专利名称：：抗原制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含有能够从喜角质真菌以及酵母菌中制备的多糖和/或糖肽的抗原制剂，制备这些抗原制剂的方法，它们作为药物的应用以及它们作为疫苗的应用，包括但不限于，预防和治疗变态反应，以及调节免疫反应。变态反应以一种或另一种形式折磨超过百分之二十的人类，并且它在过去十年中普遍性，致病性和死亡率的警告性增加导致它被称为首位环境疾病(Sutton和Gould，自然(Nature)1993，366，pp.421-428)。变态反应以相近的程度给人类和动物造成痛苦。在变态反应发生中，免疫反应起着关键作用(Paul，WilliamE.(编者)，基础免疫学(FundamentalImmunology)，RavenPressBooksLtd.，纽约，1984)。基本上描述了两种不同类型的变态反应。一种是速发型超敏反应(ITH)，在几分钟至几小时内观察到对变应原的最强变态反应。第二种是迟发型超敏反应(DTH)。在DTH情况下，对变应原的变态反应通常在24到48小时后达到最强。ITH最通常主要通过IgE途径介导，而DTH则更复杂。DTH发生中可能包括进一步的细胞介导反应(例如B-和T-淋巴细胞)。例如，将来自变态反应供体动物的淋巴细胞和抗体转移到非变态反应受体动物后，受体发生DTH(Askenase，P.W.(1973)实验医学杂志J.exp.Med.，138，pp.1144-1155)。由于直接暴露于环境抗原，上皮组织，特别是皮肤是最易被变态反应影响的组织。例如，在皮肤科中，急性变应性接触性皮炎和慢性变应性接触性湿疹占所有皮肤病的15％。变应性哮喘占人的所有哮喘病例的20％。可分类为ITH的变应性疾病例如有特应性湿疹，变应性支气管哮喘，枯草热，鼻炎，结膜炎。它们都可发展成慢性形式因此不应仅仅认为是IgE-依赖性反应。DTH的例子是急性变应性接触性皮炎和慢性变应性接触性湿疹，它们可进一步分类为与上皮有关的DTH(IV型)。此类病人先前通过与一种变应原接触致敏并发展成超敏反应性。再次与变应原接触造成急性的，亚急性的或慢性的发炎性接触性皮炎。来自兽医临床的一个变应性皮炎的例子是夏季湿疹(SummerEczema)，也叫作Sweet或QueensLandItch。夏季湿疹是马的一种变应性皮炎，属于变应性疾病的特应性形式(包括I型和IV型反应)。夏季湿疹是由蚊科(Culicidae)和蠓科(Ceratopgonidae)的蠓叮咬引起的，特征是有持久糜烂和渗出液的皮肤损伤，主要在鬃毛，尾巴，和腹部等区域。患病动物皮肤对刺激即触摸，雨水，风等显示强敏感性，并损害它们的整体健康和行为。与其它变应反应相似，据认为此种疾病的发生也由营养因素影响。只有从三月到九月份才能看到此病的症状，但在全年内均观察到皮肤的变应原诱导敏感性。夏季湿疹为研究变态反应和开发抗变应性药物提供了一种令人感兴趣的普遍的模型系统。依据临床图建议了多种治疗变态反应的方法。通常使用含有糖皮质激素，抗菌药物，消炎药物和/或钙的亲脂乳剂治疗急性变应性接触性皮炎，慢性变应性接触性湿疹和/或特应性湿疹。局部或注射使用多种组合物治疗夏季湿疹，例如甾族化合物制剂，杀虫剂，草药制剂，水杨酸盐，从微生物中分离的油或肽。所有上述处理仅治疗症状但不能治疗变态反应的起因。受损伤的免疫反应或免疫缺陷在变态反应发生中通常起着重要作用。因而，也使用免疫治疗方法，例如施用诸如BCG，左旋咪唑和其它免疫刺激物治疗湿疹，特应性湿疹，皮肤溃疡，以及自身免疫疾病(A.M.Tschernucha(编者)，Koscha，Medicina1982年出版，莫斯科)。为了治疗跳蚤-变应性皮炎，成功的使用了施用抗体衍生肽的方法(英国专利申请号8913737)。为了治疗特应性湿疹，使用脱敏剂也达到了比较好的结果(A.M.Tschernucha(编者)，Koscha，Medicina1982年出版，莫斯科)。尽管有治疗变态反应的多种不同方法，据我们所知，并没有人使用能从喜角质真菌或酵母菌制备的抗原组合物治疗变态反应。在本发明文中，术语“可溶解的”或“不可溶的”是指在水溶液中的溶解度。术语“抗原制剂”是指能够产生抗原性或免疫原性反应的任何物质成分。术语“调节免疫反应”是指本发明的抗原制剂刺激或增强免疫反应的能力，例如作为它们能力证明的刺激淋巴细胞在细胞培养中的增殖(详细的综述见于Strube等(1989)兽医研究Vet.Med.Rev.，60，pp.3-15，ButtnerM.(1993)微生物传染病的免疫组合物Comp.Immun.Microbiol.Infect.Dis.，16，No.1，pp.1-10)。现在惊奇地发现，来自喜角质真菌或酵母菌的抗原制剂能够用于预防和治疗变态反应，以及调节免疫反应，特别是对哺乳动物。现在已研究了从喜角质真菌以及酵母菌中制备抗原性物质的方法。能够按照这些方法制备的抗原制剂含有多糖和/或糖肽。可将这些抗原制剂作为药物组合物以及疫苗用以治疗动物和人，特别是治疗变态反应和调节免疫反应。将会理解本发明的药物组合物能同时具有免疫学和药学应用。本发明的抗原性物质也可从喜角质真菌或酵母菌衍生物质制备，例如来自真菌或酵母细胞壁。为了制备本发明的抗原制剂，研究了三种不同的方法。根据这些方法，可从喜角质真菌以及酵母菌制备三种不同的抗原性组分(ASMP，ANMP或AEMP)，以下一般称为“组分(fractions)”。含有超过一种组分的抗原制剂在下面称为“组合物制剂(complexpreparation)”或简称为“组合物(Complex)”。方法1；根据此方法可制备的组分由含有多糖和/或糖肽的抗原性可溶物质(ASMP)组成。此方法在实施例1中有详细说明，简要叙述如下在琼脂平板上培养喜角质真菌或酵母菌，例如如EP0564620中所述。一种优选的培养基例如是来自Oxoid的麦芽提取物琼脂。同样也可使用能够保证喜角质真菌或酵母菌生长的其它培养基。取产生的真菌生物量并用碱性水溶液处理。优选的碱性水溶液是优选浓度为0.1-5％(w/v)的氢氧化钠或氢氧化钾。优选地在20-150℃下碱处理至30小时。其后是在碱性水溶液条件下的处理步骤，分离制剂的固相和液相，例如通过离心，过滤或沉降。优选地例如在3500g的离心力离心进行分离，保证真菌细胞碎片的良好分离。在碱性水溶液条件下的处理，也就是分离步骤，可以重复多次。碱处理之后，在酸性水溶液例如0.2-1.5M有机酸或0.05-1M无机酸条件下处理产生的上清液。例如可使用盐酸或醋酸，优选地在pH2.5和pH4.5之间。在酸性水溶液条件下的处理优选地在4到8℃温度下进行2到4小时，其后发生固相层和液相层的分离。在酸性水溶液条件下的处理，也就是分离步骤，可以重复多次，优选地在上面指示的条件下。然后将来自分离步骤的上清液用于沉降步骤。优选地通过向上清液中加入合适的有机溶剂例如一种醇诸如一种低级烷醇例为甲醇或乙醇进行沉降。一个体积上清液对2-5个体积醇的比率将产生抗原性物质的良好沉降。同样也可使用本
技术领域：
熟练人员熟知的其它非醇沉降方法，例如硫酸铵或其它盐沉淀剂也可产生抗原性物质的沉降。然后将固相用于进一步的分离步骤，优选地在上述条件下。回收产生的固相并且如果需要可溶于水溶液，优选地溶于蒸馏水，典型地用25到100毫升。最后可将ASMP制剂冷冻干燥并在干燥条件下贮藏很长的时间。方法2根据此方法可制备的组分由含有多糖和/或糖肽的抗原性不可溶物质(ANMP)。此方法在实施例2中有详细说明，简要叙述如下在琼脂平板上培养喜角质真菌或酵母菌，例如如EP0564620中所述。一种优选的培养基例如是来自Oxoid的麦芽提取物琼脂。同样也可使用能够保证喜角质真菌或酵母菌生长的其它培养基。取产生的真菌生物量并用碱性水溶液处理。优选的碱性水溶液是优选浓度为0.1-5％(w/v)的氢氧化钠或氢氧化钾。优选地在20-150℃下碱处理至30小时。其后是在碱性水溶液条件下的处理步骤，分离制剂的固相和液相，例如通过离心，过滤或沉降。优选地例如在3500g的离心力离心进行分离，保证真菌细胞碎片的良好分离。在碱性水溶液条件下的处理，也就是分离步骤，可以重复多次。碱处理之后，用无机或有机酸处理固相。优选地在70到100℃温度下将0.2-1.5M醋酸或0.05-1M盐酸加至固相中0.5到3小时。酸处理之后，用一种水溶液优选地是蒸馏水冲洗固相。最好重复洗5次。最后将固相悬浮于蒸馏水。方法3根据此方法可制备的组分由含有多糖和/或糖肽的抗原性外源物质(AEMP)组成。此方法在实施例3中有详细说明，简要叙述如下在水溶液中温育或在液体培养基中培养喜角质真菌或酵母菌直至240小时(此处溶液或培养基体积定义为原始体积PV)。可使用蒸馏水(参看实施例3.I.)以及描述于EP0564620的培养基。温育或培养之后，通过例如离心，过滤或沉降，优选地在上面所述条件下离心分离真菌细胞。然后冷冻干燥产生的上清液并随后溶于水。水的体积优选地相当于0.1到0.2体积的原始体积(PV)。然后将产生的溶液进行沉降步骤。优选地通过向上清液中加入合适的有机溶剂例如一种醇诸如一种低级烷醇例为甲醇或乙醇进行沉降。一体积上清液对2-5体积醇的比率将产生抗原性物质的良好沉降。同样也可使用本
技术领域：
熟练人员熟知的其它非醇沉降方法，例如硫酸铵或其它盐沉淀剂也可产生抗原性物质的沉降。回收产生的固相并且如果需要可溶于水溶液，优选地溶于蒸馏水。优选地将0.5到50毫克沉淀物溶于1毫升水溶剂。最后可将AEMP溶液冷冻干燥并在干燥条件下贮藏很长时间，优选地在2到10℃。可制备上面阐明组分的优选真菌属是发癣菌属(Trichophyton)，小孢子菌属(Microsporum)或假丝酵母属(Candida)。优选的种是-马发癣菌(Trichophytonequinum)，-须发癣菌(Trichophytonmentagrophytes)，-沙凯斯维发癣菌(Trichophytonsarkisovii)，-疣状发癣菌(TrichophytonVerrucosum)，-犬小孢子菌(Microsporumcanis)，-石膏状小孢子菌(Microsporumgypseum)，或-白假丝酵母(Candidaalbicans)。上述参考种的优选菌株是-马发癣菌DSMNo.7276，-须发癣菌DSMNo.7279；-沙凯斯维发癣菌(Trichophytonsarkisovii)DSMNo.7278，-疣状发癣菌DSMNo.7277，-犬小孢子菌DSMNo.7281，-犬小孢子菌肥大变种DSMNo.7280(MicrosporumCanisVar.obesumDSMNo.7280)，-犬小孢子菌扭曲变种DSMNo.7275(MicrosporumCanisVar.distortumDSMNo.7275)，-石膏状小孢子菌DSMNo.7274，或-白色假丝酵母DSMNo.9656。所有上述参考菌株都由申请人依据布达佩斯条约关于微生物保藏的条文保存于DSM(“DeutscheSammLungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH”，MascheroderWeglB，D-38124Braunschweig，Germany)。除了白色假丝酵母DSMNo.9656以外的所有菌株先前已描述于USSR专利申请No.5006861归档于21.10.1991，以及相应的申请即公布的专利申请EP0564620，归档于17.10.1992。根据菌株不同，组分可依据下面获取于，及称为。组分衍生于(i)马发癣菌，称为ASMP-TE，ANMP-TE，或AEMP-TE，(ii)须发癣菌，称为ASMP-TM，ANMP-TM，或AEMP-TM，(iii)沙凯斯维发癣菌(Trichophytonsarkisovii)，称为ASMP-TS，ANMP-TS，或AEMP-TS，(iv)疣状发癣菌，称为ASMP-TV，ANMP-TV，或AEMP-TV，(v)犬小孢子菌，称为ASMP-MC，ANMP-MC，或AEMP-MC，(vi)石膏状小孢子菌，称为ASMP-MG，ANMP-MG，或AEMP-MG，或(vii)白色假丝酵母，称为ASMP-CA，ANMP-CA，或AEMP-CA。当给出与特定菌株相关信息时，菌种缩写后面有特定DSM保藏号的数字，例如AEMP-CA9656指能从白色假丝酵母菌株DSMNo.9656制备的AEMP组分。可以如上述方法(1到3)的任何一个制备的组分至少包括能从至少一个上述真菌中制备的一个单一抗原。本发明的抗原制剂至少包括一个上述组分或其组合物。描述于实施例1和3的抗原制剂(ASMP和AEMP)1)含有单糖，氨基酸和核苷酸，它们在多聚结构中结合到大的延伸部分以及较小的片段，是游离单体。2)主要由单糖单位组成不同相对含量的甘露糖，半乳糖，葡萄糖和木糖以及其它单糖。3)含有由显著量的这些单糖形成的聚合物结构的混合物。此聚合物结构的重要部分显示超过20000千道尔顿(KD)的分子量。4)含有少量的游离和接合氨基酸。5)含有少量对DNA酶I(DNaseI)消化显示敏感性的DNA分子。抗原制剂ASMP和AEMP的核磁共振(NMR)波谱测定得到的NMR谱图显示于图1到4。化学位移和信号复杂度(总结于表12)与文献中关于糖类和氨基酸的数据相符。对于AEMP和ASMP组分，例如MG7274，TM7279和CA9656，糖类信号占据3.2-5.5ppm的范围，氨基酸信号在0.75-3.45区域(不包括α质子)。ASMP还显示典型的乙酸根甲基信号，1.92ppm。AEMP组分也显示二糖和氨基酸的典型信号。例如TM7279谱图显示芳香族氨基酸的信号诸如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸在7.15-7.9ppm区域。提到单一组分ASMP或AEMP，优选浓度是0.1到50毫克/毫升。提到单一组分ANMP，优选浓度是0.1到5％(体积/体积)(v/v))。本发明抗原制剂的优选实施例含有例如下列组分组合物(复合物)组合物1含有ASMP-TM，ASMP-MG，以及ASMP-CA。优选地每种组分浓度为0.1到50毫克/毫升。根据组合物1的一个高度优选实施例是ASMP-TM7279，ASMP-MG7274，和ASMP-CA9656的组合物。组合物1.1含有ASMP-MG和ASMP-CA。优选地每种组分浓度是0.1到50毫克/毫升。根据组合物1.1的一个高度优选实施例是ASMP-MG7274和ASMP-CA9656的组合物。组合物2含有ANMP-TM，ANMP-MG，以及ANMP-CA。优选地每种组分浓度是0.1到5％(v/v)。根据组合物2的一个高度优选实施例是ANMP-TM7279，ANMP-MG7274，和ANMP9656的组合物。组合物3含有AEMP-TM，AEMP-MG，以及AEMP-CA。优选地每种组分浓度为0.1到50毫克/毫升。根据组合物3的一个高度优选实施例是AEMP-TM7279，AEMP-MG7274，和AEMP-CA9656的组合物。组合物4含有ANMP和AEMP。下面是优选的组分组合物(1)ANMP-CA和AEMP-TM或(2)ANMP-MG，ANMP-TM和AEMP-TM。优选地ANMP浓度为0.1到5％(v/v)以及AEMP浓度为0.1到50毫克/毫升。根据组合物4的高度优选实施例是下列组合物4.1ANMP-CA9656，和4.2ANMP-MG7274，和AEMP-TM7279；ANMP-TM7279，以及AEMP-TM7279；组合物5含有ANMP和ASMP。一个优选组合物是ANMP-MG，ANMP-TM，和ASMP-CA。优选地单独的ANMP组分浓度是0.1到5％(v/v)，以及单独的ASMP组分是0.1到50毫克/毫升。高度优选地是ANMP-MG7274，ANMP-TM7279，和ASMP-CA9656的组合物。依据本发明的其它优选抗原组合物包括例如ASMP和AEMP或ASMP和AEMP和ANMP，浓度为对ASMP和AEMP是0.1-50毫克/毫升以及对ANMP是0.1到5％(v/v)。本发明的抗原制剂能与不导致不良生理副反应的合适生理可接受载体，包括缓冲液，溶液或佐剂，例如盐溶液，乳酸盐溶液或任氏(Ringer)溶液等一起使用。优选的载体例如载体A含有0.85％(重量/体积)(w/v))氯化钠的水溶液；载体B含有5％(w/v)葡萄糖，0.3％肉浸汁“lab-lemco”(Oxoid)，和0.1％(w)v)酵母提取物(Oxoid)的水溶液；载体C培养基RPMI1640(购于Serva，目录号12-702)。本发明的抗原制剂可使用其本身或用作注射液，乳剂，喷剂，雾剂，片剂以及本
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熟练人员熟知的其它使用方式。本发明的抗原制剂可进一步提供高效疫苗。本发明的抗原制剂能够刺激免疫系统细胞的增殖因而能够调节免疫反应。本发明的抗原制剂进一步能抑制人角质形成细胞的增殖。本发明的抗原制剂可提供对变态反应的高度抗性，特别是对于上皮组织，更特殊地对于皮肤。它们对于预防和治疗变态反应是有意义的，并且在我们研究中如在实验室动物(即，豚鼠(guineapigs)和小白鼠)和马(即杂种马和冰岛马(Icelandichorses))活体证明的并不显示不良副作用。特别地，通过施用本发明的抗原制剂，即通过接种，可有效治愈急性变应性皮炎和皮肤损伤且没有副作用。在肌肉内注射本发明抗原制剂以后，可去除皮肤变应性发炎，瘙痒和由变应性皮炎造成的个体皮肤敏感性等症状。在最后注射之后2到8星期内可获得免除变应症状的完全恢复并且除去了变应原诱导的皮肤对刺激的敏感性。此外，在最后注射之后1到6星期内可除去瘙痒。在一个优选实施例中，本发明的抗原制剂提供了对马，特别是冰岛马的称为夏季湿疹的保护和治疗。肌肉内或皮肤内注射本发明的抗原制剂1到3次后，为夏季湿疹困扰的马可治愈或产生保护，优选地是组合物1和1.1。在另一个优选实施例中，本发明的抗原制剂提供了对哺乳动物脱毛症的保护和治疗。在肌肉内或皮肤内注射本发明抗原制剂1到3次之后，为脱毛症困扰的哺乳动物可治愈或产生保护，优选地是组合物1或1.1。在另一个优选实施例中，本发明的抗原制剂改善哺乳动物的毛发状况以及季节性换毛。肌肉内或皮内注射1到3次后，可显著改善毛发状况以及在为不完全换毛困扰的个体中产生彻底变化成为正常季节的毛，优选地是组合物1或1.1。在又一个优选实施例中，本发明的抗原制剂提供对湿疹的保护和治疗。在用本发明抗原制剂皮内或肌肉内注射1到3次或局部处理之后，为湿疹困扰的哺乳动物，即人可治愈或对湿疹产生保护，优选地是组分ASMP-MG，ASMP-CA和ASMP-TM，即ASMP-MG7274，ASMP-CA9656和ASMP-TM7279或组合物1和1.1。在另一个实施例中，本发明抗原制剂提供对神经性皮炎的保护和治疗。在局部施用本发明抗原制剂后，为神经性皮炎困扰的哺乳动物，即人，可治愈或对神经性皮炎产生保护，优选地是组分ASMP-MG，ASMP-CA和ASMP-TM，即ASMP-MG7274，ASMP-CA9656和ASMP-TM7279或组合物1和1.1。本发明的抗原制剂可用于处理多种病征例如描述于“KlinischeImmunologie”(Peter，H.H.(编者)，1991年由Urban&Schwarzenberg，Munich，Germany出版)中，诸如1.空气传播变应性疾病1.1.变应性鼻炎和结膜炎1.1.1.季节性鼻-结膜炎1.1.2.持久性鼻炎1.2.支气管哮喘1.3.气喘危象1.4.儿童哮喘1.4.1.感染性细支气管炎后的障碍性肺病1.4.2.温和间歇性或温和持久性支气管哮喘1.4.3.强烈持久性支气管哮喘2.变应性支气管肺曲霉病3.食物变态反应3.1.IgE-介导的食物变态反应3.11.IgE-介导的婴儿食物变态反应3.1.1.IgE-介导的青年人和成人食物变态反应3.2.IgG-和T-细胞-介导的食物变态反应3.3.对牛奶的不耐受性3.4.Heiner综合症3.5.嗜酸性细胞增多的(eosinophilic)胃肠病3.6.腹腔疾病4.昆虫叮咬变态反应5.所有形式的荨麻疹5.1.接触性荨麻疹5.2.与变态反应并生的荨麻疹5.3.与对前列腺素合成的添加物和抑制剂无耐受性(假-变态反应)并生的荨麻疹5.4.物理性荨麻疹5.4.1.皮肤划纹症(人工荨麻疹)5.4.2.胆碱能和肾上腺素能荨麻疹5.4.3.冷诱导荨麻疹5.4.4.光荨麻疹5.4.5.压力荨麻疹5.4.6.其它罕见形式的物理性荨麻疹5.5.荨麻疹性脉管炎5.6.着色荨麻疹和色点荨麻疹(mastocytosisandurticariapigmentosa)5.7.与感染疾病并生的荨麻疹5.8与免疫性甲状腺炎并生的荨麻疹5.9.荨麻疹和淀粉样变性6.血管神经性水肿6.1.遗传性血管神经性水肿(HANE)6.2.获得性血管神经性水肿7.特应性皮炎，特应性湿疹8.药物相关的变态反应表1白色假丝酵母DSMNo.9656的性质和特征</tables>本发明进一步涉及白色假丝酵母菌株DSMNo.9656，它通过依据培养形态特征的稳定性以及在1990年从人体中分离的流行病性菌株No.008的减毒性直接筛选获得。白色假丝酵母菌株DSMNo.9656的生物学特征描述于表1。菌株白假丝酵母DSMNo.9656进而以在营养培养基上长期传代时的群体稳定性和形态特征以及低毒性区别于流行病菌株。根据所教的制备本发明抗原制剂的方法，可以从这菌株制备依据本发明的高效和安全抗原制剂。本
技术领域：
熟练人员将易于认识的是本发明很好的适于生产目的物以及获得提及的及其内在的目标和优点。此处代表优选实施例的组合物，方法和技术是为了举例说明，而不是为了限制其范围。现在已大体描述了本发明，通过对以说明但不是为了限制本发明目的提供的下列实施例的参考将更易于理解本发明。实施例对于所有实施例离心在3000g到3500g离心力下进行30-50分钟。培养基购于Oxoid(UnipathGmbH，AmLippeglacis6-8，46483Wesel，Germany)或Serva(ServaFeinbiochemicaGmbH&Co.KG，Carl-Benz-Str.7，69115Heidelberg，Germany)。如果没有其它说明，真菌按照Oxoid目录“5.aktualisiertedeutscheAusgabe”或EP0564620中所述培养。用于制备本发明抗原制剂的真菌菌株通过从描述于下的真菌菌株的筛选和减毒获得，N.V.Mazkevitch，1981，“Spontannajaismentchivostikariologianesovershennichgibov”，IsdatelstwoNauka出版，莫斯科；以及Ivanova，L.G.，1992，“Sistematika，morphologitcheskajacharakteristika，biologitcheskiisvojstvavosbuditelejdermatophitosov，obshindljagivotnihitcheloveka”，莫斯科，莫斯科大学图书馆。用于哺乳动物细胞培养的基本培养方法可很容易地在Doyle，Griffiths，和Newell(编者)，细胞和组织培养(Cell&TissueCulture)实验室方法(LaboratoryProcedures)，JohnWiley和Sons(1995)中找到。为了角质细胞测定，使用了HaCaT细胞(Boukamp等(1988)，细胞生物学杂志(J.CellBiol.)，106，pp.761-771，和Ryle等(1989)，分化(Differentiation)，40，pp.42-54)，也可使用分离的角质形成细胞或其它角质形成细胞系。马淋巴细胞依据Friemel，H.，“ImmunologischeArbeitsmethoden”，VEBGustavFischerVerlag出版，Jena，1984；或Paul，E.，“基础免疫学(FundamentalImmunology)”，RavenPress出版，纽约，1984中所述进行分离和培养。放射分析基本上按照Boehncke等，1994，Scand.J.Immunol.39，pp，327-332及其引用的参考文献中所述进行。氢氧化钠，氢氧化钾，盐酸和乙酸制成水溶液。如果没有其它说明，术语可溶的指在水溶液中的溶解性。用于下述实验中的生理可接受载体举例为载体A含有0.85％(w/v)氯化钠的水溶液；载体B；含有5％(w/v)葡萄糖，0.3％(w/v)“lab-lemco”肉汤(Oxoid)，以及0.1％(w/v)酵母抽提物(Oxoid)的水溶液；载体C培养基RPMI1640(Serva)。实施例1含有多糖和/或糖肽的抗原性可溶物质制备于须发癣菌(ASMP-TM)，石膏状小孢子菌(ASMP-MG)或白色假丝酵母(ASMP-CA)，依据下面的方法依据EP054620中所述在琼脂平板上培养真菌。取真菌生物量用于生产I.ASMP-TM(i)在大约140℃下用4.5％(w/v)氢氧化钠处理须发癣菌生物量1小时，随后离心45分钟。向上清液中添加4M乙酸溶液至最终pH3.5。2小时后离心分离沉淀并把3体积乙醇加入1体积上清。离心分离乙醇沉降产生的沉淀，将沉淀溶于蒸馏水。最后冷冻干燥单独的ASMP制剂。(ii)在大约140℃下用0.2％(w/v)氢氧化钾处理须发癣菌生物量1小时，随后离心。用1M盐酸溶液处理上清液至终pH3.5，在4-10℃放置4小时。然后离心分离产生的沉淀，并将2体积乙醇加到1体积上清液中。醇沉降产生的沉淀以离心法沉降并溶于蒸馏水。最后冷冻干燥单独的ASMP制剂。II.ASMP-MG，(i)在大约140下用0.2％(w/v)氢氧化钠处理石膏状小孢子菌生物量2小时，随后离心。再用0.2％(w/v)氢氧化钠在大约140℃下处理沉淀2小时，随后离心，并将此步骤进行第三次重复。然后用8M乙酸溶液处理最终上清液至终pH3.5，在18-20℃下放置3小时。然后离心分离沉淀，并将3体积乙醇加入到1体积上清液中。醇沉降产生的沉淀再离心沉降并溶于蒸馏水。最后冷冻干燥单独的ASMP制剂。(ii)在大约75℃下亦用3％(w/v)氢氧化钾处理石膏状小孢子菌生物量6小时，随后离心。在75℃下再用3％(w/v)氢氧化钠处理沉淀6小时随后离心。最后的上清液用0.5M盐酸溶液处理至终pH3.5，在4-10℃放置4小时。然后将沉淀物离心分离，并将3体积甲醇加到1体积上清液中。醇沉降产生的沉淀以离心法沉降并溶于蒸馏水。最后冷冻干燥单独的ASMP制剂。III.ASMP-CA(i)在大约75℃下用3.0％(w/v)氢氧化钠处理白色假丝酵母生物量6小时随后离心。在75℃下再用3.0％(w/v)氢氧化钠处理沉淀6小时随后离心。最终上清然后用12M乙酸溶液处理至终pH3.5，在4-10℃放置2小时。沉淀再离心分离，并将2体积乙醇加到1体积上清液中。醇沉降产生的沉淀物离心进行分离并溶于蒸馏水。最后冷冻干燥单独的ASMP制剂。(ii)在大约35℃下用4.5％(w/v)氢氧化钾处理白色假丝酵母3小时随后离心。在大约35℃下再用4.5％(w/v)氢氧化钠处理沉淀3小时随后离心，并将此步骤进行第三次重复。最终上清再用0.25M盐酸溶液处理至终pH3.5，在18-20℃放置4小时。然后离心分离沉淀物，并将2体积乙醇加到1体积上清液中。醇沉降产生的沉淀物通过离心沉降并溶于蒸馏水。最后冷冻干燥单独的ASMP制剂。实施例2含有多糖和/或糖肽的抗原性不可溶物质(ANMP)制备于须发癣菌(ANMP-TM)，石膏状小孢子菌(ANMP-MG)或白色假丝酵母(ANMP-CA)依据下面方法如EP0564620中所述在琼脂平板上培养真菌。取真菌生物量并用于生产I.ANMP-TM(i)在大约35℃下用0.2％(w/v)氢氧化钠处理须发癣菌生物量24小时随后离心。在大约60℃下用0.3M乙酸处理沉淀3小时并用蒸馏水洗5次。每一清洗步骤随有一次离心。将终沉淀重新悬浮于0.85％(w/v)氯化钠水溶液(载体A)至ANMP-TM终浓度为0.5％(v/v)。ANMP-TM制剂以悬液形式贮存于2-10℃。(ii)在大约35℃下用0.2％(w/v)氢氧化钾处理须发癣菌生物量24小时随后离心。在70℃下用0.1M盐酸处理沉淀30分钟并用蒸馏水洗5次。每一清洗步骤随有一次离心。将终沉淀重新悬浮于RPMI1640(载体C)至ANMP-TM终浓度1.5％(v/v)。ANMP-TM制剂以悬液形式贮存于2-10℃。II.ANMP-MG(i)在大约75℃下用3％(w/v)氢氧化钠处理石膏状小孢子菌6小时随后离心。在大约75℃下再用3％(w/v)氢氧化钠处理沉淀6小时随后离心。产生的沉淀在60℃下用0.7M乙酸处理大约4小时并用蒸馏水洗5次。每一清洗步骤随有一次离心。将终沉淀重新悬浮于含有5％(w/v)葡萄糖，0.1％(w/v)来自Oxoid的酵母抽提物，以及0.3％(w/v)来自Oxoid的肉汤“lablemco”水溶液(载体B)至ANMP-MG终浓度2.5％(v/v)。ANMP-MG制剂以悬液形式贮存于2-10℃。(ii)在大约35℃下用3％(w/v)氢氧化钾处理石膏状小孢子菌生物量3小时随后离心。在大约35℃下再用3％(w/v)氢氧化钾处理沉淀物3小时随后离心，并且对此步骤重复第三次。产生的沉淀在80℃下用0.5M盐酸处理30分钟并用蒸馏水洗5次。每一清洗步骤后随有离心。最终沉淀重新悬浮于RPMI1640(载体C)至ANMP-MG终浓度2.0％(v/v)。ANMP-MG制剂以悬液形式贮存于2-10℃。III.ANMP-CA(i)在大约140℃下用4.5％(w/v)氢氧化钠处理白色假丝酵母生物量2小时随后离心。在14℃再用4.5％(w/v)氢氧化钠处理沉淀物2小时随后离心，并第三次重复此步骤。产生的沉淀物用1M乙酸在60℃下处理1小时并用蒸馏水洗5次。每一清洗步骤后伴随有离心。将最终沉淀重新悬浮于0.85％(w/v)氯化钠水溶液(载体A)至ANMP-CA终浓度为1.5％(v/v)。ANMP-CA制剂以悬液形式贮存于2-10℃。(ii)在大约140℃下用4.5％(w/v)氢氧化钾处理白色假丝酵母生物量2小时随后离心。在大约140℃再用4.5％(w/v)氢氧化钠处理沉淀物2小时，并在100℃下用0.1M盐酸处理产生的沉淀30分钟，用蒸馏水洗5次。每一清洗步骤后伴随有离心。最终的沉淀重新悬浮于RPMI1640(载体C)至ANMP-CA终浓度为2.5％(v/v)。ANMP-CA制剂以悬液形式贮存于2-10℃。实施例3含有多糖和/或糖肽的抗原性外源物质(AEMP)从下面菌种的液体培养物制备须发癣菌(AEMP-TM)，石膏状小孢子菌(AEMP-MG)或白色假丝酵母(AEMP-CA)。液体培养物基本上在按照EP0564620所述的条件下培养。各AEMP制剂依据下列方法获得。I.AEMP-TM在26℃下1000毫升蒸馏水中温育须发癣菌240小时。然后离心含有大约每毫升1.2×108细胞的培养物。冷冻干燥上清液并溶于100毫升蒸馏水，加入3体积甲醇并将沉淀溶于水溶液。冷冻干燥上清液产生AEMP-TM。II.AEMP-MG在28℃下200毫升载体C(RPMI1640培养基，来自Serva)中培养石膏状小孢子菌50小时。离心含有大约每毫升3×107细胞的培养物。冷冻干燥上清液并溶于20毫升蒸馏水，加入2体积甲醇并将沉淀溶于水溶液。冷冻干燥上清液产生AEMP-TM。III.AEMP-CA在37℃下800毫升载体B(1％(w/v))来自Oxoid的肉汤lab-lemco，0.1％(w/v)来自Oxoid的酵母抽提物和5％(w/v)葡萄糖)中培养白色假丝酵母30小时。离心含有大约每毫升108细胞的培养物。冷冻干燥上清液并溶于少量蒸馏水，加入2体积甲醇并将沉淀溶于水溶液。将上清液冷冻干燥产生AEMP-TM。实施例4测定了不同的抗原制剂对角质形成细胞的细胞培养物(HaCaT细胞培养物)生长的影响。I.使用了不同浓度的从须发癣菌DSMNo.7279制备的ASMP-TM，ANMP-TM，和AEMP-TM，从石膏状小孢子菌DSMNo.7274制备的ASMP-MG，ANMP-MG，和AEMP-MG，以及从白色假丝酵母DSMNo.9656制备的ASMP-CA，ANMP-CA，和AEMP-CA等抗原性组分。将如根据实施例2所述制备的ANMP组分冷冻干燥并重新悬浮于PBS(磷酸浓度于生理pH大约7.2为6.7mM的磷酸盐缓冲液；购于Serva，产品目录号17-516)。使用Falcon的12孔组织培养板(平底，表面积9.6厘米2)进行培养。每孔中加入0.15毫升浓度为每毫升营养培养基(补充有10％(w/v)胎牛血清的RPMI1640)1百万细胞的角质形成细胞细胞悬液(HaCaT细胞)，2毫升营养培养基，以及溶于PBS的0.02-0.1毫升抗原性组分。对照孔中不加入抗原性组分。在5％(v/v)二氧化碳培养箱中37℃下培养48小时，至对照孔中形成铺满的细胞单层。将用抗原性组分处理的细胞层面积与未用抗原性组分处理的对照相比较(对照＝100％)确定了对细胞生长的抑制。结果显示于表2和3。在ASMP-MG浓度0.1毫克/毫升，ASMP-TM浓度0.3毫克/毫升，以及ASMP-CA浓度1毫克/毫升下观察到细胞生长的抑制。对于ANMP(MG，TM，和CA)在浓度1毫克/毫升观察到抑制。对于AEMP-MG，在浓度为0.3毫克/毫升时观察到细胞生长的抑制，以及对AEMP-TM和AEMP-CA浓度为1毫克/毫升。实施例5测定了不同抗原性组分对马淋巴细胞细胞增殖的影响。使用了真菌菌株须发癣菌DSMNo.7279，石膏状小孢子菌DSMNo.7274；以及白色假丝酵母DSMNo.9656的ASMP和AEMP抗原性组分。制备了大约每毫升营养培养基40000淋巴细胞(来自冰岛马)的悬液。营养培养基RPMI1640补充有10％(w/v)胎牛血清。在96孔U形底组织培养板(FalconNo3077)上培养淋巴细胞。每孔分装200微升细胞悬液并加入溶于PBS的20微升抗原性组分。对照中未加抗原性组分物质。在37℃下5％(v/v)二氧化碳条件下培养组织培养板72小时。然后换营养培养基并加入含H3胸腺嘧啶的溶液(每孔1微升)。再进行12小时培养步骤，用PBS洗培养物。如Boehncke等，1994，Scand，免疫学杂志(J.Immunol.)39，pp.327-332所述用放射分析技术确定细胞增殖。通过比较试验培养物与未暴露于抗原性组分物质的对照测量细胞增殖。对照值定义为100％。结果显示于表4。各抗原性组分对淋巴细胞的细胞增殖有抑制或刺激效应。实施例6此实施例阐明典型的组合物制剂。此实施例中所述的组合物(1到5)制备于须发癣菌DSMNo.7279，石膏状小孢子菌DSMNo.7274或白色假丝酵母DSMNo.9656。I.组合物1在合适载体中含有ASMP-TM，ASMP-MG，和ASMP-CA，在实施例中</tables>组合物1.1在合适载体中含有ASMP-MG，和ASMP-CA，在实施例中</tables>II.组合物2在合适载体中含有ANMP-TM，ANMP-MG，以及ANMP-CA，在实施例中</tables>III.组合物3在合适载体中含有AEMP-TM，AEMP-MG，以及AEMP-CA，在实施例中</tables>IV.组合物4在合适载体中含有ANMP和AEMP，在实施例中(i)组合物4.1ANMP-CA96562.5％(v/v)AEMP-TM72797.1毫克/毫升在载体A或B或C中</tables>V.组合物5在合适载体中含有ASMP和ANMP，在实施例中实施例7在动物模式系统中(小白鼠，豚鼠，和马)进行疫苗接种实验检测了不同抗原性制剂的安全性。如实施例1到3和6中所述从须发癣菌DSMNo.7279，石膏状小孢子菌DSMNo.7274，或白色假丝酵母DSMNo.9656制备了抗原性组分。下面关于接种动物状况的临床观察是在每次接种后每天进行直至5天1.一般状况-食欲-对行动的影响2.局部反应-注射部位的水肿和发炎-注射部位的温度变化-注射部位的疼痛发生-用药物处理注射部位的必要性I.抗原制剂腹内注射到小白鼠以及腹内和皮下注射到豚鼠一次或相隔10天注射两次。抗原制剂，其浓度及结果显示于表5和6(A和B)。作为单一或组合物制剂皮下或腹内注射真菌抗原通常对动物的一般状况没有不良效应并且未观察到注射部位的局部反应。II.将描述于实施例6(组合物4.1，4.2，和5)的真菌抗原的组合物制剂每种一次肌肉内注射到同一匹马的不同部位(脖子的左侧和右侧以及一块胸肌)。接种了三匹不同的马(i)一匹怀孕母马，(ii)一匹马驹，年龄7-8个月，和(iii)一匹雄马，年龄6岁。抗原制剂，其浓度及结果显示于表7。作为组合物制剂的真菌抗原的肌肉内注射对马的一般状况没有影响并且在注射部位未发现局部反应。这些研究证明了本发明抗原制剂优秀的安全性。实施例8在小白鼠中研究了不同抗原制剂对皮肤和皮毛状况的影响。如实施例1到3和6中所述从须发癣菌DSMNo.7279，石膏状小孢子菌DSMNo.7274，或白色假丝酵母DSMNo.9656中制备了抗原制剂。将抗原制剂间隔10天腹内注射到小白鼠两次。对皮肤和皮毛状况的观察持续5天。抗原制剂，其浓度及结果显示于表8。与患皮炎的对照动物相比，注射抗原制剂改善了小白鼠的皮肤和皮毛状况。实施例9通过有安慰剂对照试验的对患夏季湿疹冰岛马的接种研究了三种不同抗原制剂的功效。如实施例1到3和6中所述从须发癣菌DSMNo.7279，石膏状小孢子菌DSMNo.7274以及白色假丝酵母DSMNo.9656中制备了抗原制剂。将含有单独的抗原制剂的1毫升载体A肌肉内注射三次。每次注射间隔5天。交替地在胸肌右侧和左侧进行注射。抗原制剂，其浓度和结果显示于表9和10。第三次注射四星期后，给予含有ASMP-MG7274，ASMP-TM7279，和ASMP-CA9656的抗原制剂使所有接种的马(3)完全治愈。对照组的马(注射不含抗原的载体A)未显示任何康复迹象。实施例10通过有安慰剂对照试验的对患夏季湿疹冰岛马的接种研究了三种不同抗原制剂的安全性。如实施例1到3和6中所述从须发癣菌DSMNo.7279，石膏状小孢子菌DSMNo.7274以及白色假丝酵母DSMNo.9656中制备了抗原制剂。将含有单独的抗原制剂的1毫升载体A肌肉内注射三次。每次注射间隔5天。交替地在胸肌右侧和左侧进行注射。每次注射后三天时间内观察动物的副作用。抗原制剂，其浓度及结果显示于表11。未发现通常的副作用如发烧或食欲不振。只有一种抗原制剂在注射部位引起肿胀。此微小副作用只在一匹马中观察到。未观察到疼痛征兆。实施例11在实验室动物模型中研究了单一组分ASMP-TM7279，ASMP-MG7274和ASMP-CA9656以及含有ASMP-TM7279，ASMP-MG7274和ASMP-CA9656的组合物1的抗变态反应功效。根据实施例1制备了单一组分。根据实施例1和6制备组合物1。按照鼠耳肿胀检测(MouseEarSwellingTest)(GadSC，DimmBK，DobbsDW，ReillyC，WalshRD一种替代的皮肤敏感作用检测的研究和证实鼠耳肿胀检测(DevelopmentandValidationofanAltemativeDermalSensitizationTestTheMouseEarSwellingTest)(MEST)。毒理学及应用药理学(ToxicologyandAppliedPharmacology)84，93-114，1986)。这是一种众所周知的，已证实并为OECD接受的测定变应性物质的检测方法。为了证明组合物或其单一组分的抗变态反应能力的功效，应当防止变应原造成的耳肿胀。进行了安慰剂鼠对照研究以及使用了两种不同的变应原。使用对变应原最敏感的CF-1鼠进行了MEST。通过刮净腹部皮肤，在0到4天向刮净的腹部皮肤局部注射0.05毫升福氏佐剂以及在一个试验中用100微升变应原1-氯-2，4-二硝基氯苯(DNCB)在另一试验中用螨变应原从而准备好6-10周年龄的CF-1鼠。7天后，将20微升变应原局部施用到实验耳，将溶解溶液用于对照耳。24和48小时后检测耳厚度。用相同的方法处理对照组，它们已用安慰剂而不是组合物或组合物各组分处理。与对照组相比，使用单一组分ASMP-TM7279，ASMP-MG7274和ASMP-CA9656和含有ASMP-TM7279，ASMP-MG7274和ASMP-CA9656的组合物再攻击后48小时后使蠓变应原致敏后的耳肿胀减小90％以及使DNCB致敏后的耳肿胀减小87.5％。实施例12通过接种一匹患夏季湿疹的冰岛马证明了按照实施例1制备的含有抗原制剂ASMP-MG7274和ASMP-CA9656的组合物制剂的功效。皮下注射含0.2毫克MG和0.2毫克CA的0.4毫升载体A三次，每次注射之间间隔5天，使接种的马在最后一次注射三星期后治愈，这由临床症状的显著消退证明。未观察到副作用。实施例13通过接种一位患有湿疹，在第4，5脚趾之间皮肤有发炎，痒，糜烂的41岁男病人证明了按照实施例1(ASMP)从石膏状小孢子菌DSMNo.7274制备的抗原制剂的功效。皮下注射含有0.4毫克ASMP-MG7274的0.1毫升载体A仅一次。治疗4-5天后皮肤变成正常。注射24小时后已消除了痒。未观察到强烈的副作用。实施例14证明了按照实施例1所述(ASMP)从白色假丝酵母DSMNo.9656制备的一种抗原制剂在治疗神经性皮炎中的功效。使用购于Procter&Gamble的“KamillHandundNagelcreme”将ASMP-CA9656混合到乳剂中，至终浓度每毫升乳剂60毫克ASMP-CA9656。将制剂局部用于患神经性皮炎的在两耳附近皮肤有黄痂的3岁女孩。将乳剂每天局部用药到皮肤损伤部分，持续30天。此治疗之后皮肤转为正常。未观察到副反应。实施例15证明了如实施例1所述(ASMP)从石膏状小孢子菌DSMNo.7274制备的抗原制剂在湿疹治疗中的功效。使用购于Procter&Gamble的“KamillHandundNagelcreme”将ASMP-MG7274混入乳剂，至终浓度每毫升乳剂60毫克ASMP-CA9656。通过局部用药处理患有湿疹，无名指发炎，糜烂和发痒的30岁男病人皮肤的患病部分，每天一次持续30天。治疗后完全治愈。开始治疗几天后即不再发痒。未观察到副作用。实施例16通过接种一匹直到六月还未换冬毛的5岁马检测了依据实施例1所述(ASMP)从石膏状小孢子菌DSMNo.7274，须发癣菌DSMNo.7279，以及白色假丝酵母DSM，No.9656制备的抗原制剂的功效。间隔5天肌肉内注射三次含有15毫克ASMP-MG7274，ASMP-TM7279和ASMP-CA9656每种抗原制剂(终浓度45毫克ASMP/毫升)的1毫升载体A，15天内导致完全变成正常季节毛。未观察到副作用。实施例17证实了如实施例1所述(ASMP)从石膏状小孢子菌DSMNo.7274，须发癣菌DSMNo.7279，以及白色假丝酵母DSMNo.9656制备的一种组合物抗原制剂在治疗脱发中的功效。使用含有10毫克ASMP-MG7274，ASMP-TM7279和ASMP-CA9656每种抗原制剂的1毫升载体A(终浓度30毫克/毫升)的疫苗处理全身分别有3-5和7-10处不同部位患有脱毛症的两匹7岁马。间隔5天肌肉内注射疫苗三次，最后一次用药10天后两匹马完全恢复了皮毛。未观察到副作用。实施例18证明了如实施例1所述(ASMP)从石膏状小孢子菌DSMNo.7274，须发癣菌DSM.No.7279，以及白色假丝酵母DSMNo.9656制备的一种组合物抗原制剂在治疗马脱毛症中的功效。使用含有15毫克ASMP-MG7274，ASMP-TM7279和ASMP-CA9656每种抗原制剂的1毫升载体A(终浓度45毫克/毫升)的疫苗处理全身有10-12处不同部位患有脱毛症的一匹10岁马。间隔5天肌肉内注射疫苗三次，最后一次用药15天后完全恢复3皮毛。未观察到副作用。实施例19证明了如实施例1所述(ASMP)从石膏状小孢子菌DSMNo.7274，须发癣菌DSM，NO.7279，以及白色假丝酵母DSMNo.9656制备的一种组合物抗原制剂在治疗狗脱毛症中的功效。使用含有10毫克ASMP-MG7274，ASMP-TM7279和ASMP-CA9656每种抗原制剂的1毫升载体A(终浓度30毫克/毫升)的疫苗处理全身有2-3处不同部位患有脱毛症的一条3岁母狗。间隔5天肌肉内注射疫苗三次，最后一次用药15天后完全恢复了皮毛。未观察到副作用。实施例20证明了如实施例1所述(ASMP)从石膏状小孢子菌DSMNo.7274，须发癣菌DSMNo.7279，以及白色假丝酵母DSMNo.9656制备的一种组合物抗原制剂在治疗狗脱毛症中的功效。使用含有15毫克ASMP-MG7274，ASMP-TM7279和ASMP-CA9656每种抗原制剂的1毫升载体A(终浓度45毫克/毫升)的疫苗处理全身有2-4处不同部位患有脱毛症的分别为5岁和8岁的两条公狗。间隔5天肌肉内注射疫苗三次，最后一次用药30天后完全恢复了皮毛。未观察到副作用。表2各抗原性组分浓度对角质形成细胞的细胞培养的影响(HaCat细胞百分数，与未暴露于抗原性组分的对照相比(铺满的细胞单层对照＝100％)表3产生角质形成细胞(HaCaT细胞)50％生长抑制的各抗原性组分浓度</tables>表4各抗原性组分对马淋巴细胞的细胞增殖的影响</tables>表5A“首次注射”单独的抗原性组分后实验动物(小白鼠，体重12-14克)的反应表5B“首次注射”组合物制剂后实验动物的反应</tables>表6A“第二次注射”单独的抗原性组分后实验动物(小白鼠，体重12-14克)的反应</tables>表6B“第二次注射”组合物制剂后实验动物的反应[毫克/毫升]或[％(体积/体积)]表7注射(单一注射)组合物制剂后马的反应(每匹马在同一时间在不同部位分别注射序号4.1，4.2和5组合物)表8注射组合物抗原制剂后小白鼠(体重12-14克)皮毛状况</tables>表9患有夏季湿疹的冰岛马中测定的各组合物制剂的接种功效</tables>表10患有夏季湿疹的冰岛马中测定的各组合物制剂的接种功效</tables>表11患有夏季湿疹的冰岛马中测定的各种抗原制剂的接种安全性</tables>表12核磁共振-谱图<</tables>ppm＝百万分之(几)s＝单峰图1到4显示于图1到4的ASMP和AEMP的核磁共振实验根据下面所述进行谱图用250兆赫兹BRUKER数字型核磁共振谱仪(型号DRX400)在D2O中获得，1H频率为400.13Mc。扫描宽度14.5ppm，室温为300K。化学位移通过溶剂峰距离标定。使用合适的BRUKER脉冲序列获得标准的1H-一维谱图。专利程序上的关于微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约原保存说明(规则6.1)DSM德国微生物和细胞培养物的保藏股分有限公司马霞奥达路1bD-3300布良斯维克细菌/霉菌1对下列特征的微生物的保藏是基于布达佩斯条件并且在规则9.1所述期间负有责任不能取回2</tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。2.本表格用于鉴署保藏的微生物，如其本身或其前身已有保藏单位，但不是在布达佩斯条约内的，则可按布达佩斯条约请求移求保藏。因而，不管其原保藏是在获得国际保藏单位地位时之前或之后，都是一样的。3.编号，符号等由微生物保藏单位给予。4.需提出，微生物的分类特征和/或科学描述5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables></tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables>5.如提交有另外的陈述时，则请求“+”记号。7.需提出，所提交微生物的科学描述和/或所推荐的分类特征8.不提交另外陈述时划“+”字(除注5所述外)例如微生物起源，其它保藏地点的名称和通讯地址。其中微生物需保藏的，或者对所推荐分类学特征所使用的标准出处(陈述是有选择的)9.保藏者名字和签署是相同的，公司必须有二个官方公司代理人签名。当法人由自然人签署，则签署字体和打印字体要一致专利程序上的关于微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约原保存说明(规则6.1)DSM德国微生物和细胞培养物的保藏股分有限公司马霞奥达路1bD-3300布良斯维克细菌/霉菌1对下列特征的微生物的保藏是基于布达佩斯条件并且在规则9.1所述期间负有责任不能取回2</tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。2.本表格用于鉴署保藏的微生物，如其本身或其前身已有保藏单位，但不是在布达佩斯条约内的，则可按布达佩斯条约请求移求保藏。因而，不管其原保藏是在获得国际保藏单位地位时之前或之后，都是一样的。3.编号，符号等由微生物保藏单位给予。4.需提出，微生物的分类特征和/或科学描述。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables></tables>5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。7.需提出，所提交微生物的科学描述和/或所推荐的分类特征8.不提交另外陈述时划“+”字(除注5所述外)例如微生物起源，其它保藏地点的名称和通讯地址。其中微生物需保藏的，或者对所推荐分类学特征所使用的标准出处(陈述是有选择的)9.保藏者名字和签署是相同的，公司必须有二个官方公司代理人签名。当法人由自然人签署，则签署字体和打印字体要一致专利程序上的关于微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约原保存说明(规则6.1)DSM德国微生物和细胞培养物的保藏股分有限公司马霞奥达路1bD-3300布良斯维克细菌/霉菌对下列特征的微生物的保藏是基于布达佩斯条件并且在规则9.1所述期间负有责任不能取回21.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。2.本表格用于鉴署保藏的微生物，如其本身或其前身已有保藏单位，但不是在布达佩斯条约内的，则可按布达佩斯条约请求移求保藏。因而，不管其原保藏是在获得国际保藏单位地位时之前或之后，都是一样的。3.编号，符号等由微生物保藏单位给予。4.需提出，微生物的分类特征和/或科学描述5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables>5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。7.需提出，所提交微生物的科学描述和/或所推荐的分类特征8.不提交另外陈述时划“+”字(除注5所述外)例如微生物起源，其它保藏地点的名称和通讯地址。其中微生物需保藏的，或者对所推荐分类学特征所使用的标准出处(陈述是有选择的)9.保藏者名字和签署是相同的，公司必须有二个官方公司代理人签名。当法人由自然人签署，则签署字体和打印字体要一致专利程序上的关于微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约原保存说明(规则6.1)DSM德国微生物和细胞培养物的保藏股分有限公司马霞奥达路1bD-3300布良斯维克细菌/霉菌1对下列特征的微生物的保藏是基于布达佩斯条件并且在规则9.1所述期间负有责任不能取回2</tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。2.本表格用于鉴署保藏的微生物，如其本身或其前身已有保藏单位，但不是在布达佩斯条约内的，则可按布达佩斯条约请求移求保藏。因而，不管其原保藏是在获得国际保藏单位地位时之前或之后，都是一样的。3.编号，符号等由微生物保藏单位给予。4.需提出，微生物的分类特征和/或科学描述5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables></tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables>5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。7.需提出，所提交微生物的科学描述和/或所推荐的分类特征8.不提交另外陈述时划“+”字(除注5所述外)例如微生物起源，其它保藏地点的名称和通讯地址。其中微生物需保藏的，或者对所推荐分类学特征所使用的标准出处(陈述是有选择的)9.保藏者名字和签署是相同的，公司必须有二个官方公司代理人签名。当法人由自然人签署，则签署字体和打印字体要一致专利程序上的关于微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约原保存说明(规则6.1)DSM德国微生物和细胞培养物的保藏股分有限公司马霞奥达路1bD-3300布良斯维克细菌/霉菌1对下列特征的微生物的保藏是基于布达佩斯条件并且在规则9.1所述期间负有责任不能取回2</tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。2.本表格用于鉴署保藏的微生物，如其本身或其前身已有保藏单位，但不是在布达佩斯条约内的，则可按布达佩斯条约请求移求保藏。因而，不管其原保藏是在获得国际保藏单位地位时之前或之后，都是一样的。3.编号，符号等由微生物保藏单位给予。4.需提出，微生物的分类特征和/或科学描述。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables>5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。7.需提出，所提交微生物的科学描述和/或所推荐的分类特征8.不提交另外陈述时划“+”字(除注5所述外)例如微生物起源，其它保藏地点的名称和通讯地址。其中微生物需保藏的，或者对所推荐分类学特征所使用的标准出处(陈述是有选择的)9.保藏者名字和签署是相同的，公司必须有二个官方公司代理人签名。当法人由自然人签署，则签署字体和打印字体要一致专利程序上的关于微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约原保存说明(规则6.1)DSM德国微生物和细胞培养物的保藏股分有限公司马霞奥达路1bD-3300布良斯维克细菌/霉菌1对下列特征的微生物的保藏是基于布达佩斯条件并且在规则9.1所述期间负有责任不能取回2</tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。2.本表格用于鉴署保藏的微生物，如其本身或其前身已有保藏单位，但不是在布达佩斯条约内的，则可按布达佩斯条约请求移求保藏。因而，不管其原保藏是在获得国际保藏单位地位时之前或之后，都是一样的。3.编号，符号等由微生物保藏单位给予。4.需提出，微生物的分类特征和/或科学描述。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables></tables>5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。7.需提出，所提交微生物的科学描述和/或所推荐的分类特征8.不提交另外陈述时划“+”字(除注5所述外)例如微生物起源，其它保藏地点的名称和通讯地址。其中微生物需保藏的，或者对所推荐分类学特征所使用的标准出处(陈述是有选择的)9.保藏者名字和签署是相同的，公司必须有二个官方公司代理人签名。当法人由自然人签署，则签署字体和打印字体要一致专利程序上的关于微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约原保存说明(规则6.1)DSM德国微生物和细胞培养物的保藏股分有限公司马霞奥达路1bD-3300布良斯维克细菌/霉菌1对下列特征的微生物的保藏是基于布达佩斯条件并且在规则9.1所述期间负有责任不能取回2</tables></tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。2.本表格用于鉴署保藏的微生物，如其本身或其前身已有保藏单位，但不是在布达佩斯条约内的，则可按布达佩斯条约请求移求保藏。因而，不管其原保藏是在获得国际保藏单位地位时之前或之后，都是一样的。3.编号，符号等由微生物保藏单位给予。4.需提出，微生物的分类特征和/或科学描述。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。7.需提出，所提交微生物的科学描述和/或所推荐的分类特征8.不提交另外陈述时划“+”字(除注5所述外)例如微生物起源，其它保藏地点的名称和通讯地址。其中微生物需保藏的，或者对所推荐分类学特征所使用的标准出处(陈述是有选择的)9.保藏者名字和签署是相同的，公司必须有二个官方公司代理人签名。当法人由自然人签署，则签署字体和打印字体要一致专利程序上的关于微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约原保存说明(规则6.1)DSM德国微生物和细胞培养物的保藏股分有限公司马霞奥达路1bD-3300布良斯维克细菌/霉菌1对下列特征的微生物的保藏是基于布达佩斯条件并且在规则9.1所述期间负有责任不能取回2</tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。2.本表格用于鉴署保藏的微生物，如其本身或其前身已有保藏单位，但不是在布达佩斯条约内的，则可按布达佩斯条约请求移求保藏。因而，不管其原保藏是在获得国际保藏单位地位时之前或之后，都是一样的。3.编号，符号等由微生物保藏单位给予。4.需提出，微生物的分类特征和/或科学描述。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables></tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables></tables>5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。7.需提出，所提交微生物的科学描述和/或所推荐的分类特征8.不提交另外陈述时划“+”字(除注5所述外)例如微生物起源，其它保藏地点的名称和通讯地址。其中微生物需保藏的，或者对所推荐分类学特征所使用的标准出处(陈述是有选择的)9.保藏者名字和签署是相同的，公司必须有二个官方公司代理人签名。当法人由自然人签署，则签署字体和打印字体要一致国际格式INTERNATIONALFORMBUDAPESTTREATYONTHEINTERNBATIONALRECOGNITIONOFTHEDEPOSUITOF[专利程序上的关于微生物保MICROORGANISMSFORTHEPURPOSES藏的国际承认的布达佩斯条OFPATENTPROCEDURE约]以下遵照国际保藏单位的规则VIABILITYSTATEMENT7.1发行issuedpursuanttoRole7.1bytheINTERNATIONAL保藏证明DEPOSITORYAUTHORITYidentifiedonthebottomofthispage。姓名BoehringerIngelheimInt.GmbH(贝林格尔.英格海姆国际有限公司)寄存人地址Postfach20055216IngelheimamRhein(D-55216德国莱茵河畔英格尔海姆市第200号邮政信箱)</tables></tables>专利程序上的关于微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约原保存说明(规则6.1)DSM德国微生物和细胞培养物的保藏股分有限公司马霞奥达路1bD-3300布良斯维克细菌/霉菌1对下列特征的微生物的保藏是基于布达佩斯条件并且在规则9.1所述期间负有责任不能取回2</tables></tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。2.本表格用于鉴署保藏的微生物，如其本身或其前身已有保藏单位，但不是在布达佩斯条约内的，则可按布达佩斯条约请求移求保藏。因而，不管其原保藏是在获得国际保藏单位地位时之前或之后，都是一样的。3.编号，符号等由微生物保藏单位给予。4.需提出，微生物的分类特征和/或科学描述。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables></tables>1.DSM仅接受以下微生物保藏，属于按化学工业专业协会的安全生物学细菌(B0061/92ZH1/346)”的活页中所属的危险组1或2，或属于按“基因工程问题的控制法规”中所用的劳动安全方案S1或S2。5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。</tables>5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。6.GenTH＝调解有关遗传工程问题的德国法律5.如提交有另外的陈述时，则请作“+”记号。7.需提出，所提交微生物的科学描述和/或所推荐的分类特征8.不提交另外陈述时划“+”字(除注5所述外)例如微生物起源，其它保藏地点的名称和通讯地址。其中微生物需保藏的，或者对所推荐分类学特征所使用的标准出处(陈述是有选择的)。9.保藏者名字和签署是相同的，公司必须有二个官方公司代理人签名。当法人由自然人签署，则签署字体和打印字体要一致权利要求1.用于制备含有多糖和/或糖肽的抗原性可溶物质(ASMP)的方法，特征在于属于喜角质真菌或酵母类群的真菌细胞，或其物质-在碱性水溶液中处理，-分离制备物的固相和液相，-分离后用无机或有机酸处理上清液，以及-分离后从上清液中沉降ASMP。2.根据权利要求1所述的方法，特征在于上述真菌细胞或其物质-在大约20-150℃下用大约0.1-5％(重量/体积)氢氧化钾或氢氧化钠处理30小时，-离心，-离心后用0.2-1.5M有机酸或0.05-1M无机酸处理上清液，-离心后用合适的有机溶剂或一种盐，例如用一种醇诸如低级烷醇，或硫酸铵处理上清液，以及-回收沉淀以及如果需要则溶于水溶液。3.用于制备含有多糖和/或糖肽的抗原性不可溶物质(ANMP)的方法，特征在于属于喜角质真菌或酵母类群的真菌细胞，或其物质-在碱性水溶液中处理，-分离制备物的固相和液相，以及-分离后用无机或有机酸处理固相。4.根据权利要求3所述的方法，特征在于上述真菌细胞或其物质-在大约20-150℃下用大约0.1-5％(重量/体积)氢氧化钾或氢氧化钠处理30小时，-用0.2-1.5M有机酸或0.05-1M无机酸处理固相，以及-用水溶液清洗。5.用于制备含有多糖和/或糖肽的抗原性外源物质(AEMP)的方法，特征在于属于喜角质真菌或酵母类群的真菌细胞，或其物质-在液体培养基中培养，-分离制备物的固相和液相，以及-分离后AEMP从上清液中沉降出来。6.根据权利要求5所述的方法，特征在于-培养直至250小时，-分离后向上清液中加入一种醇，以及-回收沉淀以及如果需要则溶于水溶液。7.根据权利要求5或6所述的方法，特征在于-分离后将上清液冻干，-溶于水溶液，-用大约1-5体积的醇沉降后，将沉淀溶于水溶液，-将溶液冻干。8.根据权利要求1到7中的一个所述的方法，特征在于上述喜角质真菌至少属于下列真菌属中的一个发癣菌属和/或小孢子菌属和/或上述酵母菌属于假丝酵母属。9.根据权利要求1到7中的一个所述的方法，特征在于上述真菌属于下列真菌种的一个-马发癣菌，-须发癣菌，沙凯斯维发癣菌，-疣状发癣菌，-犬小孢子菌，-石膏状小孢子菌，或-白色假丝酵母。10.根据权利要求1到7中的一个所述的方法，特征在于上述真菌属于下列真菌菌株的一个-马发癣菌DSMNo.7276，-须发癣菌DSMNo.7279，-沙凯斯维发癣菌DSMNo.7278，-疣状发癣菌DSMNo.7277，-犬小孢子菌DSMNo.7281，-犬小孢子菌肥大变种DSMNo.7280，-犬小孢子菌扭曲变种DSMNo.7275，-石膏状小孢子菌DSMNo.7274，或-白色假丝酵母DSMNo.9656。11.在哺乳动物中具有抗变态反应活性的含多糖和/或糖肽的一种物质，上述物质可通过合适的分离技术，例如那些阐述权利要求1，3和5任一的方法，衍生于或能够衍生于喜角质真菌或酵母菌或其物质。12.可按照权利要求1或2或权利要求8到10中的任一个所述制备的物质(ASMP)。13.可按照权利要求3或4或权利要求8到10中的任一个所述制备的物质(ANMP)。14.可按照权利要求5到7中的任一个或权利要求8到10中的任一个所述制备的物质(AEMP)。15.根据权利要求11或12所述的物质，特征在于它含有来自须发癣菌DSMNo.7279的ASMP，来自石膏状小孢子菌DSMNo.7274的ASMP以及来自白色假丝酵母DSMNo.9656的ASMP。16.根据权利要求11或13所述的物质，特征在于它含有来自须发癣菌DSMNo.7279的ANMP，来自石膏状小孢子菌DSMNo.7274的ANMP以及来自白色假丝酵母DSMNo.9656的ANMP。17.根据权利要求11或14所述的物质，特征在于它含有来自须发癣菌DSMNo.7279的AEMP，来自石膏状小孢子菌DSMNo.7274的AEMP以及来自白色假丝酵母DSMNo.9656的AEMP。18.含有如权利要求11到17中任一个所述的物质的任何组合的物质。19.根据权利要求18所述的物质，特征在于它含有ASMP和AEMP。20.根据权利要求18所述的物质，特征在于它含有ASMP和AEMP以及ANMP。21.根据权利要求18所述的物质，特征在于它含有AEMP和ANMP。22.根据权利要求18所述的物质，特征在于它含有ASMP和ANMP。23.含有如权利要求11到22中任一个所述的物质的疫苗。24.含有如权利要求11到23中任一个所述的物质与一种合适的生理载体的疫苗。25.含有如权利要求11到24中任一个所述的物质的注射液。26.将权利要求11到25中任一个所述的物质用于医药用途。27.将如权利要求11到25中的任一个所述的物质用作药品。28.将权利要求11到25中的任一个所述的物质用于制备药品，该药品用于预防和/或治疗变态反应。29.将权利要求11到25中的任一个所述的物质用于制备药品，该药品用于调节免疫反应。30.一个用于预防和/或治疗变态反应的方法，包括向哺乳动物施用有效量的如权利要求11到25中的任一个所述的物质。31.一个调节哺乳动物免疫反应的方法，包括向哺乳动物施用有效量的如权利要求11到25中的任一个所述的物质。32.以登记号No.9656保藏于德意志微生物保藏中心(DSM)′的白色假丝酵母，以及也具有低病原性并能提供如权利要求11所述物质的该菌的突变体。33.根据权利要求11或12所述的物质，特征在于它含有来自菌株石膏状小孢子菌DSMNo.7274的ASMP以及来自菌株白色假丝酵母DSMNo.9656的ASMP。34.将定义于权利要求11到25或33中的任何一个中的物质用于制备药品，该药品用于预防或治疗夏季湿疹。35.将定义于权利要求11到25或33中的任何一个中的物质用于制备药品，该药品用于预防或治疗脱毛症。36.将定义于权利要求11到25或33中的任何一个中的物质用于制备药品，该药品用于预防或治疗湿疹。37.将定义于权利要求11到25或33中的任何一个中的物质用于制备药品，该药品用于预防或治疗神经性皮炎。38.将定义于权利要求11到25或33中的任何一个中的物质用于制备药品，该药品用于改善哺乳动物毛发。全文摘要本发明涉及含有能够从喜角质真菌以及酵母菌中制备的多糖和/或糖肽的抗原制剂,制备这些抗原制剂的方法,它们作为药物的应用以及它们作为疫苗的应用,包括但不限于,预防或治疗变态反应,以及调节免疫反应。文档编号A61P37/00GK1199426SQ96197571公开日1998年11月18日申请日期1996年8月9日优先权日1995年8月11日发明者迪特尔·法诺,乔基姆·卡勒,伊戈·D·玻利亚可夫,柳德米拉·G·依凡诺娃申请人:贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司