甲鱼四联疫苗及制备方法

专利名称：甲鱼四联疫苗及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于防治甲鱼白板病、红肿病、赤斑病和疖疮病四种疾病的疫苗及制备方法。
由于甲鱼具有滋阴补肾、强身健体、延年益寿之功效，甲鱼养殖业愈来愈发达，正逐渐向高密度、集约化精养的方向发展，区域性的流通也大大加强，导致甲鱼的病害亦愈来愈多，严重地制约了甲鱼的生产。到目前为止，甲鱼的病害以红肿、赤斑、疖疮、腐皮、白板、红底板、白斑等传染性疾病危害严重，其中又以红肿、赤斑、白板、疖疮四种病毒的传染性最强，发病率和死亡率最高，造成的损失最大。特别是白板病，损失可高达97％。近几年来国产、进口的药物对它均无明显疗效，只能通过免疫途径进行预防，而这种疫苗在国内是空白，这种病毒已严重威胁了甲鱼养殖业的发展前景。而赤斑病、红肿病、疖疮病虽有一定的药物可以防治，但都存在着操作不便，成本较高且效果不理想的缺点。
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种成本低廉，操作方便，可有效地防治甲鱼白板、赤斑、红肿、疖疮四种疾病，提高甲鱼免疫力的四联疫苗及其制备方法。
本发明的目的是通过下面的技术方案来实现的其四联疫苗由嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、点状气单胞菌和鲍爱德华氏菌按3～4∶2∶1～2∶2～3的比例再加入适量双抗和防腐剂组成。制备方法是从患白板病的甲鱼肝脏和血液中分离出病原菌；从患赤斑病的甲鱼脾、肺、卵中分离出嗜水气单胞菌；从患红肿病的甲鱼肌肉、血、心脏中分离出豚鼠气单胞菌；从患疖疮病的甲鱼病肚容物中分离出点状气单胞菌；将上述四种菌分别以1～2×109/只的浓度注入健康幼甲鱼体内，后再从发病甲鱼体内分离出上述四种菌分别接种在普通琼脂营养基或肉汤培养基中进行纯化，然后在25°～35°条件下取单个菌落进行扩大培养，当达到一定浓度后用微生物方法计数，使每毫升含菌1～2×109；再将这四种菌放入32℃和热水中灭活72小时，将灭活后的菌置于高速离心机中用10000转/分的速度离心浓缩3分钟，然后按3～4∶2∶1～2∶2～3的比例混合。
本发明填补了国内防治甲鱼四类疾病尤其是防治甲鱼白板病方面的空白，能对甲鱼白板、赤斑、红肿、疖疮四类疾病联合防治，效果显著，操作方便，易于实现，无任何副作用，可给甲鱼养殖业带来巨大的经济效益和社会效益。
下面详述本发明的具体步骤和过程。
①提取菌种首先从患白板病的甲鱼肝脏和血液中分离出鲍爱德华氏菌(甲鱼白板病病原菌)；从患赤斑病的甲鱼脾、肺、卵中分离出嗜水气单胞菌(甲鱼赤斑病病原菌)；从患红肿病的甲鱼肌肉、血、心脏中分离出豚鼠气单胞菌(甲鱼红肿病病原菌)；从患疖疮病甲鱼肚内容物中分离出点状气单胞菌(甲鱼疖疮病病原菌)。其分离方法为将病甲鱼上述部位的脏器或病灶部分从甲鱼体内取出，放入搅拌机内打碎，再置于离心机中以10000转/分的速度离心5～10分钟，然后取上清液接种于普通营养琼脂培养基上培养48小时，取典型菌落作为毒种。
②攻毒将上述方法取出的四种菌分别以1～2×109/只的浓度通过腹注接种于健康的幼甲鱼体内，以验证其毒力和致病性。
③取材按上述提取菌种方法从具有典型发病症状的甲鱼体内分离出四种病原菌；④纯化再将上述四种病原菌分别接种在普通琼脂营养基或肉汤培养基中；⑤扩大培养取单个菌落在25℃～30℃的条件下培养48～72小时；⑥计数当达到一定浓度之后用微生物的方法进行活菌计算，使每毫升溶液含相应的菌1～2×109个；⑦灭活再分别将上述四种菌放于32℃的热水浴中72小时；⑧合成将灭活后的菌置于高速离心机中用10000转/分钟的速度离心浓缩3分钟，然后将这四种菌按3～4∶2∶1～2∶2～3的比例混合，使每毫升溶液中含爱德华氏菌约3×109个；含嗜水气单胞菌约2×109个；含豚鼠气单胞菌约1.5×109个；含点状气单胞菌约2.5×109个。然后向溶液中加入双抗(即青霉素，链霉素各适量)和防腐剂—福尔马林适量；最后添加适当的佐料—PHA。这样就基本上完成了甲鱼四联疫苗的制备过程。该过程完成以后还要进行分装(每100ml一小瓶)和抽样检验。
⑨检验检验包括无菌检验、安全检验和免疫效果检验、无菌检验是抽取样本接种在普通营养琼脂培养基上，在25～28℃的条件下培养48小时，观察是否形成菌落。若形成菌落则说明疫菌含菌，必须重新灭活。安全检验是用免疫量5倍的剂量去接种健康甲鱼，观察有无异样，必须做到100％安全才能使用。免疫效果检验是在给健康甲鱼接种疫苗二周后进行攻毒(每只攻毒MD50菌数)，观察免疫保护率，结果表明，甲鱼四联疫苗对四种病的免疫保护率均在80％以上。无论是稚鳖、幼鳖、成鳖、亲鳖，甲鱼四联疫苗都可以拌饲口服，无任何副作用，且效果不受影响。因此，操作十分方便。对于30g以上的甲鱼也可以通过肌注/腹注进行免疫，这样操作用量较均，避免浪费。口服方法为三天一个疗程，稚、幼鳖第一天用量为100ml/kg饲料，第二、三天减半。成鳖、亲鳖第一天用量为150ml/kg饲料，第二天为100ml/kg饲料，第三天为50ml/kg饲料。注射一次见效，注射剂量为幼鳖0.3～0.5ml/只；亲鳖每公斤体重注射2ml。
权利要求
1.一种甲鱼四联疫苗，其特征在于它是由嗜水气单胞菌(甲鱼赤斑病病原菌)，豚鼠气单胞菌(甲鱼红肿病病原菌)，点状气单胞菌(甲鱼疖疮病病原菌)鲍爱德华氏菌(甲鱼白板病病原菌)按3～4∶2∶1～2∶2～3的比例，再加入适量双抗和防腐剂组成。
2.一种甲鱼四联疫苗的制备方法，其特征在于本发明由下列步骤组成1>提取菌种从患白板病的甲鱼肝脏和血液中分离出病原菌；从患赤斑病的甲鱼脾、肺、卵中分离出嗜水气单胞菌；从患红肿病的甲鱼肌肉、血、心脏中分离出豚鼠气单胞菌；从患疖疮病的甲鱼病肚容物中分离出点状气单胞菌；2>攻毒将上述四种菌分别以1～2×109/只的浓度接种于健康幼甲鱼体内；3>取材从发病的甲鱼体内按上述提取菌种的方法分离出上述四种菌；4>纯化将上述四种菌分别接种在普通琼脂营养基或肉汤培养基内；5>扩大培养取单个菌落在25°～30°条件下培养48-72小时；6>计数用微生物方法进行活菌计数，使每毫升含菌1～2×109个；7>灭活将四种菌放入32℃的热水中72小时；8>合成将灭活后的菌置于高速离心机中用10000转/分的速度离心浓缩3分钟，然后按3～4∶2∶1～2∶2～3的比例混合。9>检验进行无菌检验、安全检验和免疫效果检验。
全文摘要
一种甲鱼四联疫苗,其特征在于它是由嗜水气单胞菌(甲鱼赤斑病病原菌),豚鼠气单胞菌(甲鱼红肿病病原菌),点状气单胞菌(甲鱼疖疮病病原菌)鮰爱德华氏菌(甲鱼白板病病原菌)按3～4∶2∶1～2∶2～3的比例,再加入适量双抗和防腐剂组成。其制备方法由提取菌种,攻毒,取材,纯化,扩大培养,计数,灭活,合成,检验九个步骤组成。本发明成本低廉,操作方便,可有效地防止甲鱼白板、赤斑、红肿、疖疮四类疾病,提高甲鱼免疫力。
文档编号A61K35/74GK1188673SQ97107929
公开日1998年7月29日 申请日期1997年1月22日 优先权日1997年1月22日
发明者王卯光 申请人:王卯光