专利名称：用于免疫调节的基于肽和助剂的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫调节领域本发明是基于肿瘤细胞的治疗性疫苗的研制。它主要基于以下前提在肿瘤细胞与正常细胞之间存在量或质的区别；该免疫系统基本上具有识别这种区别的能力；该免疫系统能够通过和疫苗的活性特异免疫作用而被刺激以根据上述区别，识别肿瘤细胞并导致排斥。
为了形成抗肿瘤应答，至少必须满足两个条件首先，肿瘤细胞必须表达抗原，该抗原在正常细胞上不能产生或只能产生到免疫系统可在正常组织与肿瘤组织之间的质量上进行区别的程度。其次，该免疫系统必须适当活化，以便在抗原上反应。在肿瘤的免疫治疗中存在的主要障碍是其低的免疫原性，尤其是在人体中。
目前，已发现肿瘤缔合的抗原和肿瘤特异抗原。它们构成这种新抗原决定基，因此，应该具有被免疫系统袭击的潜在的目标。但实际上虽然免疫系统没有达到消除表达这种新抗原决定基的肿瘤，明显地不是由于缺乏新抗原决定基，而由于对这些新抗原上的免疫学应答不够之故。
对于细胞基的癌症的免疫治疗而言，通常有两个对策一方面，采用继承性免疫治疗，它是在活体外使肿瘤反应的T-淋巴细胞扩张，然后，重新输入到患者体内；另一方面，是主动免疫治疗，它使用的肿瘤细胞，要求对肿瘤抗原引起新的或增强的免疫应答。以导致系统性的肿瘤应答。主动免疫治疗的肿瘤疫苗已以不同的方式制备；其中的一个实例是混有免疫刺激助剂如微细棒状杆菌或结核杆菌(BCG)的辐射肿瘤细胞。以便诱发对肿瘤抗原的免疫反应(Oettgen与Old,1991年)。
最近几年，人们已使用用于癌症的主动免疫治疗的基因改性的肿瘤细胞。Zatloukal等人，1993年综述了这些不同的方法。其中，考虑到增强免疫原性。通过引入不同的基因，使肿瘤细胞外来化。对一个至今仍采用的方法，所使用的肿瘤细胞是进行基因改性，以产生细胞分裂素。
肿瘤抗原和肿瘤缔合抗原(TAS)及其衍生的肽的鉴定和离析，(例如，Wolfel等人，1994年a.)和1994年b.)；Carrel等人，1993年，Lehmann等人，1989年，Tibbets等人，1993年，或者国际专利申请文献WO92/20356,WO94/05304,WO94/23031,WO95/00159所描述)，是另一个方法的先决条件。其中，使用肿瘤抗原作为肿瘤疫苗的免疫原。它可以是蛋白质形式也可以是肽的形式。由Boon等人，1992年；Boon等人，1994年；Boon等人1995年；Van Peel等人，1995年；Van der Eynde,1995年等的研究，可知，恶性黑素瘤在MHC-1范围表现肿瘤抗原衍生的肽。但是是这种肿瘤抗原形式的肿瘤疫苗的免疫原性不足以引发消除带有肿瘤抗原的肿瘤细胞所必要的细胞免疫应答，(Marchand等人，1995年)。为了保证表现抗原的细胞(APCs)在其表面上表现限定的肽抗原，建议使肽“脉动”但是，结果是导致有肽细胞的无效负载(Tykocinski等人，1996年)。还要指出，助剂的共施用在加强免疫应答方面是有限的(Offegen与Old,1991年)。
用于提高肿瘤疫苗功效的第三个主动免疫治疗方法是基于异基因化(异源化的)自体肿瘤细胞。这概念是基于以下的一种假设，即免疫体系在表达一种异种蛋白的肿瘤细胞上反应，而且在该反应过程中，也引起一种对这些肿瘤抗原的免疫应答，该抗原是被疫苗的肿瘤细胞所表现的。
在特异免疫应答的调节中，一个由T-细胞抗原受体，MHC(主要组织相容性复合物)分子和其配位体(它是一个由蛋白质衍生的肽片段)，所组成的三分子复合物起中心作用。
MHC分子(或其相应的人的分子，HLAs)是肽受体，它们在具有严格特异性下，可以与众多不同的配位体相结合。为此的前提是由等位基因特异的肽基元提供，它具有如下的特性标准肽具有取决于MHC单元型的限定的长度，该长度通常在MHC-Ⅰ单元型中是8-10个氨基酸基。通常氨基酸位置中的两个构成了所谓的“锚定”。它们只能被单独的氨基酸或具有紧密关联的侧链的氨基酸基团所占有。在肽中的锚定氨基酸的确切位置，以及其特性要求是随MHC单元型而变化的。肽-配位体的C-终端常常是脂族基团或带电荷的基团。此外，这种MHC-Ⅰ肽配位体基元至今已知的有H-2Kd、Kb、Kk、Kkml、Db、HLA-A*0201,A*0205与B*2705单元型。
在细胞内的蛋白质转变的范围内，有规则的、退化的及异种的基因产物，如病毒性的蛋白质或肿瘤抗原，分解成小的肽。其中，某些肽形成了MHC分子的潜在的配位体。因此，对通过MHC分子的表现提供了先决条件，其结果，是引发细胞的免疫应答。其中，有些还不能详尽地解释。例如，在细胞中作为MHC配位体的肽是如何生成的。异源或异化的蛋白质及其片段，也可以通过可形成体液免疫应答的免疫球蛋白而被识别、结合与消除。这也适用于所有的肿瘤抗原例如肿瘤缔合抗原MUC1,CEA与HER2/neu已证实，对这种蛋白具有特异性的免疫球蛋白，可以识别和消灭携带蛋白的细胞。为了触发肿瘤抗原特异的体液免疫应答，因此将不同形式的MUC1和CEA作为免疫原(例如在重组的痘载体；Bronte等人，J.Immunol.154:5282,1995年)在动物模型中试验并进行初步临床试验。
本发明的范围内，在开发细胞的肿瘤疫苗的某些思考，还需继续进行研究；因此当非恶性的、正常的人体细胞能忍受免疫体系，如当正常的细胞，由于病毒感染，合成异体的蛋白质时，人体通过免疫应答而对正常的细胞进行反应。如果该细胞合成对人体外源的蛋白，结果引起病毒感染。其原因在于，该MHC分子表现外源的肽，它们是来源于异体蛋白质。结果，该免疫系统记录某些对该细胞所不期望的和异化的作用。将APCs(包括巨噬细胞，树状细胞，郎氏细胞，B-细胞，以及新近发现的双表型细胞，它不仅具有B-细胞特性，而且还具有巨噬细胞特性。Tykocinski等人，1996年)进行活化，就会产生一种新的，特异的免疫性，并消除该细胞。
肿瘤细胞公认含有有关肿瘤特异性的肿瘤抗原，然而只是作为一种无效的疫苗。由于其低微的免疫原性，不可视为免疫系统。如果在肿瘤细胞上不装载外源蛋白质，而是装载外源肽。而且除了外源肽，该细胞的本身的肿瘤抗原也被该细胞识别为外源的。通过用肽进行异化作用企图通过对肿瘤抗原的外源肽引发细胞的免疫应答。
低微的肿瘤细胞的免疫原性的理由，不仅是数量问题，而且是质量问题。对于一个从肿瘤抗原衍生的肽而言，它意味着虽然被MHC分子所表现，但其浓度太低以致不能引发细胞的肿瘤特异的免疫应答。提高肿瘤细胞上的肿瘤特异肽的量，也会导致肿瘤细胞的异化作用，从而可引发细胞的免疫应答。有人提出，将肿瘤抗原或由其衍生的肽在细胞表面上表现，这可通过用编码有关的蛋白质或肽的DNA转染而进行。这已描述于国际专利申请文献WO92/20356,WO94/05304,WO94/23031和WO95/00159中。
德国专利申请文献P19543649.0描述了一种细胞疫苗，它含有作为活性组分的带有一个或多个的肽的肿瘤细胞。以致于这种载有肽的肿瘤细胞被病患者的免疫系统识别为外来的，并引发细胞的免疫应答。这种肽的主要特征是，它们是用于患者的MHC单元型的配位体。因此，这种肽被患者的免疫系统识别为外源的。由于它们一方面可以是“外源肽”或“异化肽”。也就是说，它们不同于由患者的肿瘤细胞所表达的蛋白质衍生的肽。另一种类的肽是从被病人的细胞表达的肿瘤抗原衍生的。这些会起到提高免疫原性的作用，因为它会以一定的浓度存在于疫苗的肿瘤细胞上。该浓度高于在患者的肿瘤细胞上同一个肽的浓度。
本发明的任务在于，制备一个新的具有免疫调节作用的药物组合物，特别是疫苗。
根据德国专利申请文献P19543649.0公开的细胞疫苗的概念的继续研究，可以研制本发明范围的药物的组合物。它含有起免疫调节作用的肽它不在细胞的范围，而是和助剂一起使用。以便引发或加强细胞的和/或体液的，优选是系统的，针对病原体的免疫应答或抗肿瘤应答或者形成对具有自体免疫作用的蛋白质的耐受性。
令人惊奇地发现，某些助剂，如聚阳离子，首先已在1965年公布，它可以增强将蛋白质转移入细胞(Ryser等人，1965年；Ryser等人，1978年；Shen等人，1981年)，从而提高肽的免疫原性。
本发明涉及一种药物组合物，它含有一个或多个具有免疫调节作用的肽、蛋白质或蛋白质片段，以及一种助剂。该组合物的特点在于，该助剂具有增强将该肽或蛋白质或蛋白质片段结合到要治疗处理的人体的细胞上的能力，或促进其进入到该细胞中的能力，从而导致增强肽或蛋白质或蛋白质片段的免疫调节功能。
通常，为简化起见，将具有免疫调节作用的肽、蛋白质或蛋白质片段简称为“肽”。当不特别涉及配位体时，上述“肽”也可以理解为更大些的蛋白质片段或衍生肽的蛋白质，或细胞分解的产物。
上述的“免疫调节作用”，一方面可理解为细胞的和/或体液的，优选是系统的免疫反应的引发或增强。在本实施方案中，本发明的药物组合物是起疫苗作用的。
在一个优选的实施方案中，该肽是用于至少一个MHC分子的配位体，该MHC分子是被要治疗的人体所表达的。
人体的MHC分子，根据国际惯例，以下也称为“HLA”(人的白细胞抗原)。
本文中的“细胞免疫应答”，首先是理解为细胞毒性的T-细胞免疫性。它是产生细胞毒性的CD8-阳性T-细胞和CD4-阳性辅助T-细胞，其结果会造成肿瘤细胞的破坏或被病原体侵袭的细胞的破坏。
本文中的“体液免疫应答”，可理解为产生免疫球蛋白，它可选择性地识肿瘤细胞或从病原体衍生的结构，因而，与其他的系统，如补体，ADCC(抗体依赖性细胞毒性)或吞噬作用一起，起到破坏这些肿瘤细胞或病原体或被病原体袭击的细胞的作用。
包含在疫苗中的肽，是由抗原衍生的，或者在蛋白质的情况下，呈现出一种抗原，针对该抗原是要引发细胞和/或体液的免疫应答。因此产生T-细胞或其它的细胞毒性效应子细胞，它们可以识别致病体或含有抗原的肿瘤细胞，和/或产生抗体。
为了针对疾病的致病物，如细菌、病毒、寄生物的免疫作用，可以使用蛋白质或肽，它们是病原体蛋白或有关病原体或由其衍生的蛋白。特别适用的，首先是蛋白质。它们不受通常较高的病原体的突变率的干扰。已公布的实例有，HPV16/17(人体乳头瘤病毒。Feltkamp等人，1995年)，乙肝病毒核心抗原(Vitiello等人，1995年)，原质团(Widmaun等人，1992年)。流感核蛋白质，丙肝病毒。
本发明的一个实施方案中为了引发抗肿瘤应答，使用蛋白质或肿瘤抗原或由肿瘤抗原衍生的肽，以及药物组合物作为肿瘤疫苗的。在这种情况下，当疫苗用作治疗时，该肽是由肿瘤抗原衍生的，并被患者的肿瘤细胞所表达。这些肿瘤抗原例如被患者表达的浓度太低，以致于不能识别出该肿瘤细胞是外来的。
在诊断和治疗过程中，可以用标准方法测定出患者的肿瘤抗原。可以使用抗体通过简单的免疫组织化学方法，检测肿瘤抗原。当该肿瘤抗原是酶时，如酪氨酸酶，则可以用酶试验法检测。当肿瘤抗原具有已知的顺序时，则可以用RT-PCR方法(Boon,T.等人，1994年，Coulie P.G.等人，1994年，Weynants,P等人1994年)。检测肿瘤抗原的其他方法是基于具有要检测的肿瘤抗原特异性的CTLs的试验法。此外，上述试验方法可以参见Herin等人，1987年；Coulie等人，1993年；Cox等人，1994年；Rivoltini等人，1995年；Kawakami等，1995年，以及WO94/14459等文献。上述文献也公开了适用于本发明的，各种肿瘤抗原以及由其衍生的肽抗原决定基。例如，在此后不久发表的Rosenberg,1996年与Henderson和Finn,1996年的综述文章所介绍的适用的肿瘤抗原实例。可用于本发明的有关肿瘤抗原并不受任何限制。本发明可用的已知肿瘤抗原以及由其衍生的肽的一些实例列于表中。
一种含有肿瘤抗原或由肿瘤抗原衍生的肽的肿瘤疫苗，除了可用于治疗外，也可用于预防。在用于预防时，优选是使用由通常存在的肿瘤抗原代表的衍生的肽混合物。本发明的肿瘤疫苗用于治疗时，可以使用一个或多个肽，其中它们是包含在患者的肿瘤抗原中。
本发明的肿瘤疫苗，优于基于自体的肿瘤细胞的细胞疫苗，甚至对早期(一期和二期)症状的病人的治疗也有利。然而，该病人没有足够的肿瘤细胞以制备细胞疫苗。
本发明的优选实施方案，考虑到要引发细胞免疫应答，将肽调配到要施用疫苗的患者的MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ亚型上。该肽因而具有确保与MHC分子的结合的一个顺序或含有一个顺序。
本发明的另一个实施方案中，用作免疫疫苗的药物组合物，也含有有免疫刺激作用的多肽，还特别含有细胞分裂素。本发明的一个优选实施方案中，用白细胞介素2(IL-2)或GM-CSF作为细胞分裂素。其剂量约为1000个单位。适用的细胞分裂素还有IL-4、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、TNF-α以及其组合物，如IL-2+IFN-γ、IL-2+IL-4、IL-2+TNF-α、或TNF-α+IFN-γ。
本发明的一个实施方案中，药物组合物是起具有对蛋白质或其片段的耐受性，它会引起自体免疫诱导的疾病。也就是用于治疗自体免疫疾病。在本发明的实施方案中所用的肽是由蛋白质衍生的，它会引起自体免疫疾病。
本发明作为肿疫疫苗或作为对致病剂的疫苗使用的情况下，其中肽基本上与部分原始蛋白质(肿瘤抗原或病原体蛋白质)相符的，其程度是使肽被识别为“原来的抗原”。与此相反，在本发明的用作治疗自体免疫疾病的情况下，所用的肽与原始蛋白质的氨基酸顺序在关键方面有区别。这种肽由于其锚定位置结合在MHC分子上，然而在其顺序中有突变，这导致这些肽起拮抗剂的作用，从而再关闭活化的，特异的T-细胞(Kersh与Allen,1996年)。
合适的肽拮抗剂既是病毒中发现的“天然”拮抗剂(Betroletti等人，1994)也可以是通过筛选肽库系统研究而发现的拮抗剂。肽拮抗剂的实例是能关闭对髓鞘碱性蛋白特异性的T-细胞；这些在动物试验中测试其功效(Brocke等人，1996)。
一个可以引发细胞免疫应答的肽，必须可以结合到MHC分子上。为了在患者中引发免疫应答。因而要治疗的个体，在其所有组成成分中，必须具有相应的HLA分子。就获得细胞免疫响应答而言，患者的HLA亚型的测定，是对患者有效施用肽的一个重要前提。
可以使用标准方法，例如微淋巴毒性试验，测定患者的HLA亚型(Practical immunology,1989年)。该测试方法所根据的原则是首先，将由患者血中离析的淋巴细胞，在有家免补体(c)的参与下，与对特异性HLA分子的抗血清或单克隆抗体进行混合。溶解出阳性细胞，然后吸收一种指示剂染料因而未受损坏的细胞保持不被染色。
可以用RT-PCR法测定患者的HLA-Ⅰ或HLA-Ⅱ单元型(Curr,Prot.Mol.Biol.第2,15章)。为此，采取患者的血样，并从中分离出其RNA。首先，将该RNA经受逆转录作用，导致形成患者的cDNA。这种cDNA在使用引物对聚合酶链反应时用作基质，这特别引起代表确定的HLA单元型DNA片段的放大。当用琼脂糖凝胶电泳法显示出DNA带后，患者表达相应的HLA分子。如果没有显示DNA带时，说明患者是阴性。
用HLA分子定义本发明所用的肽，确定其锚定氨基酸和其长度。限定的锚定位置与长度可确保，肽配入有关HLA分子的肽结合的叉口。这意味着如使用由肿瘤抗原衍生的肽的情况下，将刺激免疫系统，并引起对患者肿瘤细胞的免疫反应。
适用于本发明的肽可以具有宽的范围。其顺序可以是由天然产生的免疫原蛋白质或其细胞分解产物，如病毒的或细菌的肽衍生，或由肿瘤抗原衍生的，或者它们可以是由诱发白体免疫疾病的蛋白质衍生的肽的拮抗剂。
适用的肽可以例如选自文献上已知的肽顺序。
考虑到引发细胞免疫应答，所用的肽可以是由Rammensee等人，1993年，Rammensee等人，1995年，Falk等人1991年，描述的用于各种HLA基元，由各种不同源的免疫原蛋白质衍生的肽，这些肽适合于各种HLA亚型的分子的结合叉口。
具有带有免疫原性活性的蛋白质的部分顺序的肽，可以依据已知的或仍要测定的多肽顺序，并考虑HLA的特定需求，通过顺序平衡调整而确定。合适肽的实例有，例如，Rammensee等人，1993年，Falk等人1991年与Rammensee,1995年，以及WO91/09869(HIV-肽)所描述的肽，以及在国际专利申请文件WO95/00159、WO94/05304所述的，由肿瘤抗原衍生的肽。在上述公开的文献，以及与肽有关的所引用的文章在此都引入作为参考。优选的适用的，是已表明免疫原性的肽，该肽是由已知的免疫原，如病毒的或病菌的蛋白质衍生的。
代替使用适合于MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ分子的结合叉口的原始肽的肽，也就是不变地，由天然的蛋白质衍生的肽。它可以按需要进行改变，基于原肽顺序所规定的，使用有关锚定位置和长度的最低要求进行这些变化，不仅不损害但优选地增强肽的有效免疫原性即可，它是由其与MHC分子的结合亲合力以及其刺激T-细胞受体的能力所组成的。因此，在这种情况下使用本发明的合成肽，它是按照有关与MHC分子相结合的要求而设计的。例如，由H2-Kd-配位体Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile(LFEAI EGFI)开始，可以改变不锚定的氨基酸，以致得到Phe Phe Ile Gly Ala Leu Glu GluIle(FFIGA LEEI)顺序的肽。此外，可以用Leu代替第九位置上的锚定氨基酸Ile。使用Rammensee等人，1995年所述的原则，可以测定MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ配位体或其变体的抗原决定基。肽的长度最好相当于和所需锚定氨基酸一起，用于结合到MHC-Ⅰ分子所必要要的至少具有8-10个氨基酸的顺序。
在MHC-Ⅱ结合基元中，它延伸超过9个氨基酸，并在锚定位置上具有更高程度的变性。最近，开展基于MHC-Ⅱ分子的X光结构分析法的方法。它能够精确分析MHC-Ⅱ结合基元，并在其基础上，可以改变肽顺序(Rammensee等人，1995年及其引用的原始文件)。
此外，该肽还可以在C终端和/或N终端延长，只要这种延长不损害结合到MHC分子上的能力，或者延长的肽可以在降到最小顺序的细胞量上进行操作。
在本发明的一个实施方案中，该肽是负电荷的。在本实施方案中，可以用具有负电荷氨基酸进行延长，或者可以把负电荷的氨基酸嵌入到肽中，或优选的是嵌入到对用特定的CTLs进行识别是不重要的位置或作为锚定氨基酸，以便使肽能连结到多阳离子性助剂如多粒氨酸上，是静电结合。
在本发明的一个实施方案中，所用抗原不是以肽形式，而是以蛋白质或蛋白质片段，或是蛋白质或蛋白质片段的混合物形式。在本发明范围内，适用更大的蛋白质片段或整个的蛋白质，这可确保，在病人使用APCs后，它们可以被处理成肽，后者是适合于MHC分子的。
蛋白质是抗原或肿瘤抗原，由此可以在处理后衍生所得的片段。在本实施方案中，该助剂可用于装载或加强装载(“转载”)细胞，特别是具有肿瘤抗原或片段的APCs，如树状的细胞或巨噬细胞。这样吸收的蛋白质或蛋白质片段被细胞所处理。此后，在MHC范围对免疫效应子细胞进行表现，并由此引发或加强免疫应答(Braciale和Braciale,1991年；KovacsovicsBankowski和Rock,1995年；York和Rock,1996年)。
本发明的实施方案，使用了作为抗原的蛋白质或较大的蛋白质片段，其优点，它对病人的HLA型的依赖性较小，因为该蛋白质被处理成许多片段。所以对肽的“适配形式”具有更大的可变性。
在施用蛋白质或蛋白质片段时，可以用化学分析法(处理片段的Edman降解法或质谱分析法，参见Rammensee等人，1995年的综评文章及其中引证的原文)，或者用生物分析法(APCs的刺激对处理的片段特异性的T细胞的能力)测试被处理的最终产物的特性。
原则上适于产生细胞免疫应答的肽是以几个步骤选择。通常对选用的肽优选进行系列试验，首先，要进行肽结合试验，以测试其在MHC分子上的结合能力。
较适用的研究方法是基于肽对空载MHC分子稳定的能力，这已由Stuber等人，1994年和McIntyre等人，1996年所描述。将肽加到细胞上。该细胞能表达有关MHC分子，但由于基因缺陷，它们不能在MHC范围内结合任何内生肽。适用的这种类型的细胞系是RMA-S(鼠)和T2(人)以及其转染的变体。仅由有关肽稳定的MHC-分子是可检测的，优选是用基于流式细胞计量术的FACS分析法进行测定(Flowcytometry,1989年；FACS VantageTM用户指南，1994年；CELL QuestTM用户指南，1994)。可以用一个适合的抗MHC抗体和用一个用萤光着色剂，如FIFC(萤光素异硫氰酸盐)标记的第二个(如，多克隆)抗体检测稳定的MHC分子。在流动的各个细胞被具有一定波长的激光所激励，并测量发射出的萤光，后者是取决于与细胞结合的肽量。
另一个测定结合肽量的方法是由Settle等人，1994年描述的Scatchard-blot。其中，将肽用I125进行标记，然后在4℃下，用离析或重组产生的MHC分子，采用了各种不同浓度的肽培育过夜。为了测定肽的非特异性的相互作用，向一些试样中加入过量的未标记的肽，抑制标记肽的非特异性的相互作用。然后，用凝胶色谱法除去非特异性结合的肽。使用闪烁计数器，用发出的放射性测得结合肽的量。然后，用标准方法评价上述所得的数据。
Rammensee等人，1995年描述了用于表征MHC/肽的相互作用的方法并可以用于本发明范围内的，分析MHC-配位体和肽结合试验的分析方法。
在下一步骤中，测试具有优良结合质量的所选用的肽的免疫原性例如按Blomberg等人，1993年描述的，或Current Protocols inImmunology第三章所描述的方法，通过检测肽特异性CTLs，可以证实细胞免疫应答的引发。另一个表示细胞免疫应答存在的方法是，当没有T-细胞时，在动物试验中没有免疫应答(其中，用缺失CD4-或CD8-细胞的抗体处理该试验动物，就可获得)。
也可以通过在被免疫的动物中检测“迟发过敏性”(DTH)，而也能所表明细胞免疫应答。为此，可以在试验鼠的足底注入肽，并且，测量被注射部位的肿胀情况(Grohman，等人，1995年；Puccetti等人，1994年)。
可以用血清中检测特异性的抗体测定被肽诱导的体液的免疫应答，该肽是对有机体的异种抗原或以被要处理的有机体以低浓度表达的抗原。检测血清中抗体量的合适方法，是酶连接免疫试验法(ELISA)。可以通过染色反应在结合到用于免疫的肽后检测特异性的抗体。另一个方法是Western印迹法。其中，使特异性血清抗体结合到固定在膜上的肽。然后，再用染色反应检测结合的抗体(上述两个方法可参阅Gurrent Protocols Immunology编者Coligan等人，1991年)。
用外源抗原，如病毒源接种后，就可形成抗体。然而也不能排除，该特异性抗体也可以形成抗突变或由细胞肿瘤抗原衍生的过表达的肽。通过用免疫系统的其他组分，如补体，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或巨噬细胞的吞噬作用，在抗体结合到肿瘤细胞上后，由于这种抗体而导致肿瘤的毁灭(RottI.M.,Brostoff J,Male D.K.Immunology,Churchipl Livingstone)。
通过由蛋白质衍生的肽而引发的细胞免疫应答，其免疫原活性是未知的但可以测试，例如按Rivoltini等人，1995年，或Kawakami等人，1994年a所述方法。为此，需要T-细胞，该T-细胞可以识别出所要求的肽当它被MHC分子表现时。当使用源自肿瘤细胞的肽的情况下，可以由肿瘤渗透的淋巴细胞(TILs)得到相应的的T-细胞，如Kawakami等人1994b所描述的。当使用外源肽时，这种类型的T-细胞可类似地由周缘血得到。这种T-细胞与已混有有关肽的细胞系，如T2(Alexander等人，1989年)或RMA-S(Karre等人，1986年)，一起培育，如果它是免疫原性的肽时，它们就溶解之。
另一个测试MHC结合的选用肽的免疫原性的方法是，检测肽对T2-细胞上的结合。这种试验是基于T2-细胞(Alexauder等人，1989年)或RMA-S细胞(Karre等人，1986年)的特定性质上，它们在TAP-肽-转移机理中缺损，并当将它们加到在MHC范围呈现的肽上时只表现稳定的MHC分子。在该试验中，使用T2-细胞或RMA-S细胞时，它们稳定地用一个HLA基因，如用HLA-A1和/或HLA-A2基因转染。当该细胞与是良好的HLA-配位体的肽混合时，通过在HLA范围要这样表现，致使它们可以被免疫系统识别为外源的。这种肽引起HLA分子以显著的量显示在细胞表面上。用单克隆抗体，可以在细胞表面上检测HLAs。使其有可能鉴别合适的肽(Malnati等人，1995年；Sykuler等人，1994年)。这里也可适当使用已知具有良好HLA结合能力的标准肽。
考虑到本发明的药物组合物广泛应用，优选使用多种肽的混合物。其中，每个肽可以结合到另外的MHC分子，最好是结合到两个或三个最常有的MHC亚型中的一个上。可以使用一个基于能结合到这些单元型上的肽的混合物的疫苗，以包括广泛的患者群体。
本发明的一个实施方案中，该疫苗可以具有许多有不同顺序的肽。在这种情况下所用的肽，一方面可以彼此不同，它们可结合到不同的HLA亚型上。这样就可以检测一个患者或更多患者群的多个或全部的HLA亚型。
另外，在所用的有关肽方面，还可以有另外的变异性。包括结合到一定的HLA亚型上的肽，在其对HLA结合不起决定性作用的顺序方面有所不同。它们是由同样致病剂的不同蛋白质或由不同的病原体所衍生的。根据这种变异性，可以增强免疫应答的刺激，或对各种不同的病原体具有免疫性。
本发明的组合物的有效肽的用量可以在较大范围内变化。此外，肽的用量取决于该组合物的施用方法和所用的特别配剂。肽的施用量，可以是每剂量约为1.0-5000微克，通常为1.0-1000微克，并以约10-约500微克为宜。可以一次或分多次施用。在多次施用时，优选至少是三次。特别是用于治疗时，每次服用间隔(例如，每周一次-每月一次)可以任意选定。这取决于患者的特异的免疫状况及疾病进程。
本发明的药物组合物也可以在体外使用。应用于体外的原则是，将APCs，如树状细胞在体外培养。该细胞培养基与本发明的组合物一起培育并将现已在MHC-范围内表现的APCs给于要治疗处理的个体施用。可以使用文献已知的方法进行这类施用。如Porgador和Gilboa,1995年；Yourg和Inabe,1996年所描述的。
含于本发明的组合物中的助剂，具有辅助肽进入到病人的细胞，或使肽结合在病人的细胞上，并加强肽的免疫原性。该助剂可以至少短时间使肽渗透通过靶细胞的膜，而进入其中。以使该肽送入到细胞中。它具有优点，但并非绝对需要的。由于通过在电负性肽与多阳离子助剂之间的静电相互作用，使肽结合到助剂上。因此，只要该助剂具有使其可渗透性通过肽所在其空间密闭的地方穿过细胞膜则也可以达到使肽进入到细胞中。该助剂的作用也可以基于，其提高在对其吸收入细胞是至关重要的细胞表面上的肽的浓度，或者将肽进行吞噬作用或液体转送(胞饮作用)。
令人惊奇的是，有助剂存在不仅可以提高肽吸收入细胞，而且也可增强肽的免疫调节作用。这里归因于MHC分子对肽的正确表现。
本发明的一个实施方案中，助剂原则上全部可以是用于转运核酸入细胞中的可渗入膜的物质，关于这方面可以参考WO93/19768，它提及了这种物质。
本发明的一个较佳实施方案中，助剂可以是碱性聚氨基酸或碱性氨基酸的混合物。
上述聚氨基酸的聚合度可以在较大范围内变化。其聚合度约为5-1000，并以15-500为宜。
据本发明范围所用的助剂优选是多精氨酸。
本发明范围内所用的助剂优选是多赖氨酸。
其他适用的助剂还可以是多阳离子的，有机的化合物(碱性多氨基酸)，如多鸟氨酸、组蛋白、鱼精蛋白、乙烯亚胺、或其混合物。
该助剂可任选地与细胞配位体共轭结合，(如与运铁蛋白，gp120,LDL(低密度脂蛋白)，α-胎球蛋白，EGF(表皮生长因子)肽或者与其他细胞配位体的代表物，如在专利文献WO93/07283所述的用于通过受体介导的胞吞作用，而传递DNA的配位体，碳水化物残基，如甘露糖或岩藻糖(用于巨噬细胞的配位体)，或针对细胞表面蛋白的抗体或抗体片段进行共轭配合。
一些多阳离子助剂，如多精氨酸或多赖氨酸，它们与细胞配位体任选地共轭结合。并可以作为有DNA的复合物组份产生，如质粒DNA的形式。
上述DNA可以没有，编码功能性肽的顺序，这种情况下，该DNA是空的质粒。
本发明的一个实施方案中，该DNA含有编码免疫调节的蛋白质，特别是细胞分裂素，如IL-2，干扰素，GM-CSF的顺序。
为了研究被碱性多氨基酸介导的肽运转的机理，在本发明范围内要测定乳酸脱氢酶(LDH)的释放情况。如果在多精氨酸处理的试样中，实际上不能检出被释放的LDH的浓度时，在用多赖氨酸培育后，可以在细胞上清液中检测出较高LDH浓度。这些结果可以推论，该多赖氨酸的作用必定是由于细胞膜的可渗透性。
不受规定理论的束缚，本发明的药物组合物的功能在于，通过助剂的辅助，使肽透入靶细胞，或结合到皮肤的内胚层区存在的细胞上。靶细胞包括表现抗原的细胞，其中经处理后的肽表现到B-细胞和/或T-细胞。该靶细胞的实例是巨噬细胞，或纤维细胞，角质形成细胞，郎氏细胞，树状细胞或B-细胞。
在本发明的范围内进行研究，在有碱性多氨基酸或糖化形式的多阳离子存在下，通过表现类巨噬细胞的抗原细胞(APCs)以发现是否小肽大量地被吸收。有关所用的糖基是已知的；它们是通过使用受体介导的胞吞作用而被巨噬细胞吸收的。至于APCs，假定它们在体内构成吸收肽并表现其它免疫细胞的细胞类型。从体外试验结果可以看出，在有所测试的助剂存在下，APCs胞吞作用提高肽抗原的量，这表明，这种助剂也适用于体内增强肽对细胞毒性效应子细胞的表现及其活性作用，导致对含于疫苗的标的物具有总的增强的免疫应答。
除了上面提及的助剂，也可以使用微粒状组分的助剂。原则上该微粒状物质可以是任何的制备合成肽时所用的柱材料。例如，硅胶或合成树脂，只要它们是生理学上可使用的，而且可以由其制备出足够小的，可进入到细胞中的微粒就行。使用颗粒状助剂，可以得到肽的局部高浓度，使其易于被细胞吸收。
所用助剂的种类，其用细胞配位体改性的适应性，或DNA的加入，以及助剂对于肽的必要用量都可以用经验来决定。例如，肽对助剂的具体比例。原则上，可在较广范围内变化，它可通过滴定法测定。
原则上，助剂可以用和肽的同样方法测试，该方法分有多个步骤可以测试助剂在提高肽对APCs的结合能力和/或内在化的能力，例如，第一步，将带有萤光标记的肽和助剂的APCs进行培育。通过直流式细胞计量计测量并与混有肽的细胞本身进行比较，可以测定被助剂吸收或结合的增加量。
在第二步中，可以将要测试的助剂在体外进行检定，在有助剂存在的情况下，是否或在多大程度上导致肽在APCs上的表现。上述用于测试肽的方法，可以用于测定出在细胞上的MHC浓度。
另一个用于测试助剂功效的方法是使用体外的模型系统。其中，将APCs与助剂和肽一起进行培育，并测定T-细胞克隆的相对活性，它可特异地识别所用的肽(Coligan等人，1991年；Lopez等人，1993年)。
所制配剂的功效，也可以通过在免疫试验的动物进行“迟发过敏性”(DTH)表明并以细胞免疫应答来表示。
最后，进行动物试验，以测定出配剂的免疫调节作用。还可以使用确定的肿瘤模型，其中免疫细胞所识别的肽顺序是已知的。含有肽和助剂的疫苗，可以以不同的肽和助剂比例方式和总量进行施用。防止肿瘤生长是肿瘤疫苗有效性的量度。
本发明的药物组合物可以以非肠道、局部、口服的方式进行施用。优选采用非肠道使用方式，如皮下的，皮内的或肌内的注射方法。其中，以皮下的或皮内的注射方法为宜。以便首先达到作为靶细胞的皮肤细胞特别是(角蛋白细胞，成纤维细胞)，树状细胞，郎氏细胞或巨噬细胞。在肿瘤治疗时，也可以以肿瘤内注射方式施用肿瘤疫苗。
以非肠道使用的方式的本发明的组合物，通常是配成在可药用载体中的肽和助剂的溶液或悬浮液形式。可用的含水载体可以是水，缓冲的水，盐水(0.4％)，甘氨酸溶液(0.3％)，透明质酸及其他类似的已知载体。除了含水载体外，还可使用溶剂，如二甲基亚砜，丙二酸，二甲基甲酰胺及其混合物。上述组合物还可以含有可药用的赋形剂，如缓冲物质及无机盐，以便达到正常的渗透压力和/或有效的冷冻干燥。上述添加剂的实例可以是钠盐和钾盐，如氯化物、磷酸盐、蔗糖、葡糖、蛋白质水解物、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇。组合物可以用惯用的方法进行消毒，例如用灭菌过滤法，组合物可以以上述方式直接装入或也可进行冷冻干燥，并在施用前与消毒溶液混合。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物被制成局部用剂型。例如，皮肤用或经皮肤使用的剂型。药物组合物例如可以制成基于聚丙烯酸或聚丙烯酰胺的水凝胶形式(如，Dolobene,Merckle)，或作为软膏，如用聚乙二醇(PEG)作为赋形剂，如标准软膏DAB 8(50％的PEG300,50％的PEG1500)，或者作为乳液，特别是作为基于油包水或水包油的微滴乳状液，必要时加入脂质体。此外，适宜的渗透促进剂(夹带剂)有亚砜衍生物，如二甲基亚砜(DMSO)或癸甲基亚砜Decyl-MSO)，以及Transcutol(二乙二醇单乙基醚)或环糊精，以及吡咯烷酮，如2-吡咯烷酮，N-甲基-2吡咯烷酮，2-吡咯烷酮-5-羧酸或可生物分解的N-(2-羟基乙基)-2-吡咯烷酮以及其脂肪酸酯，脲的衍生物，如十二烷基脲，1,3-双十二烷基脲及1,3-二苯基脲；萜烯，如D-苎烯，薄荷酮，a-萜品油，香芹酮，苎烯氧化物，或者1,8-桉树脑。
其他的剂型还可以包括气溶胶喷雾剂，如用作鼻孔喷雾及吸入法使用。
本发明的组合物也通过脂质体而施用，它可以是乳液、泡沫、微胶拉、不溶的单分子层、磷脂分散液、薄片层、或类似物。它们可用作赋形剂，起输送肽到其确定组织的标的载体，如淋巴组织或肿瘤组织，或者延长肽的半衰期。
当把本发明的组合物制成局部用的剂型时，它也可以含有紫外线吸收剂，以便例如在用于预防黑素瘤的同时，也可用作防晒霜。
本领域专业人员可从“Remington′s药物科学”，1990年等标准著作中找到合适的助剂与配剂。
附图概述
图1．对DBA/2鼠接种有肽KYQAVTTTL的抗肥大细胞瘤P815的疫苗。
图2．对DBA/2鼠接种有肽SYFEITHI的抗肥大细胞瘤P815的疫苗。
图3．对DBA2鼠接种有肽SYFPEITHI的抗肥大细菌瘤P815疫苗。
图4．对DBA/2鼠接种有肽混合物的抗黑(素)瘤M-3的疫苗。
图5．用局部施用方式对DBA/2鼠接种抗黑素瘤M-3的疫苗。
图6．对DBA/2鼠接种抗转移性黑素瘤M-3的疫苗。
图7．经接种肽混合物的疫苗后，治疗带有微转移性M-3瘤的老鼠。
图8．用酪氨酸酶对细胞实施多赖氨酸介导的装载。
图9．以治疗方式接种疫苗后的T-细胞的活性作用(由接种疫苗的试验动物的脾细胞的释放IFN-γ，作为在M-3细胞上的反应)。
图10．通过流感核衣壳肽ASNENMETM和作为助剂的岩藻糖基化的多赖氨酸诱导抗病毒的免疫性(CTL活化作用)。
图11．通过碱式聚氨基酸加强肽在APCs上的结合。
图12．通过碱性聚氨基酸使细胞膜渗透化(经用多赖氨酸或聚精氨酸处理细胞后的LDH的释放)。
图13．通过多精氨酸内在化肽。
图14．肽转运入表现抗原的骨髓细胞中。
图15．通过多阳离子的多氨基酸和组蛋白提高肽转运入表现抗原的细胞中。
图16．转送效率和碱式氨基酸的聚合度的关系图。
图17．通过低分子量的多精氨酸转送肽。
图18．肽载量对转送效率的影响。
在下列实例中，若无特别说明，采用下列物与方法A)．细胞a)．细胞系得自ATCC的老鼠黑素瘤细胞系Cloudman S91(克隆M-3；ATCCNo.CCL53.1)，肥大细胞瘤P815(ATCC Nr.TIB64)，单核细胞巨噬细胞的细胞系P388 D1(ATCC TIB 63)。这些细胞是在高含量的葡糖的DMEM培养基中(“高葡糖DMEM”,Life Technologies)，并补加有10％的FCS,2mM的L-谷氨酰胺与20微克/毫升的庆大霉素进行培养。可以在没有支原体染污的条件下，用常规方法测试上述细胞(PCR-支原体检测合，Stratagene)。
鼠细胞系RMA/S(鼠淋巴)已由Karre等人，1986年和Liunggren等人，1990年，所描述。
b)来自骨髓的表现抗原的细胞首先，冲洗DBA/2试验鼠的股骨。将骨髓的细胞置于高葡糖含量的，含10％FCS,5％马的血清，2mM的L-谷氨酰胺和20微克/毫升庆大霉素的DMEM培养基中，在有200单位/毫升鼠-GM-CSF存在下进行培养(Li等人，1989年；Genzyme,Cambridge,MA.USA)。在开始5天期间，每24个小时更换三分之二的培养基，以去除未粘附的粒细胞与B-细胞(Inaba等人，1992年)。在第8-10天之间，通过用PBS/5mM EDTA的培养，收集粘附的细胞和松粘附的细胞并以每孔3×104细胞的浓度接种在8孔显微载片上(Nunc,Roskilde,Denmark)。其中，90％以上的细胞对抗体F4/80显示阳性反应(Endogen,Cambridge,MA,USA)。
B)肽合成可以按Fmoc方法，用Tenta TentaGel S PHB(Rapp,Tubingen)作为固相，在一个肽合成器中(具有反馈检测器的)433A型，Applied Biosystems,FosterCity,Kanada)合成肽(HBTU-活化作用，FastmocTM，大小为0∶25毫摩尔)。将肽溶于1M TEAA中，pH=7.3。并用反相色谱法，在C18-柱上净化。然后，用快速(blight time)质谱仪在MAT Lasermat(Finnigan,San Jose,Kanada)上确定其顺序。
C)所用的肽的一栏表
(
肽混合物用于M-3黑素瘤疫苗的肽混合物Ⅰkpep143,kpep145,kpep146,kpep150。
用于肥大细胞瘤P815疫苗的肽混合物Ⅲkpep117,kpep118,kpep162,kpep163,kpep164。
D)疫苗的制备D1)单独的肽疫苗a)通过在PBS中取肽的浓度为1毫克/毫升而制备没有助剂的单独肽对照疫苗。直至注射前的培育时间为室温下4小时。
b)制备含有多赖氨酸作为助剂的单肽疫苗(除非另有说明，该多赖氨酸具有200的链长)。它通过确定量的肽与多赖氨酸在HBS中混合而制备。直至注射前的培育时间为室温下4小时。
ⅰ)为了制得含有16微克有效肽的疫苗，把11.8微克多赖氨酸与160微克的肽kpep117，在总容量为1毫升的HBS中混合。
ⅱ)为了制得含有100微克有效肽的疫苗，把74微克多赖氨酸与1毫克的肽kpep117，在总容量为1毫升的HBS中混合。
c)制备具有不完全的弗氏佐剂(IFA)的单肽对照疫苗。它通过将确定量的肽与IFA进行乳化。直至注射前的培育时间为室温下30分钟。
ⅰ)为制得含有16微克有效肽的对照疫苗，将在600微升HBS中的192微克的肽kpep117与600微升的IFA乳化而制备ⅱ)为制得含有100微克有效肽的对照疫苗，将溶于600微升HBS中的1.2毫克的肽kpep117与600微升的IFA乳化。
D2)作为疫苗的肽混合物a)作为不含助剂的对照疫苗的肽混合物Ⅰ，在总容量为1毫升的PBS中含有各为250微克的肽kpep143,kpep145,kpep146,kpep150。
b)作为不含助剂的对照疫苗的肽混合物Ⅲ，在总容量为1毫升的PBS中含有各为250微克的肽kpep117,kpep118,kpep162,kpep163,kpep164。
c)制备含有多赖氨酸作为助剂的疫苗的肽混合物Ⅰ，通过把1毫克的肽混合物Ⅰ(含有250微克的各种肽)与74微克的多赖氨酸在HBS中混合。直至注射前的培育时间为室温下4小时。
d)制备含有多赖氨酸作为助剂的疫苗的肽混合物Ⅲ，通过把1.25毫克的肽混合物Ⅲ(含有250微克的各肽)与93微克的多赖氨酸在HBS中混合。直至注射前的培育时间为室温下4小时。
e)制备含有不完全费氏佐剂的作为对照疫苗的肽混合物Ⅰ。通过，把在600微升HBS中的1.2毫克的肽混合物Ⅰ(含300微克的各肽)与600微升的IFA进行乳化。直至注射前的培育时间为室温下30分钟。
f)制备含有不完全弗氏佐剂的作为对照制疫苗的肽混合物Ⅲ。通过把在600微升HBS中的1.5毫克的肽混合物Ⅲ(含有300微克的各肽)与600微升的IFA进行乳化。直至注射前的培育时间为室温下30分钟。
g)为了制得含有多赖氨酸作为助剂的局部用的制剂。把1毫克的肽混合物Ⅰ(含250微克的各肽)与74微克的多赖氨酸，在总容量为400微升的HBS中培育4个小时。把上述制得的混合物搅拌下加入1.6克的水凝胶DOLOBENE(Merckle)中。
h)为了制得没有助剂的对照疫苗的局部用的配剂，把在总容量为200微升HBS的1毫克的肽混合物Ⅰ(含有250微克的各肽)搅拌下加入1.8克的水凝胶DOLOBENE(Merckle)中。
i)使用MacBroom等人，1992年描述的方法，进行制备偶联岩藻糖的多赖氨酸(链长为240或200)。其中，得到约40％的取代(所用的原料是由Sigma得的β-L-岩藻吡喃糖基苯基异硫氰酸酯和多赖氨酸)。
j)当使用运铁蛋白/多赖氨酸共轭物时(按文献WO93/07283描述的方法制备)。其用量要调整到每毫克肽有75微克的多赖氨酸。如在复合物中整合有质粒DNA时(空质粒pSP65，不含LPS,Boehringer Mannhein)。则其比例为37.5微克DNA/75微克多赖氨酸/l毫克肽。当肽的用量是160微克，而不是1毫克时，则其他组分的量以同样因子减少(6.25)。
E)疫苗的注射在皮下注射前，把每组至多8只鼠的试验动物在一个隔离的气室中麻醉。经3.5分钟的氟烷处理后(4％的O2，流率为4)，试验鼠处于约1分钟的麻醉状态。在这期间皮下注射疫苗。
不经预先麻醉处理，就对试验动物进行腹膜内注射。每只试验动物的疫苗注射量为100微升，这相当于每只试验动物接受100微克的单肽或肽混合物Ⅰ。在用肽混合物Ⅲ的情况下，每只试验鼠接受的总肽量为125微克。
F)局部使用的疫苗在经剃刮的每只试验鼠的皮肤上，涂擦200毫克的含有100微克的肽或肽混合物Ⅰ，或125微克的肽混合物Ⅰ的膏剂。而且涂擦整个背面和其耳部。确切的涂擦用量可用天平控制。
G)鼠模型中使用抗肿瘤生长的疫苗除非另有说明，用DBA/2型作试验鼠模型根据WO94/21808所述原则在预防性或治疗性的鼠模型中进行测试癌疫苗的效用试验。
实施例1对DBA/2试验鼠接种抗肥大细胞瘤P815的疫苗。
把由Lethe等人，1992年所述的肿瘤抗原P815衍生而得的160微克具有KYQAVTTTL顺序的肽，H2-Kd的配位体。与11.8微克的多赖氨酸300，在500微升的HBS中进行混合，并在室温下培育4小时。然后，添加500微升的EBSS(Earl缓冲盐液)。在一周内，把各100微升上述所得到混合物，分别皮下注射到8只试验鼠中。经上述预免疫处理一周后，向试验鼠上引入肿瘤。每只鼠对侧地注射在100微升EBSS中的5×104细胞的肥大细胞瘤细胞系P815(ATCC Nr.TIB64，这些细胞表达肿瘤抗原，由后者衍生出肽P815)。试验结果列于图1中(黑方块)。
在平行试验中，将200微克肽与500微升HBS相混合，接着用500微升的费氏助剂进行乳化。用各100微升的所得乳状液分别对8只试验鼠进行预免疫处理。然后，如上述引入P815细胞以形成肿瘤(图1中的黑圆点)。
为了进行另外的平行试验，如下制备细胞肿瘤疫苗。
把160微克的肽kpep118和3微克运铁蛋白-多赖氨酸(TfpL)，10微克pL和6微克质粒PSP65(无LPS)，在500微升HBC缓冲液中混合。经在室温下放置30分钟后，将上述溶液加到具有在20毫升DMEM培养基中(10％FCS,20毫摩尔葡萄糖)的1.5×106个异源的成纤维细胞系NIH3T3(ATCC.Nr.CRL1658)的T75细胞培养瓶中，并在37℃中培育。3小时后，向细胞中加入15毫升的新鲜培养基。并在37℃中，5％CO2气氛中培育过夜。在施用前4小时，用20Gy辐射处理该细胞，按WO94/21808中所述制备疫苗。在一周时间间隔内，用105细胞的疫苗进行予免疫。又经一周后，如上述植入肿瘤。(图1中的黑色三角)。发现，含有与多赖氨酸结合的肽的疫苗，对试验鼠提供最好防止肿瘤的形成的作用。
实施例2对DBA/2鼠接种抗肥大细胞瘤P815的单肽疫苗。
a)三个单肽疫苗，其中分别含有在PBS中的单纯肽kpep117(图2a)，或含有在IFA乳化的肽kpep117(图2b)，或含有肽kpep117与作为助剂的多赖氨酸(链长240)(图2C)。分别对其进行防止P815肿瘤的作用试验。用上述D段所述制备疫苗。每次的注射剂量为100微升。注射是以皮下(sc)或腹膜内(ip)。其中，用幼鼠作为阴性对照，而包含分泌P815细胞的GM-CSF的全细胞疫苗用作阳性对照(P815-GM-CSF；对每只试验鼠皮下注射在100微升中的105细胞)。每个试验组有8只鼠。它们分别在7天间隔内接种疫苗三次。在最后一次接种一周后，每只鼠引入有5×104P815细胞剂量的对侧肿瘤。每天检测试验鼠。并用一周时间监控任何肿瘤的情况。
当每只试验动物皮下注射100微克肽并结合作为助剂的多赖氨酸的肽kpep117能获得最佳的抗肿瘤作用。(8只试验鼠中有三只得到防护)，其效用大约与用全细胞疫苗的试验结果一样好(8只试验动物有4只得到防护)。当每只试验动物接种和多赖氨酸一起的16微克的肽时，其抗肿瘤作用就小些(8只试验鼠有2只受保护)，但是，明显地优于PBC中的100微克的肽(图2a，没有防护作用)。但在IFA乳化的情况下，该肽没有达到结合多赖氨酸的肽所具有的作用(图2C)。
b)在另一个在P815肥大细胞瘤模型上的试验中，把两个具有不同链长的未改性的多赖氨酸进行相互比较。短链仅具有16个多赖氨酸基(PL16)，长链具有240个多赖氨酸基(PL240)。对照组的试验动物接受100微克肽kpep117，或溶于PBS中或乳化在IFA中的疫苗注射。使用两个分泌GM-CSF的细胞对照疫苗作为阳性对照(见a))。一个是由稳定转染P815细胞获得的疫苗，第二个疫苗是用Wagner等人，1992年描述的方法(AVET)，瞬时转染而获得的。这两个全细胞疫苗可使总共8只试验动物中有4只或5只受保护。基于单纯肽或乳化于IFA的肽的疫苗没有防护作用。所有的试验动物在引入肿瘤剂量后，肿瘤迅速生长。但是，当肽与多赖氨酸一起施用时，该肽疫苗就防止试验动物对肿瘤的袭击，如果使用长链的多赖氨酸(PL240)时，8只试验动物中有2只受保护。当使用短链的多赖氨酸时，8只试验动物有4只受保护。这些结果列于图3中，它表明单个肽与作为助剂的多赖氨酸一起结合使用时，可提供足够的抗肿瘤的保护作用。该作用可与文献中所提及的最有效的分泌胞质分裂素的全细胞疫苗之一相比较。而后者作为抗肿瘤用的疫苗接种的标准(Dranoffi等人，1993年；Schmidt等人，1995年)。
实施例3用含有P815单肽或P815肽的混合物的肿瘤疫苗对DBA/2鼠接种以抗肥大细胞瘤P815。
使用下述肽制备疫苗kpep118(每针剂为100微克)肽混合物Ⅲ(kpep117,kpep118,kpep162,kpep163,kpep164)，该肽混合物含有至今已知的所有P815肽；每针剂中含有25微克的各种肽)。
用分泌GM-CSF的P815细胞作为阳性对照。
在初步试验中已表明，当使用100微克的肽和多赖氨酸一起结合使用时(7.5微克的多赖氨酸/100微克的肽，符合标准比例；多赖氨酸的链长为200)，肽kpep117具有最好的抗植入的P815肿瘤的保护作用。kpep117的含量愈低(16微克)则其效用愈小。在本实例中，每只试验动物注射100微克的kpep118，在一种情况下只和多赖氨酸结合使用(B组)，另一组与运铁蛋白多赖氨酸结合使用(C组)，第三组与运铁蛋白-多赖氨酸/DNA结合使用(D组)。使用和IFA的kpep118作为对照。在本试验中，只用肽kpep118对植入肿瘤没有保护作用。
在实施例4进行的试验中表明，含有黑素瘤肽的肽混合物的疫苗具有抗黑素瘤的保护作用。因此，在本实施例用于试验的肽混合物这概念，是否也适用于P815。
该肽混合物Ⅲ，在一组试验中只与赖氨酸结合使用(E组)，在另一组试验中与运铁蛋白-多赖氨酸结合使用(F组)，又一组是和运铁蛋白-多赖氨酸/DNA结合使用(G组)。用在IFA的肽混合物Ⅲ作为对照。用幼鼠作为阴性对照，并且GM-CSF转染的P-815细胞作为阳性对照(每鼠为105细胞)。
在本实例中进行的试验发现，与其他的试验比较，是很不典型的，在阳性对照试验组(分泌GM-CSF细胞)中，在植入肿瘤后，所有的试验动物的肿瘤立刻发展。而，大部分的这些肿瘤同样也很快消失。对此的一种可能的解释是，在肿瘤破坏前，它们暂时生长。第二种可能的解释是，将肿胀诊断为肿瘤，它并不出自肿瘤的生长而是强大的免疫细胞系浸润(肉芽肿)。因为没有解剖试验动作，所以没法确定其原因。总之，产生的肿瘤最终被破坏。更有趣的试验结果得自试验G组，其中试验动物接受由肽混合物Ⅲ与多赖氨酸所组成的组合物处理。所有的试验动物都产生肿瘤，但有两只动物的肿瘤肿胀(或免疫细胞浸润)程度相当小，不再增长。而且鼠并不显示不健康。这两只鼠没有死，而是继续处于监视下，令人惊奇地发现，植入肿瘤后第9个星期，肿瘤已不可检出。这是以前从未观测到的结果。最后八只中有二只试验动物破坏了其肿瘤。上述肿瘤的破坏，应归因于在肽混合物中肽kpep117含量。如同在实例2所述，其中用16微克kpep117时，八只中有二只试验动物受到抗肿瘤的保护，当用100微克kpep117时，八只中有三只试验动物受保护。但保护作用也可以通过混合物中的一个以上的肽而产生的。
实施例4用含有肽混合物的肿瘤疫苗向DBA/2鼠灾进行予免疫，以保护抗黑素瘤M-3的作用。
使用预防性疫苗，其中含有黑素瘤肽的混合物(肽混合物Ⅰ，上述的D2段)。
按实例2所述步骤，用疫苗进行予免疫，并植入肿瘤，除了植入的肿瘤是，用M-3细胞(每只试验动物105细胞)进行；所用的对照疫苗是由分泌适量的IL-2(每105细胞有1000-2000单位)的M-3细胞制得的全细胞疫苗。并如Schmid等人，1995年所描述进行制备。在所用的试验条件下，该疫苗获得100％的保护作用(图4)。用含有肽混合物的疫苗对四组试验动物进行试验。有两组试验采用皮下的(S.C.)或腹膜内的(i.P.)注射的，在IFA乳化的肽的疫苗，而另两组试验采用皮下(S.C.)或腹膜内(i.P.)注射的，和多赖氨酸(PL240)结合使用的肽的疫苗。
图4说明含有作为助剂的多赖氨酸(PL240)的肽疫苗的保护效用；50％的试验鼠防止了M-3肿瘤的袭击，并与未受处理的试验鼠进行比较，后者的硬性肿瘤迅速增长。当皮下注射肽-多赖氨酸疫苗或作为水凝胶涂擦在皮肤上时，这种效果可以达到(图5)。在另三个对照组中，即在腹膜内注射肽-多赖氨酸-疫苗的，或用在IFA的肽的疫苗处理，这些疫苗基本上没有效果。在这里，植入的肿瘤并没有排斥，与没有处理的对照试验动物相比较，其肿瘤生长速度仅稍有延迟。这些结果表明，含有肽混合物的疫苗，如果它含有多赖氨酸时，能给出抗肿瘤的保护作用。在所择试验条件下，这种肽疫苗只有细胞IL-2疫苗的效用的一半。后者与最近发表的报告(Zatloukal,1993年；Zatloukal,1995年)，相一致，用105的活的M3-细胞进行肿瘤攻击，可以至多达100％的试验动物受到保护。
实施例5对DBA/2鼠的防M-3转移瘤a)使用治疗性疫苗，其中含有黑素瘤肽的混合物(肽混合物Ⅰ，上述D2段所述)。在一周间隔内进行三次疫苗接种(SC)。第一次接种是在植入转移肿瘤五天后进行的。因而，接种是为抗五天的转移肿瘤的。为植入转移肿瘤使用文献WO94/21808和Schmidt等人，1996年所述方法，注入1.2×104的M-3细胞。
所用疫苗是肽混合物Ⅰ，其中有不含助剂的(PepmixⅠPBS)，含有IFA作为助剂(IFAPepmixⅠ)或有用岩藻糖改性的多赖氨酸的(FpLPepmixl)。对照试验组没有接种疫苗(空白)，或如实例4所述的产成IL-2的M-3全细胞疫苗。图6中表示，当用含有岩藻糖改性的多赖氨酸作为助剂的肽混合物Ⅰ处理试验动物时，将会得到最好的保护(图6a)，50％的试验鼠可以排斥转移肿瘤(4/8鼠)。甚至优于用全细胞疫苗处理所得的。后者只保护33％的试验鼠(3/9鼠)。用含有IFA的或没有助剂的肽疫苗仅能延迟转移肿瘤生长成肿瘤(图6b)。
b)在另一个试验中，研究了治疗型含有肽混合物Ⅰ的疫苗的保护作用，并以皮下注射进行。对照试验组是用在PBS的肽混合物(不含助剂)或含IFA的肽混合物。用未改性的多赖氨酸240作为助剂。此外，用岩藻糖改进的多赖氨酸200(fpL200)作为助剂。对照试验是用表达IL-2的细胞疫苗处理一组试验动物。如图7a所示，肽-多赖氨酸疫苗在处理M-3-转移肿瘤时是有效的。在本试验中，只用岩藻糖改进的多赖氨酸才能达到明显的治愈率。上述处理可以使50％的试验动物排斥转移肿瘤。而与治愈70％试验动物的IL-2疫苗相比较，结果也是好的。
c)在另外的一个试验中，进行了治疗型模拟试验。研究了多阳离子的变化和改进对抗肿瘤作用的影响。为此，除了对未改性的和岩藻糖改性的多赖氨酸200外，还对短的，未改性的多赖氨酸pL16，长的多赖氨酸pL450，以及其他的多阳离子，即多精氨酸(PArg720)进行试验。使用分泌适量(每105细胞≥10ng)GM-CSF的细胞M3-疫苗作为阳性对照(Schmidt,1995年)。在本试验中，对照试验组含有在IFA中的肽混合物或没有任一助剂的肽混合物。如实例5b)中那样，当用岩藻糖-多赖氨酸作为助剂时，如图7b所示，能得到最好的效果。在这试验组中，与只有30％排斥的用短的多赖氨酸pL16的情况相比较，有40％的试验动物排斥转移肿瘤。除了用和多精氨酸结合使用的肽的试验组外。其他用肽疫苗的试验组的试验动物，表明只在形成肿瘤前，有短时间的延迟。在本试验中，未改性的多精氨酸却与岩藻糖改进的多赖氨酸的效果是相同的，使10只试验动物中有4只排斥转移肿瘤。
图7C表明在分开单独的试验中，用多精氨酸达到重复这种作用。在这里用和多精氨酸结合使用的肽混合物进行接种疫苗，表明可使8只的试验动物中有4只具有抗肿瘤作用。
实施例6使用多赖氨酸作为助剂的情况下，用酪氨酸酶转载细胞。
本实例用以试验，即多赖氨酸适于作为助剂以用于在细胞上负载较大的蛋白质片段或整个蛋白质，其中用M-3细胞作为细胞实例。
为了加载细胞，首先向160微克的FITC标记酪氨酸酶(EC1.14.18.1；Sigma)中加入3微克的多赖氨酸(pL240)，并在室温下培育3小时。然后，把所得溶液放入装有2×106M-3-细胞的T75细胞培养瓶中，并在37℃下培育。接着用PBS两次洗涤细胞。用PBS/2毫摩尔EDTA解析，并置入1mlPBS/5％FCS中，以进行FACS-分析。图8表示在M-3-细胞上载有酪氨酸酶的情况(左边曲线表示对照试验，右边曲线表示载有酪氨酸酶的试验)。
实施例7在治疗性模型中免疫接种后测定T-细胞活性对治疗试验鼠模型接种肽/多阳离子疫苗后清楚地具有效果(参见实例5)，研究了这种处理是否也会引起T-细胞的活性作用。为此，在由接种疫苗的试验动物中来的脾细胞和作为标记的亲代M-3细胞进行共培育后，使用细胞质分裂素的分泌(Kawakami等人，1994b)。
从已接种疫苗的和未处理的试验动物制取单脾细胞悬浮液。接着用低渗的缓冲液进行红血球细胞溶解作用(0.15NH4Cl,1mM KHCO3,0.1mMEDTA,pH7.4)。在37℃温度下，在Peri培养皿中，使每毫升DMEM培养基的3×106脾细胞进行培育90分钟以除去粘附的细胞。对不粘附的细胞，通过谨慎的移液并和不同比例的1×103亲代细胞进行共培养。细胞是在有200μl的DMEM培养基(10％FCS)，2mM的L-谷氨酰胺和20μg/ml的庆大酶素的96孔平底-组织培养盘中进行培养。到第九天，收集100微升的上清液，并通过市场购得的ELISA-合(Endogen，Cambridgc,MA,USA)，按厂商提出的指南，测定出IFN-γ含量。从中发现，九天培育后，只有已接种疫苗的动物的脾细胞在培养基中分泌大量IFN-γ。而，在M-3细胞和未处理动物的脾细胞的共培养中，实际上没有检出IFN-y。这试验结果示于图9中。
实施例8用流感核衣壳肽ASNENMETM和岩藻糖化的多赖氨酸作为助剂以诱导抗病毒免疫。
使用一种每毫克肽ASNENMETM含有75微克的fpLys疫苗。按方法部分所述，将该疫苗通过单次注射而施用的，每只试验动物注入100微克肽/7.5微克fpLys。在对照试验中。只注射含100微克的纯肽(PBS)，或根本就不进行注射(空白对照试验)。
RMA-S鼠淋巴细胞是在26℃温度下，在无血清的培养基中，用10微克/毫升的肽ASNENMETM进行培育过夜。
接种疫苗十天后，从接种疫苗的动物中分离出脾细胞。并与载有肽的RMA-S细胞，以5∶1的比例相混合。并再次培养5天(Stuber，等人，1994年)。测定在不同培养基中存活的效应子-脾细胞的量。然后，使用标准4小时的铕释放试验(Blomberg等人，1993年)，测定CTL活性，细胞以不同的比例已和肽ASNENMETM和铕螯合物结合的RMA-S细胞进行混合。如图10所示，在本试验中的特异的免疫性只有通过接种含有肽与fpLys的疫苗才能获得。但施用只含有肽的疫苗则不能得到。
实施例9各种碱性多氨基酸对提高肽对APCs的内在化和/或结合作用的能力的试验。
在本试验中，使用了萤光试验根据制造商的指南(Molecular Probes)，用萤光染料萤光素异硫代氰酸盐(FITC)标记LFEAIEGFI顺序的肽抗原模型(MHC Kd限制的)。通过MHC Kd-限制的单细胞的巨噬细胞细胞系P388D1，用直流式细胞计量仪测定单纯的FITC标记的肽(“脉冲”)的吸收量和结合量，或者该肽和各种不同浓度的碱性多氨基酸(有16-490链长的多赖氨酸，其链长为15-720的多精氨酸)相结合情况下的吸收量和结合量。为此，在离心试管中，在最终容积为1毫升的培养基(DMEM/10％FCS)中将1×106个P388D1细胞和5μg单独的FITC标记的肽，或者其和肽和多氨基酸的混合物，在37℃温度中培育30分钟。接着进行充分洗涤，以去除游离肽。加入的多氨基酸的浓度是每毫升含有5微克的FITC标记的肽培养基中有50,25,12.6和3微克。把不同试样的相对的萤光强度进行比较，以便评判肽的吸收和/或结合能力。这些试验的结果示于图11，试验是分别用25微克的pL450或pArg450进行的。在所用条件下，多精氨酸的效应比多赖氨酸的高约5倍。
实施例10研究APCs吸收肽的机理。
通过诸如大胞饮作用或受体-介导胞吞作用(Lanzavecchia,1996年)的特定机理，APCs可以吸收肽。另一个机理是在多氨基酸中可以使细胞膜成为可渗透。由此，可使肽从培养基质中扩散到胞质中。
a)有关细胞膜的可渗透性试验是通过市场上可购得的仪器(Cytotox96,Promega,Madison,Wiscosin,USA)按制造商的指南，在等渗条件下，在用多氨基酸(多赖氨酸或多精氨酸)对P388D1细胞进行培育后，测量所释放出的胞质的酶乳酸盐脱氢酶(LDH)。据图12a所得的结果可知，pLys的作用在于，使细胞膜成为可渗透性，它在等渗条件下的高浓度释放出的胞质中表达。与此相反，经过pArg处理(图12b)后，实际上没有LDH检出。当试样进行比较时，发现当只用多氨基酸进行处理时，和用多赖氨酸或多精氨酸与肽结合一起处理时，在LDH释放方面并不存在差异。当只用肽进行培养时，就没有检出LDH活性。
b)在有碱性多氨基酸或没有碱性多氨基酸存在的情况下，研究FITC标记的肽的内在化行为。这是基于Midoux等人，1993年公开的原理，被细胞内在化的颗粒被传输到核内体中。与胞质或有中性pH值的细胞培养基进行比较，这些细胞器是酸性，其pH值约5。由FITC辐射的萤光是强烈受pH值影响的。在诸如核内体的pH值的环境下，萤光作用就受抑制。因此，它是由细胞吸收核内体中的FITC标记的肽，表明萤光作用降氐。在加入莫能菌素后，核内体的低pH值成为中性。这就会导致内化的FITC标记的肽具有可测定的强的萤光作用。
在4℃或37℃下，把细胞与多精氨酸(平均分子量为100,000，链长为490)和萤光标记的肽所组成的混合物一起进行培育。将在37℃中培育的等分试样保持基底，并在进行直流式细胞计量分析前，在4℃，用50μM的莫能菌素处理。
发现，当用特定碱性多氨基酸，如多赖氨酸(pLys)和多精氨酸(pArg)培养APCs时。就会增强肽吸收APCs或与APCs结合的能力。
如图13所示，在只用肽处理和用莫能菌素处理的细胞中，只观测到萤光作用的微小增加。与其相比较，发现当用莫能菌素和由多精氨酸和肽组成的混合物处理试样时，其萤光信号就大大提高。当在4℃下培育试样时，就不会观测到肽的吸收。经用莫能菌素处理后，萤光明显增强，这表明了具有pArg的肽的负载导致在细胞内的小泡积累(Midoux等人，1993年，图13)。正如所料，把负载多赖氨酸的试样进行莫能菌素处理后，仅可观测到萤光作用的微小提高。在4℃下负载多赖氨酸则可以导致萤光作用的可测量的提高。由此，表明多赖氨酸的作用主要是归于细胞膜的渗透作用(图12b)。
实施例11研究用短链肽装载APCs。
把源于骨髓的并用GM-CSF取得的APCs用由萤光标记的肽和多赖氨酸(PL200；Sigma)组成的组合物，或者用单纯的肽通过萤光显微镜进行研究。为了用显微镜检测肽的吸收，将APCs放在物样载片上，并在37℃下，用40微克的单纯的萤光素标记的肽LFE-EGFI或用由50微克/毫升的多赖氨酸(pL200)与40微克/毫升的肽LFEAIEGFI所组成的混合物，进行培育30分钟。经充分洗涤后，用4％的多聚甲醛固定该细胞，并用抗-褪色剂(Dako,Glostrup，丹麦)覆盖，然后用萤光显微镜(Zeiss)检测。用4,6-二脒基2-苯基吲哚(DAPI；Signa)将该核进行补色。如同图14的萤光显微照片所示，与肽和多赖氨酸一起培育(A)的细胞比只用肽处理的细胞(B)相比较，显示出明显更多的对肽的吸收能力。只用肽处理的细胞(“脉冲”)中所显示的萤光作用是分散的，并呈粒状，而在有多赖氨酸存在下以肽装载的细胞有强力的萤光作用，并通常是均匀分布在整个细胞上。
实施例12
用直流式细胞计量仪(“Transloading Assag”-“转载试法”)对载有肽的细胞进行定量测定。
a)通过实例11的试验可知，对载有少量肽而言APC是最好的靶细胞，FACS试验是在体外进行，以便识别用于肽疫苗的适用助剂。这个试验可以快速定量测试萤光标记的肽；用LFEAIEGFI顺序的肽作为模式肽。在这些试验中，用鼠细胞系P388D1作为APC。其中，在37℃中，把1×106个细胞放入一个其最终容积为1毫升高葡萄糖DMEM培养基和10％FCS中，与5微克肽及其终浓度为5nmol/ml的萤光素一起进行培育。将上述细胞或用单纯的肽，或者用肽和多阳离子的组合物，或用肽和组蛋白的组合物，在提高浓度的情况下(3-50微克/毫升)，如图15所示那样进行处理。其中，要使用下列化合物A聚鸟氨酸(平均分子量110,000，链长为580)；B富含精氨酸的组蛋白；C富含赖氨酸的组蛋白；D多精氨酸(平均分子量100,000，链长490)；E多赖氨酸(平均分子量94,000，链长450)。在初步试验中发现，经30分钟的培育时间，可以得到最大的肽吸收。更长处理时间(例如4或8个小时)，其萤光信号也没有明显增加。在进行分析前，用大量的含0.2％BSA的PBS洗涤五次。然后，把该细胞放入冰冷的PBS/0.2％BSA中，并用流式细胞计量仪(FACS can；Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)进行分析。
证明，多精氨酸和多赖氨酸是最有效的助剂。在选定条件下，多鸟氨酸显示细胞毒性作用。通过多精氨酸和多赖氨酸所引起的肽吸收量的增加是与浓度是有关的(图15d,e)。吸收量也随着链长而增加(图16)。
可以观测到，与对照相比，精氨酸以10的三次方增加比多赖氨酸具有更宽的适用浓度范围。后者所导致的肽吸收量的增加最大小于10的2次方。所用的全部链长对蛋白质的传输都比多赖氨酸更为有效(图16)即使在非常低的浓度，如3微克/毫升的情况下，多精氨酸也足以传送。然而，对于多赖氨酸，则需要＞25微克/毫升的浓度，以便使萤光有明显提高(图15,de)。
b)为了验证在肽传输作用中是否存在链长的下限，需要合成制备具有各种不同链长的多精氨酸(10-30基团)，在有高浓度的多阳离子的存在下，测定其提高肽传输的能力(图17)。在这些试验中，使用顺序为LFEAIEGFI的肽，而所试验的多精氨酸聚合物的浓度是100微克/毫升。
即使使用最短链长的多精氨酸进行试验，也能测出，虽然肽的传输性能的提高是微小的。
c)碱式氨基酸是正电荷的分子。因此，可以假设通过静电的作用，可以使负电荷的肽结合到这些多阳离子上。这就有可能使接受肽的吸收能力加强。为了验证上述假设，对于阳离子的多氨基酸，对吸收短链肽入P388 D1细胞中的性能作为其电荷的函数进行比较。在下表中，列出了所用的负电荷肽，它们都满足了与MHC-Ⅰ结合时的所有必要条件(Rammensee，等人，1995年)。肽1是从鼠-TRP(与酪氨酸酶有关的蛋白质)衍生的。肽2是由流感血细胞凝集素(Schmidt等人，1996年)衍生的，肽3是由鼠-酪氨酸酶产生，肽4是由P198肿瘤抗原产生，肽5是由β-半乳糖苷酶产生(Gavin等人，1993年)。(“Mr”代表分子量范围，“Fluo”表示萤光素)。
表
根据所用方法要用萤光素标记肽，要引入两个负电荷。发现，用多精氨酸培育后，有最高负电荷值的肽(每个样品5nmol)最有效地，传输入P388D1细胞中，这表明在肽与多阳离子之间的离子相互作用进一步提高了肽向细胞中的传输作用(图18)。但是与只用肽处理的细胞进行比较，在有多阳离子存在下，中性肽的情况下可吸收较大的量。只用肽进行处理的情况下，其结果实际上和试验的所有肽具有相类似的荧光信号。图18中表示了用肽LFEAIEGFI得到的萤光信号，作为“单独肽”以代表性容量表示。
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权利要求
1．药物组合物，它含有至少一个有免疫调节活性的肽，蛋白质或蛋白质片段，以及助剂，其特征是，该助剂能提高肽，蛋白质或蛋白质片段结合到要治疗的个体的细胞上或增加肽，或蛋白或蛋白片段进入到该细胞中的作用，并有益于加强该肽，蛋白质或蛋白质片段的免疫调节作用。
2．根据权利要求1的药物组合物，其特征是，所述肽或蛋白质的细胞分解产物或蛋白质片段是一个用于至少一个MHC分子的配位体，该分子是被要治疗的个体所表达。
3．根据权利要求2的药物组合物，其特征是，所述肽或蛋白质的细胞分解产物或蛋白质片段是一个用于MHC-Ⅰ分子的配位体。
4．根据权利要求2的药物组合物，其特征是，所述肽或蛋白质的细胞分解产物或蛋白质片段是一个用于MHC-Ⅱ分子的配位体。
5．根据权利要求中1-4中之一的药物组合物，其特征是，它含有从病原体的蛋白质衍生的肽。
6．根据权利要求5的药物组合物，其特征是，该肽是从细菌蛋白质衍生的。
7．根据权利要求5的药物组合物，其特征是，该肽是从病毒蛋白质衍生的。
8．根据权利要求1-4中之一的用作肿瘤疫苗的药物组合物，其特征是，该蛋白质是肿瘤抗原，蛋白质片段或者肽是从肿瘤抗原或抗原衍生的。
9．根据权利要求8的用于治疗用的药物组合物，其特征是，该肿瘤抗原或抗原是从肿瘤抗原衍生的，并且该肿瘤抗原被要治疗的个体所表达。
10．根据权利要求8的用于预防的药物组合物，其特征是，该肿瘤抗原是从通常出现的肿瘤抗原的代表衍生的。
11．根据权利要求8-10中之一的药物组合物，其特征是，该肿瘤抗原是黑素瘤抗原。
12．根据权利要求8-11中之一的药物组合物，其特征是，该组合物还含有细胞分裂素。
13．根据权利要求12的药物组合物，其特征是，该细胞分裂素选自IL-2,IL-4,IL-12,IFN-α,IFN-β,IFN-γ,IFN-ω,TNF-α,GM-CSF或其混合物。
14．根据权利要求2-11中之一的药物组合物，其特征是，它含有多个肽，这些肽的区别在于它们结合到要治疗处理的个体的不同的MHC-亚型上。
15．根据权利要求2-14中之一的药物组合物，其特征是，它含有一个或多个的肽，它们是从天然产生的免疫抗原蛋白质或肿瘤抗原或其细胞分解产物中衍生的。
16．根据权利要求2-14中之一的药物组合物，其特征是，它含有一个或多个的肽，它们不同于从天然产生的免疫抗原蛋白质或肿瘤抗原或其细胞分解产物中衍生的肽。
17．根据权利要求1的药物组合物，其特征是，该肽是一个肽的拮抗者，并是从引起自体免疫性疾病的蛋白质中衍生。
18．根据权利要求中1-17中之一的药物组合物，其特征是，所述助剂是一个有机的多聚阳离子或有机的多阳离子的混合物。
19．根据权利要求18的药物组合物，其特征是，该肽是负电荷的。
20．根据权利要求18或19的药物组合物，其特征是，该助剂是一个碱性多氨基酸或碱性多氨基酸的混合物。
21．根据权利要求20的药物组合物，其特征是，该助剂是多精氨酸。
22．根据权利要求20的药物组合物，其特征是，该助剂是多赖氨酸。
23．根据权利要求18-21中之一的药物组合物，其特征是，该助剂是和一个细胞配位体共轭结合。
24．根据权利要求23的药物组合物，其特征是，该配位体是碳水化合物基。
25．根据权利要求24的药物组合物，其特征是，该配位体是岩藻糖。
26．根据权利要求23的药物组合物，其特征是，该配位体是运铁蛋白。
27．根据权利要求18-26中之一的药物组合物，其特征是，它还含有DNA，该DNA不含有编码功能性的蛋白质的顺序。
28．根据权利要求18-26中之一的药物组合物，其特征是，它还含有编码免疫调节性蛋白质的DNA。
29．根据权利要求28的药物组合物，其特征是，该免疫调节性的蛋白质是一个选自IL-2,IL-4,IL-12,IFN-α,IFN-β,IFN-γ,IFN-ω,TNF-α,GM-CSF中的蛋白分裂素。
30．根据权利要求1-29中之一的药物组合物，它用于非肠道给药。
31．根据权利要求30的药物组合物，其特征是，它是一种在药物可用的载体中的肽与助剂的溶液或悬浮液。
32．根据权利要求1-29中之一的局部用的药物组合物，它用于局部给药。
33．根据权利要求32的药物组合物，是水凝胶形式的。
全文摘要
本发明涉及一种含有至少一种免疫调节肽或一种蛋白质(片段),以及一种助剂的药物组合物。该肽是由病原体或肿瘤抗原衍生的。该助剂能增加该肽与要治疗的人体细胞的结合,或增加该细胞对该肽的吸收能力,并且增强该肽的免疫调节功能。优选的助剂是碱性聚氨基酸,例如多精氨酸或多赖氨酸,它们可任选地与细胞配位体,例如碳水化物基因或运铁蛋白共轭。该组合物特别可用作疫苗,如肿瘤疫苗。
文档编号A61K39/02GK1211926SQ97192518
公开日1999年3月24日 申请日期1997年2月21日 优先权日1996年2月24日
发明者沃尔特·施米特, 马克斯·伯恩斯蒂尔, 彼得·斯坦莱恩, 迈克尔·布谢尔, 塔马斯·施韦格霍弗 申请人:贝林格尔·英格海姆国际有限公司