专利名称：获得能够产生抗肿瘤分子的微生物的方法
技术学科本发明涉及生物技术领域，特别是涉及获得能够产生抗肿瘤分子的微生物的方法，所述微生物是在合适的宿主中以转化细胞反击微生物菌株期间获得的。
以前的技术到目前为止没有报道过用于诱导微生物产生具有抗肿瘤潜力的分子的方法。
发明详述microbiotic构成了生物技术重要性的潜在的生物活性化合物，它们在其它天然源不存在。本发明的新颖性在于用天然形式的或通过在实验室处理过的转化细胞在合适的宿主中反击任何来源的微生物菌株，从而在微生物和这些细胞之间产生拮抗作用，这种行为导致从微生物释放能够产生导致肿瘤细胞死亡的分子，这样产生了新的微生物突变体。
获得微生物突变体的主要步骤如下分离和克隆能够在特定培养条件下突变的微生物菌株；用转化细胞进行反击，并且分离产生具有抗肿瘤活性的分子的突变菌株。将这些突变体在最佳培养基条件下进行生长并且产生上面提到的分子。
在体外检测中，利用鼠和人细胞证实所获得的制剂的抗增殖活性，利用动物模型体内证明其抗肿瘤潜力。
本发明的目的是研制用于获得能够产生抗肿瘤分子的微生物的方法，所述分子可用于治疗致瘤性疾病。
本发明的新颖性在于用肿瘤细胞在合适的宿主中反击微生物菌株。根据共培养8天可达到上述目的；然后使肿瘤样本退化，进行微生物学分析，直到发育产生微生物菌株的突变体克隆，并且根据其产生具有抗肿瘤活性的分子的能力进行识别。
为了利用本发明描述的方法获得抗肿瘤制剂，例如在1升蛋白胨-甘油培养基中，28℃，培养微生物突变菌株15小时，培养的同时进行光照和振荡。然后将培养液以12000g，4℃离心30分钟，去除上清液，随后在不同的孔径的滤膜上，在无菌条件下过滤，滤膜孔径最高达到0．2微米。
实施例1获得微生物突变菌株为了获得微生物突变菌株，使用粘质沙雷氏菌(ATCC 14756)并且以7-8周龄的重量为20-22克的雄性BALB／c小鼠作为宿主。用0．5毫升的重液体凡士林腹膜内(i．p．)注射接种这些小鼠。在10天之后，给小鼠腹膜注射鼠肿瘤细胞CB-HEP1(1×106细胞／毫升，1毫升/小鼠)，以诱导腹水肿瘤，并且注射lcfu的上述微生物菌株。8天之后，回收腹水液体，进行微生物学分析，在所述腹水液中检测接种的微生物菌株的突变体。分离突变体菌株(
图1和2)，命名为SM9056。
实施例2突变菌株SM9056的培养和保存培养物是在蛋白胨-甘油平板上，28℃生长的菌落的一部分，接种预培养物并且培养4小时(对数期为起点)。利用GRAM染色检测培养物的纯度(革兰氏阴性球杆菌)。借助于API20E试剂盒(bioMerieux)进行识别。
利用电子显微镜观察形态学特性(图3)。分析培养基和培养条件，直到建立产生重复生长曲线的最佳培养物(图4)并且保持表现型特性。
将SM9056菌株冷冻储存并且在脱脂牛奶中冻干以长期储存。
实施例3抗肿瘤制剂为了从前面描述的实施例分离的SM9056突变菌株获得抗肿瘤制剂，在1升蛋白胨-甘油培养基中，28℃培养所述微生物15小时，培养的同时进行光照和振荡。将培养液以12000g，4℃离心30分钟，去除上清液，随后在不同的孔径的滤膜上，在无菌条件下过滤，滤膜孔径最高达到0．2微米。然后利用10kDa截断膜将上清液体积降低10倍，在4℃，PBS中，生理条件下透析24小时。在无菌条件下将透析后的物质过滤，将5毫升物质分散于晶体apirogenic小管。将抗肿瘤制剂储存于4℃。
实施例4利用体外分析对抗肿瘤活性进行评估在不同的人和鼠肿瘤细胞系上，在下面的试验条件下，对抗肿瘤制剂的抗增殖或细胞毒性活性进行评估-鼠肿瘤细胞P3X63Ag8骨髓瘤(KEARNEY，J．F．等人(1979)，免疫学杂志，1231548-1550)-CB-HEP1杂交瘤(FONTIRROCHI，G．，等人(1993)，生物技术应用10(1)24-30)在24孔平板上用不同浓度的抗肿瘤制剂培养细胞(2×104细胞／毫升，CB-HEP1和1×104细胞／毫升，P3X63Ag8)，在37℃，5％二氧化碳的湿润大气中，在RPMI1640培养基中培养72小时，所述RPMI1640培养基补充了1克／升碳酸氢钠，3克／升HEPES，2nML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，0．05mM2-巯基乙醇，10％新生牛血清，40毫克／毫升庆大霉素。对于杂交瘤的情况，在培养基中还补充0．03mM次黄嘌呤，3mM胸苷和0．4mM氨基喋呤。所有细胞系中没有微生物和病毒存在。
在相类似条件下培养P3X63Ag8和CB-HEP1细胞，但是在载体(PBS)存在下培养作为阴性对照。
通过每培养24小时计算存活细胞数评估其效果。
人肿瘤细胞喉癌衍生的Hep-2细胞(ATCC CCL23)-子宫颈腺癌HeLa细胞(ATCC CCL2)-恶性黑素瘤A375细胞系(ATCC CRL1619)在补充了10％胎牛血清(GIBCO)的Dulbecco改良的MEM(GIBCO)中，37℃，5％二氧化碳的湿润大气中培养这些细胞系。如上所述，所有细胞系中没有微生物和病毒存在。
将肿瘤细胞(104细胞／毫升，0．1毫升／孔)播种到96孔平板(COSTAR)中，24小时后用含有不同浓度的抗肿瘤制剂的新鲜培养基替代现有的培养基。培养平板保温72小时，然后用5％结晶紫／20％甲醇染色。通过分光光度计读数，在580nm处，利用平板计数器(SUMA，TechnoSUMA，来自于Havana)评估细胞存活力。结果以相对于对照的生长百分数表示。将Hep-2，HeLa和A375细胞在类似条件下培养，以仅存在培养基时作为阴性对照。
利用剂量-应答曲线决定抑制50％的细胞生长所必需的浓度(IC50)，图5。生长曲线(图6)显示在处理和对照培养物中，开始的24小时期间，抗肿瘤剂量≤19．25纳克／毫升时，细胞数的增加相类似。在该阶段之后，在含有抗肿瘤制剂的培养物中观察到细胞的增殖显著地降低(或细胞死亡增加)。这些结果暗示在生长捕获之前细胞能够分裂一次以上(LOHMEYER，M．和WORKMAN，P．(1995)。英国癌症杂志，72277-286)。但是，在剂量＞19．25纳克／毫升时，24小时之后细胞生长立即降低，这可能与细胞的程序化死亡有关，因为采用光学显微镜在处理的细胞中观察到程序化死亡的细胞的一些特征，例如细胞皱缩，黑暗和变形的核(COTTER，TG和M．AL-RUBEAI(1995)。生物技术趋势13(4)150-155)。
结果证明抗肿瘤制剂的效果取决于剂量和接触的时间(图5和6)。
对于人和鼠肿瘤细胞IC50值分别是2-3纳克／毫升和12-15纳克／毫升。对于人细胞，与以前描述的其它有效的抗肿瘤药物相比，细胞毒性效果较高(COTTER，TG和M．AL-RUBEAI(1995)。生物技术趋势13(4)150-155，Van OOSTEROM，A．T．和SCHRIJVERS，D．(1995)。抗肿瘤药物，6356-368)。在各种肿瘤细胞系，鼠(P3X63Ag8和CB-HEP1)和人(Hep-2，HeLa和A375-数据未显示)，评估本发明的抗肿瘤制剂的抗增殖和细胞毒性特性，附图7。
实施例5抗肿瘤效果的测定为了测定本发明的抗肿瘤制剂的体内效果，使用7-8周龄的重量为20-22克的雄性BALB／c小鼠。将小鼠分为组，在正常的实验室条件下(21±2℃，12／12小时光／黑暗周期)用丰富的标准啮齿动物食物和水喂养。给每组至少5个的小鼠腹膜注射接种0．5毫升的重液体凡士林。
10天以后，用一百万的CB-HEP1的鼠肿瘤细胞(总体积1毫升)腹膜注射到小鼠以诱导腹水肿瘤。接种8天以后，完全发育为肿瘤，异常体积的增加阻碍了小鼠的运动。
借助于提取腹水液使腹腔代谢失调。将小鼠随机地分为三个治疗组和一个对照组，每组5个动物。每组接受腹膜注射不同抗肿瘤的唯一的剂量(1，2或8毫克／千克体重)，用载体(PBS)接种对照组动物。
在45天时，杀死来自于每个试验的和对照组的一些动物，对器官和肿瘤(如果存在)进行组织学和超微结构的分析。也记录存活性数据。抗肿瘤制剂接种一周之后，在治疗组观察到不同百分数的肿瘤退化；百分数取决于接种的剂量(图8)。剂量为1和2毫克／千克体重时显著地增加存活力，在其中两个组的100％的存活者中观察到肿瘤的退化(图9)。另外，当与该鼠菌株的已报道的寿命-120天(HOFS，H．P．and等人(1995)，新的药物的调研1323-32，HOFS，H．P．and等人(1995)，抗癌症药物，6277-284，KIKUCHI，Y_and等人(1994)，癌症和转移综述13309-315，BRUNDA，M．J_and等人(1993)。J．Exp．Med．1781223-1230和SINGHAL，A．等人(1991)。癌症研究，511406-1411)相比，观察到这些治疗过动物的长期存活力增加2倍以上(图10)，根据尸体解剖结果没有产生毒副作用或受伤的器官。所提供的结果证明本发明描述的方法具有获得产生在体内和体外具有抗肿瘤活性的分子的微生物的潜力。
建议的解决办法的优点本文描述了用于获得能够产生在体内和体外具有抗肿瘤活性的分子的第一种方法。在鼠和人细胞系甚至在化疗抗性的肿瘤细胞中证明了所获得的分子的抗肿瘤效果(HOFS，H．P．and等人(1995)，抗癌症药物，6277-284，BRUNDA，M．J_and等人(1993)。J．Exp．Med．1781223-1230，SCHULTZ，R．M．等人(1995)，抗癌研究151135-1140和KURODA，K．等人(1995)。Int．J．Cancer，63152-157)。
1毫克／千克的剂量体内诱导60％的总肿瘤退化，诱导产生高于通常报道的应答(COTTER，TG和M．AL-RUBEAI(1995)，生物技术趋势13(4)150-155，Van OOSTEROM，A．T．和SCHRIJVERS，D．(1995)。抗癌症药物，6356-368，KIKUCHI，Y．，and等人(1994)，癌症和转移综述13309-315，BISSERY，M．C．，and等人(1991)，Proc．Am Assoc．Cancer Res．，32401和LAVELLE，F．，and等人(1995)，Seminar inOncology，22(2)Supplant 43-16)。
就成本而言，本发明的方法需要最少的财力，人力和时间。另一方面，该方法构成了获得具有抗肿瘤潜力的突变体的没有限制的来源。
附图描述图1粘质沙雷氏菌SM9056菌株作为肿瘤退化的小鼠腹水液的唯一的沾染物。
图2粘质沙雷氏菌SM9056菌株的分离。
图3利用负染色技术用电子显微镜观察粘质沙雷氏菌SM9056菌株。
图4粘质沙雷氏菌SM9056菌株的生长曲线。培养基，蛋白胨-甘油。DOi是0．025(每隔30分钟在620nm处测得)和培养温度是28℃。
图5抗肿瘤制剂在72小时内对肿瘤细胞a)人和鼠细胞的抗增殖效果。数据是三次重复试验的平均值。标准误差的平均值是15％ 。
图6不同浓度的抗肿瘤制剂在过量的时间内对鼠肿瘤细胞a)P3X63Ag8和CB-HEP1的抗增殖效果。数据是三次重复试验的平均值。标准误差的平均值是10％。
图7比较抗肿瘤制剂对鼠肿瘤和人肿瘤细胞的体外细胞毒性。
图8存活的动物数量和应用的抗肿瘤制剂的剂量之间的剂量依赖性作用。
图9观察到的有肿瘤的对照组的鼠(左边)和具有肿瘤退化的治疗组(1毫克／千克应用剂量)的其它鼠(右边)。在肿瘤诱导45天之后照相。
图10由于腹膜注射了不同浓度的单剂量的抗肿瘤制剂，100％的肿瘤退化的动物的存活时间。
权利要求
1．获得能够产生抗肿瘤化合物的微生物的方法，其中所述的方法利用处于合适的宿主中的微生物和转化的细胞，以获得产生具有抗肿瘤活性的物质的突变微生物，所说方法包括这些突变微生物的使用和／或从这些微生物获得的产物。
2．根据权利要求1所述的方法，其中所述的方法利用天然来源的微生物。
3．根据权利要求1所述的方法，其中所述的方法利用实验室修饰的微生物。
4．根据权利要求1所述的方法，其中所述的方法利用天然转化的细胞。
5．根据权利要求1所述的方法，其中所述的方法利用实验室转化的细胞。
6．根据权利要求1所述的方法，其中所述的方法是基于将权利要求2和3所述的微生物和权利要求4和5所述的转化细胞同处于一个合适的动物宿主。
7．根据权利要求1所述的方法，其中所述的方法是基于将权利要求2和3所述的微生物和权利要求4和5所述的转化细胞同处于一个合适的由实验室操作获得的动物宿主。
8．根据权利要求1所述的方法，其中所述的方法是基于将权利要求2和3所述的微生物和权利要求4和5所述的转化细胞同处于一个人宿主。
9．权利要求1，2和5获得的突变微生物SM9056，其中所述微生物产生具有抗肿瘤特性或活性的物质。
10．用于获得微生物源的抗肿瘤化合物的方法，其中所述方法使用权利要求1，2，3，4，5，6，7，和8获得的微生物，所述微生物能够产生具有抗肿瘤特性或活性的物质。
11．获得细菌源的抗肿瘤化合物的方法，其中所述方法使用权利要求9获得的微生物SM9056，其中所述微生物产生具有抗肿瘤特性或活性的物质。
12．具有抗肿瘤特性或活性的药物组合物，所述组合物包括权利要求10和11获得的一种或各种化合物，所述组合物用于研究或治疗目的。
13．根据权利要求10，11和12的具有抗肿瘤特性或活性的化合物或药物组合物的应用，用于人或动物的研究或治疗目的。
全文摘要
获得了产生抗肿瘤分子的微生物。本发明涉及生物技术领域,特别是获得能够产生抗肿瘤分子的微生物的方法。本发明的目的是获得用于获得产生抗肿瘤分子的微生物的方法,所述分子可用于治疗肿瘤病症,所述方法包括将微生物菌株和肿瘤细胞同处于一个合适的宿主。本发明可用于获得抗肿瘤分子。
文档编号A61K35/66GK1205033SQ97191363
公开日1999年1月13日 申请日期1997年10月3日 优先权日1997年10月3日
发明者玛丽亚·德尔卡门·阿夫拉安蒂斯·佩雷斯, 赫苏斯·雷耶斯·冈萨雷斯, 格洛丽亚·贝利斯·里奥, 罗兰多·加西亚·米利安, 迈德尔·埃查瓦利亚·加伊 申请人:遗传和生物技术工程中心