抗病毒剂的制作方法

专利名称：抗病毒剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗病毒剂，更具体地说，本发明涉及用红小藻多糖作为抗病毒物质。
背景技术：
已经发现许多藻多糖对不同的病毒具有抗病毒活性，藻多糖潜在的抗病毒活性首先由Girber等证实(见Proc.Soc.Exp.Biol，Med.99，590-593，1958)。他观察到从软骨石花菜(Gelidiumcartilagenium)和角叉菜胶(来自Chondrus crispus)提取的多糖能保护胚胎卵抗御流感病毒B和腮腺炎病毒。这些有抗病毒活性的藻多糖被鉴定为硫酸化多糖。加入多聚阳离子例如DEAE-葡聚糖能抵消带阴性电荷抑制剂的抑制作用。
通过研究，一些生物和合成的硫酸化多聚阴离子，例如肝素，已证实能抑制各种哺乳动物病毒的复制。已经发现，像肝素的多聚阴离子仅当病毒感染初期加入时，才能够预防病毒感染。另一方面，发现类似角叉菜胶的藻多糖对病毒附着或渗入宿主细胞没有影响。也已发现，在体外，硫酸化藻多糖选择性抑制人免疫缺陷病毒逆转录酶和复制。体内研究已发现肝素能促使小鼠肿瘤退化。一些人已发现许多天然和合成的多聚阴离子在体内体外诱导干扰素的产生。
EP295956论述的是非硫酸化的源于不同的藻类，特别是海藻的抗病毒多糖，所述多糖从细胞中提取，有相对低的分子量，即这些多糖都是以细胞提取物形式存在，并可能含有不同的杂质。这些列举的多糖见EP295956的论述，其分子量在103至3×106范围内，比本发明的多糖的分子量要小，这些多糖据说也用于治疗逆转录病毒感染，尤其是艾滋病。另一方面，EP497341公开了治疗病毒感染的药物组合物，其含有纤维母细胞生长因子和硫酸化多糖的混合物，可将其用来治疗单纯疱疹病毒和人免疫缺陷病毒。此多糖具有多种形式，特别是来源于红藻。在这种情况中，多糖就具有琼脂样骨架，所述骨架由β(1→4)D半乳糖和α(1→3)L-半乳糖不断交替重复组成。但是，应注意到，一些已知的抗病毒多糖(例如在EP497341中提到的那些)的缺陷是具有毒性，因此，由于对哺乳细胞的毒性，使得EP497341中的一些多糖不能代表可有效作为抗病毒剂的多糖。
发明概述现已发现并作为本发明的目的之一的是从红小藻获得的硫酸化多糖是有效的抗病毒剂。
更进一步发现并作为本发明的另一目的的是，可以用红小藻多糖来抑制病毒在宿主细胞内的复制。
也已发现并作为本发明的另一目的的是，用红小藻多糖处理健康细胞能有效预防病毒感染。
本发明的进一步的目的是提供以红小藻多糖和已知抗病毒药物为基础的抗病毒组合物，所述组合物治疗许多耐药单纯疱疹病毒株，例如耐无环鸟苷的单纯疱疹病毒株有效。
本发明的一个目的是提供了含有红小藻多糖的抗病毒组合物，所述组合物克服了已知抗病毒多糖的缺陷。随着进一步的阐述，发明的其它目的将是显而易见的。


图1紫球藻属(Porphyridium sp.)多糖(下文缩写为P.spP)对单纯疱疹病毒细胞致病效应发展的影响；图2- P.spP对细胞增殖的影响；图3- P.spP对用单纯疱疹病毒-1感染Vero细胞的影响；图4- P.spP对带状疱疹水痘病毒致病效应发展的影响；图5- 去除P.spP后，单纯疱疹病毒-1细胞致病效应的发展；图6 将P.spP加入到预先感染细胞培养物中；图7- P.spP对单个复制周期感染性病毒的影响；图8- 与P.spP相比，角叉菜胶K和硫酸葡聚糖的细胞毒效应。
发明详述一方面，本发明涉及抗病毒组合物，其含有抗病毒有效量的源于红小藻的多糖，或两种或多种红小藻多糖的混合物，作为活性成份。
根据本发明的优选实施方案，所述抗病毒组合物含有抑制感染有效量的源于红小藻的多糖作为活性成份。虽然当然能够通过各种方法如提取从细胞壁获取多糖，但优选使用由海藻分泌于生长基液中的多糖，这种多糖基本上是一种纯多糖。除了其他考虑，例如减少不需要物质的共提取(这种危险出现在提取过程中)，从工业的角度看，当然这种分泌多糖更加方便和更经济。通过抑制病毒在宿主细胞内的复制和预防病毒重新感染，可将这些多糖组合物用于治疗已经感染的细胞，例如哺乳动物中病毒感染的伤口。当然，抑制病毒复制和病毒再感染使病毒感染的症状消失。
根据本发明的另一实施方案，此抗病毒组合物含有作为一种活性成份的一定量的红小藻多糖，所述量能有效抗御病毒感染。根据本发明的所述实施方案，健康细胞用多糖处理后，能够阻止病毒感染的发生。
当然，本发明的抗病毒组合物能够以在一种合适的载体中提供。因此例如，将源于红小藻的抗病毒有效的多糖可以与可药用载体和/或佐剂一起提供。适宜的给药载体包括乳剂，膏剂，溶液和悬浮液(液体形式)。但，应注意到，而且是本发明的主要优点，多糖由小藻细胞分泌后，能以天然的形式直接应用，即一旦从多糖所存在的培养基中分离出轻微粘稠形式的多糖后，就能够直接使用，而不用添加任何载体和赋形剂。当然，需要时，对于应用的特定形式或为了将多糖与其他活性物质一起提供，可将多糖按药学实践中常规的，以及对于本领域专业人员显而易见的许多不同方法进行配制。
另外，本发明的抗病毒组合物也可以含有其他常用抗病毒药物，如无环鸟苷，famcyclovir，velacyclovir，idoxuridine，rifluridine，阿糖腺苷，干扰素类等。也已经发现，并且是本发明的目的之一提供含有多糖和已知的抗病毒药物和无环鸟苷的抗病毒组合物是便利的。这是因为出现了许多无环鸟苷抗性单纯疱疹病毒株，而本发明人发现，用红小藻多糖可有效治疗抗性病毒株。这样，提供例如无环鸟苷混合的多糖，可以治疗各种HSV感染，而不需要检查患者并判断患者感染的是否是特殊的病毒株或是否对无环鸟苷有抗性。同样地，也可用本发明的多糖治疗其他病毒感染，特别是这些病毒株对常用的药物耐药时。联合使用本发明多糖和一或多种常用抗病毒剂来治疗这些病毒是最有效的，这种联合用药对抗病毒是有效的，而不管这些病毒对常用药物是否耐药或敏感。
虽然，本发明不限于治疗或预防由任何特定病毒引起的感染，它广泛而特别有效用于治疗的一种常见且广泛传播的病毒是单纯疱疹病毒(I和II型)。根据本发明，也可以用于治疗其他病毒，例如Vacicallazoster病毒(VZV)，呼吸道合胞病毒(RSV)，鼠白血病病毒和肉瘤病毒(MuLV和MuSV)。
红小藻是熟知的而且专业人员很容易辨认。本发明的多糖，是从不同的红小藻分泌的，其疗效也不同，虽然他们都有活性。提取抗病毒多糖的优选小藻是紫球藻属(Porphyridium sp)，P.aerugineum.，和R.reticulata。此类小藻能以本领域专业人员已知道的常用方式栽培。在EP576870(已本发明为同一申请者)论述了栽培的方法和装置。
所以，一方面，本发明涉及将含有作为活性成分的抗病毒有效量的源于红小藻的多糖，用于治疗和预防病毒感染的用途。
另一方面，本发明涉及用红小藻来制备抗病毒药剂。
在不同的条件下进行酸性水解，然后进行色谱法可以确定所用多糖的单糖组成和不同组成的化学计量。红小藻类多糖中发现的主要单糖是木糖，葡萄糖和半乳糖。
表I概括了下文举证的红小藻多糖的主要特性表I各种红小藻多糖的化学组成糖(％) P.spPR.rPP.aP

P.spP＝紫球藻属多糖P.aP＝P.aerugineum多糖P.rP＝R.reticulate多糖通过酶降解法同时用从开放培养紫球藻细胞中分离的腰鞭毛虫提取物(如在Simon等J.phycol.28，460-465(1992)中说明的)，或土壤细菌(或与腰鞭毛虫)的混合物的提取物(由Arad(Malis)等，在Phytochcm.32，2，287-290(1993)描述的)表征上述红小藻多糖。
这些多糖物理特性是典型的溶解度为10-20gr/liter(克/升)，溶液的粘滞性是25-40cp.，分子量5-7×106。在宽范围的pH、温度和渗克分子浓度内保持稳定，对不同盐类稳定并可抗生物降解。已知的碳水化合物酶没有一种能分解本发明的多糖，所以，必需借助上面所论述的土壤细菌和腰鞭毛虫才能够进行生物降解。
多糖的温度抗性使得能够对其进行高温灭菌，而不破坏其抗病毒活性。从生产和治疗观点来看，正如专业技术人员所理解，这正是本发明的多糖的主要优点。
以下将对本发明作进一步阐明，实施例所使用的材料和方法不以任何方式对本发明构成限制，而仅是为达到说明的目的。
材料和方法以下材料和方法在以下的整个实施例中通用。
细胞和病毒绿猴肾细胞(Vero cells)生长于RPMI培养液中，加有10％胎牛血清和抗生素(青霉素，链霉素和新霉素)。
所用单纯疱疹病毒(I，II型)生长于Vero细胞上，病毒浓度通过噬菌斑法估算。
小藻多糖的制备和提纯简单说，多糖糊自生长于最佳条件下的红小藻(“P.sp”紫球藻属；，“P.a”Phorphyridiumi和“R.rP.Rhodella reticulata)。小藻收采于生长静止期，通过离心从藻生长液中提取细胞，然后上清液被反复交叉-流动(Cross-flow)过滤，首先去除盐伤，然后浓缩。
更具体些，下面是使紫球藻属生长的详细过程，此过程也适用上述其他藻类，对于专业技术人员而言，稍加修改就能满足不同藻类的特有的最佳生长条件。
使紫球藻属生长在Jones et al(Physiol.Plant 16，636643，1963)提出的人造海水里(ASW)，人造海水按以下成份溶液制备主要元素溶液NaCl 27g/lMgSO4·7H2O6.6g/lMgCl2·6H2O5.6g/lCaCl2·2H2O1.5g/lKNO31.0g/lKH2PO40.07g/lNaHCO30.04g/l微量元素溶液ZnCl24.0mg/100mlH3BO360.0mg/100mlCoCl2·6H2O 1.5mg/100mlCuCl2·2H2O 4.0mg/100mlMnCl2·4H2O 40.0mg/100ml(NH4)Mo7O24·4H2O 37.0mg/100ml铁溶液将240mg FeCl3溶解于100ml Na2EDTA(0.05M，pH7.6)中。
Tris缓冲液用121.1g/l Trizma盐酸和27.8g/l Trizma碱制备pH7.6 1mol贮备缓冲液为了制备1升人造海水，需要将1ml微量元素液，1ml铁元素溶液和20ml Tris缓冲液加到上述主要元素溶液中，得到pH7.6的人造海水。
人工海水里的紫球藻培养物如前述(方法见Adda，M.，et al，S.(1986)Biomass 10，131-140)首先在室内生长。然后移到室外的聚乙烯袖袋，用人造海水稀释至8-106细胞/ml。以批量方式，培养液经过4-5天的指数生长期，然后到达生长静止期，此时生长液中富集了本发明的多糖。当以批量方式使藻类生长时，生长期间并不要再加入营养素。在初期培养15-30天后，将培养液离心，将富含本发明多糖的上清液(多糖已从细胞中分泌出)与沉淀的细胞分开，再按下面所说的方法进一步处理。应注意的是，在培养生长期，应连续监测下列参数细胞数量，生物量，培养基液中的多糖量(从细胞中分泌出)和粘稠度。
将上面所说富含已分泌多糖的上清液，再进行交叉-流动滤过，滤过使用滤过面积为2.1m2，孔大小0.45μ，纤维内径1mm，内装体积55检验器的中空纤维微滤带。
所获得的多糖在下列实施例中使用藻多糖对细胞增殖的影响将Vero细胞接种在9.2cm2平皿中，平均细胞浓度为5×105/平皿。在含有不同浓度的多糖的10％小牛血浆RPMI培养液中培养，培养温度37℃。培养液每三天用含有适宜浓度多糖的新培养液替换。每天，每一处理组的三个平皿里的细胞用胰酶消化，用Neubauer血球计数器计数，并计算出均值。
细胞致病效应(CPE)的评价在不同浓度的多糖中，用HSV感染单层Vero细胞。在多糖中，经过几个病毒复制周期后(培育在37℃24至48小时)，在相差显微镜下，由细胞退化、颗粒状和畸形细胞核、粗糙的细胞膜、细胞部分或完全丧失附着平皿表面和细胞内空泡的发生来确定细胞致病效应(简写为CPE)。细胞致病效应每24小时检查一次直到实验结束。
细胞感染将Vero细胞单层同单纯胞疹病毒一起在37℃2％血清中培养2小时。然后，未吸附的病毒颗粒被除去，加入含有2％血清的新培养液，细胞单层培养在37℃。
噬菌斑分析法在37℃2小时的吸附期后，去掉未被吸附的病毒，加入含有0.6％琼脂和2％牛血清的培养基覆盖层。所有的细胞单层在37℃空气中含有5％CO2的湿润气压下培养数天(4-7天)，直到观察到细胞致病效应，然后去掉上述的覆盖层，细胞单层用福尔马/盐水固定(10％福尔马林盐水)，细胞用结晶紫染色，并计数菌斑。
实施例1红小藻多糖对单纯疱疹病毒I，单纯疱疹病毒II在Vero细胞中致病效应(CPE)的影响在三种不同浓度的藻多糖中，用单纯疱疹病毒I，单纯疱疹病毒II感染细胞，CPE50表示对细胞致病效应能提供50％保护作用的多糖浓度。结果表明通过使用这些多糖(见表II)，对单纯疱疹病毒I，单纯疱疹病毒II引起的感染有显著的抑制作用。当紫球藻的浓度大于获得CPE50的浓度100倍时，没有表现出细胞毒性作用，用紫球藻可获得的最好结果。
表II藻多糖HSV株CPE50(μg/ml)P.spP HSV-11HSV-25R.rp HSV-110HSV-220P.ap HSV-120HSV-250实施例2P.spP对单纯疱疹病毒细胞致病 效应(CPE)发展的影响使用不同浓度的P.spP合成一系列实验，以决定P.spP的浓度对Vero细胞CPE的发生和进展的影响，Vero细胞被1感染复数(下文称为“moi”)的HSV-I所感染。结果见图1。曲线A表示未加P.spP的细胞致病效应。曲线B表示使用1μg/ml的P.spP，曲线C表示用10μg/ml的P.spP，曲线D表示用50μg/ml的P.spP，曲线E表示用100μg/ml的P.spP。可以看出，用单纯疱疹病毒I感染细胞。随着P.spP浓度的增加，CPE的发生时间推迟。此外，随着P.spP浓度的增加，CPE发生和进展的动力学更加缓慢。能够看到，在实验期间(2周)100μg/ml的P.spP完全可使单纯疱疹病毒-I引起的细胞单层破坏作用消失，此浓度时对未被感染的细胞没有毒性作用，见实施例3。
实施例3P.spP对细胞生长的影响为了检验P.spP对细胞培养物的可能的细胞毒效应，检查了P.spP对细胞形态和细胞增殖的影响Vero细胞以低浓度接种，按实施例1所示，用不同浓度的P.spP处理7天。图2表示了培养在每个9.6cm2平皿里0.9×106细胞浓度的Vero细胞情况。细胞在37℃培养，曲线A为没有P.spP，曲线B、C、D分别表示P.spP为25μg/ml，250μg/ml，1000μg/ml。另外两组Vero细胞用1moi的单纯疱疹病毒感染，一组没有P.spP，另一组加有1000μg/ml的P.spP。显微镜观察表明即使P.spP为1000μg/ml，对细胞形态也没有影响。图2表明，甚至当P.spP为250μg/ml，对Vero细胞增殖也没有影响，加有1000μg/ml的P.spP的细胞在前3天作为对照组生长、然后停止其生长。此外，若感染单纯疱疹病毒的细胞从感染初期就使用P.spP，则也能够象没有感染的一样增殖。
实施例4P.spP对早期感染的影响用1moi单纯疱疹病毒-I感染加有不同浓度P.spP的汇合Vero细胞培养物，早期受感染细胞的数量通过噬菌斑法确定。图3(曲线A)说明了在不同P.spP浓度中感染了1moi单纯疱疹病毒-I的Vero细胞情况。噬菌斑形成单位(Pfu)通过标准的噬菌斑法来评价。结果(见图3，曲线A)表明10μg/ml P.spP产生90-95％噬菌斑形成保护作用，由单纯疱疹病毒-I形成的噬菌斑的50％保护作用相应于1μg/mlP.spP。
实施例5P.spP与病毒的相互作用5moi单纯疱疹病毒与不同浓度P.spP培养在37℃，30分钟。游离多糖的影响通过下降方法减少(1)在感染前，用含2％血清的培养液，系列稀释病毒-P.spP混合物；(2)通过20％蔗糖层沉淀病毒-P.spP混合物，使沉淀的病毒和受感染的Vero细胞产生不同的稀释度。P.spP对单纯疱疹病毒感染的效应通过噬菌斑分析法由形成的噬菌斑数目估计。当病毒-P.spP混合物稀释到10-3时(图3，曲线B)，或是被蔗糖层沉淀(表3)，噬菌斑形成都受到强烈抑制。此外，可以看到，P.spP为10μg/ml，大约70-80％噬菌斑形成受到抑制，相比之下，在感染时加入同样浓度P.spP，90-95％斑块形成受到抑制(图3，曲线A)。
表IIIP.spP产生的单纯疱疹病毒-1失活(FFU/ml)稀释的病毒培养基P.spP-病毒混合物中P.spP浓度-P.spP或 病毒 (μg/ml)病毒-培养 混合物基混合物 1 5 50100未稀释 *** ***** * *0.01 600 450 200150 700.001 70 5030 18 60.0001 128 4*，**，***代表未计算数目的PFU/ml的不同程度。
实施例6P.spP与细胞的相互作用为了检验P.spP和宿主细胞间可能的相互作用，这种相互作用可能干扰病毒的吸附，将Vero细胞与含有不同浓度P.spP的培养基37℃培养2小时。培养结束时，去掉未结合的P.spP，用PBS液洗细胞单层三次。然后，用1moi的单纯疱疹病毒-1感染这些细胞培养基，通过噬菌斑法计算所形成的噬菌斑数目。结果表明(图3，曲线C)P.spP预处理细胞培养基对病毒感染有轻微抑制作用。
实施例7P.spP对Varicella Zoster病毒(VZV)细胞致病效应(CPE)发展的影响使用不同浓度的P.spP做了一系列实验，为了判定Vero细胞CPE的发生和进展，Vero细胞被1moi Variceua Zoster病毒所感染。获得的结果见图4。曲线A为没有加P.spP所测得的细胞致病效应，曲线B、C、D、E分别为加有0.1μg/ml，1μg/ml，100μg/ml，1000μg/ml的P.spP所测得的细胞致病效应。表明，随着P.spP浓度的增加，用VZV感染细胞时，CPE的出现延迟，同样情况也见实施例2所述HSV-1所感染的情况。
实施例8去掉P.spP对单纯疱疹病毒-1CPE发展的影响在P.spP 100μg/ml浓度时，同0.1moi单纯疱疹病毒感染Vero细胞单层。在感染2小时后，去掉没有吸附的病毒颗粒，用PBS液洗细胞单层三次，加有P.spP(图5，曲线A)和没有加P.spP(图5，曲线B)的新鲜培养液加入细胞单层。图5所示的结果表明用P.spP处理直至实验结束的细胞单层，完全防止了单纯疱疹病毒CPE的发展，而仅在感染初期，用P.spP处理的细胞单层，CPE的发生仅延迟了4天。
这些结果可以这样解释一些具有感染性的病毒颗粒，有P.spP时，也能继续感染细胞，感染后，连续不断地使用P.spP，抑制了病毒在宿主细胞的复制。
实施例9P.spP加入预先感染的细胞培养物中在没有加P.spP时，用0.1moi(图6，曲线A和B)和1moi(图6，曲线C)的单纯疱疹病毒-1感染Vero细胞单层。在感染结束时，用PBS液洗细胞单层三次，再加入有P.spP和没有P.spP的新鲜培养液。每天检验细胞单层的CPE出现和发展情况。
结果表示在感染低浓度moi的培养液里，P.spP完全防止了CPE的出现(见图6，曲线C)。在一些细胞培养中，感染十天后，去掉P.spP，使用含有2％血清而没有P.spP的新鲜培养液，去掉P.spP3天后，发生了CPE(图6，曲线C)。在用高浓度moi感染的培养液中，由于使用P.spP的结果，CPE的出现推迟了4天。而且，相对没有加P.spP的培养液，CPE的发生率也是相当低(图6，曲线A)。
实施例10单个复制期中，P.spP对单纯疱疹病毒-1繁殖的影响用1moi单纯疱疹病毒-1感染Vero细胞单层，在感染结束时，去掉多余的病毒，用PBS液洗细胞培养物三次，再用含有不同浓度P.spP的新鲜培养液补充。在37℃24小时培养后，去掉培养液，用PBS液洗细胞三次，把细胞收集起来，经过三次冻-融循环破裂细胞，沉淀细胞碎片，通过标准噬菌斑法估计繁殖的感染性病毒。
结果见图7，表示为阳性对照(未加P.spP的细胞)的百分率，这些结果说明在第一个复制周期里，即使加入1μg/ml这样少的P.spP也能够抑制感染性单纯疱疹病毒-1的繁殖。
这些结果也表明，P.spP也通过影响病毒在宿主细胞的繁殖，抑制了单纯疱疹病毒-1的复制。
实施例11不同多糖对Vero细胞的细胞毒效应Vero细胞以每9.6cm2平皿4×105细胞接种，这些细胞培养在37℃，见图8，曲线A为没有加P.spP，曲线B表示加有100μg/ml P.spP，曲线C、E分别表示加有1μg/ml，10μg/ml的硫酸葡聚糖，曲线D、F分别表示加有1μg/ml，10μg/ml的角叉菜胶K。这些细胞和胰酶处理，并在加入多糖早期的不同期间进行细胞计数。
象在实验2(图2)所明确证实那样，当使用P.spP为50μg/ml或更高时，能够获得一个显著的抗病毒效应。然而，当使用50μg/ml或更高浓度的角叉菜胶和硫酸葡聚糖时，由于它们的毒性，也不能应用，即使浓度低到10μg/ml也如此，见图8。这样，虽然角叉菜胶K和硫酸葡聚糖象P.spP在低浓度时一样(1μg/ml或更低)有同样的抗病毒活性，由于他们在浓度大于1μg/ml对细胞的毒性作用，所以他们不能够以更高的抗病毒有效浓度使用。所以这就显示了本发明P.spP的优越性，在即使大于100μg/ml的浓度使用也没有毒性作用。
实施例12P.spP对兔眼单纯疱疹病毒感染的影响方法和实验用1.5公斤重兔的眼，用注射针头划破眼的角膜，用0.1ml单纯疱疹病毒-1液(106Pfu/ml)感染划破的角膜。然后，用滴眼药的方式，用含1000μg/ml的P.spP的溶液治疗感染的眼，每2天二次，直至实验结束(3-4周)。
进行下面的实验1)对照组眼未受感染的眼，用磷酸缓冲液(PBS)治疗，每天2次。
2)P.spP未受感染的眼，用P.spP治疗，每天2次。
3)感染的眼受感染的眼，而不用多糖治疗。
4)受感染和用P.spP治疗的眼受感染的眼，15分钟后用多糖进行治疗，每天二次，直至实验结束(3-4周)。
5)P.spP治疗预先感染而出现症状的眼有临床症状感染的眼，感染5-6天后，用P.spP治疗。
结果1)仅用P.spP治疗的眼球，没有观察到毒性效果。
2)感染单纯疱疹病毒-1的眼球，没有接受多糖治疗，感染5-6天后，出现临床症状(分泌增多的角膜炎)。
3)感染了眼球的所有动物(没有接受多糖治疗)，感染2-3周后都死亡。
4)受感染的眼球，感染15分钟后，接受多糖治疗，没有出现临床症状，并且接受治疗的动物存活。
5)表现有单纯疱疹病毒-1感染的眼球，感染5-6天后，用多糖进行治疗，所有的临床症状消失，与未治疗的动物相比，接受治疗的动物活的更长，在感染大约4周后，才出现死亡。
实施例13P.spP对新生大鼠感染单纯疱疹病毒-1发展的影响新生大鼠(3天鼠龄)，用0.1ml 107Pfu/ml的单纯疱疹病毒-1，通过皮下注射，或抓破皮下的方法使其感染。感染30分钟后，用0.2ml的P.spP皮下(s.c.)注射进入其受感染的面积。在被抓破的大鼠，使用P.spP到抓破的区域。治疗每天二次，直到实验结束(动物死亡)。用100-1000μg/ml的多糖浓度治疗，引起皮肤症状的出现和发展的明显推迟，并且延迟了动物死亡(表4)。
表IVP.spP对感染单纯疱疹病毒-1发展的新生大鼠的抑制效应P.spP浓度(μg/ml)0 100 500 1000抓破法 皮下 抓破法 皮下 抓破法 皮下 抓破法 皮下出现皮肤损伤的天数 3 3 5 5 6 7 6 6出现死亡的天数7 7 10 101112 1212实施例14P.spP对其它病毒的影响一般的实验方法，如在实验2，4，5和13提出的一样，重复用于其他病毒实验，即呼吸道合胞病毒(RSV)，鼠白血病和肉瘤病毒(MuLV和MuSV)，通过病毒感染细胞和用本发明多糖进行治疗，用标准方法判断病毒对细胞感染的效应，特别是对每一种病毒。结果说明(还未发表)说明同样对这些病毒，本发明多糖显著抑制了病毒的生长和感染性。
实施例15从小藻细胞提取的多糖(细胞多糖)的抗病毒效应紫球藻属细胞用双蒸馏水清洗，通过离心富集。细胞团用双蒸馏水分开，加热到90℃4小时，然后，此混合物被离心，分离出上清液，估计所含有的多糖量。此上清液含有所谓的细胞多糖，既在小藻细胞内的多糖，而且，此提取的多糖也含有不同的其他细胞成分(杂质)。与上面所说的分泌多糖相比，分泌多糖基本是纯净的。
上面所获得的上清液按以前的实验方法进行实验，也显示有抗单纯疱疹病毒-1的抗病毒活性，虽然，与已证明的分泌多糖相比，其活性稍微低小。
此上的描述和实施例都是为了说明，而不是为了限制于本发明，除了权利要求所确定的以外。可对上面所述的不同方法和材料进行多种修改。例如能够应用不同的红小藻，这些小藻能够在不同的条件下生长，和以不同的方法提取多糖，或可从生长培养基中回收分泌的多糖。此外，分泌或是提取的多糖，或两者的混合物，以及二种(或多种)不同红小藻多糖的混合物，能够同已知的抗病毒剂(或治疗有效的药物)，添加剂，载体或赋形剂一起使用。根据本发明，能够用多糖治疗或预防不同阶段不同病毒引起的感染，这些所说的感染影响了不同的范围和细胞类型，能够使用不同的应用方法，技术和手段，但所有这一切都没有超出此项发明的范围。
权利要求
1.一种抗病毒组合物，含有作为活性物质的抗病毒有效量的一种红小藻多糖或者二种或多种红小藻多糖的混合物。
2.根据权利要求1的抗病毒组合物，含有作为活性成分的、抑制复制有效量的一种红小藻多糖或者二种或多种红小藻多糖的混合物。
3.根据权利要求1的抗病毒组合物，含有作为活性成分的、抵御病毒感染有效量的红小藻多糖。
4.根据权利要求1、2、3中任一权项的抗病毒组合物，其中抗病毒有效量的红小藻多糖基本上以没有可药用载体和/或赋形剂和/或佐剂的形式提供。
5.根据权利要求1-3任一权项的抗病毒组合物，其中抗病毒有效量的红小藻多糖与可药用载体和/或赋形剂和/或佐剂一起提供。
6.根据权利要求1-3中任一权项的抗病毒组合物，其中红小藻多糖是硫酸化多糖。
7.根据权利要求1-3中任一权项的抗病毒组合物，包含溶解度是10-20gr/l，粘稠度是25-40c.p.，分子量是5-7×106的多糖。
8.根据权利要求5的组合物，其是乳膏形式。
9.根据权利要求5的组合物，其是软膏形式。
10.根据权利要求5的组合物，其是液体形式。
11.根据权利要求5的组合物，还包含常用的抗病毒药物。
12.根据权利要求11的组合物，其中所述病毒是单纯疱疹病毒。
13.根据权利要求11和12的组合物，其中所说的常用抗病毒剂是无环鸟苷。
14.根据权利要求1的组合物，其中所述病毒是Varicella Zoster病毒。
15.根据权利要求1的组合物，其中红小藻多糖选自紫球藻属，P.aerugineum，和R.reticulata。
16.一种抗病毒化合物，其是红小藻多糖，或是二种或多种红小藻多糖的混合物。
17.根据权利要求16的化合物，选自P.spP，P.aP和R.rP。
18.根据权利要求16或17的化合物 在治疗或预防病毒感染中的应用。
19.根据权利要求16或17的化合物，其是溶解度为10-20gr/l，粘稠度为25-40c.p.，分子量为5-7×106的多糖。
20.红小藻多糖在制备抗病毒药物中的应用。
21.生产抗病毒剂的方法，包括在促使细胞多糖生长和分泌于培养基的合适条件下，在合适的培养基中培养红小藻；从培养液中收采和浓缩分泌的多糖；和使用所述多糖作为抗病毒剂的活性物质。
22.一种抗病毒剂，其是按照权利要求21的方法制备的。
23.红小藻分泌的多糖，其用来作为抗病毒剂。
全文摘要
抗病毒组合物,含有作为活性成分的抗病毒有效量的红小藻多糖,或两种或多种红小藻多糖的混合物。
文档编号A61P31/12GK1193277SQ96196348
公开日1998年9月16日 申请日期1996年6月20日 优先权日1995年6月22日
发明者S·阿拉德, M·胡利黑尔, J·塔尔 申请人:宾-古里安尼格夫大学研究及发展部