专利名称：治疗前列腺癌的TNF－β－样蛋白,相关的核酸分子,药物组合物和方法
技术领域：
本发明涉及可用于治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌受试者的蛋白质，本发明还涉及用于治疗患有此病的受试者的核酸分子，药物组合物和方法。发明背景在本申请上下文中，提到多篇文献。这些文献所公开的内容通过参考文献引入本文以更完整地描述本发明所涉及的现有技术。
前列腺癌是最常见的恶性肿瘤类型之一，50岁或50岁以上的男人中，30％人的前列腺中具有癌症的病灶，但每年仅有1％患此病的男人被正确地诊断为前列腺癌，尸检时揭示出的高发病率和临床上揭示出的很低的发病率相比显示出鲜明的差异。1992年，美国有134,000个男人被诊断为前列腺癌，32,000的患者死于此病。在临床上被诊断为此病的所有男人中，尽管接受了治疗，但一半以上在10年内死亡，三分之二以上遭受局部或全身性的病痛折磨。最近，对血清中前列腺-特异性抗原(PSA)的检测能做到较早地测定，但仍不清楚PSA升高但无大肿瘤负担的患者中该疾病的自然进程如何。
对于局限于前列腺的癌症而言，初级放射疗法或彻底地切除术的效力大致相当。对于初期外科手术而言，放射疗法可治疗疾病的复发，而对于初级放射疗法而言，用外科手术治疗疾病的复发较困难。前列腺损害大多转移至骨，通过降低受试者的雄激素水平可治疗这种转移。通过用药物阻断肾上腺和性腺雄激素的产生可在化学上做到这一点，或通过去势(摘除睾丸，实际上未阻断肾上腺产生)可在外科手术上做到这一点。患者对这种激素处理仅反应6个月左右然后即恶化的事实表明转移的前列腺损害可能变为雄激素-非依赖型的。经培养的前列腺癌细胞系中含有混合克隆这一发现支持了上述观点。这些混合的克隆有3种类型雄激素-依赖型，仅在外源雄激素的存在下存活；雄激素-敏感型，在无雄激素时可存活，但需有雄激素的存在才能增殖；和雄激素-非依赖型，在缺乏雄激素时可存活也可增殖。
在患有前列腺癌的受试者中，不少群体在临床上显示出雄激素非依赖性，即甚至在治疗除去雄激素之后仍可继续增殖的前列腺癌细胞的存在。除去前列腺肿瘤块的外科手术经常导致雄激素非依赖型细胞以及其它类型的细胞的去除。然而，在此方面仅靠外科手术很少有效，因为至少有些雄激素依赖型细胞仍然存在。因此，存在一个强烈的(和不合适的)需求，即需要使用特异性抑制雄激素非依赖型癌细胞增殖的药剂来治疗前列腺癌的方法。发明简述本发明提供了重组蛋白质和分离的蛋白质，当它们在适当条件下与雄激素非依赖型前列腺癌细胞接触时，可选择性地抑制所述细胞的增殖，其氨基酸序列含有图2所示的氨基酸序列或其功能衍生物。
本发明还提供了治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的药物组合物，所述组合物含有本发明蛋白质之一和药物可接受的载体。
本发明还提供了基本上由编码图4之氨基酸序列的核酸序列或其功能衍生物组成的核酸分子，所述分子包括但不限于适用于治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的基因疗法的核酸分子。
本发明还提供了治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的药物组合物，所述组合物含有适于用作基因疗法之载体的本发明的核酸分子和药物可接受的载体。
本发明提供了当在适当条件下与雄激素非依赖型前列腺癌细胞接触时，可选择性地杀死所述细胞的物质组合(composition of matter)，该物质组合含有本发明的蛋白质和能有效地与之粘附的毒性组分。
本发明也提供了治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的药物组合物，所述组合物含有本发明的物质组合和药物可接受的载体。
最后，本发明提供了治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的方法，所述方法包括给受试者施用治疗有效量的一种本发明的药物组合物。附图简述
图1描述了GF-2H的DNA序列。
图2A描述了成熟的GF-2H蛋白(被鉴定为“ACTIVE2H2”)的氨基酸序列和TGF-β家族其它成员之氨基酸序列之间的比较。
图2B描述了未成熟的GF-2H蛋白的氨基酸序列。
图3A描述了GF-2H的纯化方案。
图3B描述了rGF-2H的纯化方案。
图4描述了成熟的GF-2H的氨基酸序列。
图5描述了编码GF-2H的mRNA在不同组织中的表达。
图6描述了成熟的GF-2H对前列腺癌细胞系PC-3的调节。
图7描述了成熟的TGF-β对前列腺癌细胞系PC-3的调节。发明详述β型转化生长因子(TGF-β)是具有多种活性的多功能因子大家族的代表。TGF-β是生长，分化和形态发生因子超家族的原型，所述因子如抑制素，活化素，穆勒氏抑制物，decapentaplegic产物，和TGF-β2，这些因子在结构上都与TGF-β相关。另外，这些因子和与TGF-β相关的其它因子似乎参与组织发育和修复的很多过程(J.Massague,Ann.Rev.Cell.Biol.,1990,6:597-641)。
由于这些多种多样的作用，一组TGF-β-样蛋白可能具有用作特别地治疗增殖性疾病之治疗剂的潜力。然而，缺乏进一步的实验资料，不可能预测具有已知氨基酸序列的TGF-β-样蛋白是否对导致特殊疾病的增殖中的细胞具有抑制作用，同时在临床上也不会导致不可接受的副作用。本发明的蛋白质根据其一级结构为TGF-β-样蛋白，它能特异性地抑制雄激素非依赖型前列腺癌细胞的增殖。然而，在缺乏进一步的实验资料的情况下，仅根据氨基酸序列不能预测这种特异性。因此，本发明TGF-β-样蛋白特异性的抗前列腺癌的活性是最出乎意料的。
更具体地，本发明提供了当在适当条件下与雄激素非依赖型前列腺癌细胞接触时，可选择性地抑制所述细胞增殖的重组蛋白质，其氨基酸序列含有图4所示的氨基酸序列或其功能衍生物(“第一蛋白质”)。在一个实施方案中，第一蛋白质选自下文讨论的，被称为“rGF-2H”，“重组GF-2H”，或“重组的成熟GF-2H”的蛋白质。在优选的实施方案中，第一蛋白质是成熟的GF-2H。
本发明还提供了当在适当条件下与雄激素非依赖型前列腺癌细胞接触时，可选择性地抑制所述细胞增殖的分离的蛋白质，其氨基酸序列由图4所示的氨基酸序列或其功能衍生物组成(“第二蛋白质”)。在一个实施方案中，第二蛋白质选自下文讨论的“GF-2H”和“成熟的GF-2H”。在优选的实施方案中，第二蛋白质是成熟的GF-2H。
本文所用的重组蛋白质是通过使用重组的核酸技术得到的蛋白质。这种重组蛋白质的一级结构可以与其天然形式的一级结构相同，或可含有另外的氨基酸残基。另外的残基可存在于例如蛋白质的N-末端和/或C-末端。分离的蛋白质是指具有含50％以下蛋白质杂质之化学环境的任何蛋白质。在一个实施方案中，分离的蛋白质具有含10％以下蛋白质杂质的化学环境，在优选的实施方案中，分离的蛋白质具有含1％以下蛋白质杂质的化学环境。
在本文中，序列如图4所示的蛋白质的“功能衍生物”蛋白质，是与序列如图4所示的蛋白质具有结构(即氨基酸序列)和功能(即选择性抑制雄激素非依赖型前列腺癌细胞增殖)上的相似性的蛋白质。结构上相似的蛋白质包括例如通过基本上不消除蛋白质选择性抑制雄激素非依赖型前列腺癌细胞增殖之能力的氨基酸残基缺失，插入或保守的取代而与图4之蛋白质有所不同的蛋白质。保守氨基酸取代的例子是用亮氨酸残基取代异亮氨酸残基。
本文所用的“雄激素非依赖型”前列腺癌细胞是可在缺乏雄激素时存活以及增殖的前列腺癌细胞。本文所用的“增殖”指的是细胞群体通过细胞分裂而生长，“选择性抑制”雄激素非依赖型细胞增殖指的是在饱和条件下，并如在适当时间点(如与本发明蛋白质最初接触72小时之后)所测定，将雄激素非依赖型细胞增殖的体外速率至少降低50％，而未将HeLa细胞增殖的体外速率降低20％以上。在优选的实施方案中，将雄激素非依赖型细胞增殖的体外速率至少降低90％，而未将HeLa细胞增殖的体外速率降低10％以上。使用已知方法可容易地测定细胞增殖的速率，所述方法如下文所述的经标记胸苷掺入法。
第一和第二蛋白质当与雄激素非依赖型前列腺癌细胞接触时选择性抑制所述细胞增殖的适当条件是生理条件，即雄激素非依赖型前列腺癌细胞周围的化学环境，该环境可使雄激素非依赖型前列腺癌细胞表面受体与其相应的天然配体结合。根据已知方法易于在体外复制这种条件。
本发明另外还提供了治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的药物组合物，所述组合物含有第一或第二蛋白质和药物可接受的载体(“第一药物组合物”)。
药物可接受的载体是本领域技术人员众所周知的，它包括但不限于0.01-0.1M，优选为0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％的盐水。另外，这种药物可接受的载体可以是含水或不含水的溶液，悬浮液和乳状液。不含水的溶剂的例子是丙二醇，聚乙二醇，如橄榄油的植物油和如油酸乙酯的可注射用有机酯。含水的载体包括水，醇/水溶液，含有盐水和缓冲介质的乳状液或悬浮液。非肠道用的载体包括氯化钠溶液，林格葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸化的林格油或固定油。静脉内载体包括液体和营养补充物，电解质补充物，如基于林格葡萄糖的那些电解质补充物等等。防腐剂和其它添加剂也可以存在，例如抗微生物剂，抗氧化剂，螯合剂，惰性气体等等。
本文所用“受试者”指的是能发育或维持前列腺癌的任何动物或人工修饰的动物。人工修饰的动物包括但不限于小鼠，大鼠，狗，豚鼠，雪貂，兔和灵长类动物。在一个实施方案中，人工修饰的动物是患有诱导性前列腺癌的小鼠。这种动物的例子是本领域中已知的(N.M.Greenberg等，P.N.A S.美国，92:3439-3443(1995)；T.C.Thompson等，癌症71:1165-1171(1993))。在优选的实施方案中，受试者是人。
本发明另外还提供了治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的方法，所述方法包括给受试者施用治疗有效量的第一药物组合物。
本文所用的施用可以通过本领域技术人员已知的多种方法中的任一种来实现或进行。施用包括静脉内施用，肌内施用和皮下施用。
第一药物组合物的治疗有效量是足以选择性抑制患病受试者之雄激素非依赖型前列腺癌细胞增殖的剂量。在优选的实施方案中，对患病受试者的治疗包括在一段时间内施用多份治疗有效剂量。通过已知方法可确定剂量和时间。在一个实施方案中，治疗有效量为0.1μg/kg至1mg/kg，在优选的实施方案中，治疗有效量为1μg/kg至100μg/kg。
本发明另外还提供了基本上由编码图4之氨基酸序列的核酸序列或其功能衍生物组成的核酸分子。
在一个实施方案中，核酸分子是RNA分子，在另一个实施方案中，核酸分子是DNA分子(如cDNA或基因组DNA),DNA分子可含有图1所示的核苷酸序列。
在另外的实施方案中，核酸分子是表达载体。可使用多种表达载体。这样的载体，包括质粒载体，粘粒载体，噬菌体载体和其它病毒，是本领域已知的。例如，一类载体利用得自动物病毒的DNA元件，所述动物病毒如牛乳头瘤病毒，多瘤病毒，腺病毒，痘苗病毒，杆状病毒，逆转录病毒(RSV,MMTV或MoMLV)，塞姆利基森林病毒或SV40病毒。在优选的实施方案中，载体是pCI。另外，适用于本发明的宿主细胞，调节元件和转染方法是本领域中已知的。
在另外的实施方案中，核酸分子是适用于治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的基因疗法的载体。基因疗法的载体和传递所述载体的方法是本领域中已知的，这种传递方法包括但不限于经由腺病毒和阳离子脂质体以及经由裸露的DNA的传递。另外，本发明的载体可以被导入来自体内(ex vivo)的适当细胞中(如外周血单核细胞(PBMNC))，然后再被导入患病的受试者体内，这种来自体内的方法是本领域中已知的。
本发明另外还提供了治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的药物组合物，所述组合物含有本发明适用于基因疗法的核酸分子和药物可接受的载体(“第二药物组合物”)。
本发明另外还提供了治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的方法，所述方法包括给受试者施用治疗有效量的第二药物组合物。
第二药物组合物的治疗有效量是能有效导致受试者的细胞产生和分泌由其中的核酸分子编码的蛋白质的剂量，所述蛋白质反过来选择性抑制患病受试者之雄激素非依赖型前列腺癌细胞的增殖。在一个实施方案中，对患病受试者的治疗包括在一段时间内施用多份治疗有效剂量。通过已知方法可确定剂量和时间。在一个实施方案中，第二药物组合物的治疗有效量为每个受试者104至1011个DNA分子，在优选的实施方案中，治疗有效量为每个受试者105至1010个DNA分子。
本发明也提供了当在适当条件下与雄激素非依赖型前列腺癌细胞接触时，可选择性地杀死所述细胞的物质组合，该物质组合含有第一或第二蛋白质和有效地与之粘附的毒性组分。
毒性组分可以是蛋白质类的毒素，在一个实施方案中，蛋白质类的毒素选自蓖麻毒蛋白，破伤风毒素，白喉毒素及其亚单位和片段。毒性组分也可以是放射性核素。在另一个实施方案中，毒性组分是放射α射线或β射线的放射性核素，包括但不限于125I,131I,90Y,212Bi。将毒性组分与蛋白质有效粘附的方法是本领域中已知的。
本发明也提供了治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的药物组合物，所述组合物含有本发明的物质组合和药物可接受的载体(“第三药物组合物”)。
本发明另外还提供了治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的方法，所述方法包括给受试者施用治疗有效量的第三药物组合物。
本文所用“选择性杀死”雄激素非依赖型细胞指的是在饱和条件下，并如在适当时间点(如与本发明组合物最初接触72小时之后)所测定，在体外至少杀死50％雄激素非依赖型细胞，而不会在体外杀死20％以上的HeLa细胞。在优选实施方案中，本发明的组合物在体外至少杀死90％雄激素非依赖型细胞，而不会在体外杀死10％以上的HeLa细胞。使用包括例如台盼蓝排斥试验的已知方法可容易地测定细胞死亡。
第三药物组合物的治疗有效量是足以选择性杀死患病受试者之雄激素非依赖型前列腺癌细胞的剂量。在优选的实施方案中，对患病受试者的治疗包括在一段时间内施用多份治疗有效剂量。通过已知方法可确定剂量和时间。在一个实施方案中，治疗有效量为0.1μg/kg至1mg/kg，在优选的实施方案中，治疗有效量为1μg/kg至100μg/kg。
参照下文实验细节将能更好地理解本发明，但本领域技术人员应懂得详细描述的具体实验仅是为了阐明本发明，在下文的权利要求书中更完整地描述了本发明。实验细节材料和方法rIFN-γ购自Boehringer和Mannheim(＞2×107个单位/mg)。表达载体pCI,pcDNA3和pSV2-dhfr分别得自Promega,Invitrogen和美国典型培养物保藏中心(ATCC)。细胞培养基得自GIBCO和BioWhittaker，胎牛血清得自Hyclone，重组的人TGF-β得自R&D系统，[3H]胸苷得自DuPont NEN,S100SartoBind阳离子膜吸附器得自Sartorius，层析柱和树脂得自Pharmcia，化学药品得自Fish和Sigma。细胞系和细胞培养所有细胞系都得自ATCC,HeLa细胞在添加有5％FBS的MEM培养基中维持，PC-3和LNCaP细胞在添加有5％FBS的RPMI-1640中维持，DU145在添加有10％FBS的EMEM中维持，HEL细胞在添加有10％FBS的RPMI中维持，HepG2细胞在添加有10％FBS和1×非必需氨基酸的MEM中维持，BHK细胞在添加有5％FBS的DMEM中维持。在所有细胞系的培养基中加入抗生素(终浓度为50μg/ml的青霉素和50μg/ml的链霉素)。扣除cDNA文库的构建和筛选在添加有10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，50u/ml青霉素和50μg/ml链霉素的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM；GibcoBRL)中培养HeLa细胞(ATCCCCL185)。用浓度为2500单位/ml的重组人γ-干扰素(IFN-γ)(Boehringer Mannheim)将HeLa细胞处理48小时。根据厂商的方案，从模拟试验和经FIN-γ处理的HeLa细胞中分离出总RNA(RNAzol；Tell-Test)和poly(A)-被选定的RNA(FastTrack；Invitrogen)。
为了单向cDNA文库的构建，将由未经处理和经IFN-γ处理(处理48小时)的HeLa细胞的2微克poly(A)RNA合成的cDNA分别定向克隆至质粒pGEM11Zf(Promega)和pT7T3D18U(Pharmacia)中。根据已知方法(Usui等，J.Neurosci,14(8):4915-4926,1994)进行扣除杂交，或更具体地，进行有义链cRNA和反义cDNA合成，杂交，通过羟基磷灰石柱从双链cDNA/RNA杂合体中分离单链cDNA，和PCR扩增，接着进行扣除文库的构建。经PCR扩增的扣除cDNA被定向克隆至pT7T3D(Pharmacia)。
为了筛选扣除的cDNA文库，随机地从此文库中挑选1000个cDNA并进行测序(见下文)。克隆#15558(aka2H)被发现6次(每1000个被分析的cDNA中)，因此被认为是由IFN-γ推定差异调节的cDNA。克隆，DNA测序和计算机分析在Applied Biosystems373或377DNA测序仪上，根据厂商的方案，以使用T7引物的单次操作进行所有的测序。在使用测序程序(Gene Codes公司)分析之前除去载体序列。经由Blast(Altschul等，分子生物学杂志，215:40,1990)将大于20bp的插入物与GenBank(版本为92)相比较以用于基因鉴定，并经由FastA(Pearson&Lipman,PNAS,85:2444,1988)将大于20bp的插入物互相比较以计算cDNA在扣除cDNA文库中出现的频率。从分析中排除含有Alu元件的序列。对2H(克隆#15558)的Blast分析显示出与TGF-β超家族的几个成员有显著的同源性。克隆#15558不是全长的(即它不含有完整的编码区)，因此，使用2微克poly(A)RNA提取自用IFN-γ处理48小时的HeLa细胞(为cDNA模板合成的来源来完成锚式PCR(Frohman等，PNAS85:8998-9002；1988)。完成了两个独立的锚式PCR，随后对cDNA进行克隆和测序。发现开放阅读框架在此ATG的上游有终止密码子，这表明已得到全长的克隆。Northern印迹分析为了进行RNA印迹，将2微克提取自HeLa细胞(模拟对照和用IFN-γ处理48小时的HeLa细胞)的poly(A)RNA上样于每条泳道，随后，通过在1.2％的琼脂糖，1.2M甲醛凝胶上电泳分辨之，转移至硝酸纤维素膜上，并与全长的32P标记的2H cDNA探针杂交。另外，将此32P标记的探针与人组织RNA印迹(Clontech)杂交。rGF-2H的表达将GF-2H cDNA的完整编码区亚克隆至哺乳动物表达载体pCI(Promega)的EcoRⅠ位点以产生表达质粒pCI-2H，该质粒在紧接起始密码子ATG的上游具有Kozak共有序列。通过经改进的磷酸钙沉淀法(Graham和van der Eb，病毒学，52:456(1973))进行DNA转染。为了得到氨甲碟呤(MTX))抗性，以1比4的比例将质粒pSV2-dhfr(ATCC No.37146；S.Subramani等，分子和细胞生物学，1981-9,p854-864)或pZem229(欧洲专利申请0319944A2,1988年7月12日提交)与pCI-2H共转染，为了得到G418抗性，以1比4的比例将质粒pcDNA3(Invitrogen,#V790-20)与pCI-2H共转染。转染24小时后，在培养基中加入MTX(终浓度为1μM或G418(最终的活性浓度为1mg/ml)。10天后，随机选择抗性集落，收集无血清条件培养基和选定克隆的细胞裂解物，对它们进行Western印迹以分析rGF-2H的表达和分泌。建立生产细胞系并在1μM MTX或1mg/ml G418中维持所述细胞系。对一些MTX-抗性细胞系使用20μM MTX以进一步扩增被转染的基因。将分离得到的产量最高的克隆称为BHK-GF-2H#17并用于生产rGF-2H。重组成熟GF-2H的纯化收集得自BHK-GF-2H#17的无血清条件培养基，以下列浓度1mMPMSF,1μg/ml亮抑蛋白酶肽，2μg/ml胃酶抑制剂，1μg/ml抑蛋白酶肽和1mMEDTA加入蛋白酶抑制剂，于4℃,9000rpm下离心20分钟以除去细胞碎片后，于4℃，用乙酸(终浓度为0.2M)将上清液酸化过夜。
然后将上清液上样于预先用25mM磷酸钠pH4.0(缓冲液A)平衡的S100SartoBind阳离子膜吸附器(Sartorius,#S100X)上。用缓冲液A，接着用含有300mMNaCl的缓冲液A洗涤膜吸附器。用含有500mM NaCl和蛋白酶抑制剂(1mMPMSF,1μg/ml亮抑蛋白酶肽，2μg/ml胃酶抑制剂，1μg/ml抑蛋白酶肽和1mMEDTA)的25mM磷酸钠pH4.0从膜吸附器上洗脱rGF-2H。
加入饱和的硫酸铵至终浓度为1M之后，将收集物上样于用含有1M NaCl和1M硫酸铵的25mM NaPO4pH7.0预平衡过的8ml丁基Sepharose柱上，然后用相同缓冲液洗涤柱，并用含NaCl和硫酸铵的25mMNaPO4pH7.0的线性1-0M的梯度洗脱。收集含有rGF-2H的级分并使用Centriprep-10(Millipore)浓缩之。
将经浓缩的收集物上样于Superdex-75FPLC柱(Pharmacia)。用20mMTris-HCl,pH7.0,100mMKCl平衡并洗脱柱。
将含有rGF-2H的级分上样于Vydac C18 HPLC柱(10μm颗粒大小，4.6×250mm)，该柱已用90％溶剂A和10％溶剂B(溶剂A含有0.1％三氟乙酸和水，溶剂B由0.1％三氟乙酸和乙腈组成)平衡过。用10％至90％的溶剂B线性梯度洗脱柱。将含有纯rGF-2H的级分冻干并重新悬浮于25mM NaPO4pH7.0中，并以小的等分试样储存于-70℃中。针对GF-2H的多克隆抗体合成对应于pre-pro-GF-2H之残基253至273的肽MHAQIKTSLHRLKPDTVPAPC，将所述肽与匙孔血蓝蛋白偶联，在弗氏佐剂中乳化，并注射给兔。通过ELISA用肽滴定兔抗血清。凝胶电泳和Western印迹分析根据Laemmli,U.K.自然，227:680(1970)的方法进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过银染料或考马斯亮蓝R-250对凝胶进行染色。按Towbin等，PNAS,76,4350(1979)所述进行Western转移。使用兔抗GF-2H肽的抗体和与辣根过氧化物酶-缀合的抗兔抗体(Bio-Rad)进行免疫染色。N-末端氨基酸和质谱分析使用Applied Biosystems470A蛋白质测序仪进行N-末端序列分析，所述测序仪上装配有在线式乙内酰苯硫脲分析仪(120A型)。在Lumonics NAG激光被调至355nm的Vestec2000MALDI-TOF-MS上，使用基质辅助的激光解吸电离质谱仪(MALDI-MS)进行质谱分析。细胞增殖试验以5000至10000个细胞/孔的密度将细胞接种于每孔含100μl相应的完全培养基的96孔平底培养板中。于37℃,5％CO2下保温过夜之后，用100μl添加有1％或5％含有指定浓度的rGF-2H或TGF-β的新鲜培养基替代用过的培养基，于37℃,5％CO2下再保温指定的时间之后，于37℃,5％CO2下用[3H]胸苷(1μCi/孔)将细胞标记5小时。保温结束时，除去标记介质，用PBS洗涤细胞，并于37℃同100μl胰蛋白酶-EDTA一起保温10分钟。然后使用细胞收集器将细胞从培养板中转移至96孔玻璃纤维板(Unifilter板，Parkard)上。洗涤纤维板，于55℃干燥30分钟，用40μl闪烁(MicroScin-20,Parkard)将每个孔弄湿，使用96孔培养板计数器(TopCount,Parkard)进行计数。结果从HeLa细胞中克隆IFN-γ-诱导的基因编码GF-2H之DNA的全长克隆跨越1122个碱基对(图1)，通过下列标准鉴定起始的甲硫氨酸(碱基对35-37)(a)在此甲硫氨酸上游有一个框内的终止密码子(碱基对14-16)；(b)氨基酸序列与Kozak共有序列(Kozak，生物化学杂志，第266卷，No.30,1986-19870(1991))一致；和(c)紧接此甲硫氨酸之后的是推定的信号肽。
在碱基对959-961处发现了终止密码子，这表明开放阅读框架的终止(图1)，这相当于927个碱基对的开放阅读框架。3’非编码区含有聚腺苷酸化信号AATAAA(碱基对1100-1105)，在短命的mRNA的3’非编码区发现两个不稳定的基元ATTTA(碱基对1075-1079)。GF-2H mRNA的表达进行Northern印迹分析以测定GF-2H转录物的大致长度并显示mRNA组织表达的模式。使用1.2kb的片段作为探针进行Northern印迹，杂交显示出仅在用IFN-γ处理过的HeLa细胞中有约1.4kb的主要转录物，而在未经处理的HeLa细胞中没有这种转录物(图3A)。对不同组织的筛选显示出在胎盘，前列腺，肝脏，肾脏，胎儿肺和胎儿肾脏中可检测到GF-2H mRNA图3B)。胎盘和前列腺中的mRNA相对量大于其它组织中的量(图3B)。推定GF-2H蛋白的分析推测的GF-2H基因产物为308个氨基酸残基长，其计算分子量为34.1kDa。已将GF-2H的核苷酸和推定蛋白质序列与序列数据库中的序列进行了比较。对蛋白质序列数据库的Blast检索揭示出推定GF-2H蛋白与TGF-β超家族之间显著水平的同源性。完整的GF-2H蛋白显示出与人Gdf1的前体形式有28.2％相同，而GF-2H蛋白C-末端三分之一显示出与果蝇dpp蛋白的成熟形式有30.4％相同。当使用PILEUP程序将GF-2H蛋白C-末端三分之一的序列与TGF-β超家族成员排列在一起以寻找最大相似性时，观察到TGF-β蛋白中所有9个保守的半胱氨酸残基以及一些其它的保守残基(Hosaka等，生物化学杂志，第266卷，p12127-12130(1991))存在于GF-2H蛋白C-末端三分之一中。
与TGF-β超家族大多数成员一样，GF-2H蛋白含有N-末端的信号序列和N-联和O-联糖基化的潜在位点。有一簇碱性残基可提供潜在的裂解位点，从而由前体产生成熟的形式(Hosaka等，1991)。图2A显示出未成熟GF-2H蛋白的氨基酸序列。图2B显示出成熟GF-2H蛋白和TGF-β家族其它成员之氨基酸序列之间的比较。重组GF-2H蛋白的表达为了表达重组GF-2H，将GF-2H cDNA的整个编码区插入哺乳动物表达载体pCI中以产生pCI-2H。通过用质粒pCI-2H和含有小鼠DHFR表达单位，允许用MTX选择转染子的pSV2-dhfr或pZem229共转染BHK tk-ts13细胞得到稳定的被转染的BHK细胞系。通过使用抗-GF-2H肽抗体的Western印迹分析检查这些细胞系中GF-2H的表达(数据未显示)。使用这些细胞系中的一个，即BHK-2H-#17进一步鉴定rGF-2H的表达。
当条件培养基在还原条件下的SDS-PAGE上被分级分离并用抗-GF-2H肽抗体印迹时，在BHK-2H-#17细胞中观察到表观分子量为13kd的带(图4，泳道5)，在对照BHK细胞中未观察到此带(图4，泳道4)。在一些情况下，在BHK-2H-#17细胞中也观察到表观分子量为39kd的另一条带，而在对照BHK细胞中未观察到此带(数据未显示)。当条件培养基在非还原条件下的SDS-PAGE上被分级分离并用抗-GF-2H肽抗体印迹时，在BHK-2H-#17细胞中观察到表观分子量为25kd的带(图4，泳道3)，在对照BHK细胞中未观察到此带(图4，泳道2)。这些结果表明BHK-2H-#17细胞表达了GF-2H并将它加工至较小的形式，分泌至培养基中。分泌出的GF-2H最有可能是13kd蛋白质的二硫键连接的二聚体(25kDa)。39kd的形式最有可能是具有一些翻译后修饰，如糖基化的全长GF-2H，因为全长GF-2H的推测分子量是34kd。重组GF-2H的纯化和鉴定通过具体针对rGF-2H开发的四步纯化法(见上文的讨论)，使用得自BHK-2H-17的条件培养基纯化经加工的成熟形式的rGF-2H。使用此方法，成熟rGF-2H纯化后的纯度经SDS-PAGE和银染分析判断为大于95％(数据未显示)。
当通过还原条件下的SDS-PAGE分析时，纯化的重组的成熟GF-2H被测定为13kd的带，而当通过非还原条件下的SDS-PAGE分析时，纯化的重组的成熟GF-2H被测定为25kd的带(图5)。通过质谱分析也将成熟rGF-2H的分子量测定为25kd(数据未显示)。对纯化的重组的成熟GF-2H的N-末端氨基酸序列的分析表明成熟rGF-2H序列始于全长GF-2H的残基197(图6)。从全长rGF-2H之残基197至308的多肽的计算分子量是12.3kd。这些结果表明成熟rGF-2H含有通过二硫键连接在一起的全长rGF-2H之C-末端部分，残基197至308。rGF-2H对细胞增殖的影响对多种人细胞系试验纯化的rGF-2H以检查它对细胞增殖的影响。如上文所述，将细胞平铺，与多种浓度的rGF-2H一起保温24至96小时，并用[3H]胸苷标记。与rGF-2H平行检测人TGF-β2对这些细胞系的细胞增殖的影响以将此影响与rGF-2H的相比较。
对雄激素-非依赖型前列腺癌细胞系PC-3细胞而言，重组GF-2H显示出对[3H]胸苷掺入的剂量和时间依赖性抑制作用。在保温48小时之后最初观察到这种抑制作用(图6)，保温96小时之后仍可看到这种抑制作用，此时，开始出现明显的细胞死亡。与1.4×10-11M rGF-2H保温72小时后观察到与对照(无rGF-2h)相比为最大的抑制作用约90％(图6)。当在相同条件下对PC-3细胞检测TGF-β时，也观察到与rGF-2H类似的剂量和时间依赖性抑制作用。然而，当与对照相比时，用TGF-β观察到的最大抑制作用仅为52％(图7)。与PC-3细胞类似，对于另一个雄激素非依赖型前列腺癌细胞系DU145细胞，也观察到rGF-2H和TGF-β对[3H]胸苷掺入的剂量和时间依赖性抑制作用(表1)。与对照相比，rGF-2H和TGF-β的最大抑制作用分别为60％和80％(数据未显示)。
表1GF-2H对选定人细胞系增殖的影响细胞系 rGF-2H TNF-βPC-3(雄激素非依赖型前列腺癌)抑制抑制DU145(雄激素非依赖型前列腺癌) 抑制抑制LNCaP(雄激素依赖型前列腺癌) 无影响 抑制HepG2(肝癌) 无影响 抑制HEL(红白血病) 无影响 抑制HeLa(子宫颈上皮癌) 无影响 轻微抑制CaoV-3(卵巢腺瘤)无影响 无影响如表1所概括，rGF-2H对LNCaP,HepG2或HEL细胞[3H]胸苷掺入没有影响，与之形成对照的是TNF-β抑制这些细胞的[3H]胸苷掺入。rGF-2H或TNF-β对HeLa和Caov-3细胞的[3H]胸苷掺入都未显示出显著的影响。简单地说，rGF-2H显示出可特异性地抑制雄激素非依赖型前列腺癌细胞的增殖，与之不同的是TNF-β对其它细胞系显示出抑制作用。
权利要求
1．重组蛋白质，所述蛋白质当在适当条件下与雄激素非依赖型前列腺癌细胞接触时可选择性地抑制所述细胞的增殖，所述蛋白质的氨基酸序列含有图4所示氨基酸序列或其功能衍生物。
2．分离的蛋白质，所述蛋白质当在适当条件下与雄激素非依赖型前列腺癌细胞接触时可选择性地抑制所述细胞的增殖，所述蛋白质的氨基酸序列由图4所示氨基酸序列或其功能衍生物组成。
3．治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的药物组合物，所述组合物含有权利要求1或2的蛋白质和药物可接受的载体。
4．治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的方法，所述方法包括给受试者施用治疗有效量的权利要求3的药物组合物。
5．权利要求4的方法，其中受试者是人。
6．核酸分子，所述分子基本上由编码图4之氨基酸序列的核酸序列或其功能衍生物组成。
7．权利要求6的核酸分子，其中核酸分子是RNA分子。
8．权利要求6的核酸分子，其中核酸分子是DNA分子。
9．权利要求8的核酸分子，其中DNA分子含有图1所示的核苷酸序列。
10．权利要求7的核酸分子，其中核酸分子是表达载体。
11．权利要求10的表达载体，其中表达载体是被称为pCI的载体。
12．权利要求7或8的核酸分子，其中分子是适用于治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的基因疗法的载体。
13．治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的药物组合物，所述组合物含有权利要求12的核酸分子和药物可接受的载体。
14．治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的方法，所述方法包括给受试者施用治疗有效量的权利要求13的药物组合物。
15．权利要求14的方法，其中受试者是人。
16．物质组合，所述物质组合当在适当条件下与雄激素非依赖型前列腺癌细胞接触时可选择性地杀死所述细胞，所述物质组合含有权利要求1的蛋白质和与其有效粘附的毒性组分。
17．权利要求16的物质组合，其中毒性组分是选自蓖麻毒蛋白，破伤风毒素，白喉毒素及其亚单位和片段的蛋白质类毒素。
18．权利要求16的物质组合，其中毒性组分是选自125I,131I,90Y,212Bi的放射性核素。
19．治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的药物组合物，所述组合物含有权利要求16的物质组合和药物可接受的载体。
20．治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的方法，所述方法包括给受试者施用治疗有效量的权利要求19的药物组合物。
21．权利要求20的方法，其中受试者是人。
全文摘要
本发明提供了可选择性地抑制雄激素非依赖型前列腺癌细胞增殖的蛋白质,本发明还提供了编码本发明蛋白质的核酸分子,所述核酸分子包括适用于治疗患有雄激素非依赖型前列腺癌之受试者的基因疗法的核酸分子。本发明还提供了选择性地杀死雄激素非依赖型前列腺癌细胞的物质组合,所述物质组合含有本发明的蛋白质和与之有效粘附的毒性组分,最后,本发明还提供了相关的药物组合物和治疗雄激素非依赖型前列腺癌的方法。
文档编号A61K38/00GK1233289SQ97197712
公开日1999年10月27日 申请日期1997年9月11日 优先权日1996年9月11日
发明者M·埃兰德, S·M·黄, M·杰克森, P·彼德森 申请人:奥索·麦克尼尔药品公司