肿瘤－血管生成抑制剂和药学组合物的制作方法

专利名称：：肿瘤－血管生成抑制剂和药学组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有良好的抗癌活性和镇痛活性的肿瘤-血管生成抑制剂、包含该抑制剂的药学组合物及使用该组合物治疗癌症的方法。鲨鱼是一种属于软骨鱼纲的鱼，在近海出没。其骨骼为软骨，已知通过捕获和宰杀鲨鱼然后分出软骨而得到的鲨鱼软骨具有抗肿瘤活性，对治疗癌症有效。例如，从美洲鲨鱼得到的软骨产品Cartilaid是作为抗肿瘤物质上市的。当长至约1-2mm3大小时，肿瘤产生血管生成因子，这样，肿瘤可得到其自身生长所需的营养和氧。由于对该新血管增殖的抑制有助于抑制肿瘤细胞的生长并在癌症治疗上有效，因此，人们在寻找具有血管生成抑制活性的物质方面正进行着各种研究，已知鲨鱼软骨具有该血管生成抑制活性。然而，抑制血管生成所需鲨鱼软骨的每日有效剂量高达50-60g，而且其口味和气味令人厌恶，因此，在许多情况下，难以口服给药。由于鲨鱼软骨是粘多糖的混合物，除口服途径之外，无其他合适的给药途径，因此，在口服给药时，鲨鱼软骨必须在处于强酸性条件下的胃中保持不溶，却溶解于吸收部位的肠中。对非常衰弱的癌症患者而言，口服给药往往难以进行。不解决上述口味、气味和剂量问题，鲨鱼软骨不能用作可广泛使用的有效的抗癌物质。因此，迫切需要可将鲨鱼软骨实际用作有效的肿瘤-血管生成抑制剂的技术。此时，发现白细胞介素12(IL-12)是具有NK(自然杀伤)细胞激活作用的细胞因子之一。其后的研究揭示，白细胞介素12刺激对肿瘤细胞具有特异性细胞毒活性的T细胞(杀伤T细胞)生长并可激活T细胞，而且，它可促进能激活杀伤T细胞的干扰素γ(IFN-γ)生成。因此，作为可用于治疗癌症患者的物质，它已引起广泛注意。最近在美国，已可用基因工程技术(重组IL-12(rt-IL-12))大量生产IL-12。已有人尝试用基因转移技术将编码白细胞介素12的基因直接导入癌细胞中，以使IL-12可直接施用在癌细胞上。通过有效使用IL-12来抑制肿瘤生长或使其消失的方法包括从外部向生物体投放IL-12，而另一种方法包括使生物体诱生自体IL-12。这些自体IL-12的优点是，它没有引起异常免疫应答的危险。此外，其敏感性强。因此，它有望产生显著的使肿瘤缩小或根除的效果。鉴于上述现有技术，本发明的目的在于，提供可使为肿瘤-血管生成抑制剂的鲨鱼软骨作为抗癌药物给药的药学组合物。本发明的另一目的在于，提供合用了这些肿瘤-血管生成抑制剂和IL-12诱导物的非常有用的抗癌组合物。本发明涉及肿瘤-血管生成抑制剂，该抑制剂包含包埋在脂肪或油基质中的粉碎的鲨鱼软骨，该基质表面又被另一熔点与上述脂肪或油不同的脂质包衣。下面对本发明作详细描述。本发明的肿瘤-血管生成抑制剂的主要组分的鲨鱼软骨必定为粉碎的形式。在本说明书中，“粉碎的形式”一词是指粒径为1-90微米。为制备这样的粉碎的鲨鱼软骨，最好将市售规格的鲨鱼软骨粉碎。由于在超过60℃的温度加热时鲨鱼软骨中的蛋白质和其他活性成分会热变性并失去其作用，因此需要在低温下进行粉碎。在低温下的粉碎可例如通过在-196℃下用液氮将鲨鱼软骨瞬间冷冻，然后用切刀式粉碎机如Orient碾机等对冷冻块进行粗略的粉碎，接着用高速转子式粉碎机如Impeller碾机等对粗略粉碎过的处于冷冻状态的物块进行粉碎，并用喷气式粉碎机如喷射碾机等将所得物块进一步粉碎。在制备本发明的肿瘤-血管生成抑制剂时，上述粉碎的鲨鱼软骨包埋在脂肪或油基质中。构成该脂肪或油基质的脂肪或油不限于任何特定种类，只要其通常用于药学目的即可。因此，可对此进行适当地选择，例如，可从豆油、菜油、椰子油、花生油和棉籽油等硬化植物油；牛油、猪油和鱼油等硬化动物油；以及它们的混合物中进行选择。在上述脂肪和油中，优选熔点为42℃-56℃的脂肪和油。若必要，可与抗氧化剂如维生素E或儿茶素等合用。对将上述粉碎的鲨鱼软骨包埋在作为基质的上述脂肪或油中的方法的要求并不严格。例如，上述包埋可通过用高速搅拌型成粒机将液化状态的脂肪或油与粉碎的鲨鱼软骨的搅拌好了的混合物成粒来进行。然后将用上述方式产生的含包埋在其中的粉碎鲨鱼软骨的脂肪和油基质再用与该脂肪或油的熔点不同的另一脂质进行表面包衣。在本发明实践中使用的脂质可选自与前面工序中用来制备脂肪或油基质的脂肪或油不同的、通常具有更高熔点的那些脂质。具体例子有棕榈蜡、米蜡(ricewax)和蜂蜡等蜡；硬化动物油或植物油；硬脂酸和棕榈酸等脂肪酸；虫胶等天然树脂；和棕榈醇和硬脂醇等长链醇。在进行上述包衣时，例如可使用粉末包衣技术。另一可在制备本发明的肿瘤-血管生成抑制剂中使用的方法例如包含下述工序将上述粉碎的鲨鱼软骨分散在预先熔化的脂肪或油中，用喷雾法使分散液冷却，然后在滚动成粒机中用熔点与上述脂肪或油不同的另一脂质包衣所得粉末。由此制得的本发明的肿瘤-血管生成抑制剂含作为主要活性成分的鲨鱼软骨，其口味和气味被完全掩蔽，从而彻底解决了难以口服的问题。此外，制得的肿瘤-血管生成抑制剂的表面摩擦减少，其结果，其流动性得到改善，粘附性下降，从而非常适合口服。另外，可将其设计成在胃的强酸性条件下不溶而在其吸收部位的肠中溶解。在本发明实践中使用的粉碎的鲨鱼软骨中，粒径不超过32微米的粒子至少占99.5重量％。如在实施例中将详细说明的，粉碎的鲨鱼软骨的粒径对本发明的效果具有很大的影响。当粒径太大时，肿瘤-血管生成抑制活性下降。制备粒径均一的鲨鱼软骨的方法的例子有用所需筛目的筛将粉碎的鲨鱼软骨过筛的方法。虽然作为在本发明实践中使用的鲨鱼软骨的原料的鲨鱼不限于任何特定种类，但最优选从青鲨鱼(大青鲨)中得到的鲨鱼软骨。青鲨鱼的软骨含大量的活性成分蛋白质和共聚多糖，尤其适用。美国产品Cartilaid是从许多鲨鱼种类的混合物中制得的，因此存在批次间的差异。另一缺点是其效果较低。业已确认，本发明的肿瘤-血管生成抑制剂不仅具有肿瘤血管生成抑制活性，而且还具有可靠的镇痛活性。癌症患者，尤其是晚期癌症患者一般会诉说严重的疼痛。因此，当将本发明的肿瘤-血管生成抑制剂作为抗癌药给诉说严重疼痛的患者服用时，其抗癌活性和镇痛活性产生协同作用，从而可得到非常有效的治疗效果。对本发明的肿瘤-血管生成抑制剂如何产生肿瘤-血管生成抑制活性的研究结果提示，如在下面的实施例中将详细说明的，存在细胞凋亡。虽然本发明的肿瘤-血管生成抑制剂作为抗癌药非常有用，但它还同样地具有镇痛活性，可用于其他药学领域。因此，在第二方面，本发明提供包含本发明的肿瘤-血管生成抑制剂的药学组合物。而且，以足以抑制肿瘤血管生成的剂量施用本发明的肿瘤-血管生成抑制剂来治疗癌症的方法也落在本发明的范围内。本发明的药学组合物的特征在于，它含有肿瘤-血管生成抑制剂和白细胞介素12诱导物。该药学组合物反映本发明的第二方面。下面详细描述本发明的第二方面。在本说明书和权利要求书中，“白细胞介素12诱导物”一词不仅是指可在体内诱导白细胞介素12(IL-12)的物质，而且还包括IL-12本身、IL-12基因导入的癌细胞、rt-IL-12和概括地说，所有可在体内诱导产生IL-12的物质，而无任何特殊限定。其例子有活性半纤维素化合物(AHCC)等。已知AHCC为可通过对蘑菇菌丝细胞壁中的植物纤维进行酶处理而得到的生理活性物质，它含有β-(1→3)-D-葡聚糖、β-(1→6)-D-葡聚糖和α-(1→4)-D-葡聚糖等杂聚糖；肽聚糖、蛋白聚糖、凝集素、核酸、不消化的多糖等。除AHCC之外，上述可在本发明中使用的IL-12诱导物的例子还包括蘑菇菌丝体的成分。所述蘑菇菌丝体成分并不限于任何特定的种类，但包括作为抗癌药使用的变色多孔菌(Polyporusversicolor)菌丝体成分的PSK、裂褶菌(Schizophyllumcommune)菌丝体成分的SPG和香菇(Lentinulaedodes)菌丝体成分的蘑菇多糖。上述蘑菇菌丝体成分的例子还包括蘑菇属(agarics)、灵芝(Ganodermalucidum)、会合白孔菌(Albatrellusconfluens)、Agaricusblazei、巨大口蘑菌(Tricholomagiganteum)、歪侧纤孔菌(Inonotusobliquus)、Grifolafrondosa、猴头菌(Hericiumerinaceum)、糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)、Panellusserotinus、木层孔菌属(Phellinus)、桦褶孔菌(Lenzitesbetulinus)、松口菇(Tricholomamatsutake)、Perenniporiafraxinea、Flammulinavelutipes等的菌丝成分。可在本发明中使用的IL-12诱导物还包括酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)或haemolitycus的纤维成分。上述纤维成分的例子包括已知的抗癌药，如OK-432(picibanil)。它们是作为生物性应答修饰剂(BRM)而已知的物质。上述IL-12诱导物具有激活和启动杀伤T细胞的作用。因此，存在于体内的杀伤T细胞被上述IL-12诱导物激活。另一方面，上面详细描述的肿瘤-血管生成抑制剂抑制由癌细胞(肿瘤细胞)引起的新血管增殖。当新血管增殖被抑制时，在血液供给被抑制的压力下，肿瘤细胞在其表面表达如Fas抗原、CD80和CD86等粘着因子。杀伤T细胞可识别Fas抗原、CD80、CD86和其他作为抗原的粘着因子。因此，这些被表达的粘着因子处于可容易地被杀伤T细胞识别的状态，由此被修饰并变得容易识别的肿瘤细胞轻易地被杀伤T细胞攻击。若处于这样的条件，与仅使用IL-12诱导物时相比，上述IL-12可更显著地攻击肿瘤细胞。本发明的肿瘤-血管生成抑制剂和IL-12诱导物的协同乃基于上述机理并发挥很强的抗癌作用，从而引起肿瘤细胞被破坏的细胞凋亡。该发现是由本发明者最早完成的。对给人或其他动物服用的本发明药学组合物的剂型无任何特殊的限制，可以是通常使用的药物承载在载体上的任何剂型。作为上述载体，使用固体、半固体、液体稀释剂、填料和其他配方辅料中的至少一个，其比例例如为0.1-99.5％，最好为0.5-90％。本发明的药学组合物可完全口服或非口服给药。非口服途径的例子有局部给药(如组织内注射)、皮下注射、肌内注射、动脉注射或静脉注射以及直肠给药。适合这些给药途径的剂型可用常规的技术手段来制成。当将上述组合物用作例如抗癌药时，需根据患者的年龄和体重、给药途径、疾病及其严重程度和其他因素来确定剂量。但给成人的口服剂量以活性物质的重量来表示，一般在1-10克/日，最好在5-6克/日的范围内。非口服剂量可根据给药途径而有很大变化，一般可在100-10,000毫克/日，最好在2-5克/日的范围内。在某些情况下，剂量小一些也足够，而在另一些情况下，则可能需要更大的剂量。可将每日的药剂分2-4次服用。可使用固体或液体单位剂型，例如使用散剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、糖浆、酏剂、悬浮液等剂型。散剂可通过将活性物质粉碎成适当细度而制得。粉剂可通过将活性物质粉碎成适当细度并将其与用相同方式粉碎好了的药用载体，例如淀粉或甘露醇等食用碳水化合物或其他一些适当赋形剂混合而制得。若必要，可添加其他添加剂，如调味剂、防腐剂、分散剂、着色剂、香料等。胶囊可通过将按上述方法得到的散剂或粉剂制成颗粒或片剂，然后将所得颗粒包裹在明胶胶囊等胶囊壳中而制成。在充填之外，可根据需要加入润滑利和/或流动性改善剂，如胶体二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固态聚乙二醇。当采用胶囊时，可加入崩解剂或增溶剂，如羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、低取代的羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、碳酸钙、碳酸钠等来改善药效。软胶囊可通过将粉碎的活性物质悬浮或分散在植物油、聚乙二醇、丙三醇或表面活性剂中然后将所得分散液包裹在明胶片中而制成。颗粒可用下述方法制成将粉末形式的活性物质与上述赋形剂和崩解剂混合，然后加入湿润剂(例如，糖浆、淀粉糊、阿拉伯胶、纤维素溶液、聚合物溶液)，若必要，还可加入粘合剂(例如，羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇)，接着揉捏所得混合物并加压使该混合物过筛。除上述粉末颗粒化方法之外，还可用下述方法制备颗粒先将混合物送入制片机中，然后研磨所得的非完整形片块。可先加入阻溶剂(如石蜡、蜡、硬化蓖麻油)、重吸收剂(例如，季盐)或吸附剂(例如，皂土、高岭土、磷酸二钙)。片剂可通过在用上述方法得到的颗粒中加入硬脂酸、硬脂酸盐、滑石粉、矿物油和润滑剂等，然后将所得混合物制成片剂而制得。可用膜或糖包衣由此制得的素片。也可用下述方法制成片剂将本发明的活性物质与可流动的惰性载体混合，然后直接制成片剂而省去上述颗粒化或形成片块的工序。也可使用透明的或半透明的由不透气的虫胶涂料制成的保护性涂层、由糖或高分子材料制成的涂层和由蜡制成的抛光涂层。其他口服剂型如糖浆、酏剂和悬浮液也可制成单位剂型，以使其特定量含某特定量的活性物质。糖浆通过将活性物质溶解在合适的调味过的水溶液中而制成。酏剂通过使用无毒性的醇类载体而制成。悬浮液通过将活性物质分散在无毒性的载体中而配制成。同样地，可任意地加入悬浮剂或乳化剂(例如，乙氧化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯)、防腐剂、调味剂(例如，薄荷油、糖精)和/或其他物质。可根据需要将口服用的单位剂量药剂进行微包囊。进一步包衣上述药剂或用聚合物或蜡包埋活性物质，可延长药剂的作用时间并可获得缓释。通过制备液体单位剂型的可注射的组合物如溶液或悬浮液，可进行皮下、肌内、动脉内或静脉内给药。这些制剂可通过将某一特定量的活性物质溶解或悬浮在适合注射目的的无毒性的液体载体如水性或含油溶剂中，然后对所得溶液或悬浮液进行灭菌处理而制成。也可将某一特定量的粉末或冻干形式的活性物质装入注射剂用的小瓶中，然后对小瓶及其内容物进行灭菌处理和密封。在这种情况下，可准备备用小瓶和载体以在临注射之前进行溶解或混合。可添加无毒性的盐或盐溶液以使注射用组合物等渗化。此外，可附加使用稳定剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂和/或其他物质等。直肠给药用剂型可通过将活性物质与疏水性或亲水性栓剂基质如聚乙二醇、可可脂、高级酯(如棕榈酸肉豆蔻酯等)或它们的混合物混合并将所得混合物研磨而制成。如上所述，本发明的肿瘤-血管生成抑制剂无鲨鱼软骨的令人厌恶的口味和气味，耐酸并仅在肠中溶解，可通过口服途径用常规方法给药。此外，它具有可靠的抗癌活性和镇痛活性，作为药学组合物非常有用。将本发明的肿瘤-血管生成抑制剂和IL-12诱导物合用，可产生非常强的抗癌活性，因此对制备药学组合物非常有用。实施本发明的最佳方式下面的制造例和实施例通过举例进一步详细说明本发明。但它们并不对本发明的范围进行限定。制造例1包埋在油或脂肪中的鲨鱼软骨的包衣制剂的制造将60重量份平均粒径为27微米的粉碎的鲨鱼软骨加入高速搅拌式成粒机(高速混合器；深江工业株式会社产品)中，在将成粒机内部温度保持在10℃和以20-100rpm继续搅拌的同时，喷入10重量份熔融状态的得自牛脂的硬化油(熔点48℃)。熔融油的小滴沾在粉碎的鲨鱼软骨上，形成基体。但在该阶段，鲨鱼软骨部分暴露在表面，包衣状况尚不充分。因此，用30重量份平均粒径为5微米、熔点与上述得自牛脂的硬化油的熔点不同的粉碎的硬化菜油(熔点68℃)包衣各初始基体，包衣方法为将所述硬化菜油加入同一搅拌式成粒机中，以约1,000rpm的速率搅拌混合物30分钟，由此使所述硬化菜油沾附和涂遍初始基体表面。从而得到非常令人满意的用脂肪基质包衣的具有足够耐酸性和缓释性能的制剂。实施例1对小鼠肿瘤-血管生成抑制活性的试验(对鲨鱼软骨粒径进行评价)试验是用背部气囊法进行的。将微孔滤器固定在直径5mm的塑料环的两侧并注入1×106MH-134肿瘤细胞和培养基，由此制得试验盒。将小鼠分成6只一组，并将上述试验盒(chamber)皮下植入各小鼠的背部。给4组小鼠以1,000mg/kg的剂量口服下述鲨鱼软骨达4日。第5日，评价血管生成抑制程度。在另一组(对照组)中，不给小鼠服用鲨鱼软骨，用相同方式评价在第5日的抑制程度。促进血管生成的物质通过微孔滤器从肿瘤中泄漏导致在与试验盒接触的表面形成新血管。这些肿瘤诱导的新血管呈螺旋形状。按下述基准对该血管生成抑制程度进行计分(++)3分血管生成显著(+)2分血管生成清楚(±)1分血管生成轻微(-)0分无血管生成抑制百分比用与对照组相比得分的减少(％)来表示。鲨鱼软骨(1)Cartilaid，美洲鲨鱼软骨产品，用作原料鲨鱼软骨。用液氮(-196℃)将该产品瞬间冷冻，并用切刀式碾机(Orient碾机)进行粗略粉碎。接着，仍然在冷冻状态，用高速转子式碾机(Impeller碾机)将被粉碎物进一步研磨，最后用喷气式碾机(喷射碾机)进行研磨。鲨鱼软骨(2)将上述鲨鱼软骨(1)用32微米的筛子过筛，使用其筛上部分。鲨鱼软骨(3)将上述鲨鱼软骨(1)用32微米的筛子过筛，使用其过筛部分。结果见表1。表1*P＜0.05上述结果表明，在试验的鲨鱼软骨粉末中，通过32微米筛的粉碎的鲨鱼软骨显示明显较高的血管生成抑制活性。实施例2对小鼠肿瘤-血管生成抑制活性的试验(Cartilaid对Buttershark)用背部气囊法按与实施例1相同的方式对Cartilaid(美洲鲨鱼软骨)和得自青鲨的软骨(Bettershark)进行比较。结果见表2。100mg/kgCartilaid组的抑制％(与对照组相比，得分减少百分比)为3.6％，而1,000mg/kgCartilaid组为21.4％，具有显著差异(P＜0.05)。与之相反，Bettershark的100mg/kg组的抑制％为17.9％，具有显著差异(P＜0.05)，1,000mg/kg组的抑制％高达35.7％，其差异具有统计学上的显著性(P＜0.002)。还发现Cartilaid与Buttershark之间的显著差异(P＜0.05)。表2*P＜0.05，**P＜0.002上述结果表明，Bettershark具有高于Cartilaid的肿瘤-血管生成抑制活性。实施例3对小鼠肿瘤-血管生成抑制的试验(寻找Buttershark有效剂量的试验)将1×106肿瘤细胞(肉瘤180)皮下植入各小鼠(ICR小鼠，雄性，6周龄)的背部，共3组，每组10只。在一个组中，植入肿瘤细胞后立即给小鼠口服Cartilaid(美国产品)，剂量为每日1,000mg/kg，共20日。在另一组中，在相同期间给小鼠服用相同剂量的Bettershark(粒径已调整至不超过32微米；经确认，在pH2时放置3小时仍稳定)。在第三组中，给小鼠喂食20日而不给任何药。25日后，将小鼠全部宰杀，对肿瘤称重。所得结果见表3。抑制百分比用与对照组相比肿瘤重量的减少百分比来表示。在Cartilaid组中，与对照组相比，抑制百分比为11.1％，而在Bettershark组，则为47.0％，具有显著差异(P＜0.001)。对Cartilaid与Bettershark之间的比较结果显示，Bettershark具有更强的抗肿瘤活性(P＜0.05)。表3*P＜0.05，**P＜0.001上述结果提示，每日每人20克剂量的Bettershark(粒径不超过32微米)在临床实践中将足够有效。实施例3对小鼠镇痛作用的试验用乙酸翻滚法(aceticacidwrithingmethod)评价Bettershark的镇痛作用。将ICR小鼠(雄性，5周龄)分成5组，每组10只。按下述计划将给试验物质给各组服用，40日后，给各小鼠腹膜内注射2％乙酸。在注射乙酸后的10-20日期间里，对各小鼠出现的翻滚反射进行计数。注射乙酸后，每日给小鼠服用试验物质直至终止对翻滚反射进行计数。在Cartilaid组中，Cartilaid的口服日剂量为1,000mg/kg；在Bettershark组中，Bettershark的口服日剂量为1,000mg/kg；在Indacin组中，Indacin(吲哚美辛，非甾族镇痛药；市售品)的口服剂量为25mg/kg；在硫酸软骨素组中，硫酸软骨素(市售品)的口服剂量为333mg/kg；在对照组中，给小鼠喂食而不给任何药。抑制百分比用与对照组相比上述反射数的减少百分比表示。结果见表4。在镇痛作用方面，Bettershark也同样地具有优势。表4*P＜0.05，**P＜0.001实施例5在服用Bettershark的临床病例中免疫特异性抗原的表达一80岁的男性诉说腹上部有不适感觉。根据胃镜的检查，他被诊断为在胃角(胃角切迹)有IIc进行性型胃癌(印戒细胞癌)。对活组织检查试样进行电子显微镜和组织学检查(免疫学检查)。由于他心肌梗塞，因此不能进行手术。以20克的日剂量给上述患者每日服用实施例1中使用过的鲨鱼软骨(3)(以下，在实施例5中称为“Bettershark”)。在服用Bettershark之前进行的电子显微镜检查和免疫学特殊染色检查(第一次胃镜检查)仅给出了普通癌细胞的一般所见，表明细胞凋亡的所见很少。既未观察到粘着因子(荧光抗体技术)也未观察到Fas抗原(特殊染色法)，而且，未观察到HSP60(应激蛋白，热激蛋白；荧光抗体技术)的表达。在第一次胃镜检查2个半月后进行的胃镜检查给出了表明癌四周正明显地被正常的粘膜覆盖，四周癌隆起有被弄平的趋势的所见。在第二次活组织检查中电子显微镜检查结果显示，细胞膜和细胞质无特殊变化，但清楚地显示癌细胞核的收缩和破碎，并观察到细胞凋亡体(apoptoticbodies)。由此得到表明癌细胞凋亡的真实所见。与此同时，对活组织试样进行免疫学特殊染色。用抗HSP60抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体以及抗Fas抗体检验癌细胞。服用Bettershark制剂的结果，Fas抗原变为阳性，且HSP60抗原和CD80、CD86的粘着因子也变为阳性。在第三次胃镜检查(在第一次胃镜检查约5个月后)中，在上胃角的癌已完全消失。在发现过胃癌的部位采取活组织试样进行检查，均未发现癌细胞。上述所见可归纳如下。在服用Bettershark制剂之前未观察到的Fas抗原、HSP60抗原和CD80、CD86的粘着因子在服用Bettershark制剂2个半月后均变为阳性。其后，第三次胃镜检查显示，癌完全消失。该现象可作如下解释。由于服用了Bettershark制剂，对肿瘤的血供给被抑制，其结果，应激蛋白(HSP60)被表达出来，Fas抗原和CD80、CD86的粘着因子变为阳性。其后，在第三次胃镜检查中，证实肿瘤完全消退。对肿瘤的免疫学研究结果显示，肿瘤消退包含细胞坏死和细胞凋亡。细胞坏死是由炎症或其他因素在非特异性免疫的作用下引起的肿瘤消失的现象，其中细胞膜、细胞质和细胞核依次变质，肿瘤细胞破裂。在细胞坏死的情况下，组织学上出现其中有中性白细胞、巨噬细胞和成纤维细胞渗入，接着钙化和生成纤维，导致癌消失。其结果，在该部位留下痕迹。另一方面，在由细胞凋亡引起的肿瘤消失的情况中，炎症根本未发生，也未留下痕迹，却发现被正常的组织置换。在该情况中，已知杀伤T细胞识别在肿瘤细胞表面的Fas抗原并粘附上去，同时与CD80或/和CD86的粘着因子等一起协同诱导细胞凋亡。首先出现核变性(核破裂和形成凋亡体)，接着细胞质和细胞膜被巨噬细胞吞噬。因而未留下痕迹。在上述和其他服用Bettershark制剂的情况中，未在癌消失的部位得到提示炎症痕迹如钙化或纤维生成的所见，由此提示，癌的消失应是由于细胞凋亡所致。这表明癌在非常短的期间内已消失(1个月至1个半月)。实施例6对小鼠的免疫特异性试验将肉瘤180肿瘤细胞植入各小鼠的背部。比较下述各组的肿瘤生长抑制作用一组腹膜内注射TNP470(武田化学工业株式会社产品)10mg，一组口服Bettershark1,000mg/kg，一组腹膜内注射angiostatin(化学疗法和血清疗法研究所产品)24μg，对照组则不给任何药。2周后和3周后，发现与对照组相比，所有给药组的肿瘤生长具有显著差异(P＜0.05)地被抑制。在上述时间对肿瘤组织的HSP60、Fas抗原、CD80和CD86的表达进行免疫组织学检查，发现HSP60、Fas抗原、CD80和CD86的表达水平显著提高。另外，用T细胞缺乏小鼠，即裸小鼠进行与上述相同的试验。各药物均显示某种程度的肿瘤生长抑制作用，但无显著差异。根据免疫组织学检查的结果，发现HSP60、Fas抗原、CD80和CD86的表达为阳性。但未得到任何提示细胞凋亡的所见。上述结果提示，血管生成抑制剂的抗肿瘤活性不仅基于纯粹的对肿瘤血供给的阻止，而且还包含杀伤T细胞在对肿瘤的血供给被抑制或Fas抗原、CD80和CD86的表达出现定性或定量变化的状态下识别应激蛋白表达，从而显示它们的抗肿瘤活性，由此诱导细胞凋亡。实施例7-10并用AHCC和Bettershark的情况以3.0g的日剂量给表5所示的4个癌症患者每日服用AHCC，与此同时，以20g的日剂量给他们每日服用Bettershark。服用3个月后，评价治疗结果并确定NK活性、IL-12水平和CD4/CD8值。在实施例7和10中，肿瘤均减小50％或更多。但NK活性则仍处于正常范围，活性无任何显著的提高。在实施例7和10中，IL-12远高于正常范围。因此，可以推测，肿瘤缩小与IL-12有关。在表5中，CD4是辅助T细胞标志，CD8是杀伤T细胞标志，CD4/CD8值反映杀伤T细胞数的增加程度。该值小于1表示杀伤T细胞数增加，正常范围为1.0-1.5。表5</tables>权利要求1.肿瘤-血管生成抑制剂，包含包埋在脂肪或油基质中的粉碎的鲨鱼软骨，该基质的表面被另一熔点与上述脂肪或油基质的不同的脂质进一步包衣。2.肿瘤-血管生成抑制剂，含粉碎的鲨鱼软骨，其特征在于，在粉碎的鲨鱼软骨中，粒径不超过32微米的颗粒至少占99.5重量％。3.如权利要求1或2所述的肿瘤-血管生成抑制剂，其特征在于，鲨鱼软骨得自青鲨。4.药学组合物，包含权利要求1、2或3所述的肿瘤-血管生成抑制剂作为基本成分。5.抗癌药物，包含权利要求1、2或3所述的肿瘤-血管生成抑制剂作为基本成分。6.治疗癌症的方法，包括用权利要求1、2或3所述的肿瘤-血管生成抑制剂以足以抑制肿瘤血管生长的剂量给药。7.药学组合物，包含权利要求1、2或3所述的肿瘤-血管生成抑制剂和白细胞介素12诱导物。8.抗癌药物，包含权利要求1、2或3所述的肿瘤-血管生成抑制剂和白细胞介素12诱导物。9.治疗癌症的方法，包括用权利要求1、2或3所述的肿瘤-血管生成抑制剂和白细胞介素12诱导物给药。全文摘要本发明的目的在于提供可使肿瘤－血管生成抑制剂的鲨鱼软骨作为一种抗癌药物给药的药学组合物。本发明涉及肿瘤－血管生成抑制剂,该肿瘤－血管生成抑制剂包含包埋在脂肪或油基质中的粉碎的鲨鱼软骨,该基质的表面被另一熔点与上述脂肪或油基质的不同的脂质进一步包衣。文档编号A61K35/60GK1185319SQ9712266公开日1998年6月24日申请日期1997年11月17日优先权日1996年11月19日发明者八木田旭邦申请人:日本油脂株式会社,株式会社赛伊信企业,八木田旭邦