治疗玻璃体内出血的酶学方法与组合物的制作方法

专利名称：治疗玻璃体内出血的酶学方法与组合物的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及用于人类或其他哺乳动物眼睛治疗用药的酶制剂，并特别涉及a)利用一种或多种酶加速从哺乳动物眼睛玻璃体出血清除血液的方法和b)用于眼科给药的一种改进的透明酯酸酶。
背景技术：
i.人类眼睛的解剖在人类，眼睛的解剖包括位于晶状体之后几乎占眼球腔五分之四的“玻璃体”。该玻璃体由凝胶状物质，即所谓的玻璃液形成。一般说，正常人眼睛的玻璃液含约99％的水和1％的大分子物质包括胶原，透明酯酸，可溶性糖蛋白，糖和其他低分子量代谢物。
视网膜基本上是眼球后表面内侧形成的一层神经组织。视网膜由称做脉络膜的一层细胞所包绕。视网膜可被分成a)参与视觉机制的光学部分和b)不参与视觉机制的非光学部分。视网膜的光学部分含视杆和视锥，它们是视觉效应器。许多动脉和静脉在视网膜的中心进入视网膜，并向外展开以提供血液循环到视网膜。
玻璃体的后部直接与视网膜相接触。原纤维束网络从视网膜延伸并分布或深入玻璃体以至使玻璃体与视网膜相接。
ii.玻璃体内出血的病因，治疗及临床后遗症糖尿病视网膜病变，创伤和其他眼科疾病有时导致视网膜血管破坏或渗漏结果出血到眼睛的玻璃液中(即“玻璃体内出血”)。这种玻璃体内出血一般表现为玻璃液浑浊或不透明。
玻璃体内出血有时但不总是伴随视网膜的撕裂或分离。在玻璃体内出血伴随视网膜撕裂或分离的情况，重要的是应该对这种视网膜撕裂或分离做及时诊断和手术修复。未能及时诊断和修复视网膜撕裂或分离则可使该撕裂或分离区域的视网膜光感受器细胞形成坏死。这种视网膜光感受器细胞的坏死可导致视觉丧失。而且，视网膜分离持续未修复状态一段时间可导致进一步玻璃体内出血并/或在出血部位形成纤维组织。这种纤维组织形成可导致玻璃体与视网膜间的不良粘连。
修复视网膜撕裂或分离所使用的一般手术方法要求外科医师能透过玻璃液观察，以显现视网膜受损区(即“视网膜经玻璃体检查”)。当发生玻璃体内出血时，玻璃体内存在的出血血液会使玻璃体变浑浊以至妨碍外科医师透过玻璃体观察视网膜。这种玻璃体出血性浑浊可能需要6-12个月或更长的时间才变清澈到足以进行视网膜的经玻璃体检查。然而由于对视网膜撕裂或分离的延误诊断或治疗可产生潜在并发症，等待发生如此出血血液的自然清除一般是不期望的。
而且，甚至在无视网膜撕裂或分离相伴随的玻璃体内出血时，通常难以确认并未发生视网膜撕裂或分离，因为玻璃体出血性浑浊使医生不能进行视网膜常规眼底镜检查。而且，玻璃体内存在出血可明显损伤患者受累眼睛的视力，并且这种出血造成的损害会持续到所述出血血液被基本或完全清除。。
因此，玻璃体内存在出血血液会引起多种临床问题，包括a)不能肉眼检查和诊断出血部位和/或视网膜的任何相应撕裂或分离，b)受累眼睛的视力全部或部分损害和c)不利和妨碍进行一般为修复出血部位和/或修复任何伴随的视网膜撕裂或分离所应用的那类经玻璃体外科手术。
在玻璃体内出血已导致视网膜大量浑浊或不透明的病历中，治疗医师可选择进行所谓的玻璃体切除术，在手术中从眼睛内侧除去全部(或部分)玻璃体，并用清澈的液体代替。进行这种玻璃体切除术手术是为使医师观察视网膜足以进行必要的视网膜检查和/或对出血以及任何伴随的视网膜撕裂或分离的手术修复。然而，这种玻璃体切除术方法是高度技术密集的，并伴有一些明显的缺点，风险和并发症。这些缺点，风险和并发症是潜在的以至去除玻璃体的操作会引起视网膜进一步分离或撕裂和/或引起本已脆弱的视网膜血管进一步出血。
iii.透明酯酸酶及其他酶的早期应用为致力于使进行玻璃体切除术期间引起的视网膜进一步分离或撕裂的可能性减到最小，以前在美国专利号5,292,509(Hageman)中曾提出过向玻璃体内注射一些无蛋白酶的糖胺聚糖酶，使玻璃体从视网膜分开(uncouple)或“游离”(disinsert)，然后除去玻璃体。这种玻璃体游离或分开旨在使除去玻璃体时会发生的视网膜进一步撕裂或分离的可能性减到最小。旨在可用于产生这种玻璃体游离的专一性无蛋白酶糖胺聚糖酶的实例包括；软骨素酶ABC，软骨素酶AC，软骨素酶B，软骨素4-硫酸酯酶，软骨素6-硫酸酯酶，透明酯酸酶和β葡糖苷酸酶。
虽然已知透明酯酸酶可用于各种眼科用途，包括在美国专利5,292,509(Hageman)中描述的玻璃体切除术附属应用，发表过的研究已经表明透明酯酸酶本身对视网膜和/或眼睛的其他解剖学结构可能是有毒的。参见，玻璃体内透明酯酸酶的安全性；Gottleib，J.L.；Antoszyk，A.N.，Hatchell，D.L.和Soloupis，P.，Invest Ophthalmol Vis Sci3111，2345-52(1990)。
有些透明酯酸酶制剂的眼科毒性已由其他研究者所证实，他们建议在动物模型中用这类透明酯酸酶制剂做为一种毒性刺激剂以引起眼睛的实验诱导性新血管形成。参见，兔视网膜前新血管形成的实验动物模型；Antoszyk，A.N.，Gottleib，J.L.，Casey，R.C.，Hatchel，D.L.andMachemer，R.，Invest Ophthalmol Vis Sci 321，46-51(1991)。
遗憾的是，以前不知道所报道的透明酯酸酶的治疗活性和毒性是否普遍适用于所有的透明酯酸酶制剂，或是否这种功效和/或毒性仅适用于含某些赋形剂物质的透明酯酸酶制剂或仅适用于特殊来源的透明酯酸酶。这是一项重要的考虑，因为前述工作中使用的各种透明酯酸酶制剂随透明酯酸酶的来源以及透明酯酸酶所结合的溶剂和/或其他制剂成分而可能有纯度和特征(例如分子量分布)的不同。
iv.早期用于眼科给药的透明酯酸酶制剂之纯度及特征术语“透明酯酸酶”通常用于描述一组内切-β葡糖苷酸酶，该酶解聚某些粘多糖，如透明酯酸。Myer，K.等.，酶；第四卷，第二版447页，科学出版公司.，纽约(一九六零年)。
透明酯酸酶引起透明酯酸和硫酸软骨素A和C的内切-N-乙酰基己糖胺键水解，主要水解成四糖残基。
明显证据表明不同来源的透明酯酸酶在酶的分子量分布和特异酶活性上都不相同。鉴于透明酯酸酶可分离自各种来源，包括牛睾丸，绵羊(ovine)睾丸，某些细菌如链霉菌和某些非脊椎动物如水蛭，这种分子量分布和比酶活性的差异是值得考虑的。
据报道Wydase透明酯酸酶制剂以前已经为各种临床和实验应用给哺乳动物眼睛用药，包括治疗青光眼和在从眼睛除去玻璃体的玻璃体切除术手术期间促进玻璃体液化。
尽管已报道有些透明酯酸酶制剂在给眼睛注射或局部用药时表现出符合要求的治疗效果，透明酯酸酶和/或乙基汞硫代水杨酸钠防腐剂的潜在毒性仍是有关眼内注射制剂常规临床给药安全性的虑及原因。
因此，在本领域存在一种组合和开发新的透明酯酸酶制剂的需求，该制剂可依足以产生最理想的治疗效果又不引起眼睛的毒性的剂量水平给眼睛用药。
因此，鉴于上述讨论的有关从玻璃体自然出血清除血液缓慢的问题，本领域存在一种阐明和开展用于加速从眼睛玻璃体出血清除血液的新方法和手术的需要，以至可对眼睛后部，包括视网膜做经玻璃体检查，而无须除去玻璃体(即全部或部分玻璃体切除术)。
发明概述本发明提供一种加速从哺乳动物眼睛的玻璃液出血清除血液的方法，其中该方法包括用所述玻璃液与一定量的酶接触，该酶有加速从所述玻璃液出血清除血液的活性。可施用特殊的酶以产生本发明的出血清除效果，它们包括β葡糖苷酸酶如透明酯酸酶，角蛋白酶，软骨素酶AC，软骨素酶B和软骨素酶ABC；软骨素硫酸酯酶如软骨素4硫酸酯酶和软骨素6硫酸酯酶；基质金属蛋白酶如基质金属蛋白酶1和基质金属蛋白酶2，基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶9；以及蛋白激酶如链激酶和尿激酶。
进一步根据本发明，提供了一种改进的，无乙基汞硫代水杨酸钠的透明酯酸酶制剂，它适合于作为治疗各种病的治疗剂在眼睛上或眼睛内给药所述治疗包括但不限于根据本发明出血清除的方法学加速从玻璃液出血清除血液。本发明的这类透明酯酸酶制剂包含优选的透明酯酸酶，该酶基本没有分子量超过100,000MW，60,000-70,000MW之间和/或低于40,000MW的透明酯酸酶分子。可从绵羊睾丸得到本发明优选的透明酯酸酶，并可与大量的乳糖和磷酸盐结合成水溶液以提供无乙基汞硫代水杨酸钠的透明酯酸酶水溶液供眼内注射用。
在阅读和理解如下详细描述，附图以及其中所举实施例后，本领域技术人员将清楚本发明的进一步目的和优点。
附图简述

图1显示含1-6泳道的电泳胶，所述泳道表示1)分子量标准31，000MW到200,000MW，2)绵羊透明酯酸酶(ACS)，3)牛透明酯酸酶VI-S型，4)绵羊透明酯酸酶V型，5)牛透明酯酸酶IV-S型和6)牛透明酯酸酶I-S型。
图2是一个表，它概括了与牛透明酯酸酶VI-S型，IV-S型和I-S型以及绵羊透明酯酸酶V型相比，酶学图谱所确定的本发明的透明酯酸酶ACS的透明酯酸水解，明胶水解和酪蛋白水解活性。
图3是一个表，根据如下实施例1，它概括了BSS，BSS+乙基汞硫代水杨酸钠，透明酯酸酶(ACS)和透明酯酸酶Wydase的单剂量玻璃体内注射在兔体内的毒性作用。
图4是一个表，根据下面实施例II，它概括了单剂量玻璃体内透明酯酸酶(ACS)在兔体内的功效。
图5是一个表，根据下面实施例III，它概括了多剂量玻璃体内透明酯酸酶(ACS)在兔体内的安全性及功效。
图6是一个图表，根据下面实施例IV，它概括了在糖尿病视网膜病变的患者体内单剂量透明酯酸酶ACS的出血清除功效。
优选实施方案详述下面详述及相应的实施例仅提供用于描述和解释本发明的某些优选实施方案之目的，并无任何限制本发明范围之意。
i.加速从眼睛玻璃体出血清除血液的酶学方法根据本发明，申请人已经确定某些类型的酶在与出血之后的玻璃液接触时会加快从所述玻璃液出血清除血液的速率。
在此目的，申请人发明了一种加速从眼睛玻璃体出血清除血液的方法，所述方法一般包含用玻璃液接触至少一种含加速从玻璃液出血清除血液活性的量的酶之步骤。本发明的出血清除的方法可在无任何玻璃体切除术或其他外科操作或除去玻璃液的情况下进行，由此避免与这种玻璃体切除术方法有关的潜在风险和并发症。
表现出这种出血清除作用的专一性β葡糖苷酸酶包括·透明酯酸酶·角蛋白酶·软骨素酶AC·软骨素酶B·软骨素酶ABC·软骨素4硫酸酯酶；和·软骨素6硫酸酯酶表现这种出血清除作用的专一性金属蛋白酶包括·基质金属蛋白酶-1·基质金属蛋白酶-2·基质金属蛋白酶-3·基质金属蛋白酶-9表现这种出血清除作用的专一性蛋白激酶包括·链激酶·尿激酶这些出血清除酶的优选给药途径是通过眼内注射给药。由此将含一种或多种上而列出的出血清除酶的注射液通过针头直接注射进位于眼睛后腔的玻璃体中。然而，可另外通过任何其他足以分布所述酶到玻璃体以引起需要的出血清除作用的适当给药途径(例如局部给药)施用本发明的出血清除酶。
除出血清除酶之外，出血清除酶优选注射液含有可使该溶液基本等渗并具有适合注射进眼睛的pH的非活性成分。这样的注射液可以最初被冻干成干燥状态，然后在用前可被。
ii.优选的眼科给药用透明酯酸酶制剂本发明的可注射无乙基汞硫代水杨酸钠透明酯酸酶的一般制剂在下表I中给出表I一般制剂
这些制剂成分最初被溶解在无菌水中，无菌过滤并随后冻干成干燥制剂。该冻干的制剂被包装以便随后于用前重新溶解在平衡盐溶液中。这种平衡盐溶液一般含0.64％氯化钠，0.075％氯化钾，0.048％二水氯化钙，0.03％六水氯化镁，0.39％三水醋酸钠，0.17％二水柠檬酸钠，氢化钠/盐酸调pH，补充水到100％。
如本文所用术语“透明酯酸酶(ACS)”指无高于100,000、60,000-70,000之间和40,000以下透明酯酸酶分子量组分的优选透明酯酸酶。这种透明酯酸酶可得自绵羊睾丸，并可从Calbiochem Biochemicals，P.O.Box 12087，La Jolla，Ca 92039-2087买到。申请人已确定透明酯酸酶ACS的这种特殊分子量分布导致的眼科毒性比其他透明酯酸酶制剂小，同时在许多眼科应用中表现出称心的治疗效果。
图1显示一个电泳胶(10％-SDS-PAGE)，该电泳胶验证与购自SigmaChemical Company，P.O.Box 14508，St.Loius，Missouti 63178的牛VI-S，IV-S和I-S型以及绵羊V型透明酯酸酶对比的优选透明酯酸酶ACS的分子量分布。每种酶的标准化量(即等价单位透明酯酸酶)被添加到图1中显示的电泳胶的每个泳道中(lane)(泳道2-6)。图1中显示的电泳胶的泳道1含分子量标记分别是200,000MW，116,000MW，97,400MW，66,000MW，45,000MW，和31,000MW。图1中显示的电泳胶的泳道2-6含各个被测透明酯酸酶制剂如下泳道 泳道中被测物2透明酯酸酶ACS3牛透明酯酸酶VI-S型4绵羊透明酯酸酶V型5牛透明酯酸酶型IV-S型6牛透明酯酸酶型I-S型泳道2显示透明酯酸酶ACS的分子量分布，包括分子量组分97,000，50,000(大约)和45,000(大约)，而完全没有高于100,000、60,000-70,000之间和低于40,000的分子量组分。
图1中电泳胶泳道3，4，5和6显示被检测的全部牛睾丸透明酯酸酶VI-S，IV-S和I-S型以及绵羊睾丸透明酯酸酶V型不同于本发明的透明酯酸酶ACS，因为它们包括60,000-70,000MW之间和低于40,000MW的分子量组分。而且，被测的四种(4)牛睾丸透明酯酸酶中的三种(3)(即VI-S，IV-S和I-S型)包括了超过100,000MW的透明酯酸酶分子量组分。
此外，做酶谱以比较标准化量(即等价单位透明酯酸酶活性)的上述透明酯酸酶ACS，VI-S，V，IV-S和I-S型牛透明酯酸酶对透明酯酸，明胶和酪蛋白的相对水解活性。关于图2，这些酶谱的每个所使用的特殊方法如下透明酯酸酶活性酶谱明胶—1毫克/毫升明胶；10％聚丙烯酰胺；过夜缓冲液＝50mMTrisHCI，5mM氯化钙，0.05％Triton-100 pH7.5；考马斯蓝染色；10％醋酸/50％甲醇脱色。
酪蛋白水解活性酶谱酪蛋白-4毫克/毫升；15％聚丙烯酰胺；过夜缓冲液＝50mMTris/HCI，5mM氯化钙和0.05％Triton X-100 pH7.5；考马斯蓝染色；10％醋酸/50％甲醇脱色。
透明酯酸水解活性酶谱透明酯酸2毫克/毫升，10％聚丙烯酰胺；过夜缓冲液＝磷酸盐缓冲生理盐水，pH7.4；0.5％alcian兰于3％醋酸中染色；10％醋酸/甲醇脱色。
这些透明酯酸，明胶和酪蛋白酶谱的结果被概括于图2的表中。值得注意的是，本发明优选的透明酯酸酶ACS没有约100,000MW以上的透明酯酸水解分子量组分，而被测的每个牛睾丸透明酯酸酶(即VI-S，IV-S，和I-S型)含高于100,000MW的透明酯酸水解分子量组分。
类似的，本发明透明酯酸酶ACS没有约60,000-100,000MW之间的明胶水解分子量组分，而被测的每种牛睾丸透明酯酸酶包含约60,000-70,000MW之间的明胶水解分子量组分。
而且，本发明透明酯酸酶没有约45,00MW以上的酪蛋白水解分子量组分，而被测的每种牛睾丸透明酯酸酶(即VI-S，IV-S和I-S型)以及绵羊睾丸透明酯酸酶(V型)却包含约45,000MW以上的酪蛋白水解分子量组分。
本发明的优选透明酯酸酶(ACS)的特殊分子量分布和特殊酶活性分布型(和/或从其制剂中排除乙基汞硫代水杨酸钠)提供了一种透明酯酸酶制剂，该制剂对眼睛是无毒的，而以同样剂量给药时其他透明酯酸酶制剂会产生毒性作用。
为用于下面提供的实施例，通过下面描述并于表1给出的方法和一般制剂在无乙基汞硫代水杨酸钠制剂中制备优选的透明酯酸酶ACS。特别是，用于下述实施例并根据特殊制剂制备的透明酯酸酶在下表II中给出。
表II特殊制剂
如下述实施例中描述的，如表II(见上)给出的透明酯酸酶ACS的特别优选制剂可以产生称心效果的剂量水平直接被注射到眼睛后部腔中，其效果包括但无须限于本发明的出血清除效果，而不引起对眼睛或相关解剖学结构的明显毒性。
实施例1乙基汞硫代水杨酸钠，透明酯酸酶(ACS)和透明酯酸酶(Wydase)对兔的眼科毒性五十二(52)只健康新西兰杂交种兔(26雄，26雌)，体重1.5公斤到2.5公斤，分别被标记以便识别并各自在悬笼中饲养。所述动物每日进食市售颗粒兔饲料，并任意接供水管。
所述动物以每组四只动物(2雄，2雌)被分成十三组。选出每组中的两只动物(1雄，1雌)进行处理前眼底照相和荧光血管造影。
固定动物并用装好Kodak Gold 200 ASA胶卷的KOWA RC-3眼底相机拍摄视神经，视网膜弓形组织和眼底。
荧光血管造影包括经耳缘静脉注射1.5毫升2％荧光素溶液。约注射荧光素后30秒钟，拍摄视神经，视网膜血管和眼底。
继日，经静脉施用34毫克/公斤盐酸氯胺酮和5毫克/公斤甲苯噻嗪的制剂麻醉每个动物。用开睑器收缩眼睑，并且用providone碘洗液消毒眼睛。
用1毫升的结核菌素注射器，30号，接0.5英寸针头通过注射施用以盐水溶液(BSS)，BSS+乙基汞硫代水杨酸钠，透明酯酸酶(Wydase)或以透明酯酸酶(ACS)平衡的实验治疗剂。在此实施例中使用的透明酯酸酶(ACS)溶液不含乙基汞硫代水杨酸钠并组成上述表II中给出的特别优选透明酯酸酶ACS制剂。
给每组动物施用的实验治疗剂如下
组号治疗剂1 BSS2 BSS+0.0075毫克乙基汞硫代水杨酸钠3 BSS+0.025毫克乙基汞硫代水杨酸钠4 透明酯酸酶(Wydase)1国际单位5 透明酯酸酶(Wydase)15国际单位6 透明酯酸酶(Wydase)30国际单位7 透明酯酸酶(Wydase)50国际单位8 透明酯酸酶(Wydase)150国际单位9 透明酯酸酶(ACS)1国际单位10 透明酯酸酶(ACS)15国际单位11 透明酯酸酶(ACS)30国际单位12 透明酯酸酶(ACS)50国际单位13 透明酯酸酶(ACS)150国际单位注射后之继日(第一天)，用本底剂量检查所使用的同样方法观察做过眼底照相和荧光造影的26只动物。
注射后的第二天，第一天以本底剂量接受过眼底照相和荧光造影的13只雄兔以及没有被选做照相的13只雌兔用戊巴比妥钠类药物安乐死。然后手术移取眼睛放置于有pH7.37的0.1摩尔磷酸缓冲生理盐水的2.5％戊二醛固定液中。
或者，随机选取一只兔用戊巴比妥注射安乐死，而然后通过心内注射戊二醛溶液进入左心室以确定固定方法对被摘除眼球内组织检查的影响。
在第七天，按照同于前述方法观察先前接受过照相和造影的13只雌兔。
在给药7天后其余26只动物如上述方法安乐死。用与第二天固定的同样方法固定眼球。仍随机选一只兔子接受上述先前随机选取的动物所接受的同样心内戊二醛固定方法。
对该实施例中处理的动物眼球做肉眼观察和显微镜检查以得到与处理相关的毒性的证据。图3给出一个表，该表给出每个处理组中毒性或非毒性的组织学证据的概况。概括之，BSS处理的对照组的眼球在给药后2和7天无毒性。
BSS+乙基汞硫代水杨酸钠(0.0075毫克)处理的第二组动物之眼球在第二天无毒性，但在第7天呈现视网膜血屏障的破坏的证据。
BSS+乙基汞硫代水杨酸钠(0.025毫克)处理的第3组动物在给药后第2天和第7天呈现严重的处理相关毒性作用。
以1国际单位Wydase处理的第4组动物在第2天和第7天无毒性，然而，以剂量范围在15国际单位-150国际单位的Wydase处理的第5-8组动物的眼球一般在第2天和第7天呈现总体的与剂量相关的毒性作用。
以剂量范围1国际单位到150国际单位的透明酯酸酶(ACS)处理的第9-13处理组的动物眼球在给药后第2天和第7天无毒性作用证据。
因此，得出结论是乙基汞硫代水杨酸钠和含乙基汞硫代水杨酸钠的Wydase制剂在检测剂量下在兔眼中确引起毒性，然而，在这些动物中在检测剂量下透明酯酸酶(ACS)不产生毒性作用。
在第7天进行的检查的结果被概括在图3中。如图3所示，在BSS加乙基汞硫代水杨酸钠(0.0075毫克)和透明酯酸酶(Wydase)以1国际单位-150国际单位之间的全部剂量处理的图眼中在第7天观察到明显的毒性作用。相反，在以1-50国际单位之间剂量的透明酯酸酶(ACS)处理的动物眼中观察不到毒性作用。
实施例II在兔眼中玻璃体内注射的透明酯酸酶(ACS)的安全性和功效在本实施例中，12只健康的新西兰杂种兔被标记以供识别并在悬笼中饲养。每日这些动物食用市售颗粒饲料并任意接饮用水管。
所述动物被随机分成四个(4)处理组，每组三只(3)动物。
开始，用1-2滴10％托吡卡胺扩瞳检查每只动物的眼，随后肉眼观察，用20屈光度透镜做间接检眼镜检查，和眼睛前部解剖的裂隙镜检查。
继动物眼睛的初步检查后，向每只动物的每只眼睛玻璃体内注射100微升或10微升的血液。
第2天，每个处理组动物接受单一玻璃体内注射BSS或透明酯酸酶(ACS)进入右眼，按如下处理一览表进行组号 处理左眼 右眼A无BSS(30微升)X1B无25国际单位透明酯酸酶(ACS)30微升X1C无50国际单位透明酯酸酶(ACS)30微升X1D无75国际单位透明酯酸酶(ACS)30微升X1本实施例中使用的透明酯酸酶(ACS)是上述优选制剂并在表II给出。
在第3，5，7，14和21天，每只动物眼再次用裂隙镜检查以评估角膜，前腔和虹膜。此外，用10％托吡卡胺溶液扩瞳每只动物的眼并用有20屈光度透镜的间接检眼镜检查视网膜。
所观察到的透明酯酸酶ACS的出血清除的功效被概括于图4。一般说，由于被注入到其中的血量，每个处理组中的每只动物的左眼(未处理)含混浊的玻璃体和一些血块。组A的BSS处理的(对照)动物的右眼也含混浊玻璃体和一些血块，而在处理组B-D中所有透明酯酸酶处理的动物的右眼含清晰的玻璃体并且透过它可进行视网膜经玻璃体检查。而且，在B-D处理组中所有动物的右眼视网膜表现正常并无处理相关毒性。
本实验结果表明玻璃体内施用透明酯酸酶(ACS)在25-75国际单位的单一剂量对加快从被处理动物眼清除血液的速率是有效的，并进一步表明在本实验中施用这样单一剂量的透明酯酸酶(ACS)在本实验受处理的兔眼中不引起可见的毒性作用。
每次给药后的观察是一致的并被概括于图5。一般说，每个处理组中的每只动物的左眼(未处理)含混浊的玻璃液和一些血块，是由于被注入其中的血液量。组A的BSS处理的(对照)动物右眼也含混浊的玻璃体和一些血块，而处理组B-E(即用透明酯酸酶(ACS)处理的动物)中所有动物的右眼含清澈的玻璃体，通过它可进行视网膜的经玻璃体检查。而且，处理组B-D中的所有动物右眼的视网膜表现是正常的并无处理相关毒性，即使在多剂量透明酯酸酶ACS处理后。
本实验结果表明在25-75国际单位单一剂量的4倍时，玻璃体内施用透明酯酸酶(ACS)对加快从兔眼清除血液的速率是有效的并进一步表明透明酯酸酶(ACS)的这种剂量，以及透明酯酸酶ACS的这种剂量在受处理的兔眼中即使在2周间隔内四个(4)连续剂量的施用透明酯酸酶ACS亦不引起可见的毒性作用。
实施例III在人体中，透明酯酸酶出血清除的功效在本实验中，用单一玻璃体内注射剂量为50-200国际单位的透明酯酸酶(ACS)治疗玻璃体内出血的六位(6)病人(5女，1男)。
本实验中施用的透明酯酸酶(ACS)通过上面描述并在表II给出的优选制剂来制备。
本实验中全部接受治疗的病人有糖尿病视网膜病变史，并被发现有各期的玻璃体内出血。在每位病人中玻璃体内出现的血液量足以妨碍用标准的眼底镜方法检查视网膜。
每位病人接受了单一透明酯酸酶(ACS)玻璃体内注射。四位(4)病人接受了一个50国际单位的剂量，一位(1)病人接受了一个70国际单位的剂量，而一位病人接受了一个200国际单位的剂量。
本实验的观察结果概括于图6。
在本实验的六位(6)受治疗病人中，在单一注射透明酯酸酶(ACS)的6-16天内，出血的玻璃体变清澈足以进行视网膜的经玻璃体检查。所述玻璃体的如此的清除作用主观上被确定为其发生明显快于未受透明酯酸酶治疗的病人中所发生的清除作用。
前文详细的描述，实施例，和附图描述了本发明有关某些当前所述优选实施方案。本领域专业人员会意识到从上述具体实施方案和制剂可制造各种偏差而并没脱离本发明的动机和范围。因此，要求所有这类合理偏差都被包含在如下权利要求的范围内。
权利要求
1.一种加速从哺乳动物眼睛的玻璃液出血清除血液的方法，所述方法包括步骤用所述玻璃液与一定量的酶接触，该酶有加速从玻璃液出血清除血液的活性。
2.权利要求1的方法，其中所述酶选自的组分包含透明酯酸酶；角蛋白酶；软骨素酶AC；软骨素酶B；软骨素酶ABC；软骨素4硫酸酯酶；软骨素6硫酸酯酶；基质金属蛋白酶-1；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-3；基质金属蛋白酶-9；链激酶；尿激酶；和其组合。
3.权利要求1的方法，其中所述酶是β-葡糖苷酸酶。
4.权利要求1的方法，其中所述酶是基质金属蛋白酶。
5.权利要求1的方法，其中所述酶是蛋白质激酶。
6.权利要求1的方法，其中所述酶是软骨素硫酸酯酶。
7.权利要求1的方法，其中所述酶在流体溶液中，并且其中所述酶与玻璃液接触的步骤包括注射所述流体溶液进入玻璃液。
8.权利要求1的方法，其中所述酶是透明酯酸酶。
9.权利要求8的方法，其中所述所述透明酯酸酶的量是10-300国际单位。
10.权利要求1的方法，其中所述酶以单一玻璃体内注射方式被施用。
11.权利要求10的方法，其中单一玻璃体内注射体积低于50微升。
12.权利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶无100,000MW以上的分子量组分。
13.权利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶无低于40,000MW透明酯酸酶分子量组分。
14.权利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶无60,000-70,000MW之间的分子量组分。
15.权利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶无100,000MW以上，40,000MW以下和60,000-70,000MW之间的分子量组分。
16.权利要求8的方法，其中的透明酯酸酶无分子量为约60,000-100,000MW之间的明胶水解透明酯酸酶。
17.权利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶无分子量约为45,000MW以上的酪蛋白水解透明酯酸酶。
18.权利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶无分子量约为100,000MW以上的透明酯酸水解透明酯酸酶。
19.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括在无乙基汞硫代水杨酸钠的条件下，所述酶与所述玻璃液接触。
20.权利要求8的方法，其中所述透明酯酸酶被制备成注射用无乙基汞硫代水杨酸钠的溶液并且其含一般制剂透明酯酸酶(ACS)……0-8000国际单位；乳糖，USP……13.3毫克；和磷酸盐，USP……5mM；并且，其中透明酯酸酶无40,000以下分子量组分。
21.权利要求20的方法，其中所述注射用溶液含如下特殊制剂透明酯酸酶(ACS)……7,200国际单位；乳糖，USP……13.3毫克，和磷酸盐，USP……5mM。
22.权利要求20的方法，其中所述注射用溶液被溶解于平衡盐溶液。
23.眼科给药用透明酯酸酶制剂，所述制剂无乙基汞硫代水杨酸钠并无低于40,000MW的透明酯酸酶。
24.权利要求23的制剂，其中所述制剂还不含分子量为60,000-70,000MW之间的透明酯酸酶。
25.权利要求23的制剂，其中所述制剂还不含分子量超过100,000MW的透明酯酸酶。
26.权利要求23的制剂，其中所述制剂还不含分子量在约100,000MW以上的透明酯酸水解透明酯酸酶。
27.权利要求23的制剂，其中所述制剂还不含分子量约45,000MW以上的酪蛋白水解透明酯酸酶。
28.权利要求23的制剂，其中所述制剂还不含分子量约60,000-70,000之间的明胶水解透明酯酸酶。
29.权利要求23的制剂，其中所述制剂是含如下一般制剂的注射用溶液透明酯酸酶(ACS)……0-8000国际单位；乳糖，USP……13.3-133.3毫克；和磷酸盐，USP……5-200mM；并且，其中透明酯酸酶无低于40,000分子量组分。
30.权利要求29的制剂，其中在所述制剂中透明酯酸酶(ACS)的量是7,200国际单位。
31.权利要求29的制剂，其中所述制剂的成分被溶解于平衡盐溶液。
全文摘要
一种无乙基汞硫代水杨酸钠的制剂,其中优选的透明酯酸酶不含低于40,000MW,60,000—70,000MW之间和高于100,000MW的分子量组分。公开的还有一种加速从眼睛的玻璃液出血清除血液的方法,所述方法包含至少一种出血清除酶以有效引起加速从玻璃液清除血液之量与玻璃液相接触的步骤(例如β葡糖苷酸酶,基质金属蛋白酶,软骨素酶,软骨素硫酸酯酶或蛋白质激酶)。
文档编号A61P27/00GK1207684SQ96199746
公开日1999年2月10日 申请日期1996年11月20日 优先权日1995年11月22日
发明者H·L·卡拉格奥兹安, V·H·卡拉格奥兹安, M·C·肯尼, J·L·G·弗罗雷斯, G·A·C·阿拉贡, A·B·内斯布恩 申请人:先进角膜系统公司