanger(Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463(1977))的经典方法序列分析重组质粒的DNA。在核酸和蛋白质数据库(基因库，EMBL，SwissProt)检查得到的DNA序列和产生的氨基酸序列。用内部寡核苷酸继续序列分析cDNA插入物的序列。分析显示与保藏于数据库的任何序列都没有同源性。全长的cDNA克隆称为SK313，已经用RACE方法(Frohman MA，Dush MK，Martin GR，美国科学院院刊858998(1988))克隆了SK313，其在5’末端具有碳酸酐酶功能区。SEQ IDNO1示出了该分子的核酸序列。图2显示了来自这些实验的带有阳性克隆的硝酸纤维膜。实施例5作为这些实验的补充，根据Chomzynski和Sacchi，生化分析162156(1987)的方法从一系列恶性和正常人组织中分离RNA。在变性后，通过电泳在含有1％甲醛的琼脂糖凝胶上分离总的分离的RNA(Goldberg，美国科学院院刊775794(1980))，然后根据已知方法(Seed，核酸研究101799(1982))影印到尼龙膜上。将鉴定的克隆的放射性标记的cDNA插入物用于杂交。根据已知方法(Geoffrey和Berger，Enzymol.152419(1987))进行杂交。用放射自显影和X射线胶片证实相关RNA的存在。分析证明与正常肾相比，在19个肾细胞癌的4个中克隆HOM-RCC-313的mRNA过量表达。在结肠的粘膜组织和正常肾中只发现非常弱的表达。没有证实其它组织中的表达。实施例6为了证明抗按照本发明鉴定的抗原的抗体的发生，分析了来自健康个体和肿瘤病人的血清。为此，如上所述加工这些血清，并去除抗来源于大肠杆菌和噬菌体的抗原的抗体。为了检测特异于抗原的抗体，将来源于反应性克隆的噬菌体与来源于同样的cDNA文库的不反应噬菌体以1∶10的比例混合并如上所述测试与人试验血清中的抗体的反应性。将已经用于抗原鉴定的血清作为阳性克隆，不反应噬菌体作为阴性对照。如果有预期百分数的噬菌体噬菌斑显示阳性反应，则血清样品对于抗原反应性抗体是阳性的。在克隆HOM-RCC-313代表肾细胞癌抗原的情况中，人血清的分析显示只有来自肾细胞癌患者的血清含有反应性抗体。来自健康对照和有其它肿瘤的病人的血清不含有这样的抗体。
用限制酶EcoRI消化从质粒DNA切除克隆HOM-RCC-313的cDNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分离，接着从凝胶提取。然后将该cDNA用于构建表达带有细菌蛋白邻氨基苯甲酸合成酶的融合蛋白的载体。将正确的开放读码框架中的相关片段克隆进pATH质粒载体(Koerner等，Meth.Enzymol.194477(1991)。在如上所述将质粒转化进菌株BL21的大肠杆菌中(spindler等，J.Virol.49132(1984))后，得到蛋白质表达的诱导。将表达的融合蛋白用SDS凝胶电泳分离，从凝胶上切下，洗脱并冷冻干燥。用溶解于弗氏佐剂的100μg冷冻干燥物皮下注射免疫接种兔。用不完全弗氏佐剂以2星期的间歇重复免疫接种3次。从兔子中取血，得到抗血清。以如上所述的方式去除得到的抗血清中与大肠杆菌和噬菌体反应的抗体，并如对人血清所述测试其与肾癌抗原的反应性。以1∶＞100，000的稀释度测试反应性。实施例7利用从患有(i)恶性黑素瘤，(ii)星型细胞瘤，和(iii)霍奇金病的不同个体取出的活体解剖组织继续前面实施例中阐述的方案。下面的表1概括了结果，包括上面实施例1-6陈述的关于肾癌研究得到的那些结果。
表1 自体血清与来源于人肿瘤cDNA的重组克隆的抗体反应性。用病人自体血清筛选cDNA文库，将阳性克隆亚克隆形成单克隆。用质粒引物扩增来自每个克隆的插入物，并通过琼脂糖凝胶电泳分离。通过与相关的插入物杂交进行Southern 印迹肿瘤测试的克隆 阳性克隆 不同的插入物恶性黑素瘤 1.0×10640 10肾细胞癌1.8×1067 5星型细胞癌 1.2×10649 5霍奇金病1.0×10614 4对不同插入物的分析显示黑素瘤细胞表达已知的肿瘤排斥抗原前体MAGE-1(参见van der Bruggen等，科学2541643-7(1991)，引入本文作为参考)，以及一个新抗原。SEQ ID NO2阐述了该抗原的部分cDNA序列。
当星型细胞瘤研究完成时，观察到的插入物似乎对应于以前描述的Tegt基因(Old，癌症41361-375(1981)，引入本文作为参考)。
当霍奇金病研究完成时，用标准方法分离了一个以前未知的抗原，在文库中鉴定了编码它的cDNA。该抗原是新观察到的，类似凝集素结构，其cDNA的一部分已经在SEQ ID NO3中阐述。同时观察到的是抗Bilbe等，EMBO J 112103-13(1992)描述的休眠素的抗体。这是中间纤丝相关蛋白，已经显示它的表达限于霍奇金病和Reed-Sternberg细胞以及培养的单细胞。实施例8进行抗实施例1-7所述抗原的抗体的发生的进一步研究。表2概括了这些测定。在这些研究中，将来自阳性克隆的噬菌体与不反应噬菌体混合(比例1∶10)，然后用于转染细菌(大肠杆菌)。在如上所述的酶联免疫吸附测定(ELISA)中利用病人血清的稀释液(1∶200)。“HOM-MEL-40”指新的黑素瘤抗原(SEQ ID NO2)，而“HOM-MEL-55”指MAGE-1(van der Bruggen等，如上所述)。“HOM-RCC3.1.3”是SEQ ID NO1的肾癌抗原。“HOM-GLO-30.2.1”指以前鉴定的星型细胞瘤相关抗原，“HOM-HD-21”指SEQ ID NO3的新的类凝集素抗原，“HOM-HD-397”是以前鉴定的休眠素抗原。
表2 抗人肿瘤抗原的体液免疫应答，将来自阳性克隆的噬菌体与cDNA文库的不反应的噬菌体以1∶10的比例混合并用于转染细菌。用利用血清的酶联分析检测克隆的IgG抗体。n.t.＝未测试抗原 HOM-MEL-40+HOM-MEL.-55 HOM-ROC-3.1.3+ HOM-GLIO-30.2.1 HOM-HD-21+ HOM-HD-397相同/同源性 MAGE-1 CAH-类似物tegt 凝集素-类似物休眠素黑素瘤病人2/11 4/11 n.t. n.t. n.t.n.t.肾癌病人 0/80/8 2/14 0/7 0/7 5/7星形细胞瘤病人0/10 0/10 0/11 2/13 0/117/11霍奇金病人0/10 0/10 0/17 0/17 10/18 14/17健康对照 0/12 0/12 0/15 0/20 0/1712/17
只在患有同样类型肿瘤的病人的血清中检测到抗除了休眠素以外的肿瘤抗原的抗体(尽管各有差别)的事实表明肿瘤生长对于发展抗肿瘤抗原的体液应答是必要的。
在健康对照中存在休眠素的原因不清楚。可以推测可以防止抗有关的抗原的耐受性的发生，因为抗原可以有与另一个抗原类似的序列，供体可以有恶化前细胞，或在非恶性状态如病毒感染或其它炎症过程下在正常细胞中抗原可以被激活。实施例9为了测定本文所述的新鉴定抗原的表达方式，利用各种人组织进行Northern印迹分析。
用熟知的Chomzynski等，如上所述的异硫氰酸胍/酚/氯仿方法，从组织样品(肿瘤和正常组织)中提取RNA。通过在福尔马林/MOPS凝胶中的电泳检查RNA的完整性。然后，将每泳道含40μg RNA的凝胶影印到尼龙膜上。然后用SEQ ID NO1，2或3的cDNA探测这些Northern印迹。在42℃，有甲酰胺时，与32p标记的探针杂交。在65℃，在1×SSC，0.2％SDS中洗涤滤膜，并曝光16小时。这些是下文定义的“严格条件”。在曝光后，洗涤滤膜，与GAPDH再杂交。
表3概括了这些结果。
表3 各种组织中肿瘤抗原的表达方式(选择)。用与GAPDH杂交相匹配的来自肿瘤和正常人组织的RNA样品进行Northern印迹分析。在放射自显影的显象密度分析后计算表达率。患病组织的正常对应物得到的信号定为1。n.t.＝没有测试。抗原HOM-MEL-4C+HOM-RCC-3.1.3+HOM-GLIO-30.2.1 HOM-HD-21+相同/同源性 CAH-类似物Tegt 凝集素类似物肾 -1 1.5 -脑 -n.t. 1 n.t.扁桃体 -- 1 1胃 -- 1.5 -结肠粘膜 -0.2 1.5 -乳腺 -- 1.0 -肾癌 在4/19情况中＞5n.t. - -在15/19情况中≤1霍奇金病 n.t. - n.t. ＞10星型细胞瘤 n.t. n.t. 在8/12中＞5 -在4/12中为1黑素瘤 ++ - n.t. -
正如将看到的，与新黑素瘤相关的抗原在黑素瘤而不是其它组织中强烈表达。类似碳酸酐酶的抗原在约20％的肾细胞癌中强烈表达，在正常肾组织中仅微弱表达。与正常脑组织相比Tegt在8/12的星型细胞瘤组织中过量表达。与正常扁桃体相比，在患病扁桃体中与霍奇金病相关的类似凝集素分子的mRNA增加约10倍，表明过量表达可能是引发自体B细胞应答的蛋白质的常见特征。实施例10对HOM-MEL-40序列进行了进一步的研究。利用标准的遗传分析技术，证明HOM-MEL-40的mRNA的5’区含有酪氨酸激酶的结合区。这表明HOM-MEL-40可以作为受体。该RNA的3’部分与“SSX”(一个已知参与滑膜肿瘤的SYT-SSX易位的分子)的RNA分子相同。实施例11同时进行了其它实验研究HOM-MEL-40。标准的Northern印迹显示，除了睾丸，HOM-MEL-40在正常组织中不表达。相反，它在50％的黑素瘤，20％的前列腺癌，20％的胃癌，26％的结肠直肠癌，12％的肺癌和20％的乳腺癌和肝细胞癌中表达。它也在1/10的胃癌，和1/5的甲状腺癌中发现。
进行的其它Western印迹工作显示抗HOM-MEL-40的抗体存在于测试的89个黑素瘤病人中的10个中，而在49个健康男性个体中只有3个存在该抗体。
在另一个研究中，观察到HLA-A2阳性肿瘤细胞提呈来源于HOM-MEL的九聚物。这表明HOM-MEL-40特异疫苗用于诱导CTL是可能的。实施例12在前面的实施例中描述的噬菌体测试不适于筛选大量的血清样品。为了大量筛选，开发了修改的标准Western印迹分析。这一变化是根据本文描述的组氨酸标记的重组HOM-MEL-40。
利用pfu聚合酶，在从黑素瘤组织制备的质粒cDNA上将HOM-MEL-40扩增20个循环以上。所用的寡核苷酸引物是5’-GCCAAATACTTCTCTAAGGAAGAGTGG-3’(SEQ ID NO4)；(有义)5’-TTCACTGTTGTGAACACTTGCTTTCAC-3’(SEQ ID NO5)；(反义)在95℃/1分钟；60℃/1分钟；和72℃/1分钟，接着最后延伸72℃10分钟进行聚合酶链式反应(PCR)。利用已知技术凝胶纯化扩增产物，然后将其在读框中连接到SmaI消化的去磷酸化的并凝胶纯化的pQE32载体。这导致产生在N-末端具有6个组氨酸分子的“尾巴”的融合蛋白质。
然后将该构建体转化进大肠杆菌SG13009(pREP4)菌株中，接着在含有卡那霉素和氨苄青霉素的平板上选择。挑出单个菌落，用2mM异丙基硫半乳糖苷(IPTG)诱导它们小规模地表达，这使得能检查蛋白质的表达。然后对每种克隆在Ni-NTA柱上进行小规模纯化。
鉴定了一个表达预期长度的蛋白质的克隆。利用已知技术分离该克隆，进行序列分析，证明是HOM-MEL-40。在鉴定后，进行重组蛋白质的大规模诱导。具体地说，用2mM IPTG诱导细胞，在5小时后收获，与含8M脲，100mM Na2PO4，10mM Tris-HCl(pH8)，0.01％Triton X的缓冲液混合过夜裂解细胞。离心所有细胞碎片，将上清液加到预平衡的Ni-NTA树脂上，用2倍体积的前面提到的pH8的缓冲液，然后用至少10倍体积的pH6.3的缓冲液进行洗涤，然后用本文描述的缓冲液，加250mM咪唑洗脱蛋白质。每升细菌培养物的组氨酸标记蛋白质的产量范围为15-40mg。
然后利用组氨酸标记蛋白质进行Western印迹。在这些测试中，将5μg作为内部阴性对照的重组组氨酸标记的蛋白质与2×SDS样品缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH6.8，0.2M二硫苏糖醇，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)混合，然后在12％SDS-PAGE中电泳，接着利用半干转移影印到尼龙膜上。
在用5％溶解于PBS的低脂肪牛奶封闭任何非特异结合(1小时)后，用来自肿瘤病人或健康对照的1∶100稀释的血清温育膜。然后用碱性磷酸酶缀合的鼠抗人IgG温育印迹1小时。然后连续地用兔抗鼠IgG(30分钟)，抗碱性磷酸酶，然后0.25mg/毫升碱性磷酸酶温育膜。在每个温育步骤之后，用TBS和0.1％吐温充分洗涤膜。用5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)，和氮蓝四唑染色进行观察。在观察者对样品状态未知时，以任意顺序(健康/黑素瘤阳性)分析血清。所有分析重复进行。
印迹分析在SDS-PAGE上显示了分子量约为24kD的产物，与根据推测的氨基酸序列计算的分子量21.6kD一致。
对89个黑素瘤样品，6个卵巢癌样品，和10个肾癌样品进行了如上所述的免疫印迹试验。其中11个黑素瘤样品，1个卵巢癌样品，和3个肾细胞癌样品是阳性。来自患有结肠直肠癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，或胰腺癌的个体的血清是阴性。同时分析了总共41个健康对照，其中3个是阳性。然后如上所述利用噬菌体测试对在Western印迹中反应的所有血清以及20个阴性血清样品重新评价。在11个黑素瘤病人中的10个和阳性卵巢癌病人中证实了反应性。肾细胞癌病人和健康对照是阴性，并且在Western印迹中是所有阴性的样品。
有16个黑素瘤病人提供了血清和肿瘤样品。发现肿瘤表达HOM-MEL-40可以和样品中的抗体反应性相比。正如将在下面的表中所见，16个病人中8个有HOM-MEL-40阳性肿瘤，但在它们的血清中只有3个有抗抗原的抗体。在HOM-MEL-40阴性肿瘤病人的血清中没有检测到抗体。实施例13引入本文作为参考的Rammensee等，免疫遗传学41178-228(1995)公开了许多与HLA-2.1结合的肽，其中一些也引起CTL增殖。这些肽中的一些的通式为XaaLeu(Xaa)6(Ile，Leu，Val)(SEQ IDNO6)。筛选HOM-MEL-40的推导的氨基酸序列中可以作为HLA-A2.1结合物/CTL刺激物的序列，发现了下列序列Arg Leu Gln Gly Ile Ser Pro Lys Ile (SEQ ID NO7)；Arg Leu Arg Glu Arg Lys Gln Leu Val (SEQ ID NO8)；Lys Ile Gln Lys Ala Phe Asp Asp Ile (SEQ ID NO9)利用熟知的技术和Fmoc保护的氨基酸合成这些肽。利用葡聚糖凝胶G25，接着在C-18柱上的反相HPLC纯化肽。将缺乏与抗原提呈相关的转运蛋白的T2细胞(DeMars等，美国科学院院刊828183-8187(1985)；Slater等，免疫遗传学21235-241(1990))如下用于肽结合测试。在存在或没有100μM HOM-MEL-40肽时，将5×105个T2细胞的样品在37℃温育4小时。阳性对照是来源于EBVLMP2的肽Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val(SEQ ID NO10)和起源于HIV逆转录酶的肽Ile Leu Lys Glu Pro Val Gly Val (SEQ ID NO11)。用抗-HLA-A2.1特异性单克隆抗体(即，BB7.2)标记，接着用FITC缀合山羊抗鼠抗体温育测量HLA2.1对T2细胞的正调节。用流式细胞计数分析样品，由比例
得到HLA-A2.1的正调节。可以看到三个肽中的每个均与HLA-A2.1结合，如FACS分析测定，其中SEQ ID NO8显示最强的HLA-A2.1正调节。
正如前面显示，本发明涉及测定或分离免疫反应物质的方法。如本文所用“免疫反应物质”指任何在产生它的个体中引起一些形式的免疫应答的物质，该应答可以是B细胞或T细胞应答。这样的免疫反应物质包括蛋白质，肽，糖蛋白，脂蛋白，含肽复合物(例如，MHC/肽复合物)，抗体等。为了测定这些物质，利用熟知的标准方法从个体的细胞中制备cDNA文库。然后将该cDNA插入适当的载体，如真核细胞特异性病毒或噬菌体(即，细菌病毒)，形成转染/转化文库，然后将该文库掺入宿主细胞。处理宿主细胞以便它们表达它们所接受的文库成份(克隆的cDNA)，然后裂解宿主细胞，以便得到表达物质作进一步的处理。
然后将裂解物质与确信含有免疫反应物质的免疫原结合配体的“去杂”样品接触。本文所用的“免疫原结合配体”是指任何与免疫系统相关的物质，该物质与靶即免疫反应物质结合。这样的结合配体包括，但不限于，抗体，T细胞，细胞因子，配体，受体等，以及这些分子截短的部分，互补核酸分子等。注意对于这些成分中的一些，如T细胞，需要包括本文阐述的步骤在内的进一步步骤。
如上所指，去杂样品已经与(i)未转染或未转化宿主细胞，和(ii)用不含有适当cDNA的载体转染或转化的宿主细胞接触处理。
去杂样品可用于鉴定表达物质的结合配体，因为通过本文所述的吸收步骤已经除去了否则将干扰预期的特异免疫反应的许多免疫成分。
在表达物质的鉴定后可以接着分离编码它的cDNA。可以在置于含有宿主细胞的菌落的培养皿上的膜如硝酸纤维膜上刺孔，然后利用免疫反应，在固相上显示位置。每个菌落是基于有限的cDNA转染，从而简化了相关的cDNA的分离和鉴定。
本发明也涉及编码与特定状态相关的分子的SEQ ID NO1，2或3所示的分离的核酸分子。除了它们作为编码物质的作用，这些分子也可以用作鉴定表达相关抗原的细胞的探针，因为已经显示这些cDNA分子(SEQ ID NO1，2和3)是基于转译成抗原的mRNA。
本发明还包括分离的核酸分子，其互补序列与SEQ ID NO1，2或3中的一个杂交，其编码与SEQ ID NO1，2或3编码的蛋白质等价的蛋白质。本文所用的“严格条件”指至少如在50μl/cm23.5×SSC，1×Denhardt溶液，25mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)，利用32P-标记探针，在65℃杂交18小时，接着洗涤4次(每次洗涤1小时，65℃，2×SSC，0.1％SDS)，和最后在1.0×SSC，0.2％SDS中洗涤30分钟。如果需要，最后的洗涤可以变化到0.5×SSC到0.2×SSC，或甚至0.1×SSC，并且SDS可以降低到0.1％以增强严格性。
本发明还包括那些与肿瘤抗原相关的肽，如与HLA-A2.1分子结合从而引起胞溶性T细胞导致的溶解的SEQ ID NO7，8和9所示的那些肽。本发明还包括通式为Xaa Leu Xaa7，(SEQ ID NO12)的肽，其中第六个氨基酸残基是Ser，Lys或Phe，第九个氨基酸残基是Val或Ile。这些分子也可以非常简单地作为HLA-A2.1细胞的标记，因为众所周知，肽/MCH复合物的形成是非常特异的。
本发明的其它特征对于技术熟练人员将是明了的，不需要在这里重复说明。
已经使用的术语和表达法被用作说明性的术语并不受限制，使用这些术语和表达法不排除所示和所述的特征的等价物及其部分，应该认识到在本发明的范围内各种修改是可能的。序列表(1)一般资料(i)申请人米夏埃尔·普夫罗因德舒；汉斯-格奥尔格·拉门赛(ii)发明名称鉴定或分离分子的方法和由此鉴定的分子(iii)序列数目13(iv)通信地址(A)收信人Felfe和Lynch(B)街道805第三大道(C)城市纽约市(D)州纽约(E)邮政编码10022(v)计算机可读形式(A)介质类型磁盘，3.5英寸，360kb存储量(B)计算机IBM(C)操作系统PC-DOS(D)软件Wordperfect(vi)当前申请数据(A)申请号08/644,116(B)申请日1996年5月10日(C)分类435(vi)在先申请数据(A)申请号08/580,980(B)申请日1996年1月3日(vii)在先申请数据(A)申请号08/479,328(B)申请日1995年6月7日(viii)律师/代理人资料(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)登记号30，946(C)档案号LUD 5410.2(ix)电讯资料(A)电话(212)688-9200(B)电传(212)838-3884
(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度2679个碱基对(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO1CGCGAAGATG CCCCGGCGCA GCCTGCACGC GGCGGCCGTG CTCCTGCTGG50TGATCTTAAA GGAACAGCCT TCCAGCCCGG CCCCAGTGAA CGGTTCCAAG 100TGGACTTATT TTGGTCCTGA TGGGGAGAAT AGCTGGTCCA AGAAGTACCC 150GTCGTGTGGG GGCCTGCTGC AGTCCCCCAT AGACCTGCAC AGTGACATCC 200TCCAGTATGA CGCCAGCCTC ACGCCCCTCG AGTTCCAAGG CTACAATCTG 250TCTGCCAACA AGCAGTTTCT CCTGACCAAC AATGGCCATT CAGTGAAGCT 300GAACCTGCCC TCGGACATGC ACATCCAGGG CCTCCAGTCT CGCTACAGTG 350CCACGCAGCT GCACCTGCAC TGGGGGAACC CGAATGACCC GCACGGCTCT 400GAGCATACCG TCAGCGGACA GCACTTCTCC GCCGAGCTGC ACATTGTCCA 450TTATAACTCA GACCTTTATC CTGACGACAG NACTGCCAGC AACAAGTCAG 500AAGACCTCGC TGTCCTGGGT GCTCTCATTG AGATGGGCTC CTTCAATCCG 550TCCTATGACA AGATCTTCAG TCACCTTCAA CATGTAAAGT ACAAAGGCCA 600GGAAGCATTC GTCCCGGGAT TCAACATTGA AGAGCTGCTT CCGGAGAGGA 650CCGCTGAATA TTACCGCTAC CGGGGGTCCC TGATCACACC CCCTTGCAAC 700CCCACTGTGC TCTGGACAGT TTTCCGAAAC CCCGTGCAAA TTTCCCAGGA 750GCAGCTGCTG GCTTTGGAGA CAGCCCTGTA CTGCACACAC ATGGACGACC 800CTTCCCCCAG AGAAATGATC AACAACTTCC GGCAGGTCCA GAAGTTCGAT 850GAGAGGCTGG TATACACCTC CTTCTCCCAA GTGCAAGTCT GTACTGCGGC 900AGGACTGAGT CTGGGCATCA TCCTCTCACT GGCCCTGGCT GGCATTCTTG 950GCATCTGTAT TGTGGTGGTG GTGTCCATTT GGCTTTTCAG AAGGAAGAGT 1000ATCAAAAAAG GTGATAACAA GGGAGTCATT TACAAGCCAG CCACCAAGAT 1050GGAGACTGAG GCCCACGCTT GAGGTCCCCG GAGCTCCCGG GCACATCCAG 1100GAAGGACCTT GCTTTGGACC CTACACACTT CGGCTCTCTG GACACTTGCG 1150ACACCTCAAG GTGTTCTCTG TAGCTCAATC TGCAAACATG CCAGGCCTCA 1200GGGATCCTCT GCTGGGTGCC TCCTTGTCTT GGGACCATGG NCACCCCAGA 1250GCCATCCGAT CGATGGATGG GATGCACTCT CAGACCAAGC AGCAGGAATT 1300CAAAGCTGCT TGCTGTAATT GTGTGAGATT GTGAAGTGGT CTGAATTCTG 1350GAATCACAAA CCAACCATGC TGGTGGGCCA TTAATGGTTG GAAAACACTT 1400CCATCCGGGG CTTTGCCAGA GCGTGCTTTC AAGTGTCCTG GAAATTCTGC 1450TGCTTCTCCA AGCTTTCAGA CAAGAATGTG CACTCTCTGC TTAGGTTTTG 1500CTTGGGAAAC TCAACTTCTT TCCTCTGGAG ACGGGACATC TCCCTCTGAT 1550TTCCTTCTGC TATGCAAAAC CTTTAATCTG CACCTTACAN ACTCGGGGAC 1600AAATGGGGAC AGGAAGGATC AAGTTGTAGA GNAGAAAAAG AAAACAAGAG 1650ATATACATTG TGATATATAT TAGGGACACT TTCACAGTCC TGTCCTCTGG 1700ATCACAGACA CTGCACAGAC CTTAGGGAAA TGGCAGGTTC AAAGTTCCAC 1750TTCTTGGTGG GGATGAGAAG GGAGAGAGAG CTAGAGGGAC AAAGAGAATG 1800AGAAGACATG GATGATCTGG GAGAGTCTCA CTTCGGAATC AGAATTGGAA 1850TCACATTCTG TTTATCAAGC CATAATGTAA GGACAGAATA ATACAATAAT 1900AAGTCCAAAT CCAACCTCCT GTCAGTGGAA CAGTTATGTT TTATACTCTA 1950CAGATTTTAC AAATANATGA GGCTNGTTCC TTGAAAANTG TGTTGNNTTG 2000CTGTNGTCCN NTGGAGGAGA CATGAGTTCC GAGATGACCA ACTCNNGCNT 2050TGNATNCTNG GAGGNAATAN GGCAGAACCA AAATGACTGT AGAACTTATT 2100CTCTGTAGGC CAAATTTCAT TTCAGCCACT TCTGCAGGAT CCTACTGCCA 2150ACCTGGAATG GAGACTTTTA TCTACTTCTC TCTCTCTGAA GATGTCAAAT 2200CGTGGTTTAG ATCAAATATA TTTCAAGCTA TAAAAGCAGG AGGTTATCTG 2250TGCAGGGGGC TGGCATCATG TATTTAGGGG CAAGTAATAA TGGAATGCTA 2300CTAAGATACT CCATATTCTT CCCCGAATCA CACAGACAGT TTCTGACAGG 2350CGCAACTCCT CCATTTTCCT CCCGCAGGTG AGAACCCTGT GGAGATGAGT 2400CAGTGCCATG ACTGAGAAGG AACCGACCCC TAGTTGAGAG CACCTTGCAG 2450TTCCCCGAGA ACTTTCTGAT TGCACAGTCT CATTTTGACA GCATGAAATG 2500TCCTCTTGAA GCATAGCTTT TTAAATATCT TTTTCCTTCT ACTCCTCCCT 2550CTGACTCTAG GAATTCTCTC TTCTGGAATC GCTTGAACCC AGGAGGCGGA 2600GGTTGCAGTA AGCCAAGGTC ATGCCACTGC ACTCTAGCCT GGGTGACAGA 2650GCGAGACTCC ATCTCAAAAA AAAAAAAAA 2679(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度931个碱基对(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO2ACTTTCTCTC TCTTTCGATT CTTCCATACT CAGAGTACGC ACGGTCTGAT 50TTTCTCTTTG GATTCTTCCA AAATCAGAGT CAGACTGCTC CCGGTGCCAT 100GAACGGAGAC GACGCCTTTG CAAGGAGACC CACGGTTGGT GCTCAAATAC 150CAGAGAAGAT CCAAAAGGCC TTCGATGATA TTGCCAAATA CTTCTCTAAG 200GAAGAGTGGG AAAAGATGAA AGCCTCGGAG AAAATCTTCT ATGTGTATAT 250GAAGAGAAAG TATGAGGCTA TGACTAAACT AGGTTTCAAG GCCACCCTCC 300CACCTTTCAT GTGTAATAAA CGGGCCGAAG ACTTCCAGGG GAATGATTTG 350GATAATGACC CTAACCGTGG GAATCAGGTT GAACGTCCTC AGATGACTTT 400CGGCAGGCTC CAGGGAATCT CCCCGAAGAT CATGCCCAAG AAGCCAGCAG 450AGGAAGGAAA TGATTCGGAG GAAGTGCCAG AAGCATCTGG CCCACAAAAT 500GATGGGAAAG AGCTGTGCCC CCCGGGAAAA CCAACTACCT CTGAGAAGAT 550TCACGAGAGA TCTGGACCCA AAAGGGGGGA ACATGCCTGG ACCCACAGAC 600TGCGTGAGAG AAAACAGCTG GTGATTTATG AAGAGATCAG CGACCCTGAG 650GAAGATGACG AGTAACTCCC CTCAGGGATA CGACACATGC CCATGATGAG 700AAGCAGAACG TGGTGACCTT TCACGAACAT GGGCATGGCT GCGGACCCCT 750CGTCATCAGG TGCATAGCAA GTGAAAGCAA GTGTTCACAA CAGTGAAAAG 800TTGAGCGTCA TTTTTCTTAG TGTGCCAAGA GTTCGATGTT AGCGTTTACG 850TTGTATTTTC TTACACTGTG TCATTCTGTT AGATACTAAC ATTTCATTGA 900TGACGAAGAC ATACTTAATC GATATTTGGT T 931
(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度1692个碱基对(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO3GATCCCCCGG GCTGCAGGAA TTCGGCACGA GCAAAGGACT TCCTAGTGGG50TGTGAAAGGC AGCGGTGGCC ACAGAGGCGG CGGAGAGATG GCCTTCAGCG 100GTTCCCAGGC TCCCTACCTG AGTCCAGCTG TCCCCTTTTC TGGGACTATT 150CAAGGAGGTC TCCAGGACGG ACTTCAGATC ACTGTCAATG GGACCGTTCT 200CAGCTCCAGT GGAACCAGGT TTGCTGTGAA CTTTCAGACT GGCTTCAGTG 250GAAATGACAT TGCCTTCCAC TTCAACCCTC GGTTTGAAGA TGGAGGGTAC 300TTGGTGTCCA ACACGAGGCA GAACGGAAGC TGGGGGCCCG AGGAGAGGAA 350GACACACATG CCTTNCCAGA AGGGGATGCC CTTTGACCTC TGCTTCCTGG 400TGCAGAGCTC AGATTTCAAG GTGATGGTGA ACGGGATCCT CTTCGTGCAG 450TACTTCACAT CTCGTCATGC CCTGTCCACC GTTGTGGACA CCATCTCCGT 500CAATGGCTCT GTGCAGCTGT CCTACATCAG CTTCCAGCCT CCCGGCGTGT 550GGCCTGCCAA CCCGGCTCCC ATTACCCAGA CAGNNNTCAT CCACACAGTN 600GCAGAGCGCC CNCTGGACAG ATGTCTCTAC TCCCGCCATC CCACCTATGA 650TGTACCCCCA CCCCGCCTAT CCGATGCCTT TCATCACCAC CATTCTGGGA 700GGGCTGTACC CATCCAAGTC CATCCTCCTG TCAGGCACTG TNCTGCCCAG 750TGCTCANGAG GTTCCACATC NAACCTGTGC NCTGGGAACC ACATCGCCTT 800CCACCTGAAC CCCCGTTTTG ATGAGAATGC TGTGGTCCGC AACACCCAGA 850TCGACAACTC CTGGGGGTCT CAGGAGCGAA GTCTGCCCCG AAAAATGCCC 900TTCGTCCGTG GCCAGAGCTT CTCAGTGTGG ATCTTGTGTG AAGCTCACTG 950CCTCAAGGTG GCCGTGGATG GTCAGCACCT GTTTGAATAC AACCATCGCC 1000TGAGGAACCT GCCCACCATC AACAGACTGG AAGTGGGGGG CGACATCCAG 1050CTGACCATGT GCAGACATAG GCGGCTTCCT GGCCCTGGGG CCGGGGGCTG 1100GGGTGTGGGG CAGTCTGGGT CCTCTCATCA TCCCCACTTC CCAGGCCCAG 1150CCTTTCCAAC CCTGCCTGGG ATCTGGGCTT TAATGCAGAG GCCATGTCCT 1200TGTCTGGTCC TGCTTCTGGC TACAGCCACC CTGGAACGGA GAAGGCAGCT 1250GACGGGGATT GCCTCCTCAG CCGCAGCAGC ACCTGGGGCT CCAGCTGCTG 1300GAATCCTACC ATCCCAGGAY GCAGGCACAG CCAGGGAGAG GGGAGGNGTG 1350GGCAGTGAAG ATGAAGCCCC ATGCTCAGTC CCCTCCCATC CCCCACGCAG 1400CTCCACCCCA GTCCCAAGCC ACCAGCTGTC TGCTCCTGGT GGGAGGTGGC 1450CTCCTCAGCN CCTCCTCTCT GACCTTTAAC CTNACTCTCA CCTTGCACCG 1500TGCACCAACC CTTCACCCCT CCTGGAAAGC AGGCCTGATG GCTTCCCACT 1550GGCCTCCACC ACCTGACCAG AGTGTTCTCT TCAGAGGACT GGCTCCTTTC 1600CCAGTGTCCT TAAAATAAAG AAATGAAAAT NCTTGTTGGC AAAAAAAAAA 1650AAAAAAAAAC TCGAGGGGCN NCCCNGTACC CAATTCGCCC TA 1692
(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度1240个碱基对(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO4ATCTGCAGAA TTCGGCTTCG ATCTAGAACT AGTGGATCCC CCGGGCTGCA50GGAATTCGGC ACGAGCGGTT CCAAGTGGAC TTATTTTGGT CCTGATGGGG 100AGAATAGCTG GTCCAAGAAG TACCCGTCGT GTGGGGGCCT GCTGCAGTCC 150CCCATAGACC TGCACAGTGA CATCCTCCAG TATGACGCCA GCCTCACGCC 200CCTCGAGTTC CAAGGCTACA ATCTGTCTGC CAACAAGCAG TTTCTCCTGA 250CCAACAATGG CCATTCAGTG AAGCTGAACC TGCCCTCGGA CATGCACATC 300CAGGGCCTCC AGTCTCGCTA CAGTGCCACG CAGCTGCACC TGCACTGGGG 350GACCCGAAT GACCCGCACG GCTCTGAGCA TACCGTCAGC GGACAGCACT 400TCTCCGCCGA GCTGCACATT GTCCATTATA ACTCAGACCT TTATCCTGAC 450GACAGNACTG CCAGCAACAA GTCAGAAGAC CTCGCTGTCC TGGGTGCTCT 500CATTGAGATG GGCTCCTTCA ATCCGTCCTA TGACAAGATC TTCAGTCACC 550TTCAACATGT AAAGTACAAA GGCCAGGAAG CATTCGTCCC GGGATTCAAC 600ATTGAAGAGC TGCTTCCGGA GAGGACCGCT GAATATTACC GCTACCGGGG 650GTCCCTGATC ACACCCCCTT GCAACCCCAC TGTGCTCTGG ACAGTTTTCC 700GAAACCCCGT GCAAATTTCC CAGGAGCAGC TGCTGGCTTT GGAGACAGCC 750CTGTACTGCA CACACATGGA CGACCCTTCC CCCAGAGAAA TGATCAACAA 800CTNCCGGCAG GTCCAGAAGT TCGNTGAGAG GCTGGTATAC ACCTCCTTCT 850CNCAAGTGCA AGTCTGTACT GCGGCAGGAC TGAGTCTGGG CATCATCCTC 900TCACTGGCCC TGGCTGGCAT TCTTGGCATC TGTATTGTGG TGGTGGTGTC 1000CATTTGGCTT TTCAGAAGGA AGAGTANCCC CNAAAGGTGA TAACAAGGGA 1050GTCATTTACA AGCCANCCAC CAAGATGGAG ACTGAGGCCC ACGCTTGAGG 1100TCCCCGGAGC TCCCGGGCAC ATCCAGGAAG GACCTTGCTT TTGGACCCTA 1150CACACTTCGG CTCTCTGGAC ACTTGCGACA CCTCAAGGTG TTCTCTGTAG 1200CTCAATCTGC AAACATGCCA GGCCTCAGGG ATCCTCTGCT 1240(2) SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ IDNO5GCCAAATACT TCTCTAAGGA AGAGTGG27(2)SEQ ID NO6的信息
(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO6TTCACTGTTG TGAACACTTG CTTTCAC27(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ IDNO7Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa5(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO8Arg Leu Gln Gly Ile Ser Pro Lys Ile5(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO9Arg Leu Arg Glu Arg Lys Gln Leu Val5
(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO10Lys Ile Gln Lys Ala Phe Asp Asp Ile5(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO11Cys Leu Gly Gly Leu Leu Thr Met Val5(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO12Ile Leu Lys Glu Pro Val Gly Val5(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ix)特征第六个氨基酸是Ser，Lys或Phe，第九个氨基酸是Val或Ile(xi)序列描述SEQ ID NO13Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa权利要求
1.与HLA-A2.1分子结合的分离的九肽，具有通式Xaa Leu Xaa7，其中第六个氨基酸残基是Ser，Lys或Phe，第九个氨基酸残基是Val或Ile。
2.根据权利要求1所述的分离的九肽，选自SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，和SEQ ID NO9。
3.根据权利要求1所述的分离的九肽，是SEQ ID NO7。
4.根据权利要求1所述的分离的九肽，是SEQ ID NO8。
5.根据权利要求1所述的分离的九肽，是SEQ ID NO9。
6.SEQ ID NO1的核酸分子编码的分离的蛋白质。
7.筛选可能存在的肿瘤相关蛋白质的方法，包括将样品与SEQID NO4和SEQ ID NO5中的至少一个接触，并且测定SEQ IDNO4或SEQ ID NO5与靶的杂交，从而确定在所述样品中存在与所述肿瘤相关的抗原。
8.根据权利要求7所述的方法，包括将所述样品与SEQ IDNO4和SEQ ID NO5接触。
9.根据权利要求8所述的方法，包括聚合酶链式反应。
10.测定个体产生的免疫反应性物质的方法，包括(a)产生取自所述个体的细胞的cDNA文库，(b)将所述的cDNA文库插入载体中，(c)将所述载体转染进宿主细胞产生转染的宿主细胞，(d)培养所述的转染的宿主细胞以表达所述免疫反应性物质，(e)裂解所述转染宿主细胞以形成裂解物，(f)将含有所述免疫反应物质的免疫原性结合配体的样品与裂解的未转染的宿主细胞的样品接触，以便从所述样品中除去任何特异于所述未转染宿主细胞的免疫原性结合配体，以产生去杂样品，(g)将所述去杂样品与转染的宿主细胞的裂解的样品接触，以便除去特异于所述载体的任何免疫反应性结合配体，从而产生两次去杂的样品，其中所述的宿主用不含有任何cDNA的载体转染，该载体相同于插入所述cDNA的载体。(h)将两次去杂的样品与(f)的裂解物接触，从而结合任何特异于所述免疫反应性结合配体的免疫反应性结合配体，和(i)测定(h)中的结合以测定所述的免疫反应性物质。
11.根据权利要求10所述的方法，进一步包括鉴定表达所述免疫反应性物质的转染的宿主细胞，和分离其中所含的cDNA。
12.根据权利要求10所述的方法，进一步包括除去任何免疫反应性结合配体以便分离特异于所述物质的免疫反应性结合配体。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述病毒载体是基于真核病毒的载体。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述病毒载体是噬菌体载体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述噬菌体是λ噬菌体。
18.根据权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。
19.根据权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。
20.根据权利要求10所述的方法，进一步包括在与所述的两次去杂样品接触之前将所述裂解物固定在固相上。
21.根据权利要求10所述的方法，其中所述样品是血清。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述血清是自体血清。
23.根据权利要求10所述的方法，其中所述免疫原性结合配体是抗体。
24.根据权利要求10所述的方法，其中所述免疫反应性物质是与癌相关的抗原。
25.根据权利要求10所述的方法，其中所述免疫反应性物质是与自体免疫相关的抗原。
26.根据权利要求10所述的方法，其中所述免疫反应性物质由病原体产生。
27.编码肾细胞癌特异性抗原的分离的核酸分子，其互补序列在严格条件下与SEQ ID NO1杂交。
28.编码霍奇金病特异性抗原的分离的核酸分子，其互补序列在严格条件下与SEQ ID NO2杂交。
29.编码黑素瘤特异性抗原的分离的核酸分子，其互补序列在严格条件下与SEQ ID NO3杂交。
30.根据权利要求27所述的分离的核酸分子，由SEQ ID NO1组成。
31.根据权利要求28所述的分离的核酸分子，由SEQ ID NO2组成。
32.根据权利要求29所述的分离的核酸分子，由SEQ ID NO3组成。
33.包括权利要求27所述的分离的核酸分子的表达载体，可操作地与启动子连接。
34.包括权利要求28所述的分离的核酸分子的表达载体，可操作地与启动子连接。
35.包括权利要求29所述的分离的核酸分子的表达载体，可操作地与启动子连接。
36.用权利要求27所述的分离的核酸分子转化或转染的细胞系。
37.用权利要求28所述的分离的核酸分子转化或转染的细胞系。
38.用权利要求29所述的分离的核酸分子转化或转染的细胞系。
39.用权利要求33所述的表达载体转化或转染的细胞系。
40.用权利要求34所述的表达载体转化或转染的细胞系。
41.用权利要求35所述的表达载体转化或转染的细胞系。
全文摘要
本发明描述了鉴定所需分子的方法,以及编码它的核酸分子,和它的结合配体。制备了来自表达该靶的细胞的cDNA文库,并在宿主细胞中表达。用经处理除去了干扰结合配体的样品筛选宿主细胞的裂解物,所述的处理包括将样品与未转染的宿主细胞的裂解物接触,以及将样品与用制备cDNA文库的相同载体转染或转化的宿主细胞的裂解物接触。本发明还包括用该方法鉴定的抗原和cDNA。
文档编号A61K48/00GK1190894SQ96195638
公开日1998年8月19日 申请日期1996年6月7日 优先权日1995年6月7日
发明者米夏埃尔·普无罗因德舒, 汉斯－格奥尔格·拉门赛 申请人:路德维格癌症研究所