专利名称：P2嘌呤受体之激动剂或拮抗剂在预防谷氨酸引起的细胞毒性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明背景本发明涉及特定类的化合物在预防谷氨酸引起的细胞毒性中的应用。
现有技术谷氨酸是中枢神经系统之主要兴奋性神经递质(Hollmann M.，Heinemann S.，Annu.Rev.Neurosci.17，31-108，1994)，而且谷氨酸受体普遍分布于CNS中也证明谷氨酸在广范围的生理和病理过程中起着中心的作用(Watkins J.C.，Collingridge G.L.，The NMDA receptor，IRLOxford，1989)。
谷氨酸依赖型神经递质传递在如学习、图形识别和记忆等功能中的中心作用已为最令人相信的原理和一些实验发现所暗示(Bliss T.V.P.Collingridge G.L.，Nature 361，31-39，1993)。
几十年来一直认为谷氨酸在体内和培养基中对神经元是有毒性的，而且谷氨酸受体的功能在许多脑疾病和损伤中是关键性的(AppelS.H.，Trends Neurosci.16，3-5，1993)。许多涉及中风或癫痫的神经性疾病事实上导致由于谷氨酸的过度刺激引起的脑损伤，以及如阿尔茨海默氏病、杭廷顿氏病、帕金森氏病和肌萎缩侧索硬化等的变性疾病，这些疾病涉及由谷氨酸受体的过度活化导致的神经元细胞坏死。
本发明的目的本发明的目的是提供用于调节谷氨酸引发的神经递质传递和神经毒性的特定类化合物，该类化合物可治疗急性和慢性神经变性疾病。
本发明的另一个目的是提供可调节与谷氨酸有关之生理功能的特定类化合物，所述生理功能包括疼痛、激素平衡、血压、热调节、出汗、学习、图形识别和记忆。
本发明的再一个目的是提供可用作预防谷氨酸引发之细胞毒性的药物工具的特定类化合物。
本发明的进一步目的是提供有效替换用于治疗与谷氨酸有关之急性和慢性神经性疾病的已知药物如竞争性和非竞争性谷氨酸拮抗剂、神经节苷脂和生长因子的特定类化合物。本发明描述通过使用用于预防谷氨酸引发之细胞毒性的P2嘌呤受体之激动剂或拮抗剂的化合物可实现上述以及其他目的和相关的优点，这些目的和优点将在以下描述中更明确地阐明。
本发明的基本新颖性是谷氨酸引发之生物过程与P2嘌呤受体调节剂(激动剂或拮抗剂)之间的相关性。谷氨酸受体和P2嘌呤受体都是具有离子移变和代谢移变性质的受体。
例如，我们选择Basilen Blue E 3G(也称为Reactive Blue 2)和Cibacron Blue 3GA，它们是P2嘌呤受体的拮抗剂。这些化合物可商购得到，例如购自Sigma，它们的分子结构和主要特征在1995年于意大利发行的Sigma目录中都有描述，Basilen Blue E 3G在149页，Cibacron Blue 3GA在266页。我们选择的其他化合物是5-腺苷酰基亚氨基二磷酸酯(AMPPNP)，它是P2嘌呤受体的激动剂。该化合物也可从Sigma购得，其分子结构和主要特征描述于1995年在意大利发行的Sigma目录的52页。
根据本发明，这些化合物可用来预防谷氨酸引发的神经系统细胞之细胞毒性，特别是CNS神经元。作为CNS神经元的细胞模型系统，我们采用产后的鼠小脑神经元。这些细胞在由产后的鼠小脑分离时是最特征化的原始神经元培养物(Lasher R.S.，和Zagon I.S.，Brain Res.41，428-438，1972)，它们在体外可发育成作为中间神经元的成熟显型。该中间神经元用谷氨酸作为神经递质，而且可进一步构成用于研究谷氨酸介导之细胞毒性的优异模型系统。
将粒状神经元暴露在100μM谷氨酸中15-30分钟，可使全部细胞的80-100％死亡(15-20小时)。我们发现将100μM的P2嘌呤受体拮抗剂Basilen Blue(也称为Reactive Bue 2)(蒽醌磺酸衍生物)给药于粒状神经元时，如果同时存在谷氨酸，可完全保存细胞存活，由此消除谷氨酸的细胞毒性作用。尽管暴露于谷氨酸中可引发完全的细胞死亡，但是Basilen Blue对小脑粒细胞形态学的作用显示出表观健康的细胞体，该细胞体携带致密的高度分枝法的网状结构。Basilen Blue还可防止粘连和轴突自发性收缩。用谷氨酸处理的第一个5分钟内即可在粒状神经元中观察到以细胞体的快速膨胀和失去光泽为特征的急性应答，而添加Basilen Blue则可防止，这表明该化合物在EAA受体相互作用的下游时就可以立即在一连串的过程中非常早地起作用。
需重要强调的是Basilen Blue在最高至300μm的测试浓度时对细胞也没有毒性，而且在给药于粒状神经元0.5-26小时的时候，不会影响血浆膜的通透性(以溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡的摄取来测定)，或者细胞的代谢(以MTT通过线粒体脱氢酶的活性转化为fomazan来测定)。Basilen Blue可防止谷氨酸引发的细胞死亡，其IC50在10-20μM，此值通常与报道的P2嘌呤受体拮抗剂之化合物的浓度相一致。其他市售的蒽醌磺酸衍生物(Cibacron Blue)的异构体在此方面也是有效的。咖啡因是P1嘌呤受体拮抗剂，其在100μM时仍不能消除谷氨酸的细胞毒性作用。
Basilen Blue之细胞毒性防护作用与时间呈线性关系，而且取决于化合物的给药方式。如果在谷氨酸之后10分钟向细胞中加入BasilenBlue，并与粒状神经元一起仅温育15分钟，其将使神经元总数的60-70％细胞免于死亡。而如果仅在用谷氨酸处理细胞的最后5分钟内给药，Basilen Blue只能维持神经元总数的25-40％细胞存活。相反地，如果在粒状神经元暴露于谷氨酸之后1-2分钟或30分钟或2小时添加(然后与细胞再温育20小时)，Basilen Blue可分别使神经元总数的55-70％、30％和10％细胞免于死亡。在粒状神经元暴露于谷氨酸之前(不是期间或之后)添加的话，Basilen Blue需要预处理至少20-25小时，以防止谷氨酸细胞毒性作用的70-80％。对天冬氨酸摄取的抑制并不是这些相同处理的后果。与向粒状神经元给药的方式不同，对Basilen Blue诱导的细胞毒性的抑制不取决于新蛋白质的合成，这是因为它对如放线菌素D(以10μM使用)或茴香霉素(以100μM使用)的抑制剂是不敏感的。
Basilen Blue抑制[3H]ATP与粒状神经元膜的结合，其IC50约为10μM，这相应于抑制谷氨酸引发之细胞毒性的IC50。与[3H]ATP结合的研究也是直接在完整细胞上进行的，而且显示Basilen Blue是有效的。
我们已在连续存在(在体外从1天至不迟于2天)100μM已知的P2嘌呤受体激动剂5-腺苷酰基亚氨基二磷酸酯(AMPPNP)时培养细胞。该处理的结果是谷氨酸诱导的细胞毒性被抑制约50-60％。在此方面，将细胞急性暴露于100μM AMPPNP(与谷氨酸同时)是无效的。在连续存在AMPPNP时培养神经元产生与急性暴露于BasilenBlue相同的作用，这一事实支持如下假设嘌呤受体直接参与了谷氨酸依赖型的神经毒性；而且这还提示嘌呤受体的脱敏现象主要发生在小脑粒状细胞中。
因为通常使用D-[3H]天冬氨酸的释放作为体外培养之小脑粒状神经元功能状态的一个量度，而去极化或谷氨酸引发之天冬氨酸释放是这些细胞与神经元成熟所获得的渐进特征，所以我们决定测试该参数，以进一步研究使用Basilen Blue防止细胞死亡的生物作用及可能的机理。我们发现Basilen Blue抑制谷氨酸诱导的[3H]天冬氨酸释放，其IC50约为10μM。该抑制作用几乎是完全的，但不影响基础释放，而且在测定释放1分钟、更长的时间(3、10和25分钟)或者甚至在Mg2+存在时，该抑制作用才发生。粒状神经元长期暴露于100μM AMPPNP 8天可抑制70-80％的谷氨酸引发的[3H]天冬氨酸释放。
谷氨酸依赖型的神经毒性在小脑粒状神经元中通常伴随着细胞间Ca2+通过多步骤的增加。Basilen Blue与咖啡因不同，几乎完全消除谷氨酸引发的Ca2+摄取，但不消除基础的Ca2+摄取，其IC50约为10μM。而且该值与抑制ATP结合、细胞毒性和天冬氨酸释放时的IC50一致。在短时间(1分钟)或长时间(3、10和25分钟)测量Ca2+摄取时，Basilen Blue依赖型的抑制作用都发生。粒状神经元长期暴露于100μMAMPPNP 8天，可抑制50-70％的谷氨酸引发的Ca2+流入，这类似于对细胞毒性和天冬氨酸释放的抑制。
第1-2页在小脑粒状原始培养物中，Basilen Blue抑制谷氨酸诱导的细胞毒性剂量-应答的作用和添加方式。将8 DIV之复制的小脑粒状培养物暴露于100μM谷氨酸25分钟，其中同时存在不同浓度的Basilen Blue(图1)。20小时后，通过直接计数完整的有生命的细胞核来估测培养物中细胞的存活率。星号代表在向细胞中同时添加100μM谷氨酸和100μM咖啡因后得到的细胞核百分数。在图2中，将8 DIV之复制的小脑粒状培养物暴露于100μM谷氨酸25分钟。在撤出谷氨酸后的不同时间向介质中添加Basilen Blue(100μM)，直到20小时后通过直接计数完整的有生命的细胞核来估测培养物中细胞的存活率。星号代表在向细胞中同时添加100μM谷氨酸和100μM Basilen Blue后得到的细胞核百分数。在图3中，在添加100μM谷氨酸之前25分钟，在100μM Basilen Blue存在下对复制培养物进行预处理不同的时间。20小时后估测培养物的细胞存活率。
星号代表在向细胞中同时添加100μM谷氨酸和100μM BasilenBlue后得到的细胞核百分数。计数代表平均值±SEM(n＝4)，100％的细胞存活率代表1.75-2×106的总细胞量。
方法在将粒状细胞暴露于谷氨酸约20小时后，除去培养基，并用1ml含有洗涤剂的溶解溶液(0.5％乙基十六烷基二甲基溴化铵、0.28％乙酸、0.5％Triton X-100、3mM NaCl、2mM MgCl2，在PBS pH7.4中稀释1/10)。
在1-2分钟后，研磨几次细胞，产生单一的、完整的、有生命的细胞核的均匀悬浮液。通过血球计数计对后者进行定量。破裂或者损坏的细胞核不包括在计数内。第3-4页Basilen Blue抑制ATP与小脑粒状细胞膜的结合，但不抑制天冬氨酸的摄取。由8 DIV小脑粒状细胞中制备膜，然后在不同浓度的BasilenBlue存在下将20μg蛋白质与[3H]ATP(0.5μCi/ml，最终浓度为14nM)(图4)一起在4℃下温育1小时。显示出专一性的结合，计数代表平均值±SEM(n＝3)。星号代表在100μM咖啡因存在时进行的结合。在图5中，将8 DIV之复制的小脑粒状培养物洗涤二次，然后在不同浓度的Basilen Blue存在时与含有[3H]D-2，3天冬氨酸的Locke氏溶液(0.5μCi/ml，最终浓度为40nM)温育不同的时间。二次洗涤后，将细胞溶解在0.1M氢氧化钠中，然后通过液体闪烁计数掺入的放射性。所得值以cpm/μg表示，并代表平均值±SEM(n＝3)。蛋白质浓度通过Bradford法用牛血清白蛋白作标准进行测定。
方法将8DIV之复制的小脑粒状细胞收集在冰冷的缓冲液A(50mM Tris、1mM EGTA，用HCl将pH调节至7.4，还包含2mM苯基甲基磺酰氯、200 KIU/ml抑肽酶和1μg/ml的亮肽素)中，然后于4℃、35,000×g下离心20分钟。重新将沉淀物悬浮于缓冲液A中，以使蛋白质的浓度为5-6mg/ml，并立即用于结合研究中。在与[3H]ATP结合后，通过Whatman GF/B玻璃纤维过滤器真空过滤样品(1ml)，然后立即用5ml的50mM Tris-HCl(pH7.4)洗涤过滤器，空气干燥，并通过液体闪烁计数估测专一性结合的放射活性。第5-6页在AMPPNP存在下培养小脑粒状细胞调节谷氨酸依赖型的细胞死亡、Ca2+摄取和天冬氨酸释放。制备原始小脑粒状培养物，然后由1DIV开始，将它们中的一些每日补充100μM AMPPNP(图6)。在8DIV时，在洗涤二次后，将培养物中的一些在20℃下与100μM谷氨酸一起温育。在下一天如上所述对它们进行细胞存活率的估测。
(图7)在有或没有谷氨酸的情况下，在45 Ca2+(1μCi/ml)存在时在Locke氏溶液中温育8 DIV之复制的小脑粒状细胞培养物1分钟，然后估测Ca2+的流入(图8)。在[3H]D-2，3天冬氨酸(1μCi/ml，最终浓度为40nM)存在时，在Locke氏溶液中温育8 DIV之复制的小脑粒状细胞培养物5分钟，然后在有或没有100μM谷氨酸时估测天冬氨酸的释放。数据用平均值±SEM(n＝3)来表示。第7-8页Basilen Blue在小脑粒状细胞中抑制由谷氨酸诱导的天冬氨酸释放和Ca2+摄取(图9)。在[3H]D-2，3天冬氨酸(1μCi/ml，最终浓度为40nM)存在时，在Locke氏溶液中温育8 DIV之复制的小脑粒状细胞5分钟。洗涤二次后，在Locke氏溶液中在不同浓度的Basilen Blue存在时，将培养物与或不与100μM谷氨酸一起温育1分钟。将在该释放阶段中由培养基中除去的缓冲液收集在小玻璃瓶中，然后计数放射性。星号代表在100μM谷氨酸和100μM咖啡因同时存在时得到的天冬氨酸释放。将细胞溶解在0.1M氢氧化钠中，蛋白质浓度通过Bradford法用牛血清白蛋白作标准进行测定(图10)。在含有45 Ca2+(1μCi/ml)的Locke氏溶液中将8 DW之复制的小脑粒状细胞培养物与或不与100μM谷氨酸一起温育1分钟，其中同时存在不同浓度的Basilen Blue。在用冰冷154mM氯化胆碱、2mM EDTA洗涤二次后，将细胞溶解在0.1M氢氧化钠中，取几等份用于测量Ca2+流入(通过放射性计数)和蛋白质浓度。星号代表同时存在100μM谷氨酸和100μM咖啡因时得到的Ca2+流入。数据用平均值±SEM(n＝3)来表示。
权利要求
1.用于预防谷氨酸引发之细胞毒性的P2嘌呤受体激动剂或拮抗剂化合物。
2.P2嘌呤受体激动剂或拮抗剂化合物在制备用于治疗急性和慢性神经变性疾病之药物中的应用。
3.药物组合物，其包括作为活性成分的P2嘌呤受体激动剂或拮抗剂化合物以及常用的添加剂。
4.如权利要求3的药物组合物，其特征在于，除常用的添加剂外，其还包括在药物学上可接受之载体中的作为活性成分的P2嘌呤受体激动剂或拮抗剂化合物。
5.如权利要求3的药物组合物，其特征在于，所述P2嘌呤受体激动剂或拮抗剂是5-腺苷酰基亚氨基二磷酸酯(AMPPNP)。
6.如权利要求3的药物组合物，其特征在于，所述化合物选自Basilen Blue E-3G(Reactive Blue 2)和Cibacron Blue 3GA。
7.如权利要求3、5和6的药物组合物，其是用于急性和慢性神经变性疾病。
8.如权利要求3、5和6的药物组合物，其是用于调节谷氨酸引发之生理功能。
9.如权利要求8的药物组合物，其特征在于，所述谷氨酸引发之生理功能是疼痛、激素平衡、血压、热调节、出汗、学习、图形识别和记忆。
10.如权利要求3、5和6的药物组合物，其是用于预防谷氨酸引发之神经毒性。
全文摘要
P2嘌呤受体激动剂或拮抗剂的化合物在预防谷氨酸引起的细胞毒性中的应用,特别是使用Basilen Blue E－3G(Reactive Blue2)、Cibacron Blue 3GA和5－腺苷酰基亚氨基二磷酸酯(AMPPNP)。存在细胞毒性浓度的谷氨酸时,这些化合物可维持中枢神经系统(CNS)神经元如产后鼠小脑粒状神经元之细胞存活率。
文档编号A61K31/00GK1192139SQ96195903
公开日1998年9月2日 申请日期1996年7月24日 优先权日1995年7月28日
发明者钦齐亚·沃隆特, 达尼埃拉·梅洛 申请人:国家研究委员会