专利名称：脱乙酰壳多糖引起的免疫强化的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及加强动物免疫反应的方法，产生这种加强作用的组合物，及生成这种组合物的方法。具体的说，本发明提供的方法包括应用抗原/脱乙酰壳多糖混合物或抗原/脱乙酰壳多糖混合物/油/表面活化剂乳剂来加强免疫反应，用抗原/脱乙酰壳多糖混合物或抗原/脱乙酰壳多糖混合物/油/表面活化剂乳剂来产生强化作用，及制备抗原/脱乙酰壳多糖混合物或抗原/脱乙酰壳多糖混合物/油/表面活化剂乳剂的方法。
背景技术：
近期生物技术的发展简化了复合抗原成分的鉴定和分离，为安全、实用的疫苗成功发展提供了良好的前景。但是通常情况下，所分离的成分并不能象它们从中分离的，完整复合物抗原具有一样的免疫原性。为加强受体动物中对弱抗原性免疫原的免疫反应，佐剂常与免疫原一同给予。尽管佐剂已得到普遍经受，适用于人类的还很少。
理论上，佐剂可以加强功能活化抗体长期表达，引起细胞调节免疫(CMI)，并加强对于入侵抗原具有高度特异免疫反应性的记忆T和B淋巴细胞的产生。这些反应除了当时提供对外源抗原的保护作用，也可以在未来宿主接触特定抗原时提供保护。更重要的是佐剂能够在最小的毒副作用下加强免疫反应。因此，佐剂的效能可以用其平衡正(加强免疫)和负(毒性)影响的能力做为衡量指标。
刺激B细胞抗体产生的受控免疫依赖于多种与抗原本身及被免疫动物相关的因素。一般说来，抗原或其来源与被侵宿主在进化上离得越远，由抗原引起的免疫反应就越有效。由密切相关种属所衍生而来的抗原，不易产生抗体。这是由于宿主免疫系统有时不能清晰分辨外源抗原与自源或自抗原。此外，抗原的剂量，抗原的纯度以及抗原给予的频率都是显著影响抗体效价及所产生抗体特异性的因素。还有其它因素包括抗原的形式，复杂性，抗原给予方式。最后，被免疫动物的基因构成，整体生理状态与免疫反应增大的范围相关。在这些因素中，抗原的形式或复杂性受佐剂免疫的直接影响。
目前认为佐剂通过多种不同机制增强免疫反应。其中一种机制，佐剂直接刺激CD4+辅助T细胞TH2或TH2[Mosmann and Coffman,Ann.Rev.Immunol.7:145-173(1989)]。在B细胞对多数抗原的抗体反应中需要辅助T细胞的参与。正常免疫反应中，抗原被抗原呈递细胞(APC)捕捉、加工，并与第二类主要组织相容性分子(MHC)结合，在APC表面呈递。在这种形式中，抗原可与辅助T细胞表面的受体相互作用，继而激活特定的细胞亚群表达分泌多种细胞因子。细胞因子产生的本质取决于被激活的辅助T细胞亚群。这一作用可受佐剂选择的部分调节。例如，明矶，一种临床上用于人类的铝盐佐剂，有报道表明在小鼠中选择性激活TH2细胞[Grun and Maurer,Cell.Immunol.121:134-145(1989)]，而弗氏完全佐剂(CFA)，即一种矿物油和死亡的分枝杆菌的乳化剂[Freund,et al.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.37:509(1937)]，选择性激活鼠TH1细胞。[Grun and Maurer,Cell.Immunol.121:134-145(1989)]。
另一种免疫反应加强的机制与B细胞直接激活有关，例如革兰氏阳性菌脂多糖(LPS),[Gery,et al.,J.Immunol.108:1088(1972)]LPS已被证实可以刺激干扰素γ(INF-γ)的分泌[Tomai and Johnson,J.Biol.Resp.Med.8:625-643(1989)]，能够抑制TH2细胞的增殖，并刺激TH1细胞的分化[Gajewsko,et al.,J.Immunol.143:15-22(1989)；Gajewsko,et al.,J.Immunol.146:1750-1758(1991)]。LPS加强免疫反应的机制是通过B细胞的直接激活和TH1、TH2细胞群的间接调节。
免疫强化还有其他一些佐剂模式。油乳化剂(例如，弗氏完全佐剂[CFA]，弗氏不完全佐剂[FIA])和脂质体象明矾一样通过储备库的形成而作用，因而使抗原缓慢释放，抗原的缓释使抗原在免疫系统中延长暴露时间，并使一定剂量的抗原进行首次免疫，这一剂量若一次给予，一般不能产生抗体。以前曾有报道说大的抗原首次剂量可以产生较高即时效价的抗体，抗体效价的增加和抗体特异性的增加与时间的函数关系并不象用低剂量高频的抗原时那么明显[Siskind,G.,Pharm.Rev.25:319-324(1973)]，因此，控制抗原在免疫系统中呈递的佐剂改变抗原的形式、复杂性，也改变抗原的剂量。
迄今为止，只有一种佐剂，明矾[ALK(SO4)2·H2O]已被充分证实无毒性，可以用于人体。明矾不仅通过TH2细胞的激活、储备库的形成及免疫后抗原的缓释产生作用，[Edelman,Rev.Infect.Dis.2:370-383(1980)；Warren,etal.,Ann.Rev.Immunol.4:369-388(1986)]而且可以通过诱导免疫活细胞形成肉芽肿[White,et al.,JExp.Med.102:73-82(1955)]及活化补体产生作用[Ramanathan,et al.,Immunol.37:881-888(1979)]。但是，明矾并非没有负性副作用，引起包括红斑、皮下结节、接触高敏性及炎症肉芽肿的反应。其它佐剂被广泛应用于人体之外，是进一步发展能被接受用于人体的替代品的研究热点，包括上文所提的油乳剂(例如，CFA和FIA)、细菌产物(例如，LPS，霍乱毒素，分支杆菌成分和完整灭活的parvum棒状杆菌、granulosum棒状杆菌，脂质体、免疫刺激复合物(ISCOMs)和细菌以外来源的天然多糖及衍生多糖。
多糖的免疫强化能力是过去几年中探索的焦点，因为这些多糖在自然界广泛存在，例如，细菌胞壁的结构成分、昆虫和甲壳纲动物的外骨骼，从一些革兰氏阴性菌中分离得到的脂多糖(LPS)就是这样一种多糖，尽管LPS的佐剂性质主要源于分子中脂A区而不是源自O特异多糖或分子中的核心寡聚糖区LPS，但它增强了体液[Johnson,etal.,J.Exp.Med.103:225-246(1956)]和细胞调节免疫[Ohta,etal.,Immunobiology53:827(1984)]，具有多种生物学活性。但是由于它有内在毒性[Gupta等人综述，Vaccine11:291-306(1993)]，在人体应用上并不实用，于是注意力转向其它的多糖，其中包括聚氨基葡萄糖。
聚氨基葡萄糖[β-(1-4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖]是壳多糖衍生物。在生物医学中有广泛的应用。部分由于它能被溶酶体生物学降解，对人体只有低毒性。同样的特性使聚氨基葡萄糖作为免疫强化试剂成为可能。例如Matuhshi等人，U.S．专利号4,372,883，公开的将可溶多糖，包括聚氨基葡萄糖，与正常条件下的毒性抗原结合，能使抗原毒性消除，使其可以作为免疫原。但是Matuhshi等人并未提出应用聚氨基葡萄糖的不可溶形式，也未与其它已知佐剂比较这种方法所获得的血清抗体效价。
Likewisc,Suzuki等人，U.S．专利号4,814,169，公开的水溶性聚氨基葡萄糖寡聚体可以用于细菌、真菌感染的治疗，和肿瘤的治疗。Suzuki等人讨论了将聚氨基葡萄糖修饰产生某种合适的水溶形式的难点，指出非水溶性形式在治疗应用上并不实际。另外，Suzuki等人并未发现将抗原与聚氨基葡萄糖的结合能够加强免疫反应。
Mitsuhashi等人，U.S．专利号4,814,469，公开利用结合于包括聚氨基葡萄糖在内的可溶性多糖的人类蛋白能够在其它动物体内产生抗人类蛋白的抗体。人类蛋白/多糖溶液是通过静脉、腹腔、皮下注射给予的。但并未提及其它途径包括口服、直肠给予。
Nishimura等人[Vaccine2:93-99(1984)]报道壳多糖衍生物的免疫学性质包括在体内激活腹腔巨噬细胞、抑制小鼠肿瘤生长、保护机体对抗细菌感染。结果表明壳多糖和聚氨基葡萄糖对宿主抵抗肿瘤细胞或细菌是无效的刺激剂。但聚氨基葡萄糖能够轻微诱导细胞毒巨噬细胞，而修饰的去乙酰化聚氨基葡萄糖能在水相中形成胶质，在激活巨噬细胞抑制肿瘤生长及刺激对细菌感染的抵抗力中更为有效。
Marcinkiewicz等人[Arch.Immunol.Ther.Exp.39:127-132(1991)]测定水不溶性聚氨基葡萄糖的免疫佐剂活性，指出它能够明显强化T依赖性体液反应，但只是轻微增加非T依赖性体液反应。这种加强的体液反应在聚氨基葡萄糖以100mg/kg的剂量通过静脉或腹腔给予的条件下能被检测到，皮下及口服给予被特别报道为无活性，此外Marcinkiewicz等人并未提出将抗原与不可溶性聚氨基葡萄糖结合，认为聚氨基葡萄糖引起同样的反应，无论其给予部位，也不管它是否与抗原一起给予或是分开给予。
事实上仅有一种被证实可用于人体的佐剂，因而需要提供新的毒性较轻的佐剂应用于人体。改良佐剂能够产生更为有效的疫苗，并能够提高具有治疗价值的单克隆抗体的产生。
发明概述总体说来，本发明涉及聚氨基葡萄糖制剂在宿主体内加强免疫反应的应用。
一方面，本发明涉及加强免疫反应的一种方法，包括以下步骤制备聚氨基葡萄糖的溶液，将抗原加入磷酸缓冲液形成抗原/磷酸缓冲液溶液，将抗原/磷酸缓冲液溶液冻干形成冻干混合物，将此冻干混合物与氨基葡萄糖的溶液混合形成抗原/氨基葡萄糖混合物，然后将此混合物给予动物，包括人类。抗原/氨基葡萄糖混合物可以通过口服，直肠，阴道，腹腔注射，肌肉注射或皮下注射给予动物；给予方法可以包括单种或多种。
本发明的另一方面提供了一种包括与冻干的抗原/磷酸缓冲液和聚氨基葡萄糖溶液结合在内的组合物。抗原/氨基葡萄糖混合物可以通过口服，直肠，阴道，腹腔注射，肌肉注射或皮下注射给予动物；给予方法可以包括单种或多种。
本发明同时提供了一种免疫原，包括冻干的抗原/磷酸缓冲液和聚氨基葡萄糖的溶液。抗原/氨基葡萄糖混合物可以通过口服，直肠，阴道，腹腔注射，肌肉注射或皮下注射给予动物；给予方法可以包括单种或多种。
本发明的另一方面，提供了一种制备免疫原的方法，包括制备聚氨基葡萄糖的溶液，将抗原加入磷酸缓冲液形成抗原/磷酸缓冲液溶液，将抗原/磷酸缓冲液溶液冻干形成冻干混合物，将此冻干混合物与氨基葡萄糖的溶液混合形成抗原/氨基葡萄糖混合物。
本发明的又一方面，提供了一种强化免疫反应的方法，包括以下步骤制备聚氨基葡萄糖的溶液，制备氢氧化钠溶液，制备油/表面活性剂溶液，其中油可被代谢降解，将聚氨基葡萄糖的溶液、氢氧化钠溶液、油/表面活性剂溶液和抗原混合形成乳化剂，将乳化剂给予动物。抗原可以是但不限于是蛋白、糖、脂、糖蛋白或其组合。聚氨基葡萄糖溶液的最适pH大约为5。乳化剂可以通过腹腔注射，肌肉注射或皮下注射给予动物。乳化剂可以单独给予，或以结合其它佐剂的形式给予。免疫包括单一给予方式或多种给予方式。较优选的实验方案中，所用油是鲨烯。
本发明的另一方面，提供了一种组合物，当其给予动物时能够加强免疫反应，组合物包括抗原、氢氧化钠、油、表面活性剂和聚氨基葡萄糖溶液，其中油可被代谢降解。
本发明还提供了一种免疫原，包括抗原、氢氧化钠、油、表面活性剂和聚氨基葡萄糖溶液，其中油可被代谢降解。
本发明的又一方面，提供了一种用于制备免疫原的方法，步骤包括制备聚氨基葡萄糖溶液、氢氧化钠溶液、油/表面活性剂溶液，其中油可被代谢降解，将聚氨基葡萄糖溶液、氢氧化钠溶液、油/表面活性剂溶液和抗原混合形成乳化剂。
本发明还提供了试剂盒，包括聚氨基葡萄糖溶液、氢氧化钠溶液、油/表面活性剂溶液。
发明详述本发明由以下实施例来说明，涉及组合物和用组合物进行免疫强化的方法，其中又包括抗原/聚氨基葡萄糖混合物或抗原/聚氨基葡萄糖/油/表面活性剂乳化剂，和制备抗原/聚氨基葡萄糖混合物和抗原/聚氨基葡萄糖/油/表面活性剂乳化剂的方法。例1说明了抗原在磷酸缓冲液中进行掺合和冻干的制备方法，继而在聚氨基葡萄糖溶液中重构(reconstituted)。例2提供了现有佐剂与经过磷酸缓冲液中掺合继而在聚氨基葡萄糖溶液中重构的抗原刺激免疫反应能力的比较，例3说明了将抗原与聚氨基葡萄糖/油乳化剂掺合的制备方法。例4和例5提供了不同抗原掺合聚氨基葡萄糖/油乳化剂后刺激免疫反应的能力与现有佐剂刺激免疫反应能力的比较。
例1抗原在磷酸缓冲液中进行掺合和冻干及在聚氨基葡萄糖溶液中重构的制备方法以下以小鸡卵清蛋白作抗原为例，本领域普通技术人员很容易预料到其他可用的一些抗原。
0.5M磷酸缓冲液由15.6ml磷酸(16M；Mallinkrodt Chemical,Paris,KY)用400ml去离子水(18mOhm:DI)稀释，溶液pH用10N的氢氧化钠(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)调至7.3，总体积用DI水调至500ml。
稀释的聚氨基葡萄糖溶液制备，首先将1％聚氨基葡萄糖溶于2％乙酸溶液1mg聚氨基葡萄糖(实用级，Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)溶于100ml的2％冰乙酸(Mallinkrodt Chemical,Paris,KY)，得到的含1％聚氨基葡萄糖的2％乙酸溶液进一步稀释，即将7.4ml此溶液加入2.6mlDI水得到聚氨基葡萄糖工作液。最终聚氨基葡萄糖溶液的pH在6和7之间。
50μL10mg/ml卵清蛋白(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)磷酸缓冲盐溶液加入到含5ml0.5M磷酸缓冲液的10ml小瓶中，产生明显的絮状物。加入0.5mgd-山梨糖醇(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)后溶液迅速在液氮中凝固并冻干。
冻干样品用5ml聚氨基葡萄糖工作液重构，剧烈混均形成含白色颗粒的云雾状溶液，用于例2中的免疫接种。
例2经过磷酸缓冲液中掺合、冻干继而在聚氨基葡萄糖溶液中重构的抗原免疫强化的比较为确定聚氨基葡萄糖强化抗原反应的程度，用含25μg卵清蛋白及CFA的疫苗或用例1中所讲的经过磷酸缓冲液中掺合、冻干继而在聚氨基葡萄糖溶液中重构的，含25μg卵清蛋白的疫苗(实验组)免疫小鼠进行了比较(表1)。
雌性Balb/c小鼠，8周，0天用疫苗单次腹腔注射。卵清蛋白CFA处理组有3只小鼠，实验组(用经过磷酸缓冲液中掺合、冻干继而在聚氨基葡萄糖溶液中重构的卵清蛋白处理)含4只小鼠。两组实验组在注射7天后放血。CFA佐剂组还在21、28、35、42和48天放血。实验组还在26、38、38、52、70、83、102、123和159天放血。抗卵清蛋白血清抗体效价用ELISA测定。
表1经过磷酸缓冲液中混合、冻干继而在聚氨基葡萄糖溶液中重构的抗原免疫强化的比较(实验结果)免疫后天数实验组CFA(抗体平均效价)(抗体平均效价)7 1∶100 1∶7321 1∶293261∶10,00028 1∶3,20035 1∶13,867381∶11,00042 给予加强接种 1∶15,360(仅实验组)48 1∶20,48052 1∶64,00070 1∶18,50083 1∶10,250102 1∶13,500123 1∶10,000159 1∶1750结果表明含经过磷酸缓冲液中混合、冻干继而在聚氨基葡萄糖溶液中重构的抗原的组合物对受体动物没有明显毒性。实验组动物在26天(10,000)产生高抗体效价。高效价通过第42天加强接种一直可以持续到免疫后83天，加强接种后效价马上增加到约64,000(52天)并保持在10,000以上约123天(距第一次接种)。实验组的结果与本领域一般技术所用的标准佐剂，弗氏完全佐剂相类似。实验组动物的平均效价值可通过戊二醛交联于聚氨基葡萄糖的抗原结果相类似，其中通过这种处理的抗原比其它商业获得的佐剂(PCT/US95/12189；WO96/09805)的免疫强化力高，但由于在商业疫苗中不能接受戊二醛，而本疫苗中抗原是通过在磷酸缓冲液中混合、冻干继而在聚氨基葡萄糖溶液中重构制备给予的，故本发明是安全的，并与CFA及通过戊二醛交联于聚氨基葡萄糖的抗原有可比性。
例3抗原与聚氨基葡萄糖/油乳化剂掺合的制备方法下面以HIV-多肽-匙孔血蓝蛋白结合物(例4)或人类透明带B肽-卵清蛋白(例5)为抗原为例，本领域技术人员很容易预见到其他可用的一些抗原。进一步以鲨烯为例，本领域技术人员可以预见到能被所用受体动物代谢的油类。(例如，谷，canola，花生)含2％的聚氨基葡萄糖的0.5M乙酸钠溶液用4.lg乙酸钠(SigmaChemical Co.,St.Louis,MO)溶于50ml去离子水(18mOhm:DI)制备，用约7ml冰乙酸(Mallinkrodt Chemical,Paris,KY)将pH调至4.5，再加入1.5ml冰乙酸补偿聚氨基葡萄糖的加入对溶液pH的影响。溶液总体积用DI水调至100ml。29聚氨基葡萄糖(Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO)缓慢加入乙酸钠溶液并不断搅拌2-3小时直到聚氨基葡萄糖溶解。聚氨基葡萄糖溶液经25分钟循环的自切灭茵，在无菌箱内冷却至室温，并在IEC临床离心机(International EquipmentCo.,Needham Hts.,MA)上离心7-5分钟以清除杂质，将上清液与沉淀(不溶的聚氨基葡萄糖/聚乙酰氨基葡萄糖及污染物)分开。87-90％(重量比)加入的聚氨基葡萄糖能够保留在上清液中。
50％氢氧化钠溶液由50mg氢氧化钠(Sigma ChemicalCo.,St.Louis,MO)溶于lOOml去离子水中制得。鲨烯溶液由1500μl鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四烷己烯；Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)与600μl表面活性剂PluronicL121(BASF Corp.,Parsippany,Nj)振荡混均。
聚氨基葡萄糖/鲨烯/表面活性剂/抗原乳化剂的制备将约420μl水或尿素中的抗原(例如，HIV-多肽-匙孔血蓝蛋白结合物，表2；或人类透明带B肽-卵清蛋白，表3)加入约370μl含2％聚氨基葡萄糖的乙酸钠溶液振荡，所用抗原实际量(例如，蛋白或携带多肽结合物)由1μg到几mg。向抗原/聚氨基葡萄糖溶液中加入10μl50％氢氧化钠并振荡，加入10μl50％氢氧化钠直至形成稳定的云状沉淀。将约140μl事先配制好的鲨烯/表面活性剂溶液加入上文所提的抗原和聚氨基葡萄糖溶液中，所得溶液振荡直至云状乳化剂形成。在下文例4、5中描述的免疫研究给予以前，聚氨基葡萄糖/鲨烯/表面活性剂/抗原的终溶液用振荡或针管混均。
例4掺合于聚氨基葡萄糖/鲨烯乳化剂的抗原(HIV-多肽-keyhole limpet血蓝蛋白结合物)的免疫强化比较下列实验用于评价掺合于聚氨基葡萄糖/鲨烯乳化剂的抗原所引起的免疫反应。特别比较了用含不同量HIV-多肽-KLH的聚氨基葡萄糖/鲨烯乳化剂结合物疫苗与20μgHIV-多肽-KLH CFA结合物免疫的小鼠(Saren等，Vaccine Res,3:49-57；在此引入作为参考)。
参照表2和3，雌性Balb/c小鼠，8周，0天用疫苗单次腹腔注射200μl，组1在18周二次免疫(一次免疫后126天)；组2和3在24周二次免疫(一次免疫后168天)。二次免疫包括组1-3中聚氨基葡萄糖/鲨烯/表面活性剂乳化剂与不同剂量非结合HIV多肽，CFA组并不接受二次免疫。研究动物在22、35、49、63、77、91、119(包括组1)天放血，抗卵清蛋白血清抗体效价用ELISA测定。
表2聚氨基葡萄糖/鲨烯乳化剂免疫强化研究比较中的免疫组组号 多肽量μg 佐剂 动物数11聚氨基葡萄糖/鲨烯 823聚氨基葡萄糖/鲨烯 43 20聚氨基葡萄糖/鲨烯 44 20 CFA 4表3聚氨基葡萄糖/鲨烯乳化剂免疫强化比较抗体效价的周几何平均数组号 3 5 7911 13 1720 2711∶115 1∶475 1∶2260nd 1∶4000 1∶2500 nd 1∶35910 nd21∶126 1∶6400 1∶9190 1∶11310 1∶9120 1∶1130 1∶2000 1∶7071∶1800031∶141 1∶4500 1∶18400 1∶9500 1∶12900 1∶1900 1∶3360 1∶1680 1∶912041∶62 1∶2600 1∶3820 1∶800 1∶9120 1∶3200 1∶4700 1∶2200nd
nd=未确定结果表明聚氨基葡萄糖/鲨烯/表面活性剂乳化剂结合物对受体动物没有明显毒性。结果同时也表明组3(20μg多肽以聚氨基葡萄糖/鲨烯/表面活性剂为佐剂)与组4(20μg多肽以CFA为佐剂)效应相差不多，在第5周和第7周增强抗HIV-多肽-KLH结合物的免疫反应。组3(3μg多肽与聚氨基葡萄糖/鲨烯/表面活性剂结合)在11周中产生等同于甚至优于组4的结果。奇怪的是，用未结合的多肽免疫接受聚氨基葡萄糖/鲨烯乳化剂的实验动物，产生很强的加强反应。(见组1中18周和组2-3中24周)总体来说，表3中的结果表明聚氨基葡萄糖/鲨烯乳化剂能够诱导可比的，在某些方面优于CFA的体液免疫反应。此外，聚氨基葡萄糖/鲨烯/表面活性剂乳化剂作为免疫强化剂能够加强由未结合HIV多肽引起的加强反应。
例4结合于聚氨基葡萄糖/鲨烯乳化剂的抗原(人类透明带B肽-卵清蛋白结合物)的免疫强化比较下列实验用于评价结合于聚氨基葡萄糖/鲨烯表面活性剂乳化剂的抗原所引起的免疫反应。特别比较了用含六个不同人类透明带B(ZPB)合成多肽[SEQ ID NOS.1-6]与聚氨基葡萄糖/鲨烯表面活性剂乳化剂或CFA结合物免疫的小鼠。
雌性Balb/c小鼠，8周，0天及28天用200μl疫苗(20μg六个不同人类ZPB合成多肽与聚氨基葡萄糖/鲨烯/表面活性剂乳化剂(组1)或CFA结合(组2))腹腔注射，组2小鼠接受CFA疫苗强化。血清抗体效价用ELISA测定，所用板每个小室用1μg六多肽混合物包被。抗中国仓鼠卵巢细胞产生的，全长纯化重组人类ZPB蛋白的抗体滴度同样用ELISA测定，所用板用50ng纯化蛋白包被。
表4聚氨基葡萄糖/鲨烯乳化剂的免疫强化比较(数据以几何平均数给出)按天给出多肽特异抗体效价 按天给出抗-CHO ZPB抗体效价佐剂 21 43 6081 43 601∶81组1 1∶4.47 1∶30900 1∶43700 1∶87450 1∶1350 1∶2390 1∶9120组2 1∶9.45 1∶8360 1∶4550 1∶11870 1∶146 1∶2.8 1∶10表4的结果表明用聚氨基葡萄糖/鲨烯/表面活性剂乳化剂结合的多肽免疫动物引起的对多肽和全长蛋白的体液反应比用CFA结合的多肽免疫动物引起的反应强。
尽管本发明是以优选实施方案进行描述的，但本发明意在包括所有涉及此公开内容的本领域技术的修饰与变异，特别是在最广的权利要求正确解释与其要求范围内的实施方案。
序列列表(1)一般信息(ⅰ)申请者Podolski,Joseph S.
Mitzi L.Martinez(ⅱ)发明题目脱乙酰壳多糖引起的免疫强化(ⅲ)序列数目6(ⅳ)通讯地址(A)收件人Marshall,O’Toole,Gerstein,Murray&Borun(B)街道233South Wacker Drive/6300Sears Tower(C)城市Chicago(D)州IL(E)国家美国(F)邮政编码60606-6402(ⅴ)计算机可读类型(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patent in release#1.0,Version#1.30(ⅵ)本申请资料(A)申请号(B)填表日期(C)分类(ⅷ)代理人/委托人信息(A)姓名Clough,David W(B)登记号36,107(C)文献/摘要号27779/33753(ⅸ)远程联系信息
(A)电话312-474-6300(B)传真312-474-0048(2)SEQ ID NO:1信息(ⅰ)序列特征(A)长度12氨基酸(B)类型氨基酸(C)链类型无关(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:1:Gly Gln His Lys Pro Glu Ala Pro Asp Tyr Ser Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:2信息(ⅰ)序列特征(A)长度12氨基酸(B)类型氨基酸(C)链类型无关(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:2:Arg Gly Asp Cys Glu Gly Leu Gly Cys Cys Tyr Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:3信息(ⅰ)序列特征(A)长度18氨基酸(B)类型氨基酸(C)链类型(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:3:Ala Pro Asp Thr Asp Trp Cys Asp Ser Ile Pro Ala Arg Asp Arg Leu1 5 10 15Pro Cys(2)SEQ ID NO:4信息(ⅰ)序列特征(A)长度12氨基酸(B)类型氨基酸(C)链类型(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:4:Asp Arg Ala Val Tyr Glu Asn Glu Leu Val Ala Thrl 5 10(2)SEQ ID NO:5信息(ⅰ)序列特征(A)长度12氨基酸(B)类型氨基酸(C)链类型(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:5:Met Pro Val Gly Val Glu Gly Ala Gly Ala Ala Glu1 5 10(2)SEQ ID NO:6信息(ⅰ)序列特征(A)长度24氨基酸(B)类型氨基酸(C)链类型(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列的详细情况SEQ ID NO:6:Val Ser Ser Lys Gly Pro Met Ile Leu Leu Gln Ala Thr Lys Asp Pro1 5 10 15Pro Glu Lys Leu Arg Val Pro Val20
权利要求
1．加强动物免疫反应的方法，包括步骤a)制备聚氨基葡萄糖溶液；b)将抗原与磷酸缓冲液掺合形成抗原/磷酸缓冲液溶液；c)将抗原/磷酸缓冲液溶液冻干形成冻干混合物；d)将冻干混合物在所述的聚氨基葡萄糖溶液中重构形成抗原/聚氨基葡萄糖混合物；e)将抗原/聚氨基葡萄糖混合物通过某种能够使动物加强对抗原的免疫反应的给予途径给予动物。
2．权利要求1的方法，其中聚氨基葡萄糖溶液pH为约6到7。
3．权利要求1的方法，其中给予途径从包括肌肉注射，腹腔注射和皮下注射的组中选择。
4．权利要求1的方法，其中给予途径从包括口服，直肠和阴道途径的组中选择。
5．权利要求3和4的方法，其中动物为人。
6．由以下过程制备的组合物a)制备聚氨基葡萄糖溶液；b)将抗原与磷酸缓冲液掺合形成抗原/磷酸缓冲液溶液；c)将抗原/磷酸缓冲液溶液冻干形成冻干混合物；及d)将冻干混合物在所述的聚氨基葡萄糖溶液中重构形成抗原/聚氨基葡萄糖混合物。
7．权利要求6的组合物，其中聚氨基葡萄糖溶液pH为约6到7。
8．由以下过程制备的免疫原a)制备聚氨基葡萄糖溶液；b)将抗原与磷酸缓冲液掺合形成抗原/磷酸缓冲液溶液；c)将抗原/磷酸缓冲液溶液冻干形成冻干混合物；及d)将冻干混合物在所述的聚氨基葡萄糖溶液中重构形成抗原/聚氨基葡萄糖混合物。
9．权利要求8的免疫原，其中聚氨基葡萄糖溶液pH为约6到7。
10．产生免疫原的方法包括以下步骤a)制备聚氨基葡萄糖溶液；b)将抗原与磷酸缓冲液掺合形成抗原/磷酸缓冲液溶液；c)将抗原/磷酸缓冲液溶液冻干形成冻干混合物；及d)将冻干混合物在所述的聚氨基葡萄糖溶液中重构。
11．权利要求10的方法，其中聚氨基葡萄糖溶液pH为约6到7。
12．加强动物免疫反应的方法，方法包括以下步骤a)制备聚氨基葡萄糖溶液；b)制备氢氧化钠溶液；c)制备油/表面活性剂溶液，其中油可被代谢降解；d)将聚氨基葡萄糖溶液与氢氧化钠溶液，油/表面活性剂溶液和抗原混合形成乳化剂；及e)将乳化剂通过某种能够使动物加强对抗原的免疫反应的给予途径给予动物。
13．权利要求12的方法，其中油是鲨烯。
14．权利要求12的方法，其中聚氨基葡萄糖溶液pH为约5。
15．权利要求12的方法，其中给予途径从包括肌肉注射，腹腔注射和皮下注射的组中选择。
16．权利要求15的方法，其中动物为人。
17．加强免疫反应的组合物，所述组合物包括抗原，氢氧化钠溶液，油，表面活性剂溶液和聚氨基葡萄糖溶液，其中油可被代谢降解。
18．权利要求17的方法，其中油是鲨烯。
19．权利要求17的方法，其中聚氨基葡萄糖溶液pH为约5。
20．由以下步骤产生的免疫原a)制备聚氨基葡萄糖溶液；b)制备氢氧化钠溶液；c)制备油/表面活性剂溶液，其中油可被代谢降解；d)将聚氨基葡萄糖溶液与氢氧化钠溶液，油/表面活性剂溶液和抗原混合形成乳化剂。
21．权利要求20中的免疫原，其中所用油为鲨烯。
22．权利要求20中的免疫原，其中所用聚氨基葡萄糖溶液pH约为5。
23．产生免疫原的方法，包括以下步骤a)制备聚氨基葡萄糖溶液；b)制备氢氧化钠溶液；c)制备油/表面活性剂溶液，其中油可被代谢降解；及d)将聚氨基葡萄糖溶液与氢氧化钠溶液，油/表面活性剂溶液和抗原混合形成乳化剂。
24．权利要求23的方法，其中油是鲨烯。
25．权利要求23的方法，其中聚氨基葡萄糖溶液pH为约5。
26．试剂盒，包括a)聚氨基葡萄糖溶液；b)氢氧化钠溶液；及c)油/表面活性剂溶液，其中油可被代谢降解。
27．权利要求26中的试剂盒，其中所用油为鲨烯。
28．权利要求26中的试剂盒，其中所用聚氨基葡萄糖溶液pH约为5。
29．通过将聚氨基葡萄糖溶液与氢氧化钠溶液和油/表面活性剂溶液混合形成乳化剂的步骤制备的佐剂，其中油可被代谢降解。
30．权利要求29中的佐剂，其中所用油为鲨烯。
31．权利要求29中的佐剂，其中所用聚氨基葡萄糖溶液pH约为5。
全文摘要
公开了加强免疫反应的方法和组合物,其掺入了脱乙酰壳多糖作为免疫加强佐剂。本发明的组合物的给药可通过多种途径。
文档编号A61K39/39GK1226173SQ97196720
公开日1999年8月18日 申请日期1997年3月25日 优先权日1997年3月25日
发明者J·S·波多尔斯基, M·L·马尔蒂内兹 申请人:佐纳根有限公司