专利名称：肿瘤疫苗及其制备方法
基于肿瘤细胞的治疗用疫苗的开展主要是根据下列前提，在肿瘤细胞与正常细胞之间存在量或质的区别；免疫系统原则上具有识别上述区别的能力；通过用疫苗进行有效的特殊免疫作用，而可以刺激该免疫系统，并根据这种区别可以识别肿瘤细胞，由此，导致它们被推斥。
为了引起一个抗肿瘤应答，至少必须满足两个条件第一，肿瘤细胞必须表达正常细胞中没有的抗原或新抗原决定基。第二，必须使免疫系统进行活化，以便对上述抗原进行反应。对肿瘤进行免疫治疗的一大难题是其低免疫原性，尤其是在人体中。就这点而言，令人惊奇的是，正如预料那样，在恶性细胞中的大量基因变化导致肽-新抗原决定基的形成，它可被细胞毒素的T-淋巴细胞的MHC-I-分子范围所识别。
最近，发现了与肿瘤有关的以及肿瘤特定的抗原，它们构成新抗原决定基，而且由此应构成被免疫系统袭击的潜在目标。然而，它对免疫系统在消除表达这些新抗原决定基的肿瘤中并没有成功，这明显地，不是由于新抗原决定基缺乏。而是由于对该新抗原决定基的免疫性应答不够。
为了对细胞基的癌进行免疫治疗，应该开展两个一般的策略一方面所采用的免疫治疗，它是使用肿瘤反应性的T-淋巴细胞在体外扩张，并又重新引入病人中；另一方面是有效免疫治疗，它使用肿瘤细胞，以期待对肿瘤抗原形成新的或更强的免疫应答，导致系统性的肿瘤应答。
可以用各种不同方式制备基于有效免疫治疗的肿瘤疫苗，例如，辐照混有免疫刺激物助剂的肿瘤细胞，如小棒状杆菌属(Corynebacterium parvum)或菌Calmetle Guerin(BCG)以引起抗肿瘤抗原的免疫反应(Oettgen与Old，1991年)。
近几年来，尤其是采用了基因改性的肿瘤细胞，以便对癌症进行有效的免疫治疗。其中，引入到肿瘤细胞中的外来基因分成三个种类其中之一是使用基因改性的肿瘤细胞，以产生胞质分裂素。肿瘤细胞和胞质分裂素信号的局部重合，认为是有一种激起抗肿瘤免疫性的刺激物。应用这种策略的综述可参阅Pardoll，1993年，Zatloukal等人，1993年，及Dranoff与Mulligan，1995年。
具有为分泌细胞分裂素，如IL-2，GM-CSF或IFN-γ，或者为表达共-刺激的分子的改性的肿瘤细胞已在动物试验中表明，产生了有效的抗肿瘤免疫性(Dranoff等人，1993年；Zatloukal等人，1995年)。在具有明显肿瘤，而且已发展为对肿瘤产生耐受力的人中，要完全检测这一系列综合的交替作用，以便产生有效的抗肿瘤反应，是非常困难的。在人体上使用分泌细胞分裂素的肿瘤疫苗的实质效用，至今尚未被证实。
另一类用于改性肿瘤细胞以作为肿瘤疫苗使用的编码所谓的辅助蛋白，这种方法的目的在于，使肿瘤细胞转化为有抗原的细胞(新APCs)以便能直接产生肿瘤特定的T-淋巴细胞。这类方法的实例描述于Ostrand-Rosenberg，1994年。
肿瘤抗原(TAS)或由其衍生的肽的分离与识别，例如，已描述于Wolfel等人1994年a)与1994年b)；Garrel等人，1993年，Lehmann等人1989年，Tibbets等人，1993年，或国际专利申请文献Wo 92/20356，Wo 94/05304，Wo94/23031，Wo 95/00159。这些方法，对使用肿瘤抗原作为肿瘤疫苗的免疫原是必要的，该免疫原可以是以蛋白质形式，也可以肽形式存在。但是，上述的肿瘤抗原形式的肿瘤疫苗。对激起细胞的免疫应答仍是不足以致免疫性，免疫应答对清除带肿瘤抗原的肿瘤细胞是必要的，助剂的共同施用仅对加强免疫应答提供有限的可能性(Oettgen和Old，1991年)。
用于提高肿瘤疫苗效用的第三种有效免疫治疗策略是，基于异基因化(外来的)自体的肿瘤细胞。这种概念是基于免疫系统和表达一个外来蛋白的肿瘤细胞反应。并在这反应过程中，也引起了一个针对这些肿瘤抗原(TAs)的免疫应答，该免疫应答是由疫苗的肿瘤细胞呈现的。
Zatloukal等人，在1993年提出了这些不同方法的综述。其中，通过采用不同的基因，而使肿瘤细胞异化以便加强免疫原性。
三分子复合物在调节特定的免疫应答时起了重要作用，该三分子复合物是由T-细胞-抗原受体，MHC(主要组织相容性复合物)分子与其配位体所组成的，它是一个由肽片段衍生的蛋白质。
MHC-I-分子(或其对应的人体分子，即HLAs)是具有严格特性的肽受体，它可以结合上百万的不同的配位体。上述前提，可以由等位基因(Allel)特性的肽型主提供，它有下列的特性要求，根据MHC-I单模标本，该肽具有一定的长度，该长度实质上有8-10个氨基酸基团。通常两个氨基酸位置是所谓“固定式”，它仅能由一个单氨基酸或具有紧密关系的侧链的多氨基酸基团所占有。固定式氨基酸在肽中的确切位置以及特性要求随HMC-I-单模标本而变化。肽配位体的C-末端经常是一个脂族的或有加载基团。此外，这种等位基因特性的MHC-I-肽-配位体型主，迄今是众所周知的特别是，H-2Kd、Kb、Kk、Kkml、Db、HLA-A*0201、A*0205与B*2705。
在细胞内部的蛋白质转化的范围内，会使有规则的、退化的与外来的基因产物，如病毒性蛋白质或肿瘤抗原分解成小的肽。其中有一些构成用于MHC-I-分子的潜在的配位体。这就为其由MHC-分子的呈现提供了前提，其结果是导致细胞的免疫应答的激发，虽然至今尚不能清楚地解释，作为MHC-I-配位体的肽在细胞中是如何制备出来的。
为了加强免疫应答而使用这种用于异化肿瘤细胞的一种方法，包括用诱变的化学试剂，例如从N-甲基-N′-亚硝基胍处理肿瘤细胞。它将导致，肿瘤细胞呈现从细胞蛋白质的突变的变异体衍生的新抗原，构成外来的基因产物(Van Pel与Boon，1982年)。然而，因为该诱变的情况是随机地分布在基因组上，因此，可期待使一些细胞，由于不同的诱变情况而表现不同的新抗原。这种方法在质量方面与数量方面来看是难于控制的。
用一个或多个外来的蛋白质的基因转染而异化肿瘤细胞的另一方法，例如，用一个不同单模标本的外来MHC-I-分子或MHC-蛋白质，对其进行转染，然后呈现在细胞表面上(EP-A20569678；Plautz等人，1993年；Nabel等人，1993年)。这种方法是基于上述概念，即当以整体细胞疫苗形式使用时，肿瘤细胞根据表达的蛋白质或由其衍生的肽而被识别为异种，或者当自体的MHC-I-分子进行表达时，通过提高细胞表面上的MHC-I-分子的量，而使肿瘤抗原的呈现达到最佳化。由此，用一个外来蛋白质修饰肿瘤细胞。可使该细胞在MHC范围内呈现来自外来蛋白质的肽，并在MHC-肽-复合体识别范围内。产生了从“自体的”到“外来的”的变化。当识别一个蛋白质或肽为异种时，意味着在免疫识别过程中，不仅针对外来的蛋白质，而且针对归属于肿瘤细胞的肿瘤抗原产生一种免疫应答。在上述过程中，呈现抗原的细胞(APCs)是活性的。它们处理存在于疫苗的肿瘤细胞的蛋白质(包括TAs)以形成肽，而且作为配位体用于它们自己的MHC-I与MHC-II分子。上述活性的，加载肽的APCs移位到淋巴结中，其中一些未成熟的T-淋巴细胞识别来自APCS上的TA的肽，而且可将其用作克隆扩张的刺激物，换句话说，用于产生肿瘤特定的CTLs与T-辅助细胞。
本发明的目的在于，制备一个新的基于异化肿瘤细胞的肿瘤疫苗，借助于该疫苗引发一种有效的，细胞性抗-肿瘤免疫应答。
为了达到上述目的，特作如下考虑，当非恶性的，正常的体细胞忍受免疫系统时，该活体就藉助于免疫应答与正常细胞作用，如该细胞合成对体呈异源的蛋白质则导致病毒感染，并有免疫保护。其原因在于，MHC-I分子呈现来自异种蛋白异种肽，因而，免疫系统记录了某些令人讨厌的并对细胞产生异种性。排除该细胞，使APCs活化。并产生一种新的针对表达外来蛋白的细胞的特定的免疫性。
肿瘤细胞含有有关的特定的肿瘤抗原。然而，它们是非有效的疫苗。因为，其微小的免疫原性，对于免疫系统而言是可以忽略不计的。对比已知的方法，对肿瘤细胞不是加载了一个外来蛋白质，而是加载一个外源肽。除了上述外来肽以外，细胞本身的肿瘤抗原将被该细胞识别为外来体。通过用一个肽异化后，可以达到通过外源肽引发的针对肿瘤抗原的细胞免疫应答。
肿瘤细胞的微小免疫原性的原因，不是质的问题，而是量的问题。对于一个由肿瘤抗原衍生的肽而言，它虽然由MHC-I分子所呈现，然而其浓度是太小，以致于不能激发细胞肿瘤特定的免疫应答。增加在肿瘤细胞上的肿瘤特定性肽的量，也会导致肿瘤细胞的异化作用，从而导致对细胞的免疫应答的激发。与此不同，该肿瘤抗原或由其衍生的肽，用一个编码有关蛋白质或肽的DNA转染而呈现在细胞表面上，如描述于国际专利文献Wo92/20356，Wo 94/05304，Wo 94/23031与Wo 95/00159，由此通过更简化方式制备一种激发有效的免疫应答疫苗。
Mandelboim等人，在1994年与1995年定义用肿瘤抗原衍生的肽培养RMA-S细胞，以便激发针对相应病人自己的肿瘤抗原的细胞免疫应答。Von Mandelboim等人提出以已知为RMA-S的细胞(Karre等人，1986年)用于肿瘤接种。它们被认为能起APCs的作用。它们具有这样的特性，即其在细胞表面上的HLA分子，由于在细胞的TAP-机构中(“抗原性肽的转移”，引起处理肽及其与HLA分子的结合)的缺陷，是空的。因此，该细胞被用于加载一个肽，并同时被用作外来的肽的表现工具。所达到的抗肿瘤效应是基于对在细胞上呈现的肽的免疫应答的激发，它提供与肿瘤细胞的抗原作用没有直接关系的免疫系统。
本发明涉及对患者施用的肿瘤疫苗。它包括本身在HLA范围表现由肿瘤抗原衍生的肽的肿瘤细胞，而且至少其中一部分在细胞表面上具有至少一个患者的MHC-I单膜标本。并且它加载有一个或多个的肽a)和/或b)型，以致使得肿瘤细胞在有患者免疫系统的肽的范围被识别为异源，并激发一种细胞免疫应答。其中，上述的肽是，a)起MHC-T单膜标本的配位体的作用，，它与患者及疫苗的肿瘤细胞是共同的，而不同于被患者细胞所表达的蛋白质所衍生的肽，或是b)起MHC-I-单膜标本的配位体的作用，它与病人及疫苗的肿瘤细胞是共同的，并且是从被患者细胞所表达的肿瘤抗原衍生的，而且存在于疫苗的肿瘤细胞上的浓度在病人的肿瘤细胞上表达时要高于由相同的肿瘤抗原衍生的肽的浓度。
根据国际惯例，把人体的MHC分子在下面称为“HLA”(人体的白细胞抗原)。
术语“细胞的免疫应答”是指细胞毒性的T-细胞免疫性，这是由于产生肿瘤特定性细胞毒性的CD8-阳性的T-细胞与CD4-阳性的辅助-T-细胞而导致肿瘤细胞的破坏。
首先，由肿瘤细胞所得的本发明疫苗的作用主要基于在肿瘤细胞上存在的肿瘤抗原的免疫原性活性被肽所加强。
下列的a)型的肽，以下也称为“外来肽”或“异源肽”。
在本发明的一个实施方案中，疫苗的肿瘤细胞是自体的。它们是取自要治疗处理的患者的细胞，然后在体外用a)和/或b)型肽进行处理。必要时进行失活，然后又对患者施用(制备自体的肿瘤疫苗的方法描述于专利文献Wo94/21808，其内容列入本文作为参考)。
在本发明的一个实施方案中的肿瘤细胞是异源的。也就是说，它不是来源于要治疗处理的患者。当考虑经济时，利用异源细胞特别优先。为各个患者分别制备个人的疫苗是费人力和昂贵的。此外，对各个患者，在体外培养肿瘤细胞也是困难的，以致于不能得到足够量的肿瘤细胞，以制备疫苗。用异源肿瘤细胞，则要注意对患者的HLA-亚型必须匹配。
在使用a)型的外来肽时，在异源肿瘤细胞的情况下，它是一个或多个细胞系的细胞，其中至少一个细胞系表达一个或多个肿瘤抗原。这些肿瘤抗原与要治疗处理的患者的肿瘤抗原是相同的。也就是说，肿瘤疫苗将对患者的肿瘤适应症相匹配。由此可以确保，由表现MHC-I的外来肽对疫苗的肿瘤细胞激发细胞的免疫应答，从而导致肿瘤特定的CTLs与T-辅助细胞的扩张。它同样针对患者的肿瘤细胞，因为它们表达同一个肿瘤抗原，如同疫苗的细胞一样。
当用本发明的肿瘤疫苗治疗处理一个患有乳腺癌转移的女患者，该转移瘤表明是Her2/新突变(Allred等人，1992年；Peopoles等人，1994年；Yoshino等人，1994年a)；Stein等人，1994年；Yoshino等人，1994年b)；Fisk等人，1995年；Han等人，1995年)，所用疫苗包括与女患者的HLA-单膜标本相匹配的异源肿瘤细胞，作为肿瘤抗原它们也同样表达突变的Her 2/neu。最近，分离出大量的肿瘤抗原，并澄清它们与一个或多个的癌症的关系。关于这种肿瘤抗原的另外实例有ras，(Fenton等人，1993年；Gedde Dahl等人，1992年；Jung等人，1991年；Morishita等人，1993年；Peace等人，1991年；Skipper等人，1993年)，MAGE肿瘤抗原(Boon等人，1994年；Slingluff等人，1994年；Van der Bruggen等人，1994年；Wo 92/20356)；Carrel等人，1993年也提出了有关各种肿瘤的综述。
本发明范围内可使用的已知的肿瘤抗原以及由其衍生的肽综述于表中。
通常，患者的肿瘤抗原在制定诊断和治疗计划过程中，是用标准方法，例如使用基于有特性的CTLs测试法，测定出其肿瘤抗原的特性。此外，这种测定方法已由Herin等人，1987年；Coulie等人，1993年；Cox等人，1994年；Rivoltini等人，1995年；Kawakami等人，1995年所描述并已描述于专利文献Wo/14459。这些文献也描述各种不同的肿瘤抗原或由其衍生的肽抗原决定基。在细胞表面上出现的肿瘤抗原也可以用基于抗体的免疫测定法予以鉴测。如果该肿瘤抗原是酶，例如酪氨酸酶，则也可以用酶测定法予以检测。
据本发明的另一个实施方案，可以使用自体的和异源的肿瘤细胞的混合物作为疫苗的原料。本发明的这个实施方案特别适用于，当由患者表达的肿瘤抗原是未知时，或者仅部分表征时，和/或当异源的肿瘤细胞仅表达患者的某些肿瘤抗原时。通过加入，经外来肽处理过的自生肿瘤细胞，能确保，至少疫苗中的部分肿瘤细胞包含有尽可能多的患者自己的肿瘤抗原。异源肿瘤细胞是在一个或多个MHC-I单模标本中与患者相匹配的那些。
对于a)与b)型的肽而言，根据结合到一个MHC-I分子的必要性而限定，其顺序是取决于要给予疫苗的患者的HLA-亚型。测定患者的HLA-亚型，因而就创造了对合适的肽的选择或设计提供了最重要的条件。
使用本发明的以自体肿瘤细胞形成存在的肿瘤疫苗时，通过患者中遗传决定的HLA分子的特性，而自动产生HLA-亚型。患者的HLA-亚型可以用标准方法，例如微-淋巴毒性试验方法(HLC-试验，混合淋巴细胞培养法)检测[Practical lmmunol(实践免疫学)，1989年]。该MLC试验基于这样的原则，首先向患者血液中分离出的淋巴细胞中，在有家兔补体(c)的存在下，加入对特定HLA分子的抗血清或单克隆的抗体。这时，溶解阳性细胞，并吸收指示染料。而未受损的细胞保留不被染色。
为了确定患者的HLA单模标本，还可以使用RT-PCR(Curr.Prot.Mol.Biol第2和15章)。为此，取患者的血样，并从中分离出RNA。首先，使该RNA经受反转录。导致形成患者的cDNA。该cDNA作为基质用于和引物对的聚合酶链式反应。该引物对特定性地引起DNA片段的放大作用，它代表一个确定的HLA单模标本。经琼脂糖凝胶电泳反应后呈现一个DNA区带。患者表达相应的HLA分子。如没有呈现出区带，则，该患者是阴性。对每个患者至少要两个区带。
在应用本发明的异源疫苗时，使用的细胞中，至少一部分是对患者的至少一个HLA-亚型匹配。考虑到尽可能广泛地应用本发明的疫苗。优选使用不同的细胞系混合物作为原料。常常发现表达两种或三种不同的HLA-亚型。其中尤其是考虑HLA-A1与HLA-A2。用一个基于表达这些单模标本的异源肿瘤细胞的混合物的疫苗，可以覆盖广泛的患者。为此，可以覆盖约70％的欧洲人口(Mackiewicz等人，1995年)。
本发明所用的肽的定义，通过HLA-亚型，确定了其固定式氨基酸及其长度；确定的固定式的位置和长度确保，肽适于进入有关的HLA分子的肽结合的孔槽中并存在于构成疫苗的肿瘤细胞的细胞表面上，以致使得该细胞被识别为外来的。由此引起，对免疫系统的激发，并引起对患者肿瘤细胞的细胞的免疫反应。
适用于本发明范围内的a)型外来肽的肽，可在很大范围内得到。它们的顺序可以从天然存在的免疫原性蛋白质或其细胞的分裂产物，如病毒性或细菌性肽衍生，或者从对患者异生的肿瘤抗原衍生而得到。
适用的外源肽可以选自基于文选已知的肽顺序，例如Rammensee等人，1993年，Falk等人，1991年，对不同的HLA-型主所描述的肽。从不同来源的免疫原蛋白质衍生的肽，它们适于各个HLA-亚型的分子的结合位点。对于具有有免疫原活性的蛋白质的部分顺序的肽，根据已知的或仍要确定的多肽顺序而确定适于备用的肽，通过顺序比较并考虑HLA特定的需求而进行确定。对于合适的肽，例如，在Rammensee等人，1993年；Falk等人，1991年，Rammen see，1995年；以及Wo 91/09869(HIV-肽)中所发现的，此外，由肿瘤抗原衍生的肽，描述于国际专利申请Wo 95/00159，Wo94/05304中。有关肽的这些参考文献和文章列入本文作为参考。
异源肽的优选备用者是已表明有免疫原性的肽。也就是由已知的免疫原，例如疫毒的或细菌蛋白衍生出来的肽。由于其免疫原性，这种肽在MLC试验中，呈现强烈的反应。
不使用原始的肽，即由天然蛋白的不变的衍生的肽，不管基于原始肽顺序所规定的固定位置及长度使用最低条件而可以按需要进行变异；在这种情况下，据本发明也可以使用合成肽，它是根据相对于MHC-I-配位体的要求而设计的。因此，例如可以从H2-Kd-配位体Leu Phe Glu Ala Ila GluGly Phe Ile(LFEAIEGFI)开始而这样转变不固定氨基酸，以使其获得Phe PheIle Glv Ala Leu Glu Glu Ile(FFIGALEEI)顺序的肽，此外，该固定式的氨基酸第9定位上的Ile可以被Leu代替。
在本发明领域中可用的肽是a)型和/或b)型的肽可以是从肿瘤抗原衍生，也就是说，可以从在肿瘤细胞表达的蛋白衍生出来的。并且它不呈现于相应的未转化的细胞上或仅以极低的浓度呈现。
该肽的长度最好与必要的固定式氨基酸一起相当于结合到MHC-I分子所必要的8-10个氨基酸的最低顺序。必要时，该肽也可以在C-和/或N-末端上延长，只要这种延长不损害结合能力就行，也就是说上述延长的肽可以在最低顺序上进行细胞处理。
据本发明的一个实施方案，可以用具有阴性加载的氨基酸的肽进行延长，或者在肽中可以在不是固定式氨基酸的位置中加入阴性加载的氨基酸，以便使肽能与聚阳离子，如多赖氨酸上，形成静电结合。
用于本发明范围内的术语“肽”，包括更大的蛋白片段或整个蛋白质。它确保在使用APCs后要处理进入适合MHC-分子的肽。
在本实施方案中，使用的抗原，不是以肽的形式，而是以蛋白或蛋白片段，或者以蛋白与蛋白片段的混合物形式存在。该蛋白提供抗原或肿瘤抗原，由该抗原在处理后衍生得到片段。被细胞吸取的蛋白或蛋白片段进行处理，然后在MHC范围中能呈现免疫效应子细胞。因而可以激发或加强免疫应答(Braciale与Braciale，1991年，Kovacsovics Bankowski和Rock，1995年；York与Rock，1996年)。
在使用蛋白质或蛋白质片段的情况下，用化学分析方法(用埃德曼(Edman)降解或质谱仪方法测定处理过的片段，参照由Rammensee等人，1995年的综述文章及其所引用的原始文献)，或用生物分析方法(APCs激起T-细胞的能力，它是专门用于处理的片段)都证实处理的最终生成物的同一性。
原则上，可以用多个步骤选择适于作为外源肽的肽一候选者通常，优选是在连续试验中，首先使候选者，在肽结合试验中，测定其在MHC-I分子上的结合能力。
较适用的检验方法例如是基于流动式血细胞计数法的FACS分析方法[Flow Cytometry(流动血细胞计数法，1989年；FACS Vantage TM用户指南，1994年；CELL QuestTM用户指南，1994年]。其中，用荧光染料，例如，用FITC(荧光素异氰硫酸盐)，标记肽，并加到表达MHC-I分子的肿瘤细胞上。在流体中，各个细胞被一定波长的激光所激发；测定所发射的荧光，后者是取决于结合在细胞上的肽的量。
用于测定结合肽量的另一方法是Scatchard印迹法。其中使用被I125或稀土金属离子(如，铕)标记的肽。在4℃下，用30-240分钟将不同的，限定浓度的肽加载在细胞上。为了测定肽与细胞的非特定的相互作用，将过量的未标记的肽加入到一些样品中。以抑制标记肽的特定的相互作用。然后，洗涤该细胞以除去任何非特定的细胞结合的物质。结合细胞的肽量可以通过所发出放射性在闪烁计数器，或者通过适用于测定长寿命荧光的光度计，进行测定。然后，用标准方法评定所得的数据。
在第二步骤中，检测具有优良结合能力的候选者的免疫原性。
由蛋白质衍生的，其免疫原活性未知的异源肽的免疫原性，可以通过MLC试验方法测定。在该试验中能引起剧烈反应的，优选地可以和不同的肽连续进行的肽，使用具有已知免疫原活性的肽作为标准，是适合于本发明目的。
用于测定其免疫原性的结合MHC-I的肽候选者的另一个可能的测试方法，包括检测肽对T2-细胞的结合情况。这种试验是基于T2-细胞的特性(Alexander等人，1989年)或者RMA-S-细胞的特性(Karre等人，1986年)它们在TAP-肽-转移机理中是缺陷性的，当它们加到在MHC-I范围内存在的肽上仅表现稳定的MHC-I分子。在该试验中，使用用HLA-基因，例如用HLA-A1-和/或HLA-A2-基因转染的T2-细胞或RAM-S-细胞。用良好的MHC-I-配位体的肽作用该细胞，通过在MHC-I范围呈现以使它们被免疫系统识别为外来的。这些肽引起HLA-分子可以大量地呈现在细胞表面上。控制细胞表面上的HLAs，例如，可以凭借单克隆抗体，使其有可能证实为适用的肽。(Malnati等人，1995年；Sykulev等人，1994年)。这里也可以适当使用已知具有良好HLA或MHC结合能力的标准肽。
在本发明的一个实施方案中，疫苗的自体的或异源的肿瘤细胞也可以具有多个具有不同顺序的异源肽。在这种情况下，一方面这种所用的肽由于它们结合到不同的HLA-亚型上而可以是相互不同，这样，就可以得到一个病人或一大群病人的多个的或全部的HLA-亚型。疫苗可以以辐照形式施用。
另外，必要时是附加的，有关呈现在肿瘤细胞上的异源肽的变化性，该变化包括结合到一个确定的HLA-亚型上的肽，在其对HLA-结合不是关键的顺序上有不同，例如由不同来源的蛋白，例如病毒性的和/或细菌性的蛋白衍生的。这类变化性，能使接种的生物体具有更大的异源化的范围，从而可期望强化免疫应答的刺激。
在本发明的实施方案中，其中肿瘤疫苗由各种不同细胞系的异源肿瘤细胞，可能另外的自体肿瘤细胞混合物所组成的。所有的肿瘤细胞可以用同一个肽或多个肽进行处理，或者不同源的肿瘤细胞也可具有不同的异源肽。
在本发明的范围内所实施的实验中，可以用由流行性感冒病毒凝血素衍生的并且是H2-Kd-配位体的，其顺序为Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly PheIle的病毒性肽作为a)型的外源肽。下面划线的是固定式氨基酸。
用这种天然的病毒性肽作为外源肽制备肿瘤疫苗，并以动物模式(黑素瘤模式与结肠癌模式)进行试验。
为制备肿瘤疫苗还可以使用另一个其顺序为Ala Ser Asn Glu Asn MetGlu Thr Met的病毒性肽，它们是由流感病毒的核蛋白衍生的，是HLA-1-单模标本H2-Kb-的配位体(Rammensee等人，1993年；下面划线的是固定式氨基酸)。在另一个黑素瘤模式中，证实了疫苗的保护作用。
还可以制备另一种疫苗，通过异化具有其顺序为Phe Phe Ile Gly Ala LeuGlu Glu Ile(FFIGALEEI)的外源肽的肿瘤细胞。它是一个迄今在自然界尚未发现的合成肽。在选择顺序时，必须注意到，要满足有关用作H2-Kd型的，MHC-I-分子配位体的适应性的要求。按照有效免疫治疗概念，用于生产抗肿瘤免疫性的肽的适应性是在老鼠结肠癌CT-26(对鼠系Balb/c是同源的)上证实。
在本发明的另一个实施方案中，该肿瘤疫苗也可含有自体的和/或异源的肿瘤细胞和/或成纤维细胞，它们用细胞质分裂素基因转染。在专利文献Wo94/21808和Schmidt等人，1995年(已作为参考文献)，描述了高效的肿瘤疫苗。通过所谓的“转铁蛋白感染”的DNA-迁移方法，用IL-2表达媒介制备(该方法基于受体-媒介的-细胞内摄作用，而且使用一个细胞配位体，特别是转铁蛋白，它用于复合DNA的，与聚阳离子，如多赖氨酸共轭以及一个内渗作用有效剂，如腺病毒)。
最好是，肽处理肿瘤细胞与表达胞质分裂素的细胞以1∶1的比例相互混合。如每1×106细胞中产生4000单位IL-2的IL-2疫苗和1×106肽处理的肿瘤细胞混合。如此制得的疫苗可以用于两次处理。其最佳剂量为1000～2000单位IL-2(Schmmidt等人，1995年)。
通过用经肽处理过的肿瘤细胞与胞质分裂素疫苗结合时，有利于这两种疫苗型作用的结合。
用通常方法加工处理上述细胞以及本发明的疫苗制剂。例如，描述于“癌细胞生物治疗，1991年”或在Wo 94/21808文献中。
另一方面，本发明涉及生产一种对病人使用的，包括肿瘤细胞的肿瘤疫苗。
按照本发明该方法的特点在于，用一个或多个的肽处理肿瘤细胞，该肿瘤细胞本身在HLA范围呈现由肿瘤抗原衍生的肽，并且其至少部分表达至少病人的一个MHC-I-单模标本，该肽是a)起作为MHC-I-单模标本的配位体的作用，该MHC-I-单模标本是与病人及疫苗的肿瘤细胞共同的，该肽与从被病人的细胞所表达蛋白衍生的肽是不同的。
b)起作为MHC-I-单模标本的配位体的作用，该MHC-I-单模标本是与病人及疫苗的肿瘤细胞是共同的，并从被病人细胞所表达的肿瘤抗原衍生的。
在有有机聚阳离子存在下，以一个或多个a)和/或b)型肽培育肿瘤细胞，直至该肽要这样结合到该肿瘤细胞，以致在有肿瘤细胞的范围内被病人的免疫系统识别为外来的。而且激发一个细胞免疫应答。
该肽的用量最好是每1×105～2×107细胞约为50-160微克。当使用b)型肽时，其浓度也可以高些，对于这种肽，主要的是其在疫苗的肿瘤细胞上的浓度，可以比由同一个肿瘤抗原衍生的肽在病人的肿瘤细胞上的浓度更高些，其程度可使疫苗的肿瘤细胞被识别为外来的，并激发细胞免疫应答。
适用的聚阳离子可以是同系的有机聚阳离子，如多赖氨酸，多精氨酸，多乌氨酸，或者是异种的，是有两个或更多的不同的阳性加载的氨基酸的聚阳离子，这些聚阳离子可以具有不同的链长。此外，还可以是非肽的合成聚阳离子，如聚乙烯亚胺，聚阳离子性质的天然的结合DNA的蛋白例如组蛋白或臭精蛋白及类似物，或者其片段，以及精胺，或亚精胺。适用于本发明的有机聚阳离子也包括聚阳离子性的脂类(Felgner等人，1994年；Loeffler等人，1993年；Remy等人，1994年；Behr等人，1994年)，此外，还有市场上可买到的如转染子(Transfectam)，Lipofectamin或Lipofectin。
所用的聚阳离子最好是其链长为30-300赖氨酸基团的多赖氨酸(PL)。
相对于肽的所需的聚阳离子量可以按经验确定。当使用多赖氨酸和a)型的异源肽时，多赖氨酸(PL)相对于肽的重量比例大约为1∶4～1∶12。
上述培育的时间通常是30分钟至4小时。这取决于达到肽的最高加载量的时间。该加载量可以用FACS分析法监测。根据这种方法可以获知所需的培育时间。
在本发明的另一个实施方案中，加入至少部分共轭的多赖氨酸。最好有一部分多赖氨酸是与转铁蛋白(Tf)共轭结合的(即转铁蛋白-多赖氨酸-共轭体。TfpL，对此，可考虑Wo 94/21808的公开)，其中，PLTfpL的重量比例约为1∶1。
不与转铁蛋白共轭，多赖氨酸也可和其他蛋白共轭例如专利文献Wo94/21808所述的作为内在化因素的细胞配位体。
必要时，也可以在DNA参与的情况下，处理肿瘤细胞。该DNA优选是以质粒存在，质粒，最好是没有编码功能性真核蛋白的顺序。也就是以空介质形式存在。原则上，任何通用的，功能性的质粒都可以用作DNA。
DNA的用量，对必要时部分地与蛋白共轭结合的聚阳离子量的比例，例如相对于pL，TfpL或pL与TfpL的混合物的比例，大约是1∶2～1∶5。
培育的时间，相对于肿瘤细胞量，和/或肽量的聚阳离子的量和性质，或者聚阳离子以什么比例或如何共轭，或与何种蛋白共轭最好，DNA存在的优点及其用量等等都可以根据经验确定。为此，各个制备参数是可改变的，此外，在相同的条件下将肽施加到肿瘤细胞上并检测该肽如何有效地结合到肿瘤细胞上。为此，合适的方法是FACS分析方法。
本发明的方法不仅适用于处理肿瘤细胞，也适用于处理其他细胞。
除了肿瘤细胞外，自体的成纤维细胞也就是病人固有的成纤维细胞系的细胞，或者来自与病人的HLA-亚型匹配的成纤维细胞系的细胞，或者用相应的MHC-I-基因转染的细胞都可以用本发明的方法加载一个或多个由患者肿瘤细胞所表达的肿瘤抗原所衍生的肽。这样处理和辐照的成纤维细胞可以用作肿瘤疫苗，也可与肽处理的肿瘤细胞混合使用而作为肿瘤疫苗。
在本发明的另一个实施方案，可以用本发明方法处理枝状细胞代替成纤维细胞。这种枝状细胞是皮肤的APCs。它们可以有选择地在体外加载。也就是在体外，将从病人分离出的细胞以一个或多个肽混合，该肽是从病人的肿瘤抗原衍生而得的，并与病人的MHC-I分子或MHC-II分子相结合。在本发明的另一个实施方案中，这些细胞也可在体内用肽加载。为此，优选地皮下注射由肽，聚阳离子和必要时的DNA组成的复合物。因为枝状细胞特别是在皮肤中经常发现。
在本发明的范围内，该肽和用于转移到CT-26细胞的TfpL或pL，并和用于转移到M-3细胞的TfpL及非功能性质粒复合。在CT-26细胞系统中发现，用产生有效抗肿瘤免疫性的肽异化的，辐照的肿瘤疫苗75％接种的试验老鼠能消除肿瘤的免疫攻击，这导致在全部对照动物中形成肿瘤，它们或没有给予疫苗，或所给予的疫苗没有异源肽。在M-3细胞体系中同样的异源肽，在一个用于人类情况的实验中就肿瘤形成而论在对有机体更为严格的条件下进行试验。用异源胶溶(xenopeptisierfen)的，辐照的M-3细胞接种有转移瘤的鼠。87.5％经接种的鼠可以清除其转移瘤。而所有未经接种处理的鼠以及给予没有异源肽的疫苗的老鼠中8只有7只患有肿瘤。
还发现，据本方法的系统性的肿瘤疫苗的系统免疫应答的程度取决于加到肿瘤细胞上肽所用的方法。当通过多赖氨酸/转铁蛋白使肽加到细胞上时，其功效比用肽对细胞进行24个小时培育时的功效(“脉动”)要更明显。混合有肽和辐照疫苗的助剂也是无效的。转铁蛋白感染作用(transferrinfection)，应确保肽在细胞中更有效的吸取，或用多赖氨酸/转铁蛋白加载使肽仍然粘着在细胞膜上，因而物理地接近MHC-I分子并可以与之结合，由于其强烈的亲合力，它可以取代弱结合的细胞性肽。
附图附
图1a-c用外源肽处理的M-3细胞的FACS分析，附图1d用FITC-肽处理的M-3细胞的缩微照片，附图2a，b用加载外源肽的M-3细胞的疫苗治疗带有M-3-黑素瘤转移的DBA/2老鼠的情况，附图3a用于制备肿瘤疫苗的外源肽的滴定，附图3b载有外源肽的肿瘤细胞的肿瘤疫苗与分泌IL-2的肿瘤疫苗的比较，附图4a用载有外源肽的结肠癌细胞制备的疫苗进行予免疫作用而对Balb/c老鼠的防护作用。
附图4b在系统的免疫性中T-细胞的参与研究，附图5用载有外源肽的黑素瘤细胞的疫苗进行予免疫作用，以对C57BL/6J老鼠的防护。
在下列实例中，如无特别指明就使用下列的物质与方法鼠的黑素瘤细胞素细胞系Cloudman S91(克隆M-3；ATCCNo.CCL53.1)是由ATCC获得的。
黑素瘤细胞系B16-F10(Fidler等人，1975年)是由NIH DCT TumorDepository(肿瘤贮存所)获得的。
转换蛋白-多赖氨酸的共轭体是按Wo 94/21808所描述，由含有DNA的转染复合物实施的。
在一个肽合成器上(具有反馈监视器的433A型，Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster市，加拿大)，用Tenta Gel S PHB(Rapp，Tubingen)作为固定相，使用Fmoc方法(HBTU-活化，FastmocTM，比例为0∶25mmol)合成肽LFEAIEGFI，FFIGALEEI，LPEAIEGFG和ASNENMETM，将肽溶解于其pH＝7.3的1M TEAA中。并用反相色谱法在一个Vydac C 18-柱中纯化。该顺序是用快速质谱法(Flugzeitmassenspektrometrie)，在一个MATLasermat(Finnigan，San Jose，加拿大)上证实的。
使用Wo 94/21808中所述方法，测试用有效于防止形成转移瘤的癌疫苗的效果(治疗的鼠模式)，以及进行预防性鼠模式的试验。其中所用的试验鼠模式是DBA/2鼠模式与Balb/c鼠模式。
实施例1通过各种方法，用外源肽处理的M-3-细胞的比较FACS分析。
在示于图1的研究中，表明一个情况下是用TfPL/DNA复合物将外源肽LFEAIEGFI加到M-3-细胞上。(“转加载”，图1a)，另一个情况是用肽培育细胞(“脉动”，图1b)，最后一个情况是混有肽的助剂加到细胞上(附图1c)。
为了进行转载，将160微克的FITC-标记的异源肽LFEAIEGFI或未标记的对照肽，和3微克的转换蛋白/多赖氨酸(TfPL)，10微克pL及6微克PSP 65(Boehringer，不含LPS)在500毫升的HBS缓冲液中混合，室温下30分钟后，把上述溶液放入装有20毫升DMEM介质中(10％FCS，20mM葡萄糖)有1.5×106M-3细胞的T75细胞培养瓶中，并在37℃下培育。3个小时后，将上述细胞用PBS洗涤两次，并用PBS/2mM EDTA分离。然后，再悬浮在1毫升的PBS/5％FCS中，以进行FACS分析。
在37℃下，使用装在20毫升DMEM中的1-2×106细胞和450微克肽(FITC-标记的或未标记的)使细胞与肽的脉动3小时。
在FACS分析前，使从培养瓶分离的106细胞与100微克的FITC-标记的肽在1毫升的PBS/5％FCS中，在室温下培育30分钟以进行助剂混合。用PBS/5％FCS交替洗涤细胞，并再次分析。根据制造商的说明，用装有5W氩激光的FACS Vantage仪器(Becton Dickinson)，设置在100mW的458nm进行FACS分析。上述FACS分析测定结果示于图1a-1c。图1d显示了经细胞离心的M-3细胞的缩微照片其中上图表明经复合(“转载”)而得肽的细胞；而下图表明，用肽培育(“脉动”)的细胞，并使用DAP1对核进行复染。
载有含肽的复合物的M-3细胞，与未须处理的细胞或只用多赖氨酸处理的细胞相比较，表明其荧光位移几乎有2个10的幂。这表明借助TfpL/DNA复合物，肽有效转移到细胞上(图1a)。用肽培育(“脉动”)其作用很小，可由荧光移位下降到只有1个10的幂而看到，这在荧光显微术中实际上是不可检测的(图1d)。当助剂混合的情况下，经洗涤后肽已消失(图1c)，这表明肽的结合是可忽略不计的。
实施例2用加载外源肽的黑(素)瘤细胞的疫苗治疗有黑(素)瘤转移的DBA/2-鼠(治疗性鼠模式)。
a)由M-3细胞制备肿瘤疫苗。
将160微克的异源肽LFEAIEGFI和3微克的转铁蛋白/多赖氨酸(TfpL)，10微克pL和6微克Psp 65(不含LPS)，在500微升的HBS缓冲液中混合。在室温下静置30分钟后，把上述溶液加入装有在20毫升的DMEM介质(10％FCS，20mM葡萄糖)中的1.5×106M-3细胞的T75细胞培育瓶中，并在37℃下培育。3小时后，向上述细胞液中加入15毫升的新鲜介质并在37℃下与5％CO2中培育过夜。在使用前4小时，用20Gy辐照该细胞。疫苗按Wo 94/21808中所述制备。
b)肿瘤疫苗的有效性。
把肿瘤疫苗(剂量105细胞/试验动物)经皮下注射，在一周内分两次注入到染有5天转移瘤的6-12周龄的成年DBA/2鼠内(经皮下注入104的活性M-3细胞而产生)。共用8只鼠进行试验。试验结果示于图2a；其中8只中有7只的鼠经施用疫苗后治愈，该疫苗含有通过TfPL/DNA复合物而加载到肿瘤细胞上的肽。在对比试验中，使用了一种通过培育(在37℃下，3小时，“脉动”)而将肽LFEAIEGFI(400微克或4毫克)加到细胞上的疫苗。对于给以有400微克肽的疫苗的动物中，8只有3只的鼠保持不患肿瘤。当含有有4毫克肽处理的细胞的疫苗时，只有1只鼠治愈。如果只在其本身用辐照的M-3细胞，以及加载不含肽的复合物的细胞的对照实验则每种情况下8只中只有1只动物没有患肿瘤。对一组什么也不进行处理的对照试验动物，所有的动物都患有肿瘤。
为了一方面研究疫苗的制备方法的关联，另一方面，研究肽的顺序，还须进行另一组试验。在这组试验中要使用一个高致瘤性的M-3细胞变体。在这试验中，测试了处理方法的重要性。在制备疫苗中，使用多赖氨酸/转铁蛋白，没有将肽加载到细胞上，而仅仅与细胞混合而成助剂。在控制肽顺序方面，将肽的固定式氨基酸放在第2与第9位置上，即苯基丙氨酸与异亮氨酸各被脯氨酸及甘氨酸所代替，以形成肽Leu Pro Glu Ala Ile Glu Glg PheGly(LPEAIEGFG)，这种肽缺乏对H2-Kd结合能力。至少每周监测一次转移灶的形成。该试验结果示于图2b中。通过使用TfpL/DNA复合物，使细胞加载LFEAIEGFI而制备的疫苗，能治愈8个试验鼠中的6个。与此相反，当肽LFEAIEGFI与细胞仅仅混合而制备出的疫苗，或含有一种，通过具有改性的，不结合到HLA型主的肽LPEAIEGFG的TfPL/DNA复合物加载的细胞，所制备的疫苗，则试验中的8只老鼠有7只患肿瘤。在对照试验组中，仅用辐照的M-3细胞处理的，或什么也不进行处理，则全部都患肿瘤。
c)研究在疫苗中肽加入量的影响。
如同在a)所述，制备含有肽的复合物，其中含有50，5或0.5微克的有效肽LFEAIEGFI，并加载到M-3细胞。作为比较，使用一种分泌最佳IL-2剂量的IL-2疫苗(参阅d))。将该疫苗接种在有五天转移瘤的DBA/2鼠上。具有50微克肽的疫苗治愈了8只中的6只鼠，当疫苗中有5微克肽时，可治愈8只中的4只鼠，同样在IL-2疫苗中，而含有0.5微克的肽的疫苗只能治愈8只中的2只鼠，试验结果示于图3a上。
实施例3在预防性鼠模式中，含自外源肽的疫苗和由分泌IL-2的肿瘤细胞制成的肿瘤疫苗进行比较。
在对照试验中，两组试验动物(各8只)，其中一组施用实例2a)中描述的疫苗，另一组施用分泌IL-2的M-3细胞的疫苗(按Wo 94/21808所述的方法制备，每只动物的IL-2剂量为2000单位)，在一周内免疫处理二次。在最后一次接种疫苗后一周，随着肿瘤细胞数量的增长，形成对侧的肿瘤(“免疫抗原剂量”，其剂量如图3b中所示)。发现，用本发明的肿瘤疫苗进行的予免疫处理胜过用IL-2疫苗处理的结果用IL-2疫苗接种的天然鼠，只能防护剂量为105的活性高致瘤性细胞(M-3-W)。在3×105细胞的免疫抗原剂量时该疫苗的能力则已耗尽。因此，有这种范围的肿瘤，可以有效地用加载外源肽的肿瘤细胞疫苗进行予免疫而制止。
实施例4在预防性试验鼠中，通过用由加载外源肽的结肠癌细胞的疫苗，进行免疫处理，而防护Balb/c鼠。
a)CT-26疫苗的制备把160微克的异源肽LFEAIEGFI或FFIGALEEI与12微克的pL或3微克的转铁蛋白/多赖氨酸，加上10微克多赖氨酸进行混合。并在室温下，在500微升HBS缓冲液中复合30分钟。接着转移到装有4毫升DMEM介质(10％FCS，20mM葡萄糖)中有1.5×106CT-26细胞的T75细胞培育瓶中。然后，在37℃在5％CO2下培养。经4小时后，将细胞用PBS洗涤。加入15毫升的新鲜介质。并在37℃在5％CO2下培育过夜。在使用前4个小时，用100Gy辐照该细胞。疫苗按Wo94/21808所述制备。
b)测试肿瘤疫苗对CT-26免疫抗原剂量的防护作用的效果。
通过皮下注射，一周内两次对6-12周龄的Balb/c鼠进行免疫接种(细胞剂量105/鼠)。每一组试验中有8只鼠(或其中，用pL加载细胞的实验中是7只试验鼠)。在最后一次免疫接种后一周。使用5×104亲本CT-26细胞的施加到对侧肿瘤。作为比较试验。其中的疫苗不是使用TfpL/DNA复合物的方法制备，并如实例2中所述进行对比试验以及对照试验。至少每周一次检测肿瘤免疫抗原剂量的生长。肽LFEAIEGFI的试验结果示于图4a中，8只中的6只试验鼠受到防护。在肽FFIGALEEI的情况下(未在图4a中示出)8只中有4只试验鼠受到防护。
c)T-细胞在肿瘤疫苗活性中的参与为了检测T-细胞在CT-26疫苗引起的系统免疫性中的参与，在进行疫苗接种前24个小时，在另一个试验中，通过静脉注射500微克的单克隆抗体GK1.5(ATCC TIB 207)以除去CD4-细胞，并通过静脉内注射500微克的单克隆抗体2.43(ATCC TIB 210)以除去CD8+细胞。进行一个阳性的对照试验组，得到没有除去CD4+细胞与CD8+细胞的疫苗。试验结果示于图4b中通过除去T细胞的所有动物，全部发生肿瘤的事实说明T-细胞的参与。
实施例5通过用加载外源肽的黑素瘤细胞的疫苗进行予免疫处理而防护C57BL/6J试验鼠(预防性鼠模式)。
本试验中采用C57BL/6J系的试验鼠(每组为8只)。并且用与所用的鼠系同源的细胞B16-F10(NIH.DCT，肿瘤保藏所；Fidler等人，1975年)作为黑素瘤细胞。
所有的试验组的动物在一周内两次进行皮下注射，每只鼠接种105B16-F10细胞的疫苗。
在一组试验中，用顺序为ASNENMETM的肽加载辐照过的B16-F10细胞而制备疫苗。如实施例2中所述的由M-3细胞制备疫苗。
在平行试验中，使用分泌IL-2或分泌GM-CSF的B16-F10细胞(按Wo 94/21808中所述方法制备)作为予接种疫苗。该疫苗对每只动物产生1000单位的IL-2或200ng的GM-CSF。
一对照组在其予免疫中，接受经辐照，但未处理过的B16-F10细胞。
在进行最后一次疫苗接种后一周，使用1×104活性，经辐照的B16-F10细胞的动物形成肿瘤，然后观测肿瘤增长情况。
本试验的结果示于图5中，其中，表明加载有外源肽的肿瘤细胞显示出对肿瘤形成的最佳防护作用。
表肽顺序 MHC单模标本 抗原 参者文献SPSYVYHQF Ldgp70，内生的 Huang和Pardoll，1996MuLVFEQNTAQAKbConnexin37Mandelboim，等人.，1994FEQNTAQPKbConnexin37Mandelboim，等人.，1994SYFPEITHI KdJAKl Rammensee，等人.，1995EADPTGHSY HLA-A1 MAGE-1Rammensee，等人.，1995EVDPIGHLY HLA-A1 MAGE-3Rammensee，等人.，1995YMNGTMSQV HLA-A2+酪氨酸酶 Rammensee，等人.，1995HLA-A0201MLLALLYCL HLA-AO201 酪氨酸酶 Rammensee，等人.，1995AAGIGILTV HLA-AO201 Melan A/Martl Rammensee，等人.，1995YLEPGPVTA HLA-AO201 pmel17/gp100 Rammensee，等人.，1995ILDGTATLRL HLA-AO201 pmel17/gp100 Rammensee，等人.，1995SYLDSGIHF HLA-A24 B-Catenin Robbins，等人.，1996AINNYAQKL DbSV-40大小 Lill，等人.，1992CKGVNKEYL 的T-抗原QGINNLDNLNLDNLRDYLEEKLIVVLF HLA-B44 MUM-1 Coulie，等人.，1995ACDPHSGHFV HLA-A2突变的CDK4 Wolfel，等人.，1995AYGLDFYIL HLA-A24 p15，未知功能 Robbins，等人.，1995KTWGQYWQV HLA-A2gp100 Kawakami和YLEPGPVTARosenberg，1995HMTEVVRHC HLA-A2突变的p53 Houbiers，等人.，1993KYICNSSCM Kd突变的p53 Noguchi，等人.，1994GLAPPQHEI HLA-A2突变的p53 Stuber，等人.，1994LLGRNSEEMLLPENNVLSPL HLA-A2野生型p53 Theobald，等人.，1995RMPEAAPPVLLGRNSFEVLLGRDSFEV HLA-A2突变的p53 Theobald，等人.，1995
参考文献Alexander，J.等人.，1989，免疫基因(Immunogenetics)29，380Allred，D.C.等人.，1992，临床肿瘤学期刊(J.Clin.Oncol.)10(4)，599-605Behr，J.P.，1994，生物共轭化学(Bioconjug-Chem.，)9-10月，5(5)，382-9癌症的生物治疗(Biologic Therapy of Cancer，)编者Devita，V.T.Jr.，Hellman，S.，Rosenberg，S.A.，Verlag J.B.Lippincott Company，Philadelphia，纽约，伦敦，黑格斯敦。Boon，T.，1993，科学光谱(Spektrum der Wissenschaft)(五月)，58-66Boon，T.等人.，1994，免疫学的年度评论(Annu.Rev.Immunol)12，337-65Braciale，T.J.und Braciale，V.L.，1991，今日免疫学(Immunol.Today)12，124-129Carrel，S.and Johnson，J.P，1993，肿瘤学的现代评价(Current Opinion inOncology)5，383-389Coligan，J.E.，kruisbeek，A.M.，Margulies，D.H.，Shevach，Falk，K.等人.，1991，自然科学(Nature)351，290-296Coulie，P.G.等人..1992，国际癌症期刊(Int.J.Cancer，)50，289-297 Coulie，P.
G.，Lehmann，F.，Lethe，B.，Herman，J.，Lurquin，C.，Andrawiss，M.，und Boon，T.(1995).自然科学研究进展，美国(Proc Natl AcadSci)92，7976-80Cox，A.L.等人.，1994，科学(Science)264，5159，716-9分子生物学的通用协议(Current Protocols im Molecular Biology，)1995，HerausgeberAusubel F.M.，等人，Johm Wily & Sons，Inc.Dranoff，G.等人，1993，自然科学研究进展，美国90，3539-3543Dranoff，G.und Mulligan，R.C.，1995，免疫学进展(Advances in Immunology)58，417Falk，K.等人.，1991，自然科学351，290-296.Felgner，J.H.等人.，1994，生物化学期刊(J.Biol.Chem.)269，2550-2561Fenton，R.G.等人.，1993，天然癌症研究期刊J.Natl.Cancer Inst.85，16，1294-302Fisk，B.等人.，1995，实验药物学期刊(J.Exp.Med.)1881，2109-2117流动血细胞计数，科学出版社，细胞生物学中的方法(Flow Cytometry，Acad.
Press，Methods in Cell Biology，)1989，Vol.33，HerausgeberDarzynkiewicz，z.和Crissman，H.A.Gedde Dahl，T.等人.，1992，人类免疫学(Hum Immunol.)33，4，266-74Guarini，A.等人.，1995细胞分裂素和分子治疗(Cytokines and MolecularTherapy)1，57-64Han，X.K.等人.，1995，PNAS 92，9747-9751手册FACS VantageTMUser′s Guide，April 1994，Becton Dickinson手册CELL QuestTMSoftware User′s Guide，June 1994，Becton DickinsonHerin M.等人.，1987，国际癌症期刊，39，390Hock，H.等人.，1993，癌症研究(Cancer Research)53，714-716Houbiers，J.G.，Nijman，H.W.，van der Burg，S.H.，Drijfhout，J.W.，Kenemans，P.，van de Velde，C.J.，Brand，A.，Momburg，F.，Kast，W.M.，和Melief，C.J.(1993).欧洲免疫期刊(Eur J Immunol)23，2072-7.Huang，A.Y.C.和Pardoll，D.M.(1996).自然科学研究进展美国93，9730-5Jung，S.等人.，1991，实验药物学期刊.173，1，273-6Kawakami，Y.等人.，1995，免疫期刊(The Journal of Immunol.)154，3961-3968Karre，K.等人.，1986，自然科学319，20.Feb.，675Kovacsovics Bankowski，M.和Rock，K.L.，1995，科学(Science)267，243-246Lehmann，J.M.等人.，1989，自然科学研究进展，美国.86，9891-9895Lethe，B.等人.，1992，欧洲免疫期刊.22，2283-2288Lill，N.L.，Tevethia，M.J.，Hendrickson，W.G.，和Tevethia，S.S.(1992).实验药物学期刊176，449-57Loeffler，J.-P.等人.，1993，方法酶学(Methods Enzymol)217，599-618Mackiewicz，A.等人.，1995，人类基因治疗Human Gene Therapy 6，805-811Malnati，M.S.等人.，1995，科学267，1016-1018Mandelboim，O.等人.，1994，自然科学369，5.五月，67-71Mandelboim，O.等人.，1995，天然药物(Nature Medicine)1，11，1179-1183Morishita，R.等人.，1993临床研究期刊(J.Clin.Invest.)91，6，2580-5Nabel，G.J.等人.，1993，自然科学研究进展，美国，90，11307-11311Noguchi，Y.，Chen，Y.T.，和Old，L.J.(1994).自然科学研究进展，美国，91，3171-3175Oettgen，H.F.和Old，L.J.，1991，癌症的生物治疗，编者DeVita，V.T.Jr，Hellman，S.，Rosenberg，S.A，Verlag J.B.Lippincott Company，Philadelphia，纽约、伦敦、黑格斯敦，87-119Ostrand-Rosenberg，S.，1994免疫学的现代评论Current Opinion inImmunology 6，722-727Pardoll，D.M.，1993，今日免疫学14，6，310实用免疫学(Practical Immunology)编者Leslie Hudson和Frank C.Hay，Blackwell科学出版社，Oxford，London，Edinburgh，Boston，MelbournePeace，D.J.等人.，199l，免疫期刊J.Immunol.146，6，2059-65Peoples，G.E.等人.，1994，免疫期刊152，10，4993-9Plautz，G.E等人.，1993，自然科学研究进展，美国90，4645-4649Rammensee，H.G.等人.，1993，免疫学中的现代评论5，35-44Rammensee，H.G.，1995，学中的现代评论7，85-96Rammensee，H.G.，Friede，T.，和Stepvanovic，S.(1995).免疫遗传(Immunogenetics)41，178-228Remy，J.S.等人.，1994，生物共轭化学.，11-12月，5(6)，647-54Rivoltini，L.，等人.，1995，免疫学期刊(The Journal of Immunology)154，2257-2265Robbins，P.F.，el Gamil，M.，Li，Y.F.，Topalian，S.L.，Rivoltini，L.，Sakaguchi，K.，Appella，E.，Kawakami，Y.，和Rosenberg，S.A.(1995).免疫学期刊154，5944-50Robbins，und Rosenberg.(1996).实验药物期刊183，1185-92.Schmidt，W.等人.，五月1995，自然科学研究进展，美国92，4711-4714Skipper，J.，和Stauss，H.J.，1993实验药物期刊Med.177，5，1493-8Slingluff，C.L.等人.，1994，免疫学的现代评论6，733-740Stein，D.等人.，1994，EMBO-期刊，13，6，1331-40Stuber，G.，Leder，G.H.，Storkus，W.T.，Lotze，M.T.，Modrow，S.，Szekely，L.，Wolf，H.，Klein，E.，Karre，K.，和Klein，G.(1994).欧洲免疫学期刊
24，765-768Sykulev，Y.等人.，1994，免疫(Immunity)1，15-22Theobald，M.，Levine，A.J.，和Sherman，L.A.(1995)PNAS 92，11993-7Tibbets，L.M.等人.，1993，癌症，1月15.，卷.71，2，315-321Van der Bruggen，P.等人.，1994，欧洲免疫学期刊.24，9，2134-40 Issn0014-2980Van Pel，A.and Boon，T.，1982，自然科学研究进展，美国.79，4718-4722Wolfel，T.等人.，1994 a)，国际癌症期刊57，413-418Wolfel，T.等人.，1994 b)欧洲免疫学期刊.24，759-764Wolfel，T.，Hauer，M.，Schneider，J.，Serrano，M.，Wolfel，C.，Klehmann Hieb，E.，De Plaen，E.，Hankeln，T.，Meyer zum Buschenfelde，K.H.，和Beach，D.(1995).科学269，1281-4York，I.A.和Rock，K.L.，1996，免疫年度评论(Ann.Rev.Immunol).14，369-396Yoshino，I.等人.，1994 a)，免疫学期刊.152，5，2393-400Yoshino，I.等人.，1994 b)，癌症研究(Cancer Res.)，54，13，3387-90Zatloukal，K.等人.，1993，基因(Gene)135，199-20Zatloukal，K.等人.，1995，免疫学期刊.154，3406-3419
权利要求
1.给药病人的肿瘤疫苗，其特征是，它含有肿瘤细胞，该肿瘤细胞本身在HLA范围呈现由肿瘤抗原衍生的肽，而且其中至少部分在细胞表面上表明至少有一个病人的MHC-I单模标本，以及该细胞要加载一个或多个的a)型和/或b)的肽，以致使该肿瘤细胞在有肽的范围内被病人的免疫系统识别为外来的，而且激发一种细胞免疫应答，其中该肽是a)起MHC-I单模标本的配位体的作用，它与病人及疫苗的肿瘤细胞是共同的，该肽不同于由病人细胞所表达的蛋白衍生的肽，或是b)起MHC-I单模标本的配位体的作用，它与病人及疫苗的肿瘤细胞是共同的，并由病人细胞表达的肿瘤抗原衍生的，而且在疫苗的肿瘤细胞上的浓度在病人的肿瘤细胞上表达时要高于由相同的肿瘤抗原衍生的肽的浓度。
2.根据权利要求1的肿瘤疫苗，其特征是，它含有自体的肿瘤细胞。
3.根据权利要求1的肿瘤疫苗，其特征是，它含有异源肿瘤细胞。
4.根据权利要求3的肿瘤疫苗，其特征是，该异源肿瘤细胞是一个或多个的细胞系，其中至少一个细胞系表达一个或多个的肿瘤抗原，该抗原是与要治疗的病人的肿瘤抗原相同。
5.根据权利要求1-4中之一的肿瘤疫苗，其特征是，它是由自体细胞及异源细胞的混合物所组成。
6.根据权利要求1的肿瘤疫苗，其特征是，该a)型或b)型肽是一个HZ-Kd配位体。
7.根据权利要求1的肿瘤疫苗，其特征是，该a)型或b)型肽是一个HZ-Kb的配位体。
8.根据权利要求1，6或7的肿瘤疫苗，其特征是，该a)肽是一个天然的免疫原蛋白或其细胞破裂产物衍生的。
9.根据权利要求8的肿瘤疫苗，其特征是，该a)肽是一个病毒性蛋白衍生的。
10.根据权利要求9的肿瘤疫苗，其特征是，该肽是由一个流感病毒蛋白衍生的。
11.根据权利要求10的肿瘤疫苗，其特征是，该肽具有Leu Phe Glu AlaIle Glu Gly Phe Ile顺序。
12.根据权利要求10的肿瘤疫苗，其特征是，该肽具有Ala Ser Asn GluAsn Met Glu Thr Met的顺序。
13.根据权利要求8的肿瘤疫苗，其特征是，该a)型肽是由细菌性蛋白衍生的。
14.根据权利要求1的肿瘤疫苗，其特征是，该a)型肽是由对病人异源的肿瘤抗原衍生的。
15.根据权利要求1的肿瘤疫苗，其特征是，该a)型肽是一个合成肽。
16.根据权利要求15的肿瘤疫苗，其特征是，该肽具有Phe Phe Ile GlyAla Leu Glu Glu Ile顺序。
17.根据权利要求1-16中之一的肿瘤疫苗，其特征是，该肿瘤细胞用具有不同顺序的多个肽处理的。
18.根据权利要求17的肿瘤疫苗，其特征是，该肽由于结合在不同的HLA-亚型上而是不同的。
19.根据权利要求17的肿瘤疫苗，其特征是，该肽在其对HLA结合不是起决定性的顺序方面，是有区别的。
20.根据权利要求1-19中之一的的肿瘤疫苗，其特征是，它含有用一个胞质分裂基因转染的肿瘤细胞。
21.根据权利要求20的肿瘤疫苗，其特征是，该细胞分裂素是IL-2和/或IFN-γ。
22.根据权利要求1-21中之一的肿瘤疫苗，其特征是，它含有用一个b)型肽处理的成纤维细胞。
23.根据权利要求1-22中之一的肿瘤疫苗，其特征是，它也含有用一个b)型肽和/或一个与MHC-II分子结合的肽所处理的枝状细胞。
24.制备一种给药病人的，含有肿瘤细胞的肿瘤疫苗的方法，其特征是，用一个或多个肽处理肿瘤细胞，该细胞本身在HLA范围呈现由肿瘤抗原衍生的肽，而且其中至少部分表达至少一个病人的MHC-I单模标本，该肽是a)起MHC-I单模标本的配位体作用，它与病人及疫苗的肿瘤细胞是共同的，而且与由病人细胞所表达的蛋白衍生的肽是不同的，b)起MHC-I单模标本的配位体的作用，它与病人及疫苗的肿瘤细胞是共同的，并由病人细胞所表达的肿瘤抗原衍生的，在有有机聚阳离子参与的情况下，该肿瘤细胞与一个或多个的a)型和/或b)型肽进行培育，其培育的时间和要达到的量要使肽结合到肿瘤细胞上，并使它们在有肿瘤细胞的范围内被病人的免疫系统识别为外来的，而且激发一种细胞免疫应答。
25.根据权利要求24的方法，其特征是，该聚阳离子是多赖氨酸。
26.根据权利要求25的方法，其特征是，该多赖氨酸具有约30-300的赖氨酸基因。
27.根据权利要求24-26中之一的方法，其特征是，该聚阳离子至少以部分共轭方式存在。
28.根据权利要求27的方法，其特征是，该聚阳离子是与转铁蛋白共轭的。
29.根据权利要求24-27中之一的方法，其特征是，在有DNA参与的情况下，处理该细胞。
30.根据权利要求29的方法，其特征是，该DNA是一个质粒。
31.根据权利要求29或30的方法，其特征是，该DNA，必要时与蛋白部分共轭的聚阳离子的比例约为1∶2～1∶5。
32.根据权利要求29-31中之一的方法，其特征是，该细胞是黑素瘤细胞。
33.根据权利要求24的方法，其特征是，每1×105～2×107细胞中使用约50～160微克的a)型和/或b)型肽。
34.根据权利要求24-32中之一方法对成纤维细胞的应用，其中，使用一个由病人肿瘤抗原衍生的b)型肽作为肽。
35.根据权利要求24-33中之一方法对枝状细胞的应用，其中，其中使用一个由病人的肿瘤抗原衍生的b)型肽和/或结合到病人MHC-II分子上的肽作为肽。
全文摘要
本发明涉及肿瘤疫苗及其制备方法。肿瘤疫苗包含肿瘤细胞,其中至少部分,在其细胞表面上含有至少一个病人的MHC－I－单模标本,并且该细胞加载有一个或多个的结合到MHC－I分子的肽,以致使这些肿瘤细胞在有肽的范围内被病人的免疫系统识别为外来的,而且激发一种细胞免疫应答。加载是在有聚阳离子,如多赖氨酸参与下进行的。
文档编号A61P35/00GK1202931SQ96198493
公开日1998年12月23日 申请日期1996年11月21日 优先权日1995年11月23日
发明者沃尔特·施米特, 马克斯·伯恩斯蒂尔, 塔马斯·施韦格霍弗, 彼得·斯坦雷恩, 迈克尔·布希里 申请人:贝林格尔·英格海姆国际有限公司