专利名称：疫苗组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及治疗及预防疫苗、在这些疫苗中所使用的新型抗原、它们的制备方法及其在人类药品中的使用。具体地说，本发明涉及从能够刺激细胞毒性T淋巴细胞应答的单纯疱疹(Herpes Simplex)(HSV)中所得到的抗原。更具体地讲，本发明提出治疗或预防处理HSV感染的疫苗组合物及其制备方法。
HSV会在人体中造成终身感染和复发疾病。有两种密切相关的HSV血清型，它们分别是已知的HSV-1和HSV-2。在最初感染中，在一皮肤或粘膜处重复之后，该病毒移至背根神经节且通常进入一潜伏期。随之，在适当的刺激后重新复活，结果在该神经节所支配的粘膜与皮肤处产生水疱和溃疡。当用中和抗体来防止初期感染和疾病时，它们的存在对复发性疱疹疾病的过程或复发次数没有作用。有T细胞介入的免疫应答，特别是迟发型超敏反应(DTH)或细胞溶解(CTL)效应物类型也已用于在鼠类动物样品中对初期疾病的防护。而且，某些T细胞功能受损的个体可能要经历严重的、有时是有生命危险的疱疹疾病。这些观察说明效应物T细胞功能在控制人体中疱疹病毒的感染方面具有重要作用。
人们已提出将单纯疱疹病毒的主要表面糖蛋白，gD和gC用于疫苗中(EP 139417 Genentech)。这些物质主要是刺激中和抗体应答。
由于通过CTL进行抗原识别的机理涉及到将天然抗原裂解成肽，把该蛋白水解片断粘接到MHC分子上并且将该络合物输出到该细胞表面，任何编码病毒的多肽(不仅是象糖蛋白那样完整的膜蛋白质)均可以是T细胞应答的一个潜在靶。然而，由于该HSV基因组编码几种非结构蛋白质和内部病毒颗粒蛋白质(除了外部糖蛋白以外)，这就造成了大量潜在的CTL靶，且其中最相关的蛋白质是未知的。
HSV感染的特征在于只有极少量的游离病毒存在。在潜伏和复活期，病毒主要是在细胞内。因此，甚至大量的中和抗体也不能防止复发疾病，依靠细胞免疫来控制病毒。所以，为了通过疫苗作用获得保护，人们期望不仅要诱导一种抗体应答，而且还要诱导出CTL。一种有效有疫苗应该是当一出现潜伏病毒的复活信号就能尽早起作用的初始CTL。
早期的研究已识别对各种单纯疱疹的结构成分例如糖蛋白gD，gB的人类CTL应答(Zarling等人1986)，但是对于病毒清除这些CTL的实质作用还未知。然而，这种CTL是有限的HLA II类，虽然在HSV重复期间II类分子的表达是在角化细胞中诱导的，但是它可能发生得太晚以致于不能防止该病灶的出现。
为了识别出对于预防或治疗的疫苗的目的来说最重要的CTL靶抗原，本发明已注意到HSV的重复周期。在初期感染之后和从在神经无神经节中的潜伏状态重现过程中，HSV主要是在细胞内，对于中和抗体它只有最小量的暴露。然而，在包含病毒基因组的细胞内开始病毒蛋白质合成时将产生病毒蛋白质片断，该片断通过在细胞表面的MHC分子而存在，从而使它成为具有适当专一性的CTL的靶。该HSV重现周期持续约18-20小时，且涉及一个α或即早期型(IE)β或早期型(E)和γ或延迟型(L)基因产品的依次表达。所以在延迟型结构基因表达之前的早期型CTL攻击以及随后的所感染的细胞的溶解能够阻止形成新的病毒颗粒，且因此而防止该病毒扩散至相邻的细胞。为了更加有效，CTL应该检测出在感染和重现之后在该细胞内出现的最初的病毒蛋白质。
我们已经分析了人类HSV特异性CTL即早期型病毒蛋白质ICP27的专一性。首先我们调查了来自具有不同临床严重程度的疱疹生殖器病灶的病人的周围血单核细胞(PBMC)中的CTL应答。我们使用自体的感染HSV-2的淋巴母细胞作为刺激物来大量诱导HSV-2染异型HLA限制性CTL并限制稀释培养物。在病灶发生之后数天或数周所获得的PBMC样品中发现了强应答。HSV-2特异型CTL的频率范围在1/10000到1/36000之间。
使用疫苗病毒重组体ICP27.VV，可以将该基因产物表达在由EBV转化的淋巴母细胞靶细胞中用于细胞毒性试验。该感染重组体的靶细胞通过由在体外用感染HSV-2的淋巴母细胞进行再刺激作用而诱导的HSV-2特异型CTL的一部分而识别出来。所以这种IE蛋白质构成了用来诱导CTL免疫的HSV疫苗的一种候选成分所以，本发明涉及一种通过人体中细胞溶解性T淋巴细胞(CTL)而识别的即早期型HSV-2-病毒蛋白质ICP27，具体地说是一种实质上具有如在ID Sequence No.1(蛋白质序列)中所示的序列的ICT27。该术语“实质上”的意思是至少85％为同源的，优选地为90至95％同源，更好地是95％以上为同源。
更具体地讲，本发明提出一种疫苗组合物，其中包括由人体中的细胞溶解T淋巴细胞(CTL)识别的即早期型HSV-2病毒蛋白质ICP27，并配以一或多种其他的HSV蛋白质和合适的辅剂。
本发明提供出的疫苗组合物用于治疗或预防处理HSV感染，其中包括HSV-2、即早期型蛋白质ICP27、或其免疫活性片断。该ICP27蛋白质可以作为融合蛋白质而表达，或在一载体上如一乙型肝炎表面抗原上、或通过一种活细菌载体如李氏杆菌、志贺氏菌、BCG或沙门氏菌的形式存在。另外，该蛋白质可以以在一活病毒载体如疫苗、腺病毒或脊髓灰质炎病毒中的形式存在。此外，还可以将该蛋白质送入一种HSV轻质颗粒中，如美国专利申请No.91147140.0和9109763.4(公开于WO 92/13943和PCT LB 92/00824)中所述。
ICP27的这些表达形式形成了本发明的一部分。本发明的一个优选实施方案是一种疫苗重组体，它表达一种HSV-2 ICP27蛋白质或其免疫活性片断。
这是这种蛋白质第一次用作为药物，因此本发明的一个方面提供了用于药物的HSV-2 ICP27。
ICP27是一种即早期型蛋白质，但它在该病毒中的作用尚未被人们很好地理解，但人们已知它对于病毒重现是必需的并涉及病毒基因组转活化作用(transactivation)[McCarthy，A.M.，McMahan，L.Schaffer，P.A.(1989).Herpes simplex virus type 1ICP27 deletion mutants exhibitaltered patterns oftranscription and are DNA deficient.J.Virol.6318-27.，Rice，S.A，Su，L，Knipe，D.M.(1989).Herpes simplex virus alpha proteinICP27 possesses separable positive and negative regulatory actinities.J.Virol.833899-3407]。
作为本文所使用的一种ICP27免疫片断是该蛋白质的一部分，该蛋白质能够诱出功能性免疫应答。
在动物模型中，我们已看到在用剧毒的病毒进行初期攻击之后采用表达ICP27的重组疫苗病毒进行接种，实质上减少了该疾病复发的频率及严重程度。
本发明另一方面提供ICP27 HSV-2蛋白质或其免疫衍生物的制备方法，其中该方法包括在一重组宿主细胞中表达编码所述蛋白质或其衍生物的DNA且回收该产品，且随之可任选地制备它的一种衍生物。
一种包括这种编码顺序(如在IDSequence No.2中所示)或其片段的DNA分子构成了本发明的进一步的方面，且该分子能通过标准的DNA合成技术进行合成，如用酶结合法，它由D.M.Roberts等人在Biochemistry 1985，24，5090-5098中描述、用化学合成法、用体外酶聚合法、或用这些工艺的结合。关于ID顺序2，成熟蛋白质的编码顺序终止于第1536个碱基。
DNA的酶聚合作用可以在体外进行，此时可以在一适当的缓冲液中使用一种DNA聚合酶如DNA聚合I(Klenow片段)，所述的缓冲液要求处于10°-37℃温度下，一般为50ml体积或更少，其中含有三磷酸核苷dATP、dCTP、dGTP、和、dTTP。DNA片断的酶结合法可以使用一种DNA连接酶如T4 DNA连接酶来进行，此时可以在一适合的缓冲液中，例如0.05M Tris(pH7.4)，0.01M MgCl2，0.01M二硫苏糖醇，1mM亚精胺，1mM ATP和0.1mg/ml牛血清清蛋白，处于4℃至室温条件下，一般为50ml体积或更少。DNA聚合物或片断的化学合成法可以通过普通的磷酸三酯、亚磷酸酯、或氨基磷酸酯化学法来进行，其中使用的固相技术如‘Chemical and Enzymatic Synthesis ofGene Fragments-A Laboratory Manual’(H.G.Gassen and A.Lang著)，Verlag Chemie，Weinheim(1982)中所述，或如其它科学出版物中所述，例如M.J.Gait，H.W.D.Matthes，M.Singh，B.S.Sproat，和R.C.Titmas，Nucleic Acids Research，1982，10，6243；B.S.Sproat，和W.Bannwarth，Tetrahedron Letter，1983，24，5771；M.D.Matteucci和M.H Caruthers，Tetrahedron Letter，1980，20，719；M.D.Matteucci和M.H.Caruthers，Jaurnal ofthe American Chemical Society，1981，103，3185；S.P.Adams等人，Journal ofthe American Chemical Society，1983，105，661；N.D.Sinha，J.Biemat，J.Mc Mannus，和Koester，Nucleic Acids Research，1984，12，4539；以及H.W.D.Matthes等人，EMBO Joumal，1984，3，801。
另外，该编码序列可以从HSV-2mRNA中衍生出来，此时使用已知的技术(如将mRNA逆转录来产生一种互补cDNA链)，且从市售可得到的cDNA盒得到。
本发明不限于该特别描述的序列，如上所述它还包括所有编码该蛋白质或其免疫衍生物的分子。
编码本发明的蛋白质突变体的DNA聚合物可以采用常规方法对编码该蛋白质的cDNA进行位点-导向诱变来制备，该方法例如描述于G.Winter等人在Nature 1982，299，756-758中或描述于Zoller和Smith1982；Nucl.Acids Res.，10，6487-6500，或也可以采用缺失诱变法来制备，例如由Chan和Smith在Nucl.Acids Res.，1984，12，2407-2419中描述，或由G.Winter等人在Biochem.Soc.Trans.，1984，12，224-225中描述。
本发明的方法可以通过常规的重组技术来完成，该技术例如描述于Maniatis等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor，1982-1989中。
具体地说，该方法可以包括下列步骤I)制备一种可复制的或整合表达载体，该载体能够在一宿主细胞中表达一种DNA聚合物，该聚合物包括一种核苷酸序列，该序列编码所述HSV-2 ICP27蛋白质或其免疫衍生物；II)用所述载体转化宿主细胞；III)在能使所述DNA聚合物表达的条件下培养所述的转化了的宿主细胞，从而得到所述的蛋白质；且IV)回收所述的蛋白质。
“转化”一词在这里的意思是通过用适合的质粒或用病毒载体进行转化作用，转染作用或感染将异种DNA导入到一宿主细胞中，此时使用的方法例如象在Genetic Engineering；Eds.S.M.Kingsman和A.J.Kingsman；Blackwell Scientific Publication；Oxford，England，1988中所述那样的常规技术。下文将用到的“转化了的”或“转化体”一词是指所产生的含有和表达所需的异种基因的宿主细胞。
该表达载体是新型的，且也构成本发明的一部分。
所述可复制的表达载体可按照本发明来制备，即将与宿主细胞相容的载体分裂，以产生一种具有完整复制子的线性DNA片断，并在连接条件下用一种或多种DNA分子连结所述的线性片断，该分子与所述线性片断一起编码成所期望的产品，例如编码16kDa蛋白质的DNA聚合物、或它的片断。
因此，如所期望的那样，在该载体构造过程中可完成或形成该DNA聚合物。
载体的选择部分取决于宿主细胞，该宿主细胞可以是原核的或真核的。合适的载体包括质粒、噬菌体、Cosmid和重组病毒。
可复制表达载体的制备可通过例如上面已引用过的Maniatis等人的文献中所描述的方法，通常采用适合于该DNA的限制、聚合和连结作用的酶来进行。
按照本发明，通过在转化条件下采用本发明的一种可复制的表达载体来转化一种宿主细胞而制备该重组宿主细胞。合适的转化条件是常规的并描述于例如上面已引用的Maniatis等人的文献，或“DNACloning”Vol.II.D.M.Glover ed.，IRL Press Ltd，1985中。
转化条件的选择取决于该宿主细胞。因此，对于细菌宿主(如大肠杆菌)可以用CaCl2溶液来处理(Cohen等人，Proc.Nat.Acad.Scl.，973，69，2110)或用含有RbCl、MnCl2、乙酸钾和丙三醇的混合物溶液，然后用3-[N-吗啉代]-丙烷-磺酸、RbCl和丙三醇来处理。在培养液中哺乳动物细胞可通过将该载体DNA钙共沉析到该细胞上来进行转化。本发明也扩展到用本发明的一种可复制表达载体转化的宿主细胞。
在能使DNA聚合物表达的条件下培养转化了的宿主细胞通常采用上述已引用过的如Maniatis等人和“DNA Cloning”的文献所描述的常规方法来进行。因此，优选地是在45℃以下温度下向该细胞提供养分，并进行培养。根据宿主细胞采用常见方法对该产品进行回收。因此，当宿主细胞是细菌的(如大肠杆菌)时，可以对它进行物理的、化学的、或酶的溶解；且从所得的溶解产物中分离出该蛋白质产品。当宿主细胞是哺乳动物的时，该产品通常可以从营养基中或从无细胞的萃取物中分离出来。常规的蛋白质分离工艺包括选择性沉淀作用、吸收色谱法、以及亲和色谱法，其中包括单克隆抗体亲和柱。
另一方面，其表达可以在昆虫细胞中进行，其中使用一种合适的载体如杆状病毒。在本发明的一个特殊方面，该蛋白质被表达在鳞翅目细胞中，从而得到免疫多肽。为了在鳞翅目细胞中表达该蛋白质，应优选使用一种杆状病毒表达系统。在这种系统中，其中包括该蛋白质编码序列的表达盒(该盒有效地连接到一种杆状病毒启动子上)通常置于一往反载体中。这些载体包含有足种量的细菌DNA以在大肠杆菌或一些其他合适的原核宿主中传播该往返载体。这种往返载体还含有足量的位于所期望的蛋白质编码序列旁边的杆状病毒DNA，以便在野生型杆状病毒和该异种基因之间能够进行重新组合。然后，将该重组载体用野生型杆状病毒中的DNA同转染到鳞翅目细胞中。随之，从中选择出从同源重组中得到的重组杆状病毒，并且通过标准工艺对其进行斑点纯化。参见Summers等人，TAES Bull(Texas AgriculturalExperimental Station Bulletin)NR 1555，5月，1987。
在昆虫细胞中表达该CS蛋白质的方法详细地描述于SmithklineRIT(WO/US 89/05550)的VSSN 287，934。
在昆虫细胞中的生产可以通过感染昆虫幼体来完成。例如，该蛋白质可以通过一起喂入微量野生型杆状病毒和本发明的重组杆状病毒并且在约两天之后从其血淋巴中提取其蛋白质而在烟芽夜蛾毛虫中进行制备。参见，例如，Miller等人PCT/WO 88/02030。
本发明的新型蛋白质也可以表达在酵母菌细胞中，正如在EP-A-0278941对于CS蛋白质所描述的那样。
疫细构成物能用本领域已知的方法来制成，参见，如欧洲专利申请EP-083,286 Health ResearchInc，发明人Paoletti和Panicali。这种疫苗构成物的结构在实例中将更详细地介绍。
本发明已表明ICP27可以采用通过用HSV-2感染细胞体外刺激PBMC而诱导出的人类HSV特异CTL来识别。通过使用感染细胞体外刺激细胞，在细胞浆中人工合成的病毒表位优选地是以I类分子形式存在。因此，以此途径在体外刺激的效应物细胞的光谱将会包括I类和II类限制性T细胞。
这与用来活化的游离病毒来刺激准备好的PBMC的过程形成对照，该游离病毒是已知的优先诱导II类限制性效应物CTL的，该病毒通过细胞内吞作用而进入抗原存在的细胞中，且通过该II类路径而进行。抗原的新合成作用不发生，且I类受限显示较少发生。
人类CTL应答对HSV的抗原专一性对于作为有效的亚单位疫苗是相当有效的，因为HSV感染的特征在于它能建立潜伏期和定期复活。在潜伏和复活过程中，由于病毒主要是保持在细胞内时，故只有极小量的游离病毒暴露给抗体。
按照本发明为了最大程度增加疫苗的防护能力，该疫苗还可以优选地含有一种或多种其它的HSV蛋白质、其它的即早期型、早期型、或延迟型蛋白质(这些蛋白质能够在人体内刺激-CTL应答)，如gD或gC Vmw65、RR2、ICPO或ICP4。具体地说，该疫苗可以有利地含有一种从HSV-2衍生出来的截断的gD衍生物，正如描述于EP-139417B中的那样。该疫苗也可以含有HSV-1蛋白质或在它们存在处的同样蛋白质的变异体的尾部(Cocktails)。
该疫苗也可以含有HSV-1蛋白质或在它们存在处的同样蛋白质的变异体的尾部(Cocktails)。
本发明的疫苗优选地还可以加以辅物。已知的辅物包括明矾(氢氧化铝)分枝杆菌衍生的抗原，如弗洛因德完整或非完整辅剂、和胞壁酰基双肽(MDP)以及衍生物、皂苷型辅剂如QS21(美国专利US5057,540)等等。一个特别优选的辅助制剂是3-0-脱去酰基的单磷酰基脂类A(3D-MPL)，它从Rili Immunochem处买到，且可按照GB 2220211的方法进行制备，或QS21从Cambzidge Biotech处买到。
在此情况下，3D-MPL和/或QS21所存在的范围是每单位剂量10μg-100μg，且优选的为每单位剂量25-50μg。含有3D-MPL或QS21的疫苗通常存在于明矾上或在水包油型乳剂中疫苗的制备通常描述于由Voller等人编辑的New Trends andDevelopments in Vaccines.，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。在脂质体中的封装例如已描述于Fullerton的美国专利US 4235877中。蛋白质与大分子的连接例如由Likhite美国专利US 4372,945和由Armor等人的美国专US 4,474,757来描述。
在每个疫苗剂量中蛋白质的量要选择成能在典型的疫苗中诱导出免疫保护应答同时没有明显的、不利的副作用。这个量将随着所施用的特定免疫原和它的存在型式而变化。一般，所期望的每个剂量将包括1-1000μg的蛋白质，优选为2-100μg，最好是4-40μg。对于一具体的疫苗来说其最理想的用量可通过标准的研究来确定，该研究涉及在受试体中进行适当的免疫应答观察。随着起始接种之后，受试体可以接受一次或几次有适当间隔的免疫增强。
除了对易受HSV感染的人接种之外，本发明的药用组合物可以用于对受HSV感染的病人进行免疫治疗性的治疗，以便防止或明显地减少疱疹疾病的复发、频率、严重程度和持续时间。
本发明的免疫治疗使用的基本原理是HSV特异CTL(它对病毒产生一种免疫监视作用)的频率可以在最后的抗原激发扩伸之后随时间而在生理上减少。另外，病毒感染可以不激发一个足够强的CTL应答。
当这种CTL以低数量存在于身体内时，复活的HSV感染将在被HSV特异T细胞检测到之前，有更多的机会来进行多次的病毒复制，结果造成大量的在临床上明显的疱疹病灶。然而，若将CTL水平通过合适的治疗接种方案维持在一确定水平，则复活病毒未检测复制的时间将保持在最短。这样对HSV感染个体、在消除或减少临床可检测的复发病灶的严重程度方面将具有有益的作用。这个作用还具有如上所述的通过CTL对即早期抗原的专一性而提供的优点。
治疗接种的合适的方案可以确定为对于HSV感染个体在规定时间间隔内施用治疗上可接受的数量的疫苗制剂，从而达到消除或减少以前发生的复发泡疹疾病的严重程度的结果。
实例1在疫苗病毒中的HSV2 ICP27的表达1、在疫苗表达载体中插入人工合成多接头通过将人工合成多接头SC1115＇GGGAAAACCATGGATCCATGGCAGGTACTAGTGTCGACTAACTAACTAA3＇SC1123＇CCCTTTTGGTACCTAGGTACCGTCCATGATCACAGC
TGATTGATTGATT5＇插入在PSC11疫苗病毒表达载体中独有的Sma I位点中而获得pRit13389(Mackett M.等人，1985.DNA Cloning Vol II，chap 7，apractical approach，Ed.DM Glover，ISBN 0-947946-19-5)。参见
图1。2、用于HSV2基因ICP27表达的构建物。
将ICP27的开放式解读密码(1481bp)的大部分克隆，作为经过处理的1666bps Xhol/M|u|T4聚合酶的一个片断。这个片断在该基因下游含有185bp。
缺失的3＇末端区通过人工合成寡聚核苷酸。UL5415＇CATGGCTACCGACATTGATATGCTAATCGACCTAGGATTGGACCTGTCCGACAGCGAGC3′UL5423＇ CGATGGCTGTAACTATACGATTAGCTGGATCCTAACCTGGACAGGCTGTCGCTCGAGCT5＇而构成在pRit 13389中(位于经过Ncol和Spel T4聚合酶处理的位点之间)将这两个片断连接在一起。这个构建物叫做pRit 13395，参见图2。3、在疫苗中病毒中的表达按照M.MACKETT等人的方案(除了用20μg的质粒DNA进行实验以外)用该表达盒来转化疫苗病毒，(Mackett M.等人1985.ibid)。用CVl细胞(ATTC CCL70)和WR疫苗病毒株进行转染。按照Mackett等人的方法，在鼠2细胞(ATCC CRL1764)中实现重组体的选择。β-半乳糖苷酶活性的检测如Chakrabarti S.等人，Mol. Cell.Biol.1985 53403-3409中所述。4、重组疫苗病毒在疫苗病毒中重组基因产物的表达通过Western印迹法进行试验。蛋白质检测中所用的抗体通过用人工合成肽对兔子进行免疫而获得(其中该合成肽为ICP27 aa2-12 ATDIDMLIDLG，耦合到BSA载体上)。
将兔血清稀释成1/1000，以进行Western印迹分析。
实例2在大肠杆菌中表达ICP27(HSV2)说明所用的大肠杆菌表达系统是质粒pMG81，它是在大肠杆菌中通过培养而有效产生蛋白质的pMG27N的一种衍生物(参见下列参考文献1)。质粒pMG27N是载体pAS1的一种衍生物，人们已将它用于合成大量的多种异种蛋白质(参见参考文献2-9)。该pMG27N质粒(如pASl)利用了来自1噬菌体DNA的信号来驱动插入的异种基因进行转录和转译。该质粒含有1启动子PL；操纵子OL；两个利用位点(Nutl和NutR)以减轻当N蛋白被提供时的转录极性作用；C II核蛋白体接合位点其中包括在Nde I限制位点中引入的C II转译起始密码子(参考文献1)。质粒pMG1已通过将NS1编码区域中最高的81个氨基酸插入由BamHI和sacI消化的pMG27N中而构成的，该NS1编码区域来自流感菌株A/PR/8/34，该菌株是通过BamHI如NcoI从质粒pAS1EH/801(参考文献4)中裂解来的。将通过连接两种合成寡聚核苷酸(5＇ATCCCGGGATAAAAACAACCAAGGTAATGGACA3＇和5＇GCCCTATTTTTGTTGGTTCCATTACCTGTT3＇所得到的合成DNA接头在Nco I和Sac I位点之间插入。pMG81是pMG1的一种衍生物。pMG1已用Bgl II-Pst I消化以除去该氨苄青霉素抗性基因。来自转位子Tn903(13-15)的卡那霉素抗性基因被从质粒pOTS207(16)中分离出来，它是通过EcoRI-PstI消化作用而实现的，将其和人工合成的DNA接头一起连结进入pMG1中，从而将两种合成寡聚核苷酸(5＇AATTCGTACCTA3＇和5＇GCATGGATCTAG3＇)连结在一起。
用于制备NSI-ICP27蛋白质的AR58细菌细胞溶素原是标准的NIH大肠酵杆菌K12菌株N99(Fsu-gaIK2 LacZ-thr-)的一种衍生物。它含有一种缺陷性噬菌体λ溶素原(gal ETn10，1Kil-cI857 HI)，它是Kil(即防止宿主大分子合成停止)，具有一个cI857突变(该cI抑制蛋白中的一个温度敏感病灶)，且具有该H1缺失，该缺失去除了该λ噬菌体右操纵子和其宿主bio.uvr3.以及chlAloci(参考文献17)。AR56菌株是通过用在此之前生长在SA500(gal E∷Tn10，1Kil-cI857 H1)衍生物上的P1噬菌体原种转导N99而产生的。该缺失性λ溶素原向N99中的导入可以借助于在相邻galE基因中存在的编码四环素抗性的一种Tn10转位子而用四环素进行选择。N99和SA500是大肠杆菌K12菌株，它是从National Institute of Health的Dr.Martin Rosenberg＇s实验室中产生出的。
本系统的一个重要特性是将含有PL启动子的质粒导入一种大肠杆菌溶源宿主中，以稳定该质粒DNA(参考文献3)。克隆到细胞溶素原中可以阻止可能使该细胞中毒(10)蛋白质的合成。为了这些目的使用了缺失性λ噬菌体溶素原，以便不会有噬菌体制备发生。在该宿主基因中的整合了的λ噬菌体DNA引导cI抑制蛋白质的合成，该蛋白质与该质粒上的01操纵子结合且阻止RNA聚合酶与PL启动子结合。所以该插入的基因是转录静止的且不发生该重组蛋白质的合成，为了这个原因，在细胞的克隆和生长过程中，没有发生表达。然而，若缺失性λ基因cI基因中携带一种温度敏感性突变(参考文献11)，由PL引导的转录就可以是有规律的。将细菌在缺少表达的条件中生长(30℃转位子激活)，然后变成42℃使转位子不活动，且开始合成所期望的基因产物。质料pMG81/ICP27质粒pMG81/ICP27的构建物(表达NS1-ICP27)已如下列所述的那样(图3)构建成。含有ICP27基因的1.7kb片断通过用EcoRI消化质粒pSC11/ICP27、用T4 DNA聚合酶填充突出的末端、且最终用NcoI消化该线性片断而制成。在用琼脂糖凝胶进行分离和电洗脱(electroelution)之后，这种片断与前面用Xba I消化过的质粒pMG81连接在一起，用T4 DNA聚合酶进行处理，然后用NcoI进行消化。将该连结混合物转化到大肠杆菌菌株AR58中。将该转化体在含有卡那霉素的固体培养基上进行选择。
NSl/ICP27的表达将菌株AR58(pMG81/ICP27)在含有卡那霉素的20ml LB培养基中进行培育，在30℃条件下受一光密度(620nm)的照射为0.6。然后将该营养液在42℃条件下培养3小时。在培育之后在时间为0、30分钟、1小时、2小时和3小时取出5ml该培养液。对这些样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后将该蛋白质通过电迁移(electrotranfer)溅射到一硝化纤维素膜上。对该ICP27-特异蛋白质用兔X-ICP27抗体进行检测。Western印迹分析表明存在一尖锐带，它的大小与期望的NS1-ICP27的大小相一致。更小的ICP27-特异多肽用兔抗血清也检测出来它们可能表示降解的或不完整的NS1-ICP27基因产物。
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同样，用表达HSV-2的ICP27的疫苗重组体进行接种也会在Balb/c鼠中诱导中一种特异CTL应答以及防止它们朝着野生型HSVn或HSV2的带状疱疹方向扩展。
表1用VVICP27(HSVl或HSV2)进行接种以防止BALB/C鼠朝着野生型HSV1或HSV2的带状疱疹方向扩展
<p>Balb/c鼠组(15鼠/组)用107pfu的ICP27.VV在脚趾中进行免疫，且用野生型HSV-1(17+)或HSV-2(MS)在两周后进行攻击。然后记录带状疱疹型病灶和死亡情况。
Balb/c鼠用107pfu的ICP27.VV在脚趾中进行免疫。为了评价最初的应答，在5天后去除引流腿弯部淋巴节结以进行CTL试验无需体外再刺激作用。
实例3通过人类CTL对ICP27的识别材料和方法病人通过静脉穿刺术将从Topical Medicine Institute(Antwerp)处参加性传染疾病临床治疗的病人身上得到的血样收集到肝素化管。病人具有各种临床严重程度的生殖器疱疹损害病灶而且复发疾病的方式亦不同。具有复发疾病的病人的无症状的性伙伴也包括在该研究中。病毒单纯疱疹病毒。在这些实验中所使用的单纯疱疹病毒型2(HSV-2)的HG52菌株通过Prof.Subak-Sharpe(MRC，Glasgow，U.K.)友好地提供。这些病毒在BHK21细胞中生长，该细胞受到0.003菌斑形成单位(p.f.u)/每细胞的多次感染(m.o.i)条件下的感染。将该细胞在感染之后5-7天收获，通过冷冻/解冻来将其分裂以及对其进行声处理。病毒滴度通过菌斑试验在BHK21细胞上进行测定。ICP27疫苗重组体按本文所述的方式进行制备。培养基PBMC培养液在ROMI 1640(Gibco，Ghent，Belgium)中生长，并制备以10％(V/V)加热失活的胎小牛血清(FCS)(Flow laboratories，Irwine，Scotland)，2×10-3ML-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、5×10-5M巯基乙醇、1％MEM非必需的氨基酸(Gibco)、1×10-3M丙酮酸钠MEM(Bibco)。细胞周围血单核细胞(PBMC)通过在一Lymphoprep(Nycomed，Oslo，Norway)密度梯度(Boyum，A.(1968)Scand.J.Clin.Lab.Invest.21，Suppl.97，77)上分离而从血液中获得。PBMC在10％DMSO 90％FCS(V/V)中冷冻并且在使用之前马上将其解冻作为应答细胞。
从每个病人身上得到的PBMC的等分样品用于通过用Epstein-Barr病毒(EBV，从待读感染的绒细胞系B-95.8的培养液上清液中获得)进行转化而产生淋巴母细胞细胞系(LCL)。例如(Walls.E.V.和Crawford，D.H(1987))在Generafon of human B lymphoblastoid Celllines using Epstein-Barr virus中所述。InIymphocytes，a practicalapproach，Klaus，G.G.B.(编辑)pp.149-162，该LCL在细胞毒性试验中用作靶细胞。
用作刺激子细胞的PHA-激活淋巴母细胞用4μg/ml PHA-9(Sigma)在37℃下培养5×106PBMC达72小且用5U.mL rIL2(Bo-ehringer)在37℃下培养该5×106PBMC达7天多来制备。然后将该淋巴母细胞用HSV-2(m.o.i＝10)在37℃下感染16小时，且在PBS中有1％甲醛在4℃下处理20分钟。大量培养物将PBMC解冻且在24井板培养物中进行刺激，该培养物含有2×106应答细胞和5×105刺激子细胞，其中存在1U/mL人类重组IL-2(rIL-2，Boehringer Mannheim)和5％(V/V)从PHA激活淋巴母细胞中获得的上清液。每3-4天用补充以5U/mL rIL2和5％PHA-母细胞上清液培养介质加入培养液中。培养液在第10天重新刺激且在第20天进行毒性活性试验。
限制稀释增养液，将PBMC解冻且分散到96井园形底的板中。每个井的应答细胞的数量范围在103至4×104之间，且对24至32小井确定每个输入细胞浓度。将自体刺激子细胞(5×104小井)加入所有小井。其中包括没有应答子细胞的对照井。在其上层培养液回收1U/mlrIL-2和5％(V/V)PHA-母细胞上清液，且每4-6天将5U/ml rIL-2和5％(V/V)PHA-母细胞上清液加入该培养液。在铬释放试验中，对从每个独立的培养液中得到等量等分试样在第14-21天对3种不同的靶细胞型进行测试；用HSV-2，psC11.VV和ICP27.VV感染自体的LCL。
细胞毒性试验将LCL靶细胞在37℃条件下用HSV-2，psC11.VV或ICP27.Vv(m.o.i＝10)感染1小时，洗涤且在37℃条件下用500μ Ci的51Cr(Medgenix，Fleurus，Belgium)1小时标记。然后洗涤两次靶细胞，将其在冰上培养30分钟，洗涤一次，并且将每个井中的2×103细胞分散到含有应答细胞的井中和含有培养基质或TritonX-100 3％(在水中)的对照井中(分别自发释放和最大释放)。将效应和靶细胞混合物以总量为200μl在37℃条件下培养4小时，然后收获100μl上清液，且释放51Cr(计数值)。其结果按照下列公式以％特异溶解来表示
CTL频率测定和散射图应答与频率通地Fazekas de St.Groth(Fazekas de St.Groth，S.(1982)The evaluation of limiting dilution assags.J.Imm.Meth.49R11-R23)所述的最大可能的方法进行计算。对于每个靶细胞型，若％特异溶解大于截止值，则该井的得分记录为正值，该截止值定义为没有应答细胞的对照井的平均值+3标准误差。HSV-2和ICP27特异型CTL的频率预测值在排除了在对照靶(psC11.VV受感染)上任何井记录为正值的井以后而获得。
散射图用于评价在限制释放培养中细胞溶解活性的专一性。将每个井分成等量体积且对用HSV-2、psC11.VV、或ICP27.VV感染的靶细胞的溶胞作用进行测试。因此，每个井产生％特异溶解的倍数值。将选定的靶细胞类型的一对值用作在2维笛卡尔图的坐标来表示每个井。通过对每个靶细胞类型画出其截止值，将该图分成4个部分在两个靶上为负值的井，在两个靶上为正值的井，和在一个靶为正值而另一个为负值的井。
结果HSV-2染异性CTL的大量培养液诱导。从带有生殖器疱疹各种临床症状的10个病人中获得PBMC并按在材料和方法中所述的那样在大量培养中对其进行刺激。然后对该培养液测试其在51Cr释放试验中的HSV-2特异性细胞溶解活性。其中用自体的和异种的LCL靶细胞作为HLA抑制对照。
有代表性的结果列在表2中。象102的六个病人具有HSV-2特异HLA-限制效应子，而在象109那样的4个病人中没有活性显示。不能诱导CTL的所有病人在其血样取出时都具有活性病灶。仅有一个正在发病的病人可检测到对HSV-2有特异性的CTL(表2)。
HSV-2特异性CTL的频率，为了评价HSV-2特异性CTL的频率，将各种数量的病人PBMC在恒定数量的自体刺激子细胞(受HSV-2感染的PHA-母细胞，其制备如在材料和方法中所描述的那样)的存在下培养。对每个井测试用HSV-2或psC11.VV(作负对照)感染的自体LCL细胞溶解情况。在以此方法测试的14个病人中，有3个(108，114和K01)具有高效应子频率，该效应子溶解了受psC11.VV感染的靶细胞，所以不予考虑。在7个病人中(107、109、111、114、116、118、120)HSV-2特异性CTL的频率范围在1/10000至1/36000之间(例如参见病人111，表3)，而其余的3个病人(101、110、112)具有小于1/89000的频率(表3)。在大量培养时所看到的在可检测的CTL活性和病灶出现时间之间的相互关系不再明显在大量培养中CTL为负值的病人表现出在限制稀释培养中CTL可测。没有明显的关系出现在每年的复发次数与CTL频率之间，在限制稀释培养CTL活性的检测显示出它比大量培养中的更敏感。例如病人109在大量培养中显示出负值，但在限制稀释培养中发现了HSV-2特异性CTL(表2和表3比较)。
通过HSV-2特异性CTL识别病毒抗原为了评价ICP27在CTL识别中的作用，将用受HSV-2感染的刺激子刺激的病人PBMC的限制稀释培养液分成4种状态并来自每个井的3份等分试样在用HSV-2.pcC11疫苗病毒.VV或ICP27.VV(表4)感染的自体LCL上进行测试(表4)，在具有高频率HSV-2特异性CTL的7个病人中，有两个(116和118)具有IC27特异性CTL(频率为1/22000和1/50000)。在病人118中，ICP27似乎是通过CTL识别的主要HSV-2抗原。对于ICP27抗原具有特异性CTL的中间频率在病人(如107)身上发生。病人109对ICP27具有特异性的TCL的频率很低。
表2大量培养中HSV-2特异性CTL的检测结果与病灶出现后的时间关系
病人PBMC用受HSV-2感染的刺激子细胞在大量培养液中进行刺激，且在未感染的或受HSV-2感染的自体的或异种LCL靶上对其细胞溶解活性进行测试。*病史由病人报告。每年的复发次数是根据病人报告的各种时间间隔内的复发次数为基础对一年进行归一化的。**这个病人是具有复发病灶的病人的无症状性伙伴者。***这些病人在限制稀释培养中具有可检测的CTL。
表3HSV-2特异性CTL的频率
PBMC用自体受HSV-2感染的淋巴母细胞在限制稀释培养中进行刺激。各个井是分开的，且在用HSV-2或psC11.VV感染的靶细胞上进行测试。*病史人病人报。每年的复发次数是根据病人报告的各种时间间隔内的复发次数为基础对一年进行归一化的。
表4与识别HSV-2的CTL的频率相比的ICP27特异性CTL的频率<
对从对HSV-2具有良好应答的病人得到的PBMC(CTL频率在1/10000和1/36000之间)进行ICP27识别评价。在排除了在用psC11.VV感染的对照靶细胞上具有溶解活性的井之后进行频率计算。*病史由病人报告。每年的复发次数是根据病人报告的各种时间间隔内的复发次数为基础对一年进行当一化的。
我们这里第一次表明IC27 HSV-2可以通过人类HSV特异性CTL来识别的，该CTL是通过用受HSV-2感染的细胞在体外刺激PBMC而诱导的。ICP27是一种由5个X基因中的一个编码的63千道尔顿多肽，该α基因在感染后首先表达，而ICP27在2-4小时时达到峰值合成。ICP27具有调节功能而且可能是延迟型基因表达所必需的。在7个(具有频率范围在1/10000和1/36000之间的HSV-2特异性CTL的)病人小组中，其中有两个病人具有频率在1/22000和1/5000之间的ICP27特异性CTL。这些频率是在排除了在对照靶细胞上记录为正值的所有培养之后进行计算的，因此它包括最小的评价值。
这些结果表明人类对单纯疱疹病毒的应答的重要部份可以被导向非病毒颗粒的多肽。对于每一个确实能识别这种抗原的病人来说，这种应答构成了对HSV-2的总应答的主要成份，虽然我们不能排除延迟型抗原可能在用HSV-2感染靶细胞所使用的条件中可能会发生过低表达。
权利要求
1.疫苗组合物，其中包括由人体中的细胞溶解T淋巴细胞(CTL)识别的即早期型HSV-2病毒蛋白质ICP27，并配以一或多种其他的HSV蛋白质和合适的辅剂。
2.权利要求1的疫苗组合物，其中其他的HSV蛋白质选自gD或gC Vmw65，RR2，ICPO或ICP4。
3.权利要求1和2的疫苗组合物，其中其他的HSV蛋白质是来自HSV-2的截断的gD衍生物。
4.权利要求1，2和3的疫苗组合物，其中合适的辅剂包括3D-MPL或QS21。
5.权利要求1，2和3的疫苗组合物，其中合适的辅剂包括3D-MPL和QS21。
6.按照权利要求1-5中任何一项所述的疫苗制备方法，其中包括将(i)ICP27，(ii)一或多种其他的HSV蛋白质和(iii)一或多种辅剂混合。
全文摘要
本发明提出一种疫苗组合物一起制备方法,其中包括由人体中的细胞溶解T淋巴细胞(CTL)识别的即早期型HSV－2病毒蛋白质ICP27,并配以一或多种其他的HSV蛋白质和合适的辅剂,而该组合物的制备方法是将(i)IC27,(ii)一或多种其他的HSV蛋白质和(iii)一或多种辅剂混合。
文档编号A61K39/245GK1222393SQ97110399
公开日1999年7月14日 申请日期1997年4月19日 优先权日1997年4月19日
发明者M·施劳伊, P·帕拉, M·库祖科斯 申请人:史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司