诊断和/或治疗剂的改进或与其相关的改进的制作方法

专利名称：诊断和/或治疗剂的改进或与其相关的改进的制作方法
技术领域：
本发明涉及诊断和/或治疗活性剂，更具体地说涉及渗入了在体内与位点和/或结构相互作用或对其具有亲和性的组分(这样增强了体内特定部位的诊断图象和/或治疗)的诊断和/或治疗活性剂。本发明特定的目标是用于超声造影的诊断剂，其在下文中称作为导向超声造影剂。
众所周知超声造影包含具潜在价值的诊断工具，例如用于脉管系统的研究中，特别是在心动描记法，以及组织微脉管系统中。已提出利用各种造影剂来增强所获得的声学图象，包括固体微粒悬液，乳化的液滴，气泡和包裹的气体或液体。通常认为低密度造影剂(其容易压缩)就它们所产生的声学反散射而言特别有效，因此相当大的兴趣表现在制备包含气体和产生气体的系统中。
也已知含气体的造影介质在磁共振(MR)造影中有效，例如作为易感性造影剂，其可减少MR信号强度。含氧的造影介质也代表潜在有用的顺磁MR造影剂。
此外，在X-光造影领域中观察到气体(如二氧化碳)可用作为阴性口服造影剂或血管内造影剂。
已提出将放射性气体(例如惰性气体的放射性同位素，如氙)用于闪烁照相中例如血液池造影。
人们认为导向超声造影剂包含(i)能够与超声波辐射相互作用产生可检测信号的报道物组分；(ii)在体内与特殊的导向点和/或结构(例如病理学的特定细胞或区域)具有亲和性一种或多种载体；(iii)一种或多种连接所说的报道物和载体的接头(在它们不直接相连时)。
造影剂所要结合的分子和/或结构在下文中被称为靶。为了在体内所选择的区域/结构获得特定图象或治疗效应，在本区域/结构中必须存在和可利用有效的靶。理想的是仅在目的区域中得以表达，但通常在体内其它位置也有表达，这产生可能的背景问题。靶可以是确定的分子种类(如靶分子)或未知的分子或复合结构(如靶结构)，它们存在于待造影和/或治疗的区域中，且能够特异性地或选择性地结合给定的载体分子。
载体附在或连接到报道物组分上，从而使这些部分结合到待造影和/或治疗的区域/结构上。载体可特异性地结合到所选择的靶上，或者它仅选择性地结合，对少量其它分子/结构也具有亲和性，这又产生了可能的背景问题。
仅具有与导向的超声造影剂有关的有限的现有技术的例子。例如US-A-5531980涉及这些系统，在这些系统中所说的报道物包含一种空气或气体微泡(其由至少部分呈薄片状的一种或多种形成膜的表面活性剂所稳定化)的含水悬液，所说的表面活性剂结合在一种或多种载体(其包含″为特异导向目的所设计的生物活性物质″)上。据述微泡不直接由表面活性剂物质进行包裹，但却掺入到装有液体的脂质体(其稳定化微泡)内。位于脂质体的薄片状的表面活性剂物质如磷脂将不可避免地呈现一种或多种脂质双层形式，亲脂的尾部″背-对-背″而亲水的头部分别位于内部和外部(参见例如Schneider，M.药物导向中关于″作为药物载体的脂质体10年的研究″，Nyon，瑞士，3-5，1984年10月，Buri，P.和Gumma，A.(Ed)，Elsevier，Amsterdam 1984)，这是很有利的。
EP-A-0727225描述了导向的超声造影剂，其中报道物包含一种具有足够水蒸气压力的化学药品，这样在施用对象的体温下它的组分为气体。该化学药品与表面活性剂或白蛋白载体有关，包括作为载体的蛋白质-，肽-或糖-基质的细胞粘着分子配体。在这些造影剂中的报道物组分对应于WO-A-9416739中所描述的相转变胶体系统；现在认识到这样施用相转变胶体可以导致微泡的产生，微泡的生长无法控制，有可能达到引起潜在的危险的栓塞(例如心血栓和脑血栓)的程度(参见例如Schwarz，回波造影进展[1994(3)]，pp 48-49)。
WO-A-9320802提出，可利用连接在组织特异性配体(如抗体，肽，外源凝集素等等)上的声象反射单层脂质体增强组织-特异性超声图象。故意挑选没有气体的脂质体，这样没有基于气体的超声造影剂的有利的回波性质。此外本技术的一些参考文献，例如在血纤蛋白，血栓，动脉硬化症区域的导向中，见出版物Alkanonyuksel，H.等，制药科学杂志(1996)85(5)，486-490；J.Am.Coll.Cardiol.(1996)27(2)Suppl A，298A；循环，68科学会议，Anaheim1995，11，13-16。
也有关于超声造影剂的一些出版物，其顺便谈到可利用单克隆抗体作为载体但没有给出重要的实际细节和/或包含报道物的物质，这些物质可被网状内皮系统吸收，因此可增强器官(如肝)图象-参见，例如WO-A-9300933，WO-A-9401140，WO-A-9408627，WO-A-9428874，US-A-5088499，US-A-5348016和US-A-5469854。
本发明基于发现了由形成膜的表面活性剂物质单分子层所稳定化的充气微泡在导向的诊断和/或治疗剂中是非常有用的报道物。这样，例如，这些单层薄膜的弹性和柔性可实质上增强与脂质体系统相关的报道物的回波性(echogenicity)，其中脂质体系统包含脂质双层或多个这样的双层结构。这样可保证利用低剂量的报道物材料达到较高的超声波造影效应，且具有必然的安全优点。
这样根据本发明的一个方面，本发明提供了可导向的诊断和/或治疗活性剂，例如超声造影剂，该造影剂包含在含水载液(例如可注射的载液)中的报道物的悬液，其中所说的报道物包含由形成膜的表面活性剂物质单分子层稳定化的充气微泡，所说的试剂还包含至少一种载体。
本文中术语″单分子层″指两亲型表面活性剂部分在气液界面之间形成的单分子层或类似于所谓的Langmuir-Blodgett膜，其中两亲物的亲脂部分朝气相排列而亲水部分与水相相互作用。
如WO-A-9729783所示，人们相信在带电荷的磷脂膜之间的静电排斥可促进在微泡载液界面处形成稳定和稳定化的单分子层。相对于包括一个或多个脂质双层的充气脂质体来说，人们认为这些单层薄膜的弹性和柔性可增强按照本文所揭示的本发明的产物的回波性。用于稳定化这些含微泡的水悬浮液所利用的磷脂的量低至在每个微泡周围形成表面活性剂单分子层所必需的量，所形成的类膜结构稳定化微泡以防萎陷或融合。人们认为在低磷脂浓度时，不会获得具有类脂质体表面活性剂的双分子层的微泡。
本发明的一个有利的实施方案是基于另外的发现，即与靶粘着的有限性是诊断和/或治疗活性剂的一种非常有用的性质，该性质是利用临时逗留而非稳定化结合到靶上的载体产生的。这些试剂(不是稳定化保持在特异性位点的那些试剂)可以例如借助它们与内皮细胞的瞬时相互作用有效地显示沿脉管内皮细胞层延缓流速的形式。在超声造影剂提供的增强的回波性(其与血流量有关)的情况下，这些药剂可集中于血管壁上，这没有解剖学上的特性。因此，它们可增强毛细管系统的造影(包括微胶管系统)，并且利于区分正常和不充分散布的组织(例如在心脏中)，并且也对视觉结构(如Kupffer细胞，血栓，及动脉硬化症损伤)有用或对视觉新生血管和发炎组织区有用。本发明特别适于使发生于位于组织坏死区域中的正常血管中的变化造影。
在本发明的另一个实施方案中，通过一定的方式将一种或多种载体附在或包含在报道物内，使得载体不容易暴露在靶或靶接受体上。因此可利用另一种方法暴露出载体，例如在施用之后使造影剂暴露在外部超声波下，以改变包括载体的部分的扩散力来增加组织的特异性。
任何生物相容的气体均可存在于报道物内，本文所使用的术语″气体″包括在正常的人体温37℃下实质上或完全为气体形式(包括水蒸气)的任何物质(包括混合物)。因此这些气体包括例如，空气；氮气；氧气；二氧化碳；氢气；惰性气体(如氦，氩，氙或氪)；硫氟化物(如六氟化硫)，二硫十氟化物或三氟甲基硫五氟化物；六氟化硒；可有可无的卤代硅烷如甲基硅烷或二甲基硅烷；低分子量的碳氢化合物(例如包含多达7个碳原子的)，例如烷(如甲烷，乙烷，丙烷，丁烷或戊烷)，环烷(如环丙烷，环丁烷或环戊烷)，烯(如乙烯，丙烯，丙二烯或丁烯)，或炔(如乙炔或丙炔)；醚(如二甲醚)；酮；酯；低分子量卤代碳氢化合物(例如包含多达7个碳原子的)；或任何上述的混合物。有利的是在卤代气体中的至少一些卤原子为氟原子；这样，生物相容的卤代碳氢化合物气体例如可选自下列，溴氯二氟甲烷，氯二氟甲烷，二氯二氟甲烷，溴三氟甲烷，氯三氟甲烷，氯五氟乙烷，二氯四氟乙烷，氯三氟乙烯，氟乙烯，乙基氟化物，1，1-二氟乙烷，以及全氟碳，例如全氟烷烃，如全氟甲烷，全氟乙烷，全氟丙烷，全氟丁烷(例如全氟-N-丁烷，或与其它异构体的混合物，如全氟-异-丁烷)，全氟戊烷，全氟己烷及全氟壬烷；全氟烯烃，如全氟丙烯，全氟丁烯(例如，全氟丁-2-二烯)和全氟丁二烯；全氟炔烃如全氟丁-2-炔烃；及全氟环烷如全氟环丁烷，全氟甲基环丁烷，全氟二甲基环丁烷，全氟三甲基环丁烷，全氟环戊烷，全氟甲基环戊烷，全氟二甲基环戊烷，全氟环己烷，全氟甲基环己烷，以及全氟环壬烷。其它卤代气体包括氯代甲烷，氟化(例如全氟化)酮如全氟丙酮，和氟化(例如全氟化)醚如全氟二乙醚。由于认识到在血流内包含这些气体的微泡的高稳定性，因此尤为优选利用全氟化的气体，例如六氟化硫和全氟碳，如全氟丙烷，全氟丁烷和全氟戊烷。
由于按照本发明的报道物单位内的形成膜的表面活性剂单分子层可以稳定化所产生的微泡以防无限生长，因此气体可包括如丁烷，环丁烷，N-戊烷，异戊烷，新戊烷，环戊烷，全氟戊烷，全氟环戊烷，全氟己烷或包含一种或多种在处理或加工温度下为液态而在体温下为气体的这样的气体的混合物，如在上述WO-A-9416739所描述的。
在原则上，任何适当的膜形成表面活性剂都可用于形成包裹气体的单分子层，包括非聚合和非可聚合的形成壁的表面活性剂物质，例WO-A-9521631所描述的；聚合物表面活性剂物质，如WO-A-9506518中所描述的；和磷脂，如WO-A-9211873，WO-A-9217212，WO-A-9222247，WO-A-9428780，WO-A-9503835或WO-A-9729783所描述的。根据本发明，试剂中的形成膜的表面活性剂有75％掺入到气液界面的单分子层是有利的，实质上完全掺入更优选。
有效的磷脂的典型代表例子包括卵磷脂(如磷脂酰胆碱)，例如天然的卵磷脂如蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂和合成或半合成的卵磷脂如二肉桂酰磷脂酰胆碱；二棕榈酰磷脂酰胆碱或甘油二硬脂酰磷脂酰胆碱；磷脂酸；磷脂酰乙醇胺；磷脂酰丝氨酸；磷脂酰甘油；磷脂酰肌醇；心磷脂；鞘磷脂；任何上述的氟化类似物；任何上述的混合物和其它类脂类的混合物如胆固醇。
现已发现利用主要(如至少75％)包含单独带有净电荷的分子的磷脂是特别有利的，尤其是本质上用作为报道物唯一的两亲性组分时，这些磷脂有利于某些参数(如产物稳定性和声学性质)。出于理论考虑希望没有结合，人们相信在带电荷的磷脂膜之间的静电排斥力可促进在气液界面处形成稳定的单分子层(如上所述)，并且相对于包括一个或多个脂质双层的充气脂质体来说，这些单层薄膜的弹性和柔性可增强按照本发明的报道物的回波性。
利用带电荷的磷脂也可提供具有有利性质的报道物，例如，稳定性，分散性以及无需依赖于添加剂(如另外的表面活性剂和/或粘度增强剂)的抗凝聚性，由此可保证施用(通过注射将造影剂施用到受试者体内)的组分量最小。这样，例如，由于静电排斥，微泡带电荷的表面能使聚集作用最小或或阻止聚集作用。
在制备和/或使用条件下，要求至少75％，优选为所有的磷脂物质(其用于本发明活性剂中的报道物)由带净电荷的分子组成，其中该电荷可以是正电荷或优选地为负电荷。带正电荷的磷脂的代表包括磷脂酸如二棕榈酰磷脂酸，或带氨基醇(如羟乙基乙二胺)二硬脂酰磷脂酸的酯。带负电荷的磷脂的例子包括天然存在的(例如大豆或蛋黄衍生物)，半合成的(例如部分或完全氢化)和合成的磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酸和心磷脂。这些磷脂的脂酰基通常每个含约14-22个碳原子，如在棕榈酰和硬脂酰基中。依据本发明，这样带电荷的磷脂的溶解形式也有用，术语″溶解″表示仅包括一个脂酰基的磷脂，优选地以酯键连接到甘油基部分的1-位置碳原子上。这种带电荷磷脂的溶解形式若与带两个脂酰基的带电荷磷脂相混合则更利于应用。
根据本发明，磷脂酰丝氨酸为活性剂中所利用的优选磷脂，并优选地构成其主要部分，例如其磷脂含量至少80％，例如85-92％。虽然出于理论考虑希望没有结合，则在邻近丝氨酸部分的羧基和氨基之间的离子桥利于这种报道物系统的稳定性。优选的磷脂酰丝氨酸包括饱和(例如氢化或合成)天然磷脂酰丝氨酸和合成的二硬脂酰磷脂酰丝氨酸，二棕榈酰磷脂酰丝氨酸和花生烯酸酰磷脂酰丝氨酸。
其它潜在有用的类脂类包括磷脂酰胆胺或其与一种或多种下述类脂类的混合物，如磷脂酸，棕榈酸，硬脂酰胺，棕榈酰胺，胆固醇，二烃基甘油，鞘氨甘油脂，合成类脂类如N，N-二甲基-N-十八基-1-十八铵氯化物或溴化物(DODAC，DODAB)，和/或马来酸二烷基酯。
另外有效的类脂类(其可用来制备包含气体的造影剂)包括了脂肪酸，硬脂酸，棕榈酸，2-N-十六烷基硬脂酸，油酸，和其它具酸的脂质结构。脂质结构通过形成胺化合键偶连在具有一个或多个氨基的氨基酸上；所形成的脂修饰的氨基酸(例如二棕榈酰丝氨酸或二硬酯酰2，3-二氨基丙酸)是功能间隔元件(其具有与一个或多个载体分子缀合的偶连位点)接合的有用的前体。
另一些有用的稳定剂包括脂肽(包含连接在肽接头部分的脂质)，其中所说的肽连接物部分适于偶连一个或多个载体分子。尤其优选包括带正电荷的肽接头元件(例如包含两个或多个赖氨酸残余物)，它们能通过与报道物的微泡(其由带负电荷的磷脂或其它表面活性剂膜稳定化)的静电作用锚定。
另一个本发明的实施方案包括具有一个或多个可与位于细胞表面的受体分子发生非特异性反应的基团的功能性微泡。例如，微泡(包括巯基组分)通过二硫化物交换反应可结合到细胞表面的受体上。该反应的可逆的性质意味着那种微泡流可通过改变氧化还原环境来控制。同样地，具有膜的功能微型气泡(其膜包含活化的酯如N-羟基丁二酰亚胺酯)可用来与位于细胞表面的多态性分子的氨基进行反应。
以前所提出的基于磷脂的微泡包含的造影剂(例如WO-A-9409829所描述的)经常由接触磨碎的表面活性剂进行制备，例如将冻干粗制的脂质体或冻干的或喷干的磷脂溶液与空气或其它气体接触，然后与含水载体接触，搅拌以产生微泡悬液，该微泡悬液必须在制备后不久就施用。然而，该操作也有不利之处，即必须使所有搅拌能量都用于产生所需的微泡的分散，而且微泡的大小与分布规模都依赖所用的能量，因此在实践上不利于控制。
另一方面，若在适当的包含表面活性剂(例如磷脂)的水介质中产生分散的微泡而制备根据本发明的报道物或活性剂则是很有利的，如果需要，可以事先将其中所说的水介质高压灭菌或以其它方式灭菌，然后(优选在洗涤和/或大小分级分离这样形成的微泡之后)低压冻干(例如在一种或多种冷保护剂/冷冻保护剂存在下)分散物，以产生干燥产物，该产物在水溶液中容易重构产生均匀的具有再生性的微泡的弥散物。这一方法的具体细节见WO-A-9729783，本文以参考形式并入了WO-A-9729783的内容；能除去不大小的气泡和过量的表面活性剂物质的能力使该方法实质上优于如前面WO-A-9409829所述的那些方法及现有技术，如WO-A-9608234(该方法是通过在注射前振荡不同的磷脂和粘度增强剂(如丙二醇和甘油)的悬液在位点上产生小泡)可用上述方法来产生具非常窄范围的分子大小的报道物的微泡，例如超过90％(例如至少95％，优选98％)的微泡的平均体积直径为1-7μm并且不到5％(例如不超过3％，优选不超过2％)的微泡的平均体积直径超过7μm。洗涤步骤则确保报道物完全没有不需要的组分(诸如过量类脂类或粘度增强剂)。按本方法制备的包含报道物的活性剂具有下列优于现有技术造影剂材料的优点由于所有表面活性剂物质均作为单分子层充分参与了微泡的固定化，因此大大增强了每剂量的回波性。狗体内超声波检验表明，上述制备的超声造影剂虽仅静脉内注射了0.1-1μg的微泡/kg体重，却以15dB从心肌层增加反向散射信号强度。
由于该活性剂可以使所注射的磷脂的剂量可低至0.1-10μg/kg体重(如1-5μg/kg)的量，因此同样可提高体内的安全性。这样低水平表面活性剂的利用可明显减少可能的毒副作用，因而具有实质上的优点。
由于人们通常认为当利用包含具有对位点的亲和性的载体的产品时，相当低量的报道物将在所需的位点积累，因此高的效应/剂量比对于导向应用也特别有利。因此，与所熟知的可导向的超声造影剂相比，按照本发明的优选报道物在所需位点明显提高造影作用。利用超声波，这种高效性可有效地使单个微型气泡可视，其灵敏度接近闪烁照相(虽然闪烁照相照片的图形分辨率不高，但在导向定向中可能为目前最有用的技术)的灵敏度或比其具潜在地更高的灵敏度。
基于磷脂酰丝氨酸上的活性剂的特殊优点是他们的生物相容性；在动物试验中入静脉注射(以正常造影剂量进行注射，共10次)了基于磷脂酰丝氨酸的造影剂的胶块(其按上述方法制备)的狗，并未发现任何急性毒性作用如血压变化或心率变化。
由于带电荷的磷脂含有功能基如羧基或氨基，若需要，它们使得易于以连接单位连接载体，因此这些磷脂也是有优势的。注意，在微泡产生之前，其它官能团也可通过包含所需功能基的脂质与形成膜的表面活性剂相混合而掺入到系统内。
本发明中一般地没必要在活性剂中加入添加剂，如乳化剂和/或粘度增强剂(这些普遍用于现有许多造影剂的制作中)。如上所述，在保证施用给授受者体内的组分数量最小，及保证活性剂的粘度尽可能低方面均有优点。然而，由于制备活性剂通常包括上述的冷冻干燥步骤，因此最好包含冷冻保护剂或填充剂，例如醇(如脂肪族醇如T-丁醇)；多羟基化合物(如甘油)；糖(例如食糖如蔗糖，甘露糖醇，海藻糖或环糊精，或多糖如葡聚糖)；或聚乙二醇(如聚乙二醇)。优选利用生理学易耐受的糖如蔗糖。
如上述所制备冷冻干燥的产品在水中尤其容易重构，其仅需要轻微地搅拌如轻轻用手振荡几秒钟。所产生的微泡大小是均匀的具有再生性的，并且不依赖于用于振荡的能量，实践上按在初始微泡分散状态下所形成的微泡的大小决定；这一大小参数惊人地实质上维持在冷冻的和重构产物中。这样，既然通过操作参数(如方法，速度，以及搅拌的持续时间)易于控制在初始分散化中的微泡的大小，因而容易控制最后的微泡大小。
已证实冷冻干燥产物在周围环境条件之下至少可稳定存储几个月。通过水中重构所产生的微泡弥散物可稳定保存至少8小时，至于在注射前干燥的产物重构，也可保证相当的柔性。
在目前超声成像设备的最小检测水平上，这些优选报道物的高效使得可利用比通常更小的小泡而仍然很好地产生超声造影作用。较小的小泡具有潜在的优点如减少血管阻塞，循环时间更长，接近靶的能力更大，及在肺脏或其它非靶器官积累更低，并且它们的利用和包含它们的活性剂共同构成本发明另外的特性。
也可利用这些更小的小泡来开发小泡簇增强超声造影作用的效应。理论上知道，在总体积为V的稀释分散液中，特定小泡数量的超声造影效应会随着小泡聚集形成一个更大的气相(总体积相同仍为V)而增加。因此，可利用直到它们聚集才显示超声造影效应的小泡(由于非导向点的靶分子密度低，所以聚集作用优先发生在靶区域)。小泡也可用于熔合，例如通过与靶相互作用而引起的小泡间的结合，以增强在靶区域中造影效应。如果报道物(其还具有在特异性位点引起逗留的载体)具有能与其它小泡的官能团发生反应的未反应的连接物的部分，则可引起小泡间交联和随之的群聚集。
在本发明的上下文中，报道物单位通常仍然附在载体上。然而，在一类导向方法中(有时称为″前导向″)，单独施用载体(通常为单克隆抗体)；其后施用偶连了能特异结合前导向载体分子的组分的报道物(若前导向载体是抗体，则报道物偶连免疫球蛋白结合分子，如蛋白质A或抗免疫球蛋白抗体)。本方案的优点是有时间消除不结合靶的载体分子，充分减少在过量报道物-载体缀合物的情况下相关的背景问题。在本发明的上下文中，涉及具有一个特异性载体的前导向作用，随后是偶连了另一个载体和组分(该成分结合第一个载体上)的报道物单位。
在本发明的上下文中，例如在导向区域(如心肌)血液灌流速率的估价中，按要求测量速率，从此结合靶的造影剂被取代或释放。该过程可通过施用具有从靶处取代或释放造影剂能力的另外的载体和/或其它物质，以这种可控制的方式进行。
按照本发明能被利用的超声波图象形式包括两维和三维的图象技术如B-方式图象(例如利用信号膜的时间-变化振幅，该振幅产生于喷射脉冲的基频，产生于其子谐函数或高谐函数或产生于所喷射的脉冲和这些谐函数的总数或它们的不同频率，优选由基频或其第二个谐函数产生的图象)，彩色Doppler图象和Doppler的振幅图象，及后两者与上述任何形式相结合的图象。按照本发明，由导向单层-稳定化的微球体惊人地获得极佳的第二个谐函数信号。为减少运动的影响，借助于合适的同步技术(例如使接受者处于ECG或呼吸运动)，收集了组织(如心脏或肾)的连续的图象。测量共振频率或频率吸收(其可锁住或阻碍微泡)方面的变化利于造影剂的检测。
本发明提供了与载体-介导的产物对所需位点的定向作用相结合的治疗性药物的传送工具。″治疗性″或″药物″表示一种对活人或非人动物特定疾病有益的药剂。虽然在例如WO-A-9428873和WO-A-9507072中已提出了将超声造影剂和药物组合，但这些产品缺乏与位点具特异亲和性的载体，因此在药物释放前或释放期间，在所需位点的特异性保持相对较弱。
按照本发明所利用的治疗化合物可在微泡内部被包裹，或附着在或掺入到稳定化膜上。这样，治疗化合物可通过例如共价或离子键与膜部分连接，或在体内混合到稳定化材料中(尤其如果药物与膜材料的极性或溶解性类似时)则可阻止它在体内作用之前渗漏产物。在施用后，仅仅通过与血液的湿接触就可启动药物的释放，或在其它内部或外部影响下(例如通过酶或利用超声波催化的分解方法)启动药物的释放。在超声造影剂方面，利用外部超声波使气体包含的微颗粒破裂是众所周知的现象(如WO-A-9325241中所描述的)；药物释放速率的变化取决治疗应用的类型，及通过转换器所利用的超声波能量的具体量。
利用合适的连接剂(如本文所描述的)可将治疗剂共价连接在包裹的膜表面。例如，如上所述，可首先制备磷脂或脂肽的衍生物(药物通过可被生物降解的共价键或连接物结合在这些衍生物上)，然后将这些衍生物掺入到制备报道物的材料中。
适于本发明的药物传送组合物的典型治疗剂包括任何已知治疗药物或其活性类似物(含有巯基，其在氧化条件下连接在含巯基的微泡上从而形成二硫化物基团)。与一个载体或多个载体相结合的这些药物/载体-修饰的微泡可在靶组织上积累；施用还原剂(如谷胱甘肽还原剂)可使在靶细胞附近的导向的微泡释放药物分子，增加药物的局部浓度，并增强它的治疗效应。此外，也可在没有治疗药物的情况下先制备该组合物，然后在使用前将治疗药物连接到或涂在微泡上；这样，例如，治疗药物可加至含水介质的微泡的悬液中，并振荡使治疗药物附着或粘附在微泡上。
其它的给药系统包括与导向载体相结合的载体-修饰的带有脂肽结构(包括聚-L-赖氨酸或聚-D-赖氨酸链)的磷脂膜。在应用于受体-介导的给药方法特别重要的应用于基因治疗/反义技术中时，微泡载体通过与阳离子聚赖氨酸的静电作用浓缩在DNA及RNA上。本方法具有用于导向传送的一种或多种载体不直接连接在聚赖氨酸载体组分上的优点。因为脂质链的存在，聚赖氨酸链更牢固地锚定在微泡膜上。利用超声波增加输送的效应非常明显。
此外，游离的聚赖氨酸链首先由药物或载体分子修饰，然后缩合在导向微泡的阴性表面上。
按照本发明的有用的药物的代表性例子(不限于这些例子)包括抗肿瘤剂如长春新碱，长春花碱，长春碱酰胺，白消安，苯丁酸氮芥，螺旋铂氨，顺式铂氨，炭铂氨，氨甲蝶呤，阿霉素，丝裂霉素，博来霉素，阿糖胞苷，阿糖腺嘌呤，巯基嘌呤，米托坦，甲苄肼，更生霉素(放线菌素D)，道诺红菌素，阿霉素盐酸盐，红豆杉醇，邹霉菌素，氨鲁米特，雌莫司汀，氟他胺，亮丙瑞林，乙酸孕甾酮，三苯氧胺，睾内酯，腈环氧雄烷，安吖啶(M-AMSA)，天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶)，依托泊苷，干扰素a-2a和2b，血液产品如血卟啉或前面的衍生物；生物效应修饰剂如胞壁酰肽；杀真菌剂诸如酮康唑，制霉菌素，灰黄霉素，氟胞嘧啶，双氯苯咪唑或两性霉素B；激素或激素类似物如生长激素，促黑激素，雌二醇，二丙酸倍氯米松，倍他米松，可的松乙酸盐，地塞米松，9-去氟肤轻松，氢化可的松，甲基强的松龙，对氟米松乙酸盐，强的松龙，强的松，氟羟脱氢皮质醇或9-氟皮质醇乙酸盐；维生素如氰钴胺素或树脂样素；酶如碱性磷酸酶或锰超氧物歧化酶；抗过敏剂如amelexanox；组织抑制因子如单克隆抗体与其Fab片段，合成肽，后调节组织因子表达的非肽及化合物；血小板抑制剂如GPIa，GPIb和GPIIb-IIIa，ADP受体，凝血酶受体，遗传性假血因子，前列腺素，阿斯匹林，噻氯匹定，clopigogrel以及reopro；凝聚蛋白质靶抑制剂诸如FIIa，FVa，FVIIa，FVIIIA，FIXa，FXa，组织因子，肝素，水蛭素，hirulog，argatroban，DEGR-rFVIIa及膜联蛋白V血纤蛋白形成抑制剂和纤维蛋白溶解增强剂如T-PA，尿激酶，纤溶酶，链激酶，rt-纤溶酶原激活物以及r-葡萄球菌激酶；抗血管生成因子如甲羟孕酮，戊聚糖多聚硫酸酯，苏拉明，红豆杉醇，镇静剂，制管张素，干扰素-α，金属蛋白酶抑制剂，血小板因子4，促生长素抑制素，血小板反应蛋白；循环药物如普萘洛尔；代谢潜在剂如谷胱甘肽；抗癌物如P-对氨基水杨酸，异烟肼，卷曲霉素硫酸盐，环外壁外层，乙胺丁醇，乙硫异烟胺，吡嗪酰胺，利福平或链霉素硫酸盐；抗病毒如无环鸟苷，金刚胺，叠氮胸苷，病毒唑或腺嘌呤阿糖苷；血管扩大剂如硫氮酮，硝苯吡啶，异搏定，赤藓醇四硝酸酯，异山梨醇乙二醇二硝酸酯，硝化甘油或季戊四醇四硝酸酯；抗菌素如达普宋，氯霉素，新坶素，氯氨苄头孢菌素，羟氨苄头孢菌素，先锋霉素IV号，头孢环己烯，红霉素，氯林肯霉素，林可霉素，羟氨苄青霉素，氨苄青霉素，氨苄青霉素碳酯，羧苄青霉素，双氯青霉素，环青霉素，吡氯苯唑西林，缩酮氨苄青霉素，2，6-二甲氧基苯青霉素，萘夫西林素，青霉素，多粘菌素或四环素；消炎药如二氟苯水杨酸，异丁苯丙酸，吲哚美辛，甲氯芬那盐，甲灭酸，萘普生，苯基保泰松，吡氧噻嗪，四苯酰吡咯乙酸，阿斯匹林或水杨酸盐；抗原生动物剂如氯喹，灭滴灵，奎宁或葡甲胺锑酸盐；治风湿药如青霉胺；麻醉剂如樟脑鸦片酊；鸦片剂如可待因，吗啡或鸦片；强心苷如脱乙酰基毛花洋地黄甙C(强心药)，毛地黄毒苷，地高辛，毛地黄苷或毛地黄；神经肌肉阻滞剂如阿曲库铵甲磺酸盐，三乙可碘化拉加明，己芴溴铵，碘二甲箭毒，泮库溴铵，琥珀酰胆硷氯化物，氯化管箭毒碱或维库溴铵；镇静剂如异戊巴比妥，异戊巴比妥钠，阿颇巴比妥钠，布他巴比妥钠，水合氯醛，乙氯基戊烯炔醇，烃己蚁胺，氟西泮盐酸盐，苯乙哌啶酮，甲氧异丙嗪盐酸盐，美赛卜朗，咪达唑仑盐酸盐，仲醛，戊巴比妥，西可巴比妥钠，仲丁烯丙巴比妥，羟基安定或三唑仑；局部麻醉剂如布比卡因，氯普鲁卡因，依替卡因，利度卡因盐酸盐，卡波卡因，普鲁卡因或四卡因；一般的麻醉剂如氟哌利多，甲苄咪酯，具有氟哌利多的芬太尼柠檬酸盐，氯胺酮盐酸盐，美索比妥钠钠或硫喷妥盐及药学上可接受的盐(例如酸性盐(如盐酸盐或氢溴酸盐)或碱盐如(钠盐，钙盐或镁盐))或其衍生物(例如醋酸盐)。其它治疗剂的例子包括遗传物质如核酸，RNA，及天然或合成的DNA(包括重组体RNA和DNA)。DNA编码的一定蛋白质可用于治疗许多不同类型疾病的。例如，肿瘤坏死因子或白介素-2基因可用于治疗早期癌；胸苷激酶基因可用于治疗卵巢癌或人脑瘤；白介素-2基因可用于治疗神经细胞瘤，噁性黑素瘤或肾癌；白介素-4基因可用于治疗癌。
通过疏水作用与微泡膜相连接的药物的亲脂衍生物，其作为微泡的一部分或从微泡释放之后(例如通过超声波使之释放)可产生治疗效应。若药物不具有所需物理性质，则可插入亲脂基使药物锚定在膜上。插入亲脂基的优选方式是其不影响分子的体内潜能或释放活性药物时亲脂基被切除。可用各种化学手段插入亲脂基，其中所用方法取决于药物分子中可供使用的官能团。利用药物分子中官能团(其能与适当的官能化亲脂化合物进行反应)可产生共价偶联。亲脂部分的例子包括分支和无支链的烷基链，环化合物，芳香族残余物，和稠合芳香族和非芳香族的环系统。一些实例中，亲脂组分由合适的官能化类固醇组成，如胆固醇或相关化合物。特别适于衍生物的官能团的例子包括亲核基团如氨基，羟基和硫氢基。适于任何药物的亲脂衍生物(其含有硫氢基)，如甲巯丙脯酸方法包括直接烷基化(如在碱性条件下的烷基卤代)与硫羟酸酯作用(其通过与活化的羧酸反应而产生)。任何具有羧基官能团(例如氨酰心安或苯丁酸氮芥)药物衍生物的代表例子包括通过分别与胺类和醇(它们具有合适的物理性能)连接而形成的酰胺和酯。优选的具体例包括胆固醇通过形成可降解的酯键而附着在治疗化合物上的方法。
本发明的优选应用涉及血管生成，其是通过现有血管分支而形成新血管的。本过程主要刺激可以是组织中细胞营养不足及供氧不充分(缺氧)。细胞所作出的反应是分泌血管生成因子，其中有许多因子；一个例子是内皮生长因子。这些因子起始蛋白水解酶(这些蛋白水解酶水解基底膜的蛋白质)及抑制因子(限制这些有害酶的作用)的分泌。连接失败和血管生成因子受体的信号的共同影响是引起内皮细胞移动，成倍增加，和重新排列，并最后在新脉管周围合成基底膜。
当瘤达到毫米大小时，为保持生长速率，瘤必须开始血管生成。由于血管生成伴随内皮细胞和其环境的特征变化，因此该过程是治疗干涉的一个有用的靶。伴随血管生成的转变对诊断也十分有用，优选例子为噁性疾病，但在发炎和各种炎症有关的疾病中该概念也很有用。这些因子涉及心肌梗塞部分的血管再形成，狭窄区在短时间内释放时其才能发生。
一些与血管生成相关的已知受体/靶见下表。利用本文的导向原则，在使用中通过大多数药物中的图象药征可检测血管生成。增强造影的超声波能具有另外的优点，其造影介质是被限定在血管内部的一种小球。即使发现许多细胞类型有靶抗原，该小球状也独自连接在内皮细胞上。
根据本发明所谓的药物前体也可用于活性剂中。这样，可使药物发生衍生化作用，以改变它们的理化性质，并且适于进入报道物；称这些药物为药物前体，它们通常在切割衍生化基团后重新生成活性药物形式时才有活性。
通过对病理学区域导向充气微泡(其含有药物前体激活酶)，可以获得导向酶的图像，使微泡适当地导向到病理学域并且同时从非靶域消失可视化成为可能。按本方法，可确定将药物前体注射给个体患者的最佳时间。
另一个可替方案是在系统中相同的微泡中掺合药物前体，药物前体-激活酶和载体，其中药物前体仅在一些外部刺激之后才被活化。这些刺激可能是，例如，上述的肿瘤特异性蛋白酶或通过外部超声波使微泡破裂(在所需导向后)。
按照本发明，可使治疗药物容易地传送到病变或坏死的区域，例如心脏，一般的脉管，及肝，脾，肾以及其它区域如淋巴系统，体腔或肠胃系统。
按照本发明的产品可在体内或体外送递导向治疗药物。在下文中，产品可用于体外系统，如不同的疾病的诊断试剂盒或在血液或组织样品中不同的组分鉴定的试剂盒。在体外，本发明利用与那些用于连接某些血液组分或细胞粘附聚合物微粒(例如单分散磁性的微粒)相类似的技术将它们从样品中分离出来，其利用在本发明的活性剂中报道物单位的低密度并通过浮选法和再次洗涤而分离包含气体的材料。
通过共价或非共价手段可使报道物单位偶连在所需载体(和/或治疗药物)上，通常包括与一个或多个位于报道物和/或载体和/或任何插入的连接基团/间隔元件上的官能团的相互作用。为达到本目的所采用的化学反应官能团的例子包括氨基，羟基，硫氢基，羧基，和羰基，以及糖基，邻位二醇基，硫醚基，2-氨基醇基，2-氨基硫基，胍基，咪唑基和酚基。
因此利用连接剂(包含能与这些官能团反应的组分)可产生报道物和载体之间的共价连接。可与硫氢基反应的反应性部分的例子包括X-CH2CO-(其中X＝Br，Cl或I)类型的α-卤代乙酰基化合物，它们对硫氢基具有特殊的反应性，但其也可用来修饰咪唑基，硫醚基，酚基及氨基(如Gurd，F.R.N酶学方法(1967)11，532所述)。对于硫氢基，也考虑选择N-马来酰亚胺的衍生物，但其在一定的条件之下在连接氨基上也有用。如Kitagawa，T.等在化学药物信息(1981)29，1130中所述，N-马来酰亚胺可掺入到使报道物与载体缀合的连接系统中，或如Kovacic，P.等美国化学学会(1959)81，1887所描述的可用作稳定化小泡的聚合物交连剂。如Traut，R.等在生物化学(1973)12，3266所描述的，反应剂如2-亚氨基硫醇盐(其可通过转化氨基而引入硫醇基)在通过形成二硫键进行连接时可作为硫基反应剂。由于可通过在载体与报道物间的二硫化物交换来进行连接，因此这些引入反应性二硫化物键至载体或报道物的反应剂是很有用的，这些反应剂的例子包括Ellman试剂(DTNB)，4，4’-二硫化物基团二吡啶，甲基-3-N-2-吡啶基二硫化物(见Kimura，T.等(1982)122，271)。
能与氨基反应的反应性组分的例子包括烷化和酰化试剂。代表性烷化试剂包括i)α-卤代乙酰基化合物，其在缺少反应性巯基的情况下对氨基具有特异性，其类型为X-CH2CO-(其中X＝Br，Cl或I)，如Wong，Y-H.H.生物化学(1979)24，5337所描述的；ii)N-马来酰亚胺衍生物，其可通过加入环羰基进行Michael类型反应或酰化作用而与氨基反应(如Smyth，D.G.等美国化学学会杂志(1960)82，4600和生物化学杂志(1964)91，589所描述的；iii)芳基卤化物，如反应性硝基芳香卤化物；iv)烷基卤化物，如McKenzie，J.A.等在蛋白化学杂志(1988)7，581中所描述的；v)能与氨基形成希夫碱的醛和酮，所形成的加成产物通常通过还原反应而被稳定化从而形成稳定的胺；Vi)环氧化物衍生物，如表氯醇和bisoxiranes，其能与氨基，硫氢或酚羟基进行反应；vii)含氯的S-三嗪衍生物，其极易与亲核试剂(如氨基，硫基及羟基)反应；viii)基于上述详述的S-三嗪化合物的氮丙啶，例如Ross，W.C.癌研究进展(1954)2，1所描述的，其通过开环与亲核试剂如氨基进行反应；ix)方形酸二乙酯，如Tietze，L.F.Chem.Ber.(1991)124，1215中所述；以及X)α-卤烷基醚，其与通常的烷基卤化物相比是更具反应性的烷化剂(由于醚氧原子所造成的活化)，例如Benneche，T.等药物化学杂志(1993)28，463所描述的。
与氨基反应的酰化剂的代表包括i)异氰酸盐和异硫氰酸盐，特别是芳香族衍生物，其分别形成稳定的脲及硫脲衍生物，并已用于蛋白质交联，如Schick，A.F.等生物化学杂志(1961)236，2477所述；ii)磺酰基氯化物，其可将荧光报道物基团导入至连接物中，已由Herzig，D.J.等生物聚合物(1964)2，349描述；iii)酸性卤化物；iv)活性酯，如硝基苯酯或N-羟基琥珀酰酯；v)酸性酸酐，如混合的，对称的或N-羧基酸酐；VI)其它形成酰胺键有用的试剂，如Bodansky，M.等肽合成原理(1984)Springer-Verlag所述；vii)酰基叠氮化物，例如其中叠氮化物基是通过利用亚硝酸钠由预先形成的酰肼衍生物产生的，例如Wetz，K.等分析生物化学(1974)58，347所述；viii)连接在聚合物上的吖内酯(如双丙烯酰胺)，例如Rasmussen，J.K.反应聚合物(1991)16，199中所述；以及ix)亚氨基酯，其与氨基反应形成稳定的脒，例如Hunter，M.J.和Ludwig，M.L.美国化学学会杂志(1962)84，3491中所述。
羰基(如醛官能团)在一定pH下可与弱蛋白质碱进行反应，这样亲核蛋白质侧链官能团被质子化。弱碱包括1，2-氨基硫醇，如位于N-末端半胱氨酸残余物中的那些，它们与醛基选择地形成稳定的5员噻唑烷环，如Ratner，S.等美国化学学会杂志(1937)59，200中所述。也可利用其他的弱碱基如苯基腙，见Heitzman，H.等美国国家科学院院报(1974)71，3537。
醛和酮也可以与苯胺类反应形成希夫碱，该碱可以通过还原氨基化而被有利地稳定化。烷氧氨基部分易与酮和醛类进行反应而产生稳定的烷氧基胺，如Webb，R.等在生物轭合物化学(1990)1，96中所述。
能与羧基反应的反应部分的例子包括重氮化合物(如重氮基乙酸乙酯和重氮基乙酰胺)，它们具有高特异性产生酯基的反应力，例如Herriot R.等在蛋白化学进展(1947)3，169中所描述的。也可采用羧酸修饰的试剂如碳化二亚胺，其通过形成O-酰基脲接着形成酰胺键而进行反应；连接反应可通过添加胺促进或导致直接的载体-受体偶联。有用的水溶性碳化二亚胺包括1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺(CMC)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)，例如Zot，H.G.和Puett，D.在生物化学杂志(1989)264，15552中所描述的。其他有用的羧酸修饰试剂包括异噁唑鎓衍生物如Woodwards试剂K；氯仿盐，如p-X硝基苯氯仿盐；羰二咪唑，如1，1′-羰二咪唑；和N-烷氧羰基二氢喹啉，如N-(乙氧羰基)-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉。
其它有用的反应部分包括邻二酮如P-亚苯基二乙二醛(其可用来与胍基反应，如Wagner等在核酸研究(1978)5，4065中所描述的)；以及重氮盐(其可进行亲电子取代反应，如Ishizaka，K.和Ishizaka T.在免疫学杂志(1960)85，163中所描述的。在酸性溶液中，通过用亚硝酸钠处理芳基二胺易于制备双重氮化合物。将报道物和/或载体中的官能团(如果需要)在反应前转化成其它官能团(例如为了赋与另外的反应性或选择性)是有利的。对于该目的有用的方法的例子包括利用试剂(如二羧酸酸酐)将胺类转变成羧酸；利用试剂(如N-乙酰高半胱氨酸硫酮，S-乙酰氢硫基琥珀酸酸酐，2-亚氨基thiolane或含巯基的琥珀酰基衍生物)将胺转变成硫醇；利用试剂(如α-卤代醋酸盐)将硫醇转变成羧酸；利用试剂(如乙胺或2-溴乙胺)将硫醇转变成胺类；利用试剂(如碳化二亚胺接着利用二胺)将羧酸转变成胺类；利用试剂(如甲苯磺酰氯化物接着用硫代乙酸盐进行转酯并用乙酸钠其使水解成巯基)将醇转变成硫醇基。
酶作为无长度的连接剂可使载体与报道物相连接；这样，例如，转葡糖苷酶，过氧化物酶以及黄嘌呤氧化酶可用来连接产物。通过形成酰胺键，反向蛋白酶解也可用于连接。
例如，通过多赖氨酰官能团化的报道物和多谷氨酰基官能团化的载体之间的静电相互作用，或通过以稳定金属复合物形式的螯合作用或通过高亲和性的结合作用(如抗生物素蛋白/生物素结合)可形成载体报道物的非共价连接。通过电荷相互作用，非共价涂布在带负电荷膜表面的聚赖氨酸也增加微泡对细胞的非特异性亲和性。
此外，可将载体连接在已知结合磷脂的蛋白质上。在许多实例中，磷脂单一分子可连接在蛋白质(如移位酶)上，而其它蛋白质可连接在主要由磷脂头基组成的表面上，这样这些蛋白质可用于载体连接到磷脂小球上；这样的蛋白质的一个例子是β2-糖蛋白I(Chonn，A.Semple，S.C.和Cullis，P.R.，生物化学杂志(1995)270，25845-25849)。已描述了磷脂酰丝氨酸结合蛋白，如Igarashi，K.等生物化学杂志270(49)29075-29078；因此可利用具有这样的磷脂酰丝氨酸结合蛋白的载体轭合物将载体连接至包裹的微泡上。若已知结合蛋白的氨基酸序列，则可合成或分离磷脂结合部分，并且用于与载体缀合，这样避免了位于分子其它地方的生物活性。
通过对微球体结合分子的分子文库进行直接筛选，获得特异性结合到小球表面(或″膜″)上的分子也是可能的。例如，显示小肽的噬菌体文库可用于这样的选择。将小球和噬菌体显示文库简单混合，并且洗脱结合在飘浮小球上的噬菌体，从而进行选择。若需要，可在″生理条件″下(例如在血液中)进行选择，以除去与血液组分交叉反应的肽。这种类型的选择方法的优点是仅仅选择了不发生小球去稳定作用的结合分子(由于仅仅连接了完整飘浮小球的结合分子将升至顶端)。也可在选择过程期间加入某种″力″(例如压力)以确保不选择去稳定作用的结合部分。此外可在剪切条件下进行选择，例如首先让噬菌体与小球进行反应，然后在流动的条件下让小球经过涂布了抗噬菌体抗体的表面。用该方法选择出可以抵抗体内剪切条件的结合体是可能的。将本方法所鉴别的结合部分可连接(通过化学缀合方法或肽合成方法，或在DNA-水平上的载体分子重组)到载体上，以构成用以使任何载体分子连接到小球上的通用工具。
包含或偶连了肽，脂-寡糖或脂肽连接物(其含有能居中插入膜的元件)的载体也可以使用。Leenhouts，J.M.等Febs Letters(1995)370(3)，189-192描述了一个实例。对某些应用，也可利用由已知膜插入锚/信号所组成的非生物活性分子作为载体，其例子为Na，k-ATP酶，α-亚单位的H1疏水节段(Xie，Y.和Morimoto，T.生物化学杂志(1995)270(20)，11985-11991所描述的)。锚基团也可以是脂肪酸或胆固酸。
利用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白也可产生连接，这些物质具有四个与生物素高亲和性的结合位点。如果载体和报道物两者均被生物素酰化，则可利用抗生物素蛋白使载体缀合在报道物上。例子参见Bayer，E.A.和Wilchek，M.生物化学分析方法(1980)26，1。这一方法也可扩展至包括报道物与报道物的连接，该方法可增强小泡之间的联系，并随之增加潜在的回波性。此外，抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白可直接连接在报道物微型颗粒的表面。
利用双特异性免疫球蛋白的双官能团性质可形成非共价偶联。这些分子可特异地结合两个抗原，而连接它们。例如，可利用双特异的IgG或化学合成的双特异F2(ab)′2片段作为连接剂。已报道了异双官能团的双特异性的抗体可连接两个不同的抗原，例如Bode，C.等生物化学杂志(1989)264，944和Staerz，U.D等美国国家科学院院报(1986)83，1453中所描述的。同样，任何包含两个或多个抗原决定簇的报道物和/或载体(例如Chen，Aa等美国病理学杂志(1988)130，216所描述的)可通过抗体分子交叉连接，并形成交连的且具有增加的回波性的多泡集合体。
按照本发明所利用的连接剂一般来说以某种程度的特异性引起报道物与载体或报道物与报道物的连接，并且也用于一个或多个治疗活性剂的连接。
一些实例中，认为在相同的分子中包括PEG组分使之作为缀合(其为与一个载体或多个载体或直接与报道物的缀合)中的稳定物很有利，其中PEG不充当间隔子。
如果需要，按照本发明可利用所谓无长度的连接剂(其可直接使两个反应化学基形成共价连接而无须介入另外的连接物如在酰胺键形成时利用碳化二亚胺或酶)作为引起报道物与载体非共价连接的试剂(如生物素/抗生物素蛋白系统)和引起疏水或静电作用的试剂。
然而，最常见的是连接剂包括由间隔元件连接的两个或多个反应部分(如上述)。间隔子的存在可使双官能团的接头在分子内或两个不同分子之间与特异性官能团进行反应，在这两个组分之间形成键，并在报道物与载体的缀合物中引入外部的接头来源的物质。在连接剂中的反应部分可相同(同双官能团试剂)或不同(异双官能团试剂或几个不同的反应部分的存在的试剂，异多官能团剂)，这样提供了试剂的多样性，可使任何化学物种之间(分子内或分子间)形成共价结合。
由连接剂引入的外部物质的性质对终产物的导向能力与总稳定性具有重要意义。这要求引入不稳定的连接物，如其包含间隔臂(其可被生物降解或化学性质敏感或其掺入了酶促切割位点)。此外该间隔子可包含聚合组分，例如充当表面活性剂并增强小泡稳定性。该间隔子也可含有反应性部分，例如象上述增强表面交联作用的部分，或它含有示踪元件，如荧光探针，旋转标记或放射性材料。
由于易于将造影元件诸如X光造影剂，光造影探针，旋转标签或放射性单位掺入到或连接在报道物单位上，因此按照本发明的造影剂在所有造影药剂中均有用。
间隔元件典型地由脂肪族链构成，这些链可有效地隔离连接物中的反应部分，其间距为5和30。它们也可包括大分子结构如PEG，这些结构在生物技术和生物药物应用中引起人们的重视(参见例如MiltonHarris，J.编″聚(乙二醇)化学生物技术和生物药物应用″Plenum出版社(1992)。PEG在大多数溶剂中(包括水中)可溶，并且在含水的环境中每个乙二醇片段与两个或三个水分子结合而高度水化；这可阻止在PEG-修饰表面的其它聚合物或蛋白质的吸附。已知PEG无毒不会损害活性蛋白质或细胞，而共价连接的PEG为非免疫原性和非抗原性的。此外，PEG易于修饰和结合其它分子而对他们化学性质只有小的影响。由PEG和其共聚物，包括嵌段共聚物如PEG-聚氨基甲酸乙酯和PEG-聚丙烯的许多用途可明显看到它们有利的溶解性和生物性质。
按照本发明所利用的PEG间隔子的合适分子量为，例如，120道尔顿和20千道尔顿之间。
网状内皮系统(RES)的细胞摄取微粒的主要机理是血液中的血浆蛋白质的调理作用；这些标记外源微粒，然后其被RES吸收。按照本发明所利用的PEG间隔元件的生物性质可以用于以一种与PEGylate脂所观察到的相似方式增加造影剂循环时间(参见如Klibanov，A.L.等FEBSletters(1990)268，235-237和Blume，G.和Cevc，G.生物化学生物物理学学报(1990)1029，91-97)。利用结合在PEG间隔末端的抗体可增加兴趣区域的连接效力(参见例如Maruyama，K.等生物化学生物物理学学报(1995)1234，74-80和Hansen，C.B.等生物化学生物物理学学报(1995)1239，133-144)。
在一些例子中，认为包括PEG组分使之作为缀合(其为与一个载体或多个载体或直接与报道物的缀合)中的稳定物是很有利的，其中PEG不充当间隔子。
其它间隔元件的代表包括结构型多糖类，如聚半乳糖醛酸，糖胺聚糖，肝素，纤维素及海洋多糖类如藻酸盐，脱乙酰壳多糖和角叉菜胶；储存型多糖类如淀粉，糖原，葡聚糖以及氨基葡聚糖；多聚氨基酸和其甲基和乙基酯(在赖氨酸，谷氨酸以及天冬氨酸的均聚物和共聚物中)；和多肽，低聚糖和低核苷酸，它们可含或不合酶切割位点。
一般来说，间隔元件含有可切除的基团如，邻二醇，偶氮，砜，酯，硫酯或二硫键基团。包含下式的可生物降解的亚甲基二酯或二酰胺(如下式所示)的间隔元件也可使用-(Z)m.Y.X.C(R1R2).X.Y.(Z)n-[其中X和Z选自-O-，-S-，和-NR-(其中R是氢或有机基团)；各Y是羰基，硫羰基，砜基，磷酰基或类似的酸形成基团m和n各自是0或1；R1和R2都是氢，有机基团或-X.Y.(Z)m-基，或一起形成二价的有机基]；如在WO-A-9217436中所讨论的，这样的基团在酯酶的存在下易于被生物降解，例如在体内，但在缺少这些酶的情况下保持稳定。因此可将它们与治疗剂连接而使其慢慢释放。
由于聚(N-(2-羟乙基)异丁烯酰胺与细胞和组织相互作用的程度低，因此其可作为有用的间隔材料(参见例如Volfova，I.Rihova，B.和V.R.和Vetvicka，P.生物作用复合聚合物(1992)7，175-190)。对主要由密切相关的2-羟丙基衍生物所组成的类似聚合物的研究表明，其被单核吞噬细胞系统变成细胞内含物至相当低的程度(参见Goddard，P.Williamson，I.，Bron，J.，Hutchkinson，L.E.，Nicholls，J.和Petrak，K.生物作用复合聚合物(1991)6，424.)。
其它潜在有用的聚合间隔物质包括i)异丁烯酸甲酯与甲基丙烯酸的共聚物；其具腐蚀性(参见Lee，P.I.药理学研究(1993)10，980)，且该羧化物取代基与天然聚合物相比造成更高的溶胀度；ii)具有可被生物降解的聚酯的聚甲基丙烯酸酯的嵌段共聚物(参见例如San Roman，J.和Guillen-Garcia，P.生物材料(1991)12，236241 Biomaterials中)；iii)氰基丙烯酸盐，如2-氰基丙烯酸酯的聚合物，这些可被生物降解，并且以小颗粒的形式用于选择性药物传送(参见Forestier，F.，Gerrier，P.，Chaumard，C.，Quero，A.M.，Couvreur，P.和Labarre，C.抗菌化学治疗杂志(1992)30，173-179)；iv)聚乙烯醇，其为水溶性，并且一般认为是生物相容的(参见例如Langer，R.调控释放杂志(1991)16，53-60)；v)马来酐与乙烯基甲基醚的共聚物，已有人指出其具有生物腐蚀性(参见Finne，U.，Hannus，M.和Urtti，药理学杂志(1992)78.237-241)；
VI)聚乙烯吡咯烷酮(例如用分子量不到约25,000的)，其可经肾迅速过滤(参见Hespe，W.，Meier，A.M.和Blankwater，Y.M.Arzeim.-Forsch.药物研究(1977)27，1158 1162)；vii)短-链脂肪族羟基酸的聚合物和共聚物，如乙醇酸，乳酸，丁酸，颉草酸及己酸(参见例如Carli，F.Chim.Ind.(米兰)(1993)75，494-9)，包括掺合芳香族羟基酸以增加它们降解速率的共聚物(参见Imasaki，K.，Yoshida，M.，Fukuzaki，H.，Asano，M.，Kumakura，M.，Mashimo，T.，Yamanaka，H.和Nagai.T.药理学杂志(1992)81，3138)；viii)由乙二醇和对苯二甲酸单位交替组成的聚酯，例如DacronR，其不能被降解但具高度生物相容性；ix)包括脂肪族羟基酸聚合物的可被生物降解片断的嵌段共聚物(参见例如Younes，H.，Nataf，P.R.，Cohn，D.，Appelbaum，Y.J.，PizoV，G.和Uretzky，G.生物材料人造细胞人造器官(1988)16，705-719)，例如在与聚氨基甲酸乙酯的结合中(参见Kobayashi，H.，Hyon，S.H.和Ikada，Y.“水溶和可被生物降解的聚合物前体″-生物药物材料研究(1991)25，1481 1494)；x)聚氨基甲酸乙酯，已知其在移植中具有很好的耐受性，并且其能与柔性的“软″片段相结合，例如包括聚(四亚甲基乙二醇)，聚(丙二醇)或聚(乙二醇)和芳香族″硬″片段，例如包括4，4-亚甲基二(亚苯基异氰酸盐)(参见例如Ratner，B.D.，Johnston，A.B.合Lenk，T.J。生物药物材料研究应用药物材料(1987)21，59-90；Sa Da Costa，V.等细胞界面科学杂志(1981)80，445-452和Affrossman，S.等临床材料(1991)8，2531；xi)聚(1，4-二氧六环-2-酮类)，由于其可水解性的酯键，可认为是可被生物降解的酯(参见例如Song，C.X.，Cui，X.M.和Schindler，A.Med.Biol.Eng.Comput.(1993)31，S147-150)，并且这些包含增强它们的吸收性的乙交酯单位(参见Bezwada，R.S.，Shalaby，S.W.和Newman，H.D.J.农业的和合成的聚合物生物降解力和利用(1990)(Glass，J.E.和Swift，G.编辑)，167-174-ACS专题研讨系列，#433，华盛顿D.C.，美国-美国化学学会；xii)聚酐，如具有双(4-羧基-苯氧基)丙烷的癸二酸(辛二酸)共聚物，在兔研究(参见Brem，H.，Kader，A.，Epstein，J.I.，Tamargo，R.J.，Domb，A.，Langer，R.和Leong，K.W.癌治疗研讨会(1989)5，55-65)和大鼠研究(参见Tamargo，R.J.，Epstein，J.I.，Reinhard，C.S.，Chasin，M.和Brem，H.生物药物杂志(1989)23，253 266)中已阐明该共聚物在脑中可用于药物的控释且没有明显毒性作用；xiii)包含邻-酯基的可被生物降解的聚合物，其可在体内控制药物释放(参见Maa，Y.F.和Heller，J.控制药物释放(1990)14，21-28)；以及xiv)聚膦嗪，其为交互的磷和氮原子所组成的无机聚合物(参见Crommen，J.H.，Vandorpe，J.和Schacht，E.H.控制药物释放(1993)24，167-180)下表列出了可进行蛋白修饰(其可用于制备按照本发明的可导向的试剂)的连接剂。异双官能团连接剂<
备注(1)＝可可碘化的；(2)＝荧光剂同双官能团连接剂
生物素酰化剂<
>备注DPPE＝二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺；LC＝长链蛋白修饰剂
其它有用的蛋白质修饰作用包括通过神经氨酸酶，内糖苷酶或高碘酸的部分或完全的去糖苷化作用(由于去糖苷化经常导致肝，脾，巨噬细胞等等摄取得更少，而蛋白质的新-糖基化经常导致肝与巨噬细胞的摄取增加)；及通过解蛋白切割的截短化作用(其可导致大小减少及在循环中的半衰期更短)；以及阳离子化，参见例如Kumagi等生物化学杂志(1987)262，15214-15219；Triguero等美国国家科学院院报(1989)86，4761-4765；Pardridge等药理学治疗杂志(1989)251，821-826和Pardridge和Boado，Febs Lett.(1991)288，30-32。
按照本发明可用于可导向的试剂的载体包括下列
i)抗体，其可用作为许多靶的载体，并且具有有利性质，如十分高的特异性，高亲和性(如果需要)，按照需要还可具有修饰亲和性等等。抗体是否具生物活性取决于特定的载体/靶的结合。可使用常规和基因工程抗体，后者使得可以通过工程使抗体符合特殊需要，例如就亲和性和特异性而言。人抗体的利用对避免抗载体分子的可能的免疫反应可能是优选的。另一类有用的抗体包括所谓的二-和多-特异性抗体，即如在一个抗体分子中具有对两个或多个不同抗原的特异性的抗体。这些抗体可以例如促进小泡簇的形成，并且也可以用于各种治疗目的，例如向靶携带有毒部分。双特异性抗体的各方面见McGuinness，B.T.国家生物技术(1996)14，1149-1154；George，A.J.等免疫学杂志(1994)152，1802-1811；Bonardi等癌研究(1993)53，3015-3021；和French，R.R..等癌研究(1991)51，2353-2361。
ii)细胞粘着分子，它们的受体，细胞因子，生长因子，肽激素及其片段。这些载体依赖于与靶分子受体的正常生物蛋白质-蛋白质相互作用，因此在许多情况下在靶结合上时产生生物效应，并且是生物活性的；这对载体(其导向蛋白多糖)相对而言没有意义。
iii)细胞粘着分子，细胞因子，生长因子和肽激素的非肽兴奋剂/拮抗剂或非生物活性的受体粘合剂。该类别可以包括这些非生物活性载体，它们既非兴奋剂也非拮抗剂，但是具有有价值的导向能力。
iv)通过Watson-Crick或其它碱基-配对类型与DNA或RNA结合的低核苷酸和修饰的低核苷酸。由于细胞破坏的结果是DNA通常仅在细胞外空间存在，那么这样的低核苷酸(其通常是非生物活性的)在例如向坏死区域的导向中可以是有用的，所说的区域与许多不同的病理状态有关。低核苷酸也可与特异性DNA-或RNA-结合蛋白相结合，例如转录因子(其经常在肿瘤细胞或活化免疫细胞或活化内皮细胞中得以高度超量表达)。混合文库可以用来选择这些特异性结合到任何可能靶分子上的低核苷酸，因此其可用作为导向的载体。
v)DNA-结合药物可以与低核苷酸表现相同，但是其若被细胞摄取则具有生物活性/或毒副作用。
Vi)蛋白酶底物/抑制剂。许多病理状态牵涉到蛋白酶。许多酶解物/抑制剂是非肽物质，但至少在抑制剂的情况下经常具生物活性。
Vii)通过功能性选择与待造影的区域/结构相结合的分子(在体外，来自体内或在体内)，则无须了解确切的分子靶即可由混合文库产生载体分子。
viii)各种小分子，包括已知结合到各种生物受体上的生物活性化合物。这些载体或它们的靶可以用于与相同的靶结合产生非生物活性的化合物。
ix)结合氨基葡糖聚糖侧链(如乙酰肝素硫酸盐)，包括大分子的氨基葡糖聚糖-结合部分的蛋白质或肽，其与氨基葡糖醛酮聚糖结合不导致生物效应。在红细胞上没有发现蛋白多糖，该细胞除去不需要的在这些细胞上的吸附。
如下列出了有利于导向超声造影的其它肽载体和其脂肽动脉硬化噬斑的结合肽如YRALVDTLK，YAKFRETLEDTRDRMY和RALVDTEFKVKQEAGAK；血栓结合蛋白如NDGDFEEIPEEYLQ和GPRG，血小板结合蛋白如PLYKKIIKKLLES；缩胆囊素，促α-黑素细胞激素，热稳定肠毒素1，血管活性肠肽，以及来源于第三重链互补决定区的合成α-M2肽和其用于肿瘤导向的类似物。
根据包含这些载体的本发明，下表列出了各种可以导向到特殊类型的靶的载体，并且描述了用于可导向的诊断和/或治疗剂的区域。
蛋白质和肽载体-抗体
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包含细胞因子/生长因子/肽激素和其片段的载体
各种蛋白质和肽载体
包含细胞因子/生长因子/肽激素/细胞粘着分子受体的非肽兴奋剂/拮抗剂或非生物活性接头的载体
包含抗血管生成因子的载体
包含血管生成因子的载体
<p>不同于所识别的血管生成因子(已知其对血管生成有关的受体具有亲和性)的载体分子
与血管生成有关的受体/靶
低核苷酸载体
修饰的低核苷酸载体
>核苷和核苷酸载体
包含DNA-结合药物的受体
包含蛋白酶底物的受体
包含蛋白酶抑制剂的受体
来自混合文库的载体
碳水化合物载体
糖)脂载体
小分子载体
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实施例1聚-L-赖氨酸-涂布的磷脂酰丝氨酸-包裹的微泡与内皮细胞粘着作用将聚-L-赖氨酸(8mg)(其分子量为115 kDa)溶解在水中(400μ1)。在室温下，将(40μl)新近再分散的磷脂酰丝氨酸-包裹的全氟丁烷的微泡在水中或聚-L-赖氨酸溶液(400μl)中温育15分钟。Zeta潜在测量方法确认聚-L-赖氨酸-涂布的微泡带正电，而未涂布的小泡带负电。利用培养皿中所培育的人内皮层细胞并用以上描述的微泡进行细胞粘着性研究，未涂布的微泡作为对照。温育后内皮细胞的显微镜检查表明更多数量的聚-L-赖氨酸-涂布的微泡与内皮细胞相结合(与未涂布的微泡相比)。
实施例2-包含磷脂酰丝氨酸和RGDC-Mal-PEG3400-DSPF的充气微泡
a)Boc-NH-PEG3400-DSPE(t-丁基氨基甲酸酯聚(乙二醇)二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺)的合成，添加DSPE(二硬脂磷脂酰乙醇胺)(31mg，Sygena Inc.)至Boc-NH-PEG3400-SC((t-T基氨基甲酸酯聚(乙二醇)琥珀酰基氨基甲酸酯)(150mg)的氯仿(2ml)溶液中，接着加入三乙胺(33μl)。41℃搅拌10分钟，混合物形成清晰的溶液。旋转蒸发溶剂并用乙腈(5ml)萃取残余物。冷却所获得的分散物至4℃并离心，随后将溶液与不溶物分离，并且蒸发至干。由核磁共振确认所形成产物的结构。
b)H2N-PEG3400-DSPE(氨基聚(乙二醇)二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺)的合成在室温下，将Boc-NH-PEG3400-DSPE(167mg)在二噁烷(5ml)和4M盐酸中搅拌2.5小时。通过旋转蒸发除去溶剂，并用三氯甲烷(1.5ml)萃取残余物，并用水(2×1.5ml)洗涤。旋转蒸发除去有机相。TLC(氯仿/甲醇/水∶13∶5∶0.8)产生Rf＝0.6的标题产物；由核磁共振确认该产物的结构(其是阳性的茚三酮)。
c)Mal-PEG3400-DSPE(3-马来酰亚胺丙酸盐聚(乙二醇)二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺)的合成将四氢呋喃(0.2ml)中的N-琥珀酰基-3-马来酰亚胺丙酸盐聚(5.6mg，0.018mmol)的溶液添加至H2N-PEG3400-DSPE(65mg，0.012mmol)中(其溶解在四氢呋喃(1ml)和0.1M磷酸钠缓冲液pH7.5(2ml)中)。加热反应混合物至30℃，接着对反应物进行TCL，随后蒸发溶剂。
d)RGDC-Mal-PEG3400-DSPE的合成将溶于0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.5)中的Mal-PEG3400-DSPE(0.010mmol)添加至肽RGDC(0.010mmol)中。如果必要加热反应混合物至37℃，接着对反应物进行TCL，随后蒸发溶剂。
e)磷脂酰丝氨酸包裹的充气微泡和RGDC-Mal-PEG3400-DSEE的制备往磷脂酰丝氨酸(90-99.9摩尔％)和Mal-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％)的混合物(5mg)中加入溶于水中的5％丙烯二醇-甘油(1ml)。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。接着将分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后将样品放在转板上。离心后，浮游物质以0.1M最适pH7.5的磷酸钠缓冲液进行交换。将肽RGDC(其溶解在0.1M最适pH7.5的磷酸钠缓冲液中)加入经洗涤的微泡上，然后将微泡置于转板上。再次洗涤操作。
f)磷脂酰丝氨酸包裹的充气微泡和RGDC-Mal-PEG3400-DSEE的另一制备方法往磷脂酰丝氨酸(5mg)中加入溶于水中的5％丙烯二醇-甘油(1ml)。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。接着将分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后将样品放在转板上。离心后，浮游物质以0.1M最适pH7.5的磷酸钠缓冲液进行交换。将RGDC-Mal-PEG3400(其溶解在0.1M最适pH7.5的磷酸钠缓冲液中)加入经洗涤的微泡上，然后将微泡置于转板上。在RGDC-Mal-PEG3400掺入到微泡膜内后，再次洗涤操作。
实施例3-磷脂酰丝氨酸，磷脂酰胆碱和生物素-氨基己酸盐-PEG3400-Ala-胆固醇包裹的充气微泡a)Z-Ala-胆固醇(3-O-(-丙氨酰)胆固醇)的合成将胆固醇(4mmol)，Z-丙氨酸(5mmol)和二甲基氨基吡啶(4mmol)溶解在二甲基甲酰胺/四氢呋喃中(20ml＋5ml)，并加入二环已基碳化二亚胺。在环境温度下，搅拌反应混合物过夜。过滤掉二环己基脲，旋转蒸发溶剂。用三氯甲烷溶解残余物，过滤掉不溶解的二环己脲，旋转蒸发除去溶剂。残余物置于二氧化硅胶柱上，以甲苯石油醚洗脱Z-Ala-胆固醇(20∶2)，接着用甲苯乙醚洗脱(20∶2)。含有标题化合物的组分被结合住，并且旋转蒸发除去溶剂。核磁共振确认产物的结构。
b)Ala-胆固醇(3-0-L-丙氨酰)-胆固醇的合成将胆固醇(0.48mmol)置于四氢呋喃(20ml)和冰乙酸(3ml)中，并在5％钯存在的情况下在炭上氢化2小时。过滤反应混合物，并在真空中浓缩。
c)Boc-NH-PEG3400-Ala-胆固醇的合成将Ala-胆固醇加至氯仿中的Boc-NH-PEG3400-SC(t-丁基氨基甲酸酯聚(乙二醇)琥珀酰基氨基甲酸酯)溶液中，接着加入三乙胺。41℃下搅拌悬浮液10分钟。层析法纯化粗制品。
d)H2N-PEG3400-Ala-胆固醇的合成在环境温度下，将Boc-NH-PEG3400-Ala-胆固醇置于二噁烷中的4M盐酸中搅拌2.5小时。旋转蒸发除去溶剂，用三氯甲烷溶解残余物，并且以水洗涤。旋转蒸发有机相至干。层析纯化粗制品。
e)生物素氨基己酸盐-PEG3400-Ala-胆固醇的合成将四氢呋喃中的N-羟基琥珀酰亚胺酯加入至生物素氨基己酸盐-PEG3400-Ala-胆固醇(其溶于四氢呋喃及0.1M最适pH7.5的磷酸钠缓冲液(2ml)中)溶液中。加热反应混合物至30℃，接着对反应物进行TCL，随后蒸发溶剂。
f)磷脂酰丝氨酸，磷脂酰胆碱和生物素氨基己酸盐-PEG3400-Ala-胆固醇包裹的充气微泡的制备往磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱(总量为90-99.9摩尔％)和生物素氨基己酸盐-PEG3400-Ala-胆固醇(10-0.1mol％)的混合物(5mg)中加入溶于水中的5％丙二醇-甘油(1ml)。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。接着将分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后将样品放在转板上。离心后，浮游物质以0.1M最适pH7.5的磷酸钠缓冲液进行交换，并再次洗涤。
g)磷脂酰丝氨酸，磷脂酰胆碱和生物素氨基己酸盐-PEG3400-Ala-胆固醇包裹的充气微泡的另一制备方法往磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱的混合物(5mg)中加入溶于水中的5％丙二醇-甘油(1ml)。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。接着将分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后将样品放在转板上。离心后，浮游物质用水进行交换。将溶于水中的生物素氨基己酸盐-PEG3400-Ala-胆固醇加入到经洗涤的微泡上，几小时后将微泡置于转板上。在生物素氨基己酸盐-PEG3400-Ala-胆固醇掺入到微泡膜内后，再次洗涤操作。
实施例4-包含磷脂酰丝氨酸，磷脂酰胆碱和生物素酰氨基己酸盐-PEG3400-Ala-胆固醇和药物胆固醇的充气微泡a)药物-胆固醇的合成将(4mmol)胆固醇(其是具有酸基团的药物)和(4mmol)二甲基氨基吡啶溶解在二甲基甲酰胺/四氢呋喃(20ml＋5ml)中，并加入二环已基碳化二亚胺。在环境温度下反应混合物搅拌过夜。过滤掉二环己基脲，旋转蒸发溶剂。层析纯化标题化合物。
b)磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、生物素氨基己酸盐-PEG3400-Ala-胆固醇和药物胆固醇包裹的充气微泡的制备往磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱(总量为90-99.9摩尔％)和生物素酰氨基己酸盐-PEG3400-Ala-胆固醇(如实施例3制备)和药物-胆固醇(总量为10-0.1mol％)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。接着将分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后将样品放在转板上。离心后，浮游物质以水进行交换，并再次洗涤。
实施例5-磷脂酰丝氨酸和硫醇化-抗-CD34-Mal-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡a)硫醇化-抗-CD34抗体的制备如Hansen.C.B.等(1995)生物化学生物物理学学报1239，133-134中所描述的，可使抗-CD34抗体硫醇化。
b)磷脂酰丝氨酸和硫醇化-抗-CD34-Mal-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡的制备往磷脂酰丝氨酸(90-99.9摩尔％)和Mal-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％，如实施例2制备)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。接着将分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后将样品放在转板上。离心后，浮游物质用适当的缓冲液进行交换，并且硫醇化的抗体与微泡进行偶联，例如，Goundalkar，A.，Ghose，T.和Mezei，M.在药物药理学杂志(1984)36 465-66中所描述的或Hansen，C.B.等(1995)生物化学生物物理学学报1239 133-134。然后将微泡置于转板上几个小时，并洗涤。对所产生的微泡进行流动细胞计数分析(使用荧光标记的第二抗体)以确认抗-CD34抗体与小泡的连接情况。利用一定数量表达CD34的细胞和另一些不表达CD34的细胞，通过显微观察来研究小泡与表达CD34的细胞的特异结合能力。
实施例6-与充气微泡相连接的生物素生物素可通过许多不同的方法与微泡连接，例如通过Corley，P.和Loughrey，H.C.(1994)生物化学生物物理学学报1195，149-156中所描述的类似方法。通过流动细胞计数法分析所形成的小泡，例如利用荧光的链霉抗生物素蛋白来检测生物素与小泡的连接情况。此外可利用放射性或酶-标记的链霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白来分析生物素的连接情况。
实施例7-以二硬脂酰磷脂酰丝氨酸和生物素-DPPE包裹的充气微泡添加溶于水中的4％丙二醇-甘油(4ml)至二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(22.6mg)(DSPS)内。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。加入4％丙二醇-甘油中的生物素-DPPE(1.5mg)的含水分散物(1ml)，并将样品放在转板上1-2小时。将悬液(0.8ml)装进小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。小瓶振荡45秒，随后将样品放在转板上。离心7分钟后，浮游物质用水进行交换，并再次洗涤两次。利用蒸发光散射检测器，正相HPLC表明微泡的膜含有4摩尔％生物素-DPPE。通过Coulter计数器测量，微泡的平均粒径是4μm。采用3.5MHz宽带变送器的超声波透射测量法，表明小于2mg/ml的微粒分散物给出大于5dB/cm的声束衰减作用。
实施例8-以二硬脂酰磷脂酰丝氨酸和生物素酰化的抗体(其与链霉抗生物素蛋白-Succ-PEG3400-DSPE非共价结合)包裹的充气微泡a)Succ-PEG3400-DSPE的合成利用琥珀酐使NH2-PEG3400-DSPE(如同实施例2中所制备的)羧化，例如利用Nayar，R.和Schroit，A.J.在生物化学(1985)24，5967-71中所描述的类似方法。
b)二硬脂酰磷脂酰丝氨酸和Succ-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡的制备往磷脂酰丝氨酸(90-99.9摩尔％)和Succ-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。接着将分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后将样品放在转板上。离心后，浮游物质以水进行交换，并再次洗涤。此外，也可按照实施例2(f)制备微泡。
C)链霉抗生物素蛋白与经二硬脂酰磷脂酰丝氨酸和Succ-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡的偶联利用水溶性碳二亚胺，通过标准连接方法将链霉抗生物素蛋白与微泡膜上的Succ-PEG3400-DSPE共价结合。在反应期间将样品置于转板上。离心后，浮游物质用水进行交换，并再次洗涤。通过与某些标记物的结合情况可分析所连接的链霉抗生物素蛋白的官能度，例如荧光标记的生物素，生物素酰化抗体(用荧光标记的第二抗体来检测)或生物素酰化和荧光或放射性标记的低核苷酸。通过荧光显微观察或闪烁计数进行分析。
d)二硬脂酰磷脂酰丝氨酸和生物素(其与链霉抗生物素蛋白-Succ-PEG3400-DSPE非共价结合)包裹的充气微泡的制备在含有生物素酰化载体(例如生物素酰化抗体)的溶液中温育实施例8(c)中的微泡。将涂上一层载体的微泡按照上述方法洗涤。
实施例9-以二硬脂酰磷脂酰丝氨酸和生物素酰化的低核苷酸(其与链霉抗生物素蛋白-Succ-PEG3400-DSPE非共价结合)包裹的充气微泡a)Succ-PEG3400-DSPE的合成利用琥珀酐使NH2-PEG3400-DSPE(如同实施例2中所制备的)羧化，例如利用Nayar，R.和Schroit，A.J.在生物化学(1985)24，5967-71中所描述的类似方法。
b)二硬脂酰磷脂酰丝氨酸和Succ-PEG3400-DSPE包裹充气微泡的制备往磷脂酰丝氨酸(90-99.9摩尔％)和Succ-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。接着将分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后将样品放在转板上。离心后，浮游物质以水进行交换，并再次洗涤。此外，也可按照实施例2(f)制备微泡。
C)链霉抗生物素蛋白与经二硬脂酰磷脂酰丝氨酸和Succ-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡的偶联利用水溶性碳二亚胺，通过标准连接方法可将链霉抗生物素蛋白与微泡膜上的Succ-PEG3400-DSPE共价结合。在反应期间将样品置于转板上。离心后，浮游物质用水进行交换，并再次洗涤。通过与某些标记物的结合情况可分析所连接的链霉抗生物素蛋白的官能度，例如荧光标记的生物素，生物素酰化(用荧光标记的二抗来检测)或生物素酰化和荧光或放射性标记的低核苷酸。通过荧光显微观察或闪烁计数进行分析。
d)二硬脂酰磷脂酰丝氨酸和生物素化的低核苷酸(其与链霉抗生物素蛋白-Succ-PEG3400-DSPE非共价结合)包裹的充气微泡的制备在含有生物素酰化低核苷酸的溶液中温育实施例9(c)中的微泡。将涂布低核苷酸的微泡按照上述方法洗涤。例如，利用荧光标记的与小泡相连接的低核苷酸或通过所连接低核苷酸与被标记(荧光或放射性)的互补低核苷酸进行杂交，来检测低核苷酸与小泡的结合情况。例如，通过小泡与被稳定化的含有与所连接低核苷酸互补的DNA序列的结合情况来分析携带低核苷酸的微泡的官能度。例如，可利用与核糖体DNA(其中每单倍体基因组有多个拷贝)互补的低核苷酸和与癌基因(例如大鼠的癌基因每个单倍体基因组有一个拷贝)互补的低核苷酸。
实施例10-磷脂酰和叶酸-PEG3400-Succ-DSPE包裹的充气微泡a)叶酸-PEG3400-Succ-DSPE的制备按照Lee.R.J.和Low.P.S.在生物化学生物物理学学报(1995)1233，134-144中所描述的方法，合成叶酸-PEG3400-Succ-DSPE。
b)二硬脂酰磷脂酰丝氨酸和叶酸-PEG3400-Succ-DSPE包裹的充气微泡的制备往磷脂酰丝氨酸(90-99.9摩尔％)和叶酸-PEG3400-Succ-DSPE(10-0.1mol％)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。接着将分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后将样品放在转板上。离心后，浮游物质以水进行交换，并再次洗涤。此外，也可按照实施例2(e)或2(f)制备微泡。例如，通过显微观察研究含有叶酸微泡与表达不同水平叶酸受体的细胞的结合情况，可分析叶酸的连接情况。
实施例11-经磷脂酰丝氨酸和硫醇化-抗-CD34-Mal-PEG3400-DSPE和硫醇化-抗-ICAM-1-Mal-PEG3400-DSPE和硫醇化-抗-E-选择蛋白-Mal-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡a)硫醇化-抗-CD34抗体的制备按照Hansen，C.B.等在生物化学生物物理学学报(1995)1239，133-144所描述的方法，可产生硫醇化-抗-CD34抗体。
b)硫醇化-抗-ICAM-1抗体的制备按照Hansen，C.B.等在生物化学生物物理学学报(1995)1239，133-144所描述的方法，可产生硫醇化-抗-ICAM-1抗体。
c)硫醇化-抗-E-选择蛋白抗体的制备按照Hansen，C.B.等在生物化学生物物理学学报(1995)1239，
133-144所描述的方法，可产生硫醇化-抗-E-选择蛋白抗体。
d)经磷脂酰丝氨酸和硫醇化-抗-CD34-Mal-PEG3400-DSPE和硫醇化-抗-ICAM-1-Mal-PEG3400-DSPE和硫醇化-抗-E-选择蛋白-Mal-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡的制备往磷脂酰丝氨酸(90-99.9摩尔％)和Mal-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％，如实施例2制备)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。接着将分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后将样品放在转板上。离心后，浮游物质用适当的缓冲液进行交换，并且将来自实施例11(a)，11(b)，和11(c)中的抗体与微泡进行偶联，例如，按照Goundalkar，A.，Ghose，T.和Mezei，M.在药物药理学杂志(1984)36 465-66中所描述的或Hansen，C.B.等(1995)生物化学生物物理学学报1239 133-134中所述的方法。然后将微泡置于转板上几个小时，并洗涤。
实施例12-与经磷脂酰丝氨酸包裹的充气微泡相连接的肽FNFRLKAGOKIRFGAAAWEPPRARI合成含有磷脂酰丝氨酸-结合和肝素-结合片段的肽FNFRLKAGQKIRFGAAAWEPPRARI。添加肽至磷脂酰丝氨酸包裹的全氟丁烷微泡中，并充分混合。
实施例13-与经磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺包裹的充气微泡共价连接的纤连蛋白a)微泡的制备称取DSPS(25mg)和DSPE(5.0mg)置于清洁小瓶内，并加入5ml1.4％丙烯醇/2.4％甘油溶液。加热混合物至80℃5分钟，然后冷却样品至室温，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，并用蒸馏水洗涤微泡两次，然后悬浮在0.1M硼酸钠盐缓冲液(pH9)中。
b)纤连蛋白的修饰将5ml0.01MpH8 Hepes缓冲液中的纤连蛋白(1.0mg)加入到0.1mmol交联剂SDBP中。混合物在冰上培育2小时。
c)微泡修饰。
往(b)中的蛋白溶液中加入(a)微泡悬液，并在室温下，转板上温育2小时。通过使微泡飘浮而除去未反应的材料，然后用0.1MpH9硼酸钠盐缓冲液替换原有溶液。重复该过程三次。
d)体外分析。
体外分析测定微泡详见实施例21。观察到细胞上渐渐积累了被结合的微泡。
实施例14-经磷脂酰丝氨酸和3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)甲氨酰胆固醇包裹的充气微泡a)3β-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)甲氨酰胆固醇(DC-chol)的合成(Farhood.H.Gao.X.Barsoum.J和Huancr.L.分析生物化学225.89-93(1995))在室温下，往溶于二氯甲烷中的2-二甲基氨基乙胺(19.4mg，24∶1，0.22mmol)和三乙胺(310μl，2.23mmol)经搅拌的溶液(3ml)中慢慢地加入0.22mmol溶于1，4-二噁烷中的胆固醇氯甲酸乙酯(100mg)的溶液。当反应完全，蒸发混合物至于，用闪烁层析法(CHCl3/MeOH，4∶1)纯化残余物。获得一种白色固体，得到105mg(95％)。用核磁共振和MALDI检验结构。
b)微泡分散物的制备通过称取DSPS(4.5mg)和(DC-chol)(0.5mg)到2ml小瓶内，从90％磷脂酰丝氨酸和10％(DC-chol)的混合物制备含有全氟丁烷的单层包裹的微泡。添加0.8ml丙二醇/甘油(4％)水溶液。80℃加热混合物5分钟并振荡。然后冷却溶液至室温，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中以4450摆/分钟振荡小瓶45秒，并置于转板上。样品在2000rpm下离心洗涤5分钟。用注射器除去浮游物质，并加入蒸馏水至相同的量。再一次以全氟丁烷冲洗液面上空间，并且将样品继续置于转板上直到出现均相。重复一次洗涤过程实施例15-磷脂酰丝氨酸和WEPPRARI-PE包裹的充气微泡在1∶1的二噁烷和0.02MpH8.0HEPES缓冲液的混合物中，将磷脂酰乙醇胺(PE)与等摩尔量的交联剂N-羟基琥珀酰亚胺酰-2，3-二溴丙酸盐进行反应。冰上培育2小时后，加入等摩尔量的结合肝素的肽WEPPRARI，通过加入0.2M四硼酸二钠盐使pH增至9，并在室温下继续温育2小时。用层析仪纯化反应产物。从80-95％磷脂酰丝氨酸和5-20％肽取代PE的混合物制备含有全氟丁烷的单层包裹的微泡。
实施例16-磷脂酰丝氨酸和灭活的人类凝血酶-Succ-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡a)人凝血酶的灭活在37℃下将人凝血酶置于溶于0.05MpH8.0HEPES缓冲液中的20％摩尔过量的D-Phe-L-Pro-L-Arg-氯甲基酮中温育30分钟而使其灭活。
b)磷脂酰丝氨酸和Succ-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡的制备往磷脂酰丝氨酸(90-99.9摩尔％)和Succ-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％，如实施例9所制备的)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。接着将分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后将样品放在转板上。离心后，浮游物质以水进行交换，并再次洗涤。此外，也可按照实施例2(f)制备微泡。
c)经磷脂酰丝氨酸和灭活的人类凝血酶-Succ-PEG3400-DSPE包裹的充气微泡利用水溶性的碳二亚胺标准连接方法，使人类灭活凝血酶与实施例16(b)中的微泡上的Succ-PEG3400-DSPE共价结合。反应期间将样品放置在转板上。离心后，浮游物质以水进行交换，并再次洗涤。
实施例17-具有氨甲蝶呤和激活药物前体的酶的充气微泡a)通过肽接头与充气微泡结合的氨甲蝶呤一些文献充分描述了用于使氨基酸与抗癌药物氨甲蝶呤(MTX)相连接的方法(参见如Huennekens，F.M.(1994)，TIBTECH 12，234-239和本文的参考)。利用相同的技术，可使肽代替单个氨基酸与MTX连接。该肽由可与微泡表面的MTX相连接的接头构成。一类该接头包括通式结构(MTX)-F-K/R-X-R-Z-C的肽，其中X是任意氨基酸，Z是疏水氨基酸。该接头的特定例子是(MTX)-F-K-L-R-L-C。利用标准技术(如实施例2)，可利用Cys-残余物中的SH-基使MTX-肽与微泡(例如由磷脂酰丝氨酸和Mal-PEG3400-DSPE组成)连接。期望该种类的接头由酶如组织蛋白酶B切开，其中组织蛋白酶B经常在肿瘤细胞的外部和表面选择性得以过量表达(Panchal，R.G.等(1996)，Nat.生物技术14，852-856)。这样，在肿瘤中将选择地释放潜在的前药(MTX)-F-K/R-X-R。通过羧肽酶(其可内源性地存在于肿瘤中，或如通过肿瘤-相关抗体被导向到肿瘤)，该前药可进一步被激活成活性药物MTX(参见下文)。
b)与充气微泡表面共价连接的激活前药的酶激活前药的酶的例子是羧肽酶(CPA)，例如通过利用3400Da两端都含有N-羟基琥珀酸胺基的聚(乙二醇)链，可使羧肽酶与经磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺混合物包裹的微泡的表面相连接(Perron，M.J.和Page，M.Br.癌杂志73，281-287)；其中所说的微泡可用标准方法制备。含有CPA的微泡可通过在含有CPA微泡中掺入合适的导向载体导向到病理学区域。此外，例如通过上述方法，也可将CPA直接与载体(例如抗体)连接。在后一个例子中，可使CPA-载体的连接物与微泡表面相结合，见Hansen，C.B.等(1995)生物化学生物物理学学报1239133-134。Huennekens，F.M.(1994)TIBTECH 12，234-239描述了许多可作为前药-酶对的例子。
实施例18-经磷脂酰丝氨酸和硫醇化-抗-CEA-Mal-PEG3400-DSPE和抗癌前药3′，5′-0-二棕榈酰-5-氟代-2′-脱氧尿苷包裹的充气微泡a)硫醇化-抗-CEA-抗体的制备按照Hansen，C.B.等在生物化学生物物理学学报(1995)1239，133-144所描述的方法，产生硫醇化-抗-CEA-抗体。
b)经磷脂酰丝氨酸和硫醇化-抗-CEA-Mal-PEG3400-DSPE和抗癌前药3′，5′-O-二棕榈酰-5-氟代-2′-脱氧尿苷包裹的充气微泡的制备往磷脂酰丝氨酸(90-99.9摩尔％)，Mal-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％，如实施例2制备)以及抗癌前药3′，5′-O-二棕榈酰-5-氟代-2′-脱氧尿苷(Mori，A.等(1995)癌化学疗法药理学35，447-456)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。接着将分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后将样品放在转板上。离心后，浮游物质用适当的缓冲液进行交换，并使抗体与微泡进行偶联，例如，Goundalkar，A.，Ghose，T.和Mezei，M.在药物药理学杂志(1984)36 465-66中所描述的或Hansen，C.B.等(1995)生物化学生物物理学学报1239 133-134所描述的方法。然后将微泡置于转板上几个小时，并洗涤。
实施例19-经磷脂酰丝氨酸和硫醇化-抗-CEA-Mal-PEG3400-DSPE和抗癌前药N-三氟乙酰-阿霉素-14-缬草酸盐包裹的充气微泡a)硫醇化-抗-CEA-抗体的制备按照Hansen，C.B.等在生物化学生物物理学学报(1995)1239，133-144所描述的方法，产生硫醇化-抗-CEA-抗体。
b)经磷脂酰丝氨酸和硫醇化-抗-CEA-Mal-PEG3400-DSPE和抗癌前药N-三氟乙酰-阿霉素-14-缬草酸盐包裹的充气微泡的制备往磷脂酰丝氨酸(90-99.9摩尔％)，Mal-PEG3400-DSPE(10-0.1mol％，如实施例2制备)以及抗癌前药N-三氟乙酰-阿霉素-14-缬草酸盐(Mori，A.等(1993)药理学研究10，507-514)的混合物(5mg)中加入溶于水的5％丙二醇-甘油(1ml)。加热分散物至不超过80℃5分钟，然后冷却至环境温度。接着将分散物(0.8ml)移至小瓶(1ml)内，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后将样品放在转板上。离心后，浮游物质用适当的缓冲液进行交换，并使抗体与微泡进行偶联，例如，Goundalkar，A.，Ghose，T.和Mezei，M.在药物药理学杂志(1984)36 465-66中所描述的或Hansen，C.B.等(1995)生物化学生物物理学学报1239 133-134。然后将微泡置于转板上几个小时，并洗涤。
实施例20-使用方法冷冻干燥0.01MpH7.4磷酸缓冲液可得到含有磷脂酰丝氨酸-包裹微泡的活性剂，其中微泡的包裹膜掺入进了灭活的人类凝血酶-Succ-PEG3400-DSPE。将产物再次分散在无菌水中，并且静脉内注射进怀疑有静脉血栓症的患者的腿静脉内。用标准超声波技术检查腿。与周围组织相比，通过增强作用的造影剂使血栓定位。
实施例21-掺入了含有肝素硫酸盐结合肽(KRKR)和纤连蛋白肽(WOPPRARI)的脂肽的DSPS的充气微泡的制备以及生物评估该实施例针对导向微泡，该微泡含有以线型顺序排列的多肽载体。
a)含有肝素硫酸盐结合肽(KRKR)的脂肽和纤连蛋白肽(WOPPRARI)的脂肽的合成
利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上从Fmoc-Ile-Wang树脂开始以0.1mmol的规模合成脂肽。在连接之前利用HBTU预活化所有氨基酸与棕榈酸。置于TFA(其含有％5苯酚，5％EDT，5％茴香醚和5％水)中2小时可从树脂上同时移走肽和侧-链保护基，并得到150mg粗品。以9ml/分钟的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制备性HPLC纯化(超过40分钟)小份40mg的粗物质。冷冻干燥后，获得16mg纯化的物质(分析性HPLC，梯度70-100％B其中B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水检测--UV260和荧光，Ex280，Em350--产物保留时间＝19.44分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物期望预期值M＋H为2198，实测值2199。
b)具有含有肝素硫酸盐结合肽(KRKR)和纤连蛋白肽(WOPPRARI)的多特异性脂肽的DSPS的充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg)和(a)中的脂肽(0.5mg)并分别置于两个小瓶内，每一个小瓶内加入0.8ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃(加热期间振荡小瓶)。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。加帽混合器振荡小瓶45秒，转动过夜。用去离子水洗涤所形成的微泡，并用Coulter计数器[大小1-3微米(87％)，3-5微米(11.5％)]和声学衰减作用(最大衰减作用频率3.5MHz)进行分析。在120mmHg时微泡处于稳定状态。MALDI质谱分析可确认掺入进DSPS微泡的脂肽，如下约将0.05-0.1ml微泡悬液转移到清洁小瓶内，并添加0.05-0.1ml甲醇。对悬液超声处理30秒，并用MALDI MS分析溶液。正电方式给出M＋H为2200(脂肽预期值值为2198)。
c)具有含有肝素硫酸盐结合肽(KRKR)和纤连蛋白肽(WOPPRARI)的多特异性脂肽的DSPS的充气微泡的体外研究在流动条件下与内皮细胞结合在260mlNunc培养瓶中用1640RPMI培养基培养来源于正常脐带的人内皮细胞系ECV304(ATCC CRL-1988)，其中培养基添加了L-谷氨酰胺(200mM)，青霉素/链霉素(10,000 U/ml和10,000μg/ml)和10％胎牛血清。细胞以1∶5至1∶7分流比再次培养直至达到汇合。灭菌直径为22mm的涂布-玻璃，并放置在12孔培养平板的底部，随后将0.5ml含有血清的完全培养基中的细胞铺在平板上。当细胞达到汇合时，将盖玻片放置在习用由玻璃平板上所雕刻的沟组成的流腔室上，其中在玻璃平板上放置具有细胞的盖玻片，并且细胞面对沟以形成流通道。在37℃，利用蠕动泵使(b)中所制备的微泡从贮液槽穿过流腔室并返回至贮液槽中。调整流量以便模拟生理相关剪切速率。流腔室放置在显微镜下，直接观察微泡和细胞之间的相互作用。安装在显微镜上面的照相机与颜色视频打印机和探测器连接。微泡以一定的速率(其依赖于流量)在细胞上逐渐积累。若进一步增加流量，细胞开始从盖玻片上脱离，但是仍然与微泡结合。不携带载体的对照小泡不粘附在内皮细胞上，在最小限度流量条件下就从腔室中消失。
d)狗体内实验例1)用戊巴比妥麻醉一只22kg的杂种狗，并给其机械地通风。通过中线胸骨切开术打开胸腔，移走前心包膜，并在心脏和ATL HDI-3000超声波扫描器的P5-3转导物之间插入30mm胶化的聚二氧化硅氧橡胶间隔元件。放置扫描器是为了在每次结束-心缩期，通过所延迟的EGC触发形成间歇的短轴图象。静脉内大丸剂的迅速注射净量为2ml的(b)中的微泡；3秒钟后，看见形成图象的右心室含有造影材料，隔3秒后，左心室也被装满造影材料，观察到瞬时衰减作用阴影(其使左心室的后部分看得不清楚)。在心肌层中可看到明亮度得到实质性的增加；并且当衰减作用阴影平息时，心脏远侧部分中的左心室也可观察到这一增强作用。在最初所注射的试剂排出后，用超声波扫描器进行连续，高读框速率，高输出力的成象作用(已知其为一种在图象组织区域中破坏超声造影剂微泡的方法)。几秒后，调整扫描器到初始状态。然后心肌变暗，并靠近基值。移动图象片段至新位置再次出现造影作用；移动片段至初始位置再一次形成靠近基线的组织明亮度。
例2)[比较]利用上述相同的方法，注射按照上述(b)相同方式所制备的净量为2ml的微泡(但其在制备中不包括任何脂肽)。心肌回声增强作用远无例1中所观察的强烈且更短。在左心室衰减作用完成时，几乎心肌造影作用完全消失，且没有观察到例1中所提到的左心室后部分心肌回声增强现象。
实施例22-DSPS(其含有硫醇化-抗-CD34-Mal-PEG3400-PE)包裹的充气微泡的制备a)DSPS和PE-PEG3400-Mal包裹的充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg，3.9mmol)和实施例50中的PE-PEG3400-Mal(0.5mg)并分别置于两个清洁小瓶内，每一个小瓶内加入1ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃(加热期间振荡小瓶)，然后用4.5微米的滤器过滤。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，并用去离子水洗涤所形成的微泡三次。
b)抗-CD34抗体的硫醇化往溶解了0.3mg抗-CD34抗体的0.5mlpH7磷酸缓冲盐溶液(PBS)中添加0.3mgTraut试剂，并在室温下搅拌溶液1小时。从NAP-5柱上的修饰蛋白质分离出过量的试剂。
c)硫醇化-抗-CD34抗体与DSPS(其包含DSPE-PEG2000-MAL)包裹充气微泡的缀合添加0.5ml(b)所制备的硫醇化抗体至(a)中微泡的等分试样中，并使缀合反应在转板上进行30分钟。2000rpm下离心5分钟，接着除去浮游物质。以水进一步洗涤微泡三次。
d)用FITC-缀合的第二抗体检测包裹在微泡内的抗体添加0.025mlFITC-缀合的山羊-抗-小鼠抗体至(c)中微泡的悬液中，室温下将混合物置于转板上暗处温育30分钟。2000rpm下离心5分钟，接着除去浮游物质。以水进一步洗涤微泡三次。微泡悬液的流动细胞计数分析表明98％具荧光性。
实施例23-含有硫醇化-抗-CD62-MAL-PEG2000-PE的DSPS包裹的充气微泡的制备利用与实施例22中所描述的相同的方法制备含有抗-CD62抗体的微泡。
实施例24-含有硫醇化-抗-ICAM-1-MAL-PEG2000-PE的DSPS包裹的充气微泡的制备利用与实施例22中描述的相同的方法制备含有抗-ICAM-1抗体的微泡。
实施例25-经DSPS和硫醇化-抗-CD62-Mal-PEG2000-PE和硫醇化-抗-ICAM-1-Mal-PEG2000-PE包裹的充气微泡的制备本例子旨在制备用于导向超声造影的多抗体载体的微泡。
a)DSPS和PE-PEG2000-Mal包裹微泡的制备称取DSPS(4.5mg)和实施例2(a)中的PE-PEG2000-Mal(0.5mg)并分别置于清洁小瓶内，每一个小瓶内加入1ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃，然后用4.5微米的滤器过滤。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。加帽混合器振荡小瓶45秒，并用蒸馏水洗涤所形成的微泡三次。
b)抗-CD62和抗-ICAM-L抗体的硫醇化往溶解了0.3mg抗-CD62抗体和0.3mg抗-ICAM-L抗体的PBS磷酸缓冲盐溶液(0.5mlpH7)中添加Traut试剂，并在室温下搅拌溶液1小时。从NAP-5柱上的修饰蛋白质分离出过量的试剂。
c)硫醇化的抗-CD62和抗-ICAM-L抗体与DSPS和DSPE-PEG2000-Mal包裹的微泡的缀合添加0.5ml(b)所制备的硫醇化抗体混合物至(a)中微泡的等分试样中，并使缀合反应在转板上进行30分钟。2000rpm下离心5分钟，接着除去浮游物质。以水进一步洗涤微泡三次。
PEG间隔元件长度可变化为包括长链(例如PEG3400及PEG5000)或短链(例如PEG600或PEG800)。此外，第三抗体如硫醇化-抗-CD34抗体也有效。
实施例26-含有DSPS(其由聚丝氨酸非共价涂布)和融合肽(其包含PS-结合组分和纤连蛋白肽序列FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI)的导向充气微泡a)PS-结合/纤连蛋白片段融合肽FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI的合成利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上从Fmoc-Ile-Wang树脂开始以0.1mmol的规模合成该肽。在连接之前用HBTU预活化所有氨基酸。置于TFA(其含有％5苯酚，5％EDT，和5％水)中2小时可从树脂上同时移走肽和侧-链保护基，并得到302mg粗品。以9ml/分钟的流量及20-40％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.1％TFA/乙腈)，用制备性HPLC纯化(超过40分钟)一份25mg的粗物质。冷冻干燥后，获得10mg纯化的物质(分析型HPLC，梯度20-50％B其中B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水检测--UV214和260nm，产物保留时间＝12.4分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为2856，实测值2866。
b)含有DSPS(其由聚丝氨酸非共价涂布)和PS-结合/纤连蛋白片段的融合肽FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI)的导向充气微泡的制备称取DSPS(5mg)和聚-L-赖氨酸(0.2mg)和上述(a)中的肽(0.2mg)加入清洁小瓶内。小瓶内加入1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。加帽混合器振荡小瓶45秒，并离心所形成的微泡(1000rpm下3分钟)。用水，PBS和水充分洗涤后，利用MALDI MS检查终溶液以检测聚赖氨酸和肽含量。在终溶液中未观察到任何多肽物质。然后加入乙腈，超声处理破坏微泡。利用MALDI MS分析所形成的溶液以检测聚赖氨酸和PS-结合/纤连蛋白融合肽。结果如下MALDI预期值 MALDI实测值聚-L-赖氨酸 786，914， 790，919，1042，1170 1048，1177DSP8-结合肽 2856 2866PS-结合/纤连蛋白融合肽中所包含的间隔元件(-GGG-)也可用其它间隔元件如PEG2000或聚丙氨酸(-AAA-)代替。也可采用前导向的形式，首先DSP8-结合/纤连蛋白片段融合肽通过纤连蛋白肽的结合与细胞连接，接着施用PS微泡，其随后与PS-结合肽相结合。
实施例27-经磷脂酰丝氨酸和生物素-PEG3400-丙氨酰-胆固醇包裹的及链霉抗生物素蛋白/生物素基-内皮肽-1-肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，OH)和生物素基-血纤蛋白-抗-聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)官能团化的充气微泡本例子旨在制备导向超声波微泡，其中链霉抗生物素蛋白用作为生物素酰化报道物和载体之间的接头。
a)生物素-PEG3400-b-丙氨酸胆固醇的合成往3ml溶解了胆固醇-b-丙氨酸盐酸盐(如实施例59所述)(15mg，0.03mmol)的三氯甲烷/湿甲醇(2.6∶1)溶液中添加三乙胺(42ml，0.30mmol)。室温下搅拌混合物10分钟，并滴加溶于1，4-二噁烷(1ml)中的生物素-PEG3400-NHS(100mg，0.30mmol)。室温下搅拌混合物3小时，并蒸发至干，通过急骤层析法纯化残余物至析出白色晶体，产率为102mg(89％)。由MALDI-MS和NMR证实结构。
b)生物素化的内皮肽-1-肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，OH)的合成利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上从Fmoc-Trp(Boc)-Wang树脂开始以0.1mmol的规模合成该肽。在连接之前利用HBTU预活化所有氨基酸。置于TFA(其含有5％茴香醚和5％水)中2小时可从树脂上同时移走肽和侧-链保护基，并得到75mg粗品。以9ml/分钟的流量及30-80％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.1％TFA/乙腈)，用制备性HPLC纯化(超过40分钟)一份20mg的粗物质。冷冻干燥后，获得2mg纯化的组分(分析性HPLC，梯度30-80％B其中B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水检测--UV214 nm--产物保留时间＝12.6分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为1077，实测值1077。
c)生物素基-血纤蛋白-抗-聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)的合成利用上述(b)所描述的类似方案，合成和纯化该肽。通过HPLC和MALDI鉴定纯化产物。
d)磷脂酰丝氨酸和生物素-PEG3400-丙氨酸胆固醇包裹的多特异性充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg)和(a)中的生物素-PEG3400-丙氨酸胆固醇(0.5mg)置于清洁小瓶内，小瓶内加入0.8ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃(加热期间振荡小瓶)。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，并振荡过夜。用去离子水洗涤微泡悬液几次，通过Coulter计数器和声学衰减作用进行分析。
e)用荧光素-标记的链霉抗生物素基蛋白和(b)和(c)的生物素蛋白的缀合往(d)所制备的微泡添加溶解在PBS(1ml)中的缀合荧光素的链霉抗生物素蛋白(0.2mg)。室温下将小泡放置在转板上3小时。用水充分洗涤后，通过荧光显微技术进行分析，在1mlPBS(其含有分别来自(b)和(c)的生物素基-内皮-1肽(0.5mg)和生物素基-血纤蛋白-抗聚合肽(0.5mg))温育微泡2小时。充分洗涤微泡以除去非缀合的肽。
实施例28-经磷脂酰丝氨酸和生物素-DPPE(它们用来产生链霉抗生物素蛋白与生物素基-内皮肽-1-肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，OH)和生物素基-血纤蛋白-抗-聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)混合物的“夹心”形式)包裹的充气微泡a)含有生物素的微泡的制备将磷脂酰丝氨酸(5mg)和生物素-DPPE(0.6mg)置于清洁小瓶内，并加入1ml溶于水中的5％丙二醇-甘油溶液。加热分散物5分钟至80℃，然后冷却样品至环境温度。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间，接着加帽混合器振荡小瓶45秒。离心后，除去浮游物质，用水充分洗涤微泡。
b)经磷脂酰丝氨酸和生物素-DPPE包裹的充气微泡与链霉抗生物素蛋白及生物素基-内皮肽-1-肽(生物素-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp，OH)和生物素基-血纤蛋白-抗-聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)混合物的缀合按照实施例27详述的方法。
实施例29-DSPS(其通过肝素硫酸盐结合肽/纤连蛋白肽/RGD肽和荧光素官能化)的含PFB气体的充气微泡a)含有RGD序列和荧光素报道物基因的脂肽的合成(其中荧光素报道物基团二棕榈酰-Lys-Lys-Lys-Lys[乙酰-Arg-Gly-Asp-Lys(荧光素)]Gly.OH
利用商业销售的氨基酸药筒，按照实施例21(a)中所述合成该脂肽。将该脂肽置于TFA(其含有％5水，％5苯酚，5％EDT)中2小时使其从树脂上切割下来。真空中蒸发粗制品后，用二乙醚沉淀并研制粗制品。以9ml/分钟的流量及60-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.1％TFA/乙腈)，用制备性HPLC纯化(超过40分钟)一份40mg的粗物质。冷冻干燥后，获得10mg纯化的组分(分析型HPLC，梯度60-100％B其中B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水检测--UV260--产物保留时间＝20-22分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为1922，实测值为1920。
b)含有肝素硫酸盐结合序列和纤连蛋白肽的脂肽的合成如实施例21中所述进行合成和纯化c)DSPS(其通过肝素硫酸盐结合肽/纤连蛋白肽/乙酰基RGD肽和荧光素官能化)的充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg，3.9mmol)和(a)中的脂肽(0.5mg，0.2mmol)和(b)中的脂肽(0.5mg)分别置于两清洁小瓶内，每小瓶内加入0.8ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃(加热期间振荡小瓶)。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。加帽混合器振荡小瓶45秒，并振荡过夜。如实施例21(b)所述，用去离子水洗涤所形成的微泡几次，并通过Coulter计数器进行分析。显微镜下观察微泡，可看见1-5微米大小小泡。而且微泡具荧光性。
实施例30-含有DSPS(其通过CD71 FITC-标记的抗-转铁蛋白受体进行了共价修饰，而且掺入了具有对内皮细胞的亲和性的脂肽)的充气微泡本例子针对制备多载体导向超声波剂。
a)内皮细胞结合脂肽(2-n-十六烷基硬脂酰基-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH2)的合成利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上从Fmoc-Trp(Boc)-Wang树脂开始以0.1mmol的规模合成下面所显示的肽。
在连接之前利用HBTU预活化所有氨基酸和-n-十六烷基硬脂酸。置于TFA(其含有5％EDT，和5％水)中2小时可从树脂上同时移走肽和侧-链保护基，并得到150mg粗品。以9ml/分钟的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制备性HPLC纯化(超过50分钟)一份40mg的粗物质。冷冻干燥后，获得10mg纯化的组分(分析型HPLC，梯度90-100％B(其中B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水)检测--UV214nm--产物保留时间＝23分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为2369，实测值为2373。
b)含有DSPS(其掺入了内皮细胞结合脂肽和PE-PEG3400-Mal)的充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg)和(a)中的脂肽(0.5mg)及实施例50的PE-PEG3400-Mal(0.5mg)加入到清洁小瓶内，小瓶内加入1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃，然后用4.5微米滤器过滤。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。加帽混合器振荡小瓶45秒，并用蒸馏水洗涤所形成的微泡三次。
c)FITC-标记的抗-运铁蛋白受体的抗体的硫醇化室温下FITC-标记的CD71抗-运铁蛋白受体Ab(其溶于PBS中100mg/ml，0.7ml)与Traut试剂(0.9mg)反应1小时。从NAP-5柱上的修饰蛋白质分离出过量的试剂。
d)硫醇化的FITC-标记的抗-运铁蛋白受体的抗体与含有DSPS(其掺入了内皮细胞结合脂肽和PE-PEG3400-Mal)的充气微泡的缀合添加上述(c)中的蛋白质组分(共2ml)0.5ml等分试样至(b)中的微泡中，室温下置于转板上缀合反应10分钟。1000rpm下离心3分钟后，除去蛋白质溶液，接着分别与1ml和0.5ml蛋白质溶液等分试样重复两次(或多次)缀合反应。以蒸馏水洗涤微泡四次，并用流动细胞计数和显微观察分析样品，以检测抗体的存在情况。观察到92％以上具荧光性。
附

图1阐述了DSPS阴性对照微泡(左曲线)与缀合了CD71 FITC-标记的抗-运铁蛋白抗体的小泡(右曲线)的流动细胞计数对比情况，该图表明92％的群体具荧光性。
如实施例21(b)所述，通过MALDI质谱法确认脂肽掺入到微泡内的情况。
实施例31-包括DSPS，内皮细胞导向脂肽和含甲巯丙脯酸的分子的充气微泡本例子旨在制备结合了导向和治疗应用的超声波药剂。
a)由甲巯丙脯酸官能团化的脂肽的合成
利用人工氮泡装置，从Fmoc-保护的Rink酰胺MBHA树脂开始以0.125mmol规模合成上述结构。利用标准的TBTU/HOBt/DIEA方案进行连接。利用DIC预激活通过Lys侧-链连接溴乙酸以作为对称的酸酐。将DMF中所溶解的甲巯丙脯酸利用DBU(作为碱)引入固-相。置于TFA(其含有5％EDT，和5％水和5％乙甲基硫化物)中2小时可从树脂上同时移走肽及去侧-链保护基的保护作用。以10ml/分钟的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制备性HPLC纯化(超过60分钟)一份10mg的粗物质。冷冻干燥后，获得2mg纯化的组分(分析型HPLC，梯度70-100％B(超过20分钟)，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分钟检测--UV214nm--保留时间＝26分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物测得M＋H为1265与预期值相同。
b)具有内皮细胞亲和性的脂肽(二棕榈酰-Lys-Lys-Lys-Aca-Ile-Arg-Arg-Val-Ala-Arg-Pro-Pro-Leu-NH2)的合成
利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上由Rink酰胺树脂开始以0.1mmol的规模合成该脂肽。在连接之前利用HBTU预活化所有氨基酸和棕榈酸。置于TFA(其含有5％苯酚，5％EDT，和5％水)中2小时从树脂上同时移走肽和侧-链保护基，并得到160mg粗品。以9ml/分钟的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制备性HPLC纯化(超过40分钟)一份35mg的粗物质。冷冻干燥后，获得20mg纯化的组分(分析型HPLC，梯度70-100％B其中B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水检测--UV214和260nm--产物保留时间＝16分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为2050，实测值为2055。
c)包括DSPS，内皮细胞导向脂肽和含甲巯丙脯酸的分子(其用于药物输送)的充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg)和(a)的产物(0.5mg)及(b)的产物(0.5mg)加入到清洁小瓶内，小瓶内加入1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃(加热期间振荡小瓶)。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。加帽混合器振荡小瓶45秒，然后振荡1小时，接着用去离子水充分洗涤内含物。MALDI MS证明，在终溶液未检测到任何水平的原材料。如同实施例21(b)中所描述的，利用MALDI质谱分析来确认(a)和(b)的产品掺入到微泡内的情况。
d)包括DSPS，内皮细胞导向脂肽和含甲巯丙脯酸的分子(其用于治疗应用)的充气微泡的体外研究利用实施例21(c)中的体外分析法，检查在流动条件下的细胞结合情况。微泡依据流量在细胞上逐渐积累。若进一步增加流量，细胞开始从盖玻片上脱离，但是仍然与微泡结合。不携带载体的对照小泡不粘附在内皮细胞上，在最小限度流量条件下就从腔室中消失。
实施例32-包含DSPS(携有细胞膜亲和性螺旋肽脂肽)和肽抗生素多粘菌素B硫酸盐的充气微泡的制备本例子旨在制备含有多肽载体(其具有组合的导向和治疗应用)的微泡。
a)含有细胞膜亲和性螺旋肽的脂肽(十六烷基硬脂酰基-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH2)的合成如实施例30(a)制备该脂肽。
b)多-特异性充气微泡的制备称取DSPS(5.0mg)和(a)的脂肽(0.3mg)及多粘菌素B硫酸盐(0.5mg)加入到清洁小瓶内，小瓶内加入1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。超声处理混合物3分钟，并加热混合物5分钟至80℃，然后用4.5微米滤器进行过滤。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。加帽混合器振荡小瓶45秒，1000rpm下离心所形成的微泡3分钟。用水充分洗涤这些微泡，直到用MALDI MS在浮游物质中不能检测到多粘菌素或脂肽。显微观察表明小泡大小分布在所需的1-8微米范围间。添加甲醇(0.5ml)至所洗涤的小泡中(约0.2ml)，并将混合物放置在超声波水浴器中2分钟。通过MALDI MS分析，发现所形成的清溶液中含有脂肽和多粘菌素B硫酸盐(预期值1203，实测值1207)。
实施例33-包含DSPS(其掺入了包含IL-1结合受体序列的脂肽而且经含有药物氨甲蝶呤的分支结构修饰微泡。
本例子旨在制备包含用于导向/治疗应用的多载体的导向微泡。
a)含有白细胞介素-1受体结合肽的脂肽(二棕榈酰-Lys-Gly-Asp-Trp-Asp-Gln-Phe-Gly-Leu-Trp-Arg-Gly-Ala-Ala.OH)的合成
利用1mmol氨基酸药筒，在ABI 433A自动肽合成仪上从Fmoc-Ala-Wang树脂开始以0.1mmol的规模合成该脂肽。在连接之前利用HBTU预活化所有氨基氨基酸和棕榈酸。置于TFA(其含有5％水，5％茴香醚，5％苯酚，5％EDT)中2小时从树脂上同时移走肽和侧-链保护基，并得到150mg粗品。以9ml/分钟的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制备性HPLC纯化(超过40分钟)一份30mg的粗物质。冷冻干燥后，获得4 mg纯化的组分(分析型HPLC，梯度90-100％B(其中B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水)检测--UV214nm--产物保留时间＝23分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为2083，实测值为2088。
b)含有巯基组分的分支氨甲蝶呤核心结构的合成
在ABI433A自动肽合成仪上从Fmoc-Cys(Trt)Tentagel树脂开始以0.1mmol的规模合成氨甲蝶呤结构。将其置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽并去侧-链保护基的保护作用，得到160mg粗品。以9ml/分钟的流量及10-30％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.1％TFA/乙腈)，用制备性HPLC纯化(超过40分钟)一份30mg的粗物质。冷冻干燥纯化组分后，获得4mg纯化物质(分析型HPLC，梯度5-50％B(其中B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水)检测--UV214nm--产物保留时间＝9.5分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为1523，实测值为1523。
c)多特异性充气微泡的制备称取DSPS(5.0mg)和实施例64(a)的含有巯基的脂肽(0.5mg)及(a)的脂肽(0.2mg)加入到清洁小瓶内，小瓶内加入1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。超声处理混合物3-5分钟，并加热混合物5分钟至80℃，然后用4.5微米滤器进行过滤。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器中振荡小瓶45秒，1000rpm离心所形成的微泡3分钟，随后弃去浮游物质。
d)氨甲蝶呤支化结构于硫醇化微泡的缀合将上述(b)氨甲蝶呤结构(0.5mg)溶解在PBS中，pH8.0。然后添加溶液至(c)的含有巯基的微泡中，使二硫键反应进行16小时。用PBS和水充分洗涤小泡后，通过显微观察和MALDI MS分析小泡。
在体内可减少氨甲蝶呤结构与微泡相连接的二硫键从而释放游离的药物分子，那么该微泡与肿瘤特异性载体相结合则构成给药系统。利用生理可接受还原剂如谷胱甘肽可引起药物释放。
实施例34-涂布聚-L-赖氨酸复合的荧光素-标记的DNA片段(其来自质粒pBR322)的充气微泡的制备本例子旨在制备用于基因治疗/反义应用的微泡。如实施例21所述，通过用载体修饰的脂质结构进一步涂布微泡膜可获得特异性导向能力。
a)DSPS-包裹的充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg)加入到清洁小瓶内，小瓶内加入1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液，超声处理混合物2分钟，并加热混合物5分钟至80℃。加热后即用4.5微米滤器进行过滤。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器中振荡小瓶45秒。然后用去离子水洗涤所形成的微泡一次，随后弃去浮游物质。然后将微泡再悬浮在0.5ml水中。
b)制备聚-L-赖氨酸/DNA复合物并装载到DSPS-包裹的微泡上在装有1mg聚-L-赖氨酸(70-150kD)的清洁小瓶中加入0.1ml溶解在TE缓冲液(10mM tris-HCl，pH8)中的荧光素-标记的质粒pBR322的消化物。加水使溶液总量为0.6ml，并调整pH为8。使复合进行1小时，之后添加0.05ml聚赖氨酸-DNA溶液至上述(a)的微泡悬液中。1小时后，显微观察表明小泡具荧光性，并确认了DNA的存在。
实施例35-含有分支核心肽(其含有Dabsylated-动脉硬化块-结合序列)和RGDS的充气微泡的制备本例子旨在制备在其表面具有用于用含巯基的载体(其具有导向/给药和药物释放功能)修饰的巯基的微泡。
a)分支肽Dabsyl-Tyr-Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-leu-Lys-Lys(NH2-Arg-Cys-Asp-Ser)-Gly-Cys.OH的合成
mg纯化物质(分析型HPLC，梯度10-50％B超过20分钟，B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水检测--UV214和435nm--产物保留时间＝21分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为2070，实测值为2073。
b)含有巯基的充气微泡的制备如实施例64(a)所述进行制备。
c)硫醇化微泡与多特异性肽通过形成二硫键的氧化性连接弃去上述(b)的微泡的浮游物质，并换上(1mg)溶解在0.7ml稀氨溶液(pH8)中(a)的dabsyl-肽溶液。往该溶液中加入含有6mg钾高铁氰盐的贮存液(其溶解在2ml水中)。将小瓶放置在转板上，让巯基氧化反应进行2小时。然后以水充分洗涤小泡，直到通过HPLC和MALDI检测证明浮游物质无dabsyl-肽，利用水溶性的还原剂三-(2-羧乙基)-膦通过还原二硫键来检测微泡-结合肽。还原后，通过HPLC和MALDI检测发现浮游物质含有游离的dabsyl-肽。
也可采用其它生理上可接受的还原剂如还原谷胱甘肽来启动释放。
实施例36-经DSPS和生物素-PEG3400乙酰磷脂酰基乙醇胺包裹并通过生物素，寡核苷酸生物素-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG和生物素化纤维蛋白-抗-聚合肽(生物素-GPRPPERHOS.NH2)官能团化的充气微型气泡的制备a)生物素-PEG3400乙酰磷脂酰乙醇胺的合成室温下，搅拌溶解在氯仿/甲醇中的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(21.00mg，0.03mmol)，生物素-PEG3400-CO2-NHS(100mg，0.03mmol)和三乙胺(42μl，0.03mmol)混合物的溶液(3∶1)2小时。在减压条件下蒸发溶剂，用闪烁色谱处理残余物(二氯甲烷/甲醇/水，40∶8∶1)。获得黄色树胶状的产物(112mg，94％)，并通过NMR和MALDI-MS鉴定结构。
b)荧光素-缀合的链酶抗生素蛋白与充气微泡的结合如上述实施例所述，通过混合DSPS和生物素-PEG3400乙酰磷脂酰基乙醇胺制备充气微泡。将微泡悬液分成0.2ml等分试样，并如下表所示加入荧光素-连结链霉抗生物素蛋白。环境温度下在转板上温育样品15-30分钟，接着在PBS中通过洗涤除去过量的蛋白质。用流动细胞计数和Coulter计数器分析样品。结果总结在下表中。
结果
c)涂布链酶抗生素蛋白的微泡与寡核苷酸生物素-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG和生物素化的血纤蛋白-抗-聚合肽生物素-GPRPPERHOS的缀合离心上述第6份等分试样微粒，并用1mlpH7.5PBS缓冲液(其包含实施例27中(b)和(c)的0.2 mg生物素-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG和0.2mg生物素-GPRPPERHQS)取代上清液。温育24小后，用PBS和水充分洗涤这些微粒。
利用该方法将其它生物素酰化的载体或治疗剂与涂布链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白微泡相连结。
实施例37-经DSPS包裹并通血栓导向脂肽和溶解血栓酶组织纤溶酶原激活物官能团化的充气微型气泡的制备本例子涉及制备含有治疗溶解血栓剂的血栓导向超声造影剂。
a)血栓亲和性脂肽(棕榈酰-Lys-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.NH2)的合成
利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上由Rink酰胺树脂开始以0.1mmol的规模合成该脂肽。在连接前利用HBTU预活化所有氨基酸与棕榈酸。将其置于TFA(其含有5％苯酚，5％EDT，5％茴香醚，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及侧-链保护基，得到80mg粗品。用制备性HPLC纯化一份20mg的粗物质。冷冻干燥后，获得6mg纯化物质。利用MALDI质谱法和分析HPLC进一步鉴定产物。
b)具有硫-SMPB的组织纤溶酶原激活物的修饰添加水使0.1ml含有0.1mgt-PA的碳酸铵缓冲液体积达0.2ml。往该溶液中添加0.4mg硫-SMPB(其溶解在0.05mlDMSO中)。将蛋白质溶液在室温下放置45分钟，随后用Superdex200柱进行纯化。用PBS洗脱产物，并收集经修饰的蛋白质组分。
b)经DSPS/血栓结合脂肽和含有硫的脂肽包裹的充气微型气泡的制备以及与经修饰的组织纤溶酶原激活物的缀合称取DSPS(5.0mg)和0.5mg(a)的脂肽和实施例64(a)的含硫脂肽加入到清洁小瓶内。小瓶内加入1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液，超声处理混合物2分钟，并加热混合物5分钟至80℃。加热后即用4.5微米滤器进行过滤。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。加帽混合器振荡小瓶45秒。然后用去离子水洗涤所形成的微泡两次。随后弃去浮游物质，换上1ml(b)的蛋白质溶液等分试样。缀合反应进行1小时。离心微泡，用另外1ml蛋白质溶液替换浮游物质。重复温育步骤直到用完所有蛋白质溶液。然后用水充分洗涤微泡并用Coulter计数器进行分析。如实施例21(c)用流腔室分析检验微泡。发现经蛋白质修饰的微泡与那些只含有脂肽/DSPS或DSPS的小泡相比结合得更多。
在体内和体外血栓形成模型中，估价该微泡的导向/治疗/超声波活性。
实施例38-含有DSPS(携有含细胞膜亲和性螺旋肽的脂肽)的充气微泡的制备该例子旨在制备包含细胞膜结构导向肽载体的导向微泡。
a)包含细胞膜亲和性螺旋肽的脂肽的合成
利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上由Rink酰胺树脂开始以0.1mmol的规模合成该脂肽。在连接前利用HBTU预活化所有氨基酸和2-n-十六烷基硬脂酸。将其置于含有5％水TFA中2小时从树脂上同时移走肽及侧-链保护基，得到520mg粗品。以9ml/分钟的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制备性HPLC纯化(超过40分钟)一份30mg的粗物质。冷冻干燥后，获得10mg纯化物质(分析型HPLC，梯度90-100％B超过20分钟，B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水检测--UV214nm--产物保留时间＝23分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为2369，实测值为2375。
b)充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg)和0.5mg(a)的脂肽加入到清洁小瓶内，小瓶内加入1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。超声处理混合物3-5分钟，并加热混合物5分钟至80℃，然后用4.5微米滤器进行过滤。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。加帽混合器振荡小瓶45秒，在1000rpm下离心所形成的微泡3分钟。然后用去离子水洗涤这些微泡直到MALDI-MS不能检测到任何脂肽。接着进行Coulter计数，声学衰减以及压力稳定性研究。添加甲醇(0.5ml)至所洗涤的小泡中(约0.2ml)，并将混合物放置在超声波水浴器中2分钟。通过MALDI MS分析，发现所形成的清溶液中含有该脂肽。
c)体外和在体内试验这些微泡在体外和在体内的特征类似于实施例21中所制备的微泡。
实施例39-磷脂酰丝氨酸和生物素酰化脂肽包裹的充气微泡a)脂肽二棕榈酰-赖氨酰-色氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-(生物素酰)甘氨酸的合成利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上从Fmoc-Gly-Wang树脂开始以0.1mmol的规模合成该脂肽。在连接前利用HBTU预活化所有氨基酸和棕榈酸。将其置于TFA(其含有5％苯酚，5％EDT，5％茴香醚，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及侧-链保护基，得到150mg粗品。以9ml/分钟的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制备性HPLC纯化(超过40分钟)一份40 mg的粗物质。冷冻干燥后，获得14mg纯化物质(分析型HPLC，梯度70-100％B，B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水检测--UV260和荧光，Ex280，Em350--产物保留时间＝22分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为1478，实测值为1471。
b)包含DSPS(掺入(a)的生物酰化脂肽序列)的充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg)和0.5mg(a)的脂肽分别加入到两个清洁小瓶内，小瓶内分别加入0.8ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃(加热期间振荡)。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。加帽混合器振荡小瓶45秒，并振荡过夜。然后用去离子水洗涤所形成的微泡几次，并进行Coulter计数，声学衰减分析。按下述过程利用MALDI质谱分析来确认脂肽掺入到DSPS微泡内的情况将约50-100ml微泡转移到清洁小瓶内，并加入50-100ml水。超声处理混合物30秒，并点在清洁靶培养皿(把1ml＋0.5mlACH基质)上。正性方式M＋H为1474，脂肽预期值为1478。
实施例40-包含DSPS(携有含非生物活性白细胞介素-1结合受体肽的脂肽)的多特异性充气微泡的制备本例子旨在制备包含导向于IL-1受体(其不引起信号传感或阻止IL-1结合)的非生物活性肽载体的导向微泡。
a)含有非生物活性白细胞介素-1受体结合肽的脂肽的合成
利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上从Fmoc-Ala-Wang树脂开始以0.1mmol的规模合成该脂肽。在连接前利用HBTU预活化所有氨基酸和棕榈酸。将其置于TFA(其含有5％水，5％茴香醚，5％苯酚，5％EDT)中2小时从树脂上同时移走肽及侧-链保护基，得到150mg粗品。以9ml/分钟的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制备性HPLC纯化(超过40分钟)一份30mg的粗物质。冷冻干燥后，获得4mg纯化物质(分析型HPLC，梯度90-100％B，B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水检测--UV214nm--产物保留时间＝23分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为2083，实测值为2088。
b)充气微型气泡的制备称取DSPS(4.5mg)和0.5mg(a)的脂肽加入到清洁小瓶内，小瓶内加入1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。超声处理混合物3-5分钟，并加热混合物5分钟至80℃，然后用4.5微米滤器进行过滤。冷却混合物至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。加帽混合器振荡小瓶45秒，在1000rpm下离心所形成的微泡3分钟。然后用去水洗涤这些微泡直到MALDI-MS不能检测到任何脂肽。添加甲醇(0.5ml)至所洗涤的小泡中(约0.2ml)，并将混合物放置在超声波水浴器中2分钟。通过MALDIMS分析，发现所形成的清溶液中含有该脂肽(预期值为2083，实测值为2088)实施例41-用于导向超声波造影的包含DSPC，DSPS和内皮细胞结合脂肽的全氟丙烷微泡的制备添加0.5mg实施例31(b)的脂肽至0.8ml含有DSPC∶DSPS(3∶1)(5mg/ml)(其溶解在4％丙二醇/甘油水溶液中)的溶液内。加热混合物5分钟至80℃，然后用4.5微米滤器进行过滤。冷却混合物至室温并用全氟丙烷气体冲洗液面上空间。加帽混合器振荡小瓶45秒，并且置于转板上5分钟。在2000rpm下离心样品5分钟，并弃去浮游物质换上蒸馏水。再一次用全氟丙烷气体冲洗液面上空间，并将样品置于转板上直至出现均相。再次洗涤操作。对所形成的超声造影剂进行Coulter计数分析，声学衰减测量及对外压的抗性分析以确定其特征。如实施例21所详述的方法，用体外分析法试验微泡。观察到结合在细胞上的微泡逐渐积累。
实施例42-用于导向超声波造影的包含DSPC，DSPS和内皮细胞结合脂肽的含六氟化硫微泡的制备添加0.5mg实施例31(b)的脂肽至0.8ml含有DSPC∶DSPS(3∶1)(5mg/ml)(其溶解在4％丙二醇/甘油水溶液中)的溶液内。加热混合物5分钟至80℃，并振荡。冷却混合物至环境温度并用六氟化硫气体冲洗液面上空间。在加帽混合器上振荡小瓶45秒，并且置于转板上5分钟。在2000rpm下离心样品5分钟，并弃去浮游物质换上蒸馏水。再一次用六氟化硫气体冲洗液面上空间，并将样品置于转板上直至出现均相。再次洗涤操作。
对所形成的超声造影剂进行Coulter计数分析，声学衰减测量及对外压的抗性分析。如实施例21所详述的方法，用体外分析法试验微泡。
实施例43-用于导向超声波造影的包含DSPG和内皮细胞结合脂肽的充气微泡的制备添加0.5mg实施例31(b)的脂肽至0.8ml含有DSPG(5mg/ml)(其溶解在4％丙二醇/甘油水溶液中)的溶液内。加热混合物5分钟至80℃并振荡。冷却混合物至环境温度并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器上振荡小瓶45秒，并且置于转板上5分钟。2000rpm离心样品5分钟，并弃去浮游物质换上蒸馏水。再一次用全氟丁烷气体冲洗液面上空间，并将样品置于转板上直至出现均相。再次洗涤操作。对所形成的超声造影剂进行Coulter计数分析，声学衰减测量及对外压的抗性分析确定其特征。如实施例21a所详述的方法，用体外分析法试验微泡。观察到结合在细胞上的微泡逐渐积累。
实施例44-用于导向超声波造影的包含DSPG和内皮细胞结合脂肽的含全氟丙烷的微泡的制备添加0.5mg实施例31(b)的脂肽至0.8ml含有DSPG(5mg/ml)(其溶解在4％丙二醇/甘油水溶液中)的溶液内。加热混合物5分钟至80℃，并振荡。冷却混合物至环境温度并用全氟丙烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器上振荡小瓶45秒，并且置于转板上5分钟。在2000rpm下离心样品5分钟，并弃去浮游物质换上蒸馏水。再一次用全氟丙烷气体冲洗液面上空间，并将样品置于转板上直至出现均相。再次洗涤操作。对所形成的超声造影剂进行Coulter计数分析，声学衰减测量及对外压的抗性分析确定其特征。如实施例21a所详述的方法，用体外分析法试验微泡。观察到结合在细胞上的微泡逐渐积累。
实施例45-用于导向超声波造影的包含DSPG和内皮细胞结合脂肽的含六氟化硫微泡的制备添加0.5mg实施例31(b)的脂肽至0.8ml含有DSPG(5mg/ml)(其溶解在4％丙二醇/甘油水溶液中)的溶液内。加热混合物5分钟至80℃，并振荡。冷却混合物至环境温度并用六氟化硫气体冲洗液面上空间。在加帽混合器上振荡小瓶45秒，并且置于转板上5分钟。在2000rpm下离心样品5分钟，并弃去浮游物质换上蒸馏水。再一次用六氟化硫气体冲洗液面上空间，并将样品置于转板上直至出现均相。再次洗涤操作。对所形成的超声造影剂进行Coulter计数分析，声学衰减测量及对外压的抗性分析以确定其特征。
实施例46-含有DSPS(非共价地涂布聚赖氨酸)的导向充气微泡称取DSPS(4.5mg)和聚-L-赖氨酸(0.2mg)加入到清洁小瓶内。小瓶内加入1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃(加热期间振荡)。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器上振荡小瓶45秒，1000rpm下离心所形成的微泡3分钟。在用水，PBS及水充分洗涤后，接着用MALDI MS检测终溶液是否有聚赖氨酸内含物。在终溶液未检测到任何聚赖氨酸材料。然后加入乙腈并超声处理直到所有小泡破裂。再一次用MALDI MS检测终溶液是否有聚赖氨酸内含物。结果如下MALDI预期值 MALDI实测值聚-L-赖氨酸786，914，1042，1170790，919，1048，1177实施例47-用于导向超声波造影的官能团化的充气微泡的制备本例子旨在制备表面具有非特异性导向反应基团的微泡，其主要利用二硫键交换反应来结合到多样性细胞靶上。
a)巯基-官能化脂质分子的合成
利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上从Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂开始以0.1mmol的规模合成上述脂结构。利用HBTU连接化学法预活化所有氨基酸和棕榈酸。将其置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及侧-链保护基，得到250mg粗品。以9ml/分钟的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制备性HPLC纯化(超过50分钟)一份40mg的粗物质。冷冻干燥后，获得24mg纯化物质(分析型HPLC，梯度70-100％B，B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水检测--UV214nm--产物保留时间＝23分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为1096，实测值为1099。
c)包含DSPS(掺入了含巯基脂质结构)的充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg)和上述(a)的脂质结构(0.5mg，0.4mmol)加入到清洁小瓶内。小瓶内加入0.8ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃(加热期间振荡)，仍然热时用40mm滤器进行过滤。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器上振荡小瓶45秒，然后置于转板上过夜。用去离子水充分洗涤所形成的微型气泡几次，利用Ellmans试剂分析巯基掺入情况。
实施例48-包含DSPS(掺入了血栓-结合脂肽)的充气微泡的制备a)血栓亲和性脂肽(二棕榈酰-Lys-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.NH2)的合成
利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上由Rink酰胺树脂开始以0.1mmol的规模合成该脂肽。在连接前利用HBTU预活化所有氨基酸和棕榈酸。将其置于TFA(其含有5％苯酚，5％EDT，5％茴香醚，5％水)中2小时可从树脂上同时移走肽及侧-链保护基，得到80mg粗品。用制备性HPLC纯化一份20mg的粗物质。冷冻干燥后，获得6mg纯化物质。利用MALDI质谱法及分析HPLC进一步鉴定该产物。
b)血栓导向超声波微泡的制备称取DSPS(4.5mg)和上述(a)的脂肽(1.0mg)加入到清洁小瓶内，并加入0.8ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃，然后用40mm滤器进行过滤。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器上振荡小瓶45秒，并用去离子水充分洗涤所形成的微型气泡。用显微观察和Coulter计数分析法鉴定微泡。如上述实施例所述，利用MALDI-MS确认脂肽的存在情况。
实施例49-用于导向超声波造影的涂布运铁蛋白的充气微泡的制备a)巯基-官能团化脂质分子的合成
利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上从Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂开始以0.25mmol的规模合成上述脂结构。在连接前利用HBTU预活化所有氨基酸和棕榈酸。将其置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及去除侧-链保护基的保护作用，得到250mg粗品。以9ml/分钟的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制备性HPLC纯化(超过50分钟)一份40mg的粗物质。冷冻干燥后，获得24mg纯化物质(分析型HPLC，梯度70-100％B，B＝0.1％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水检测--UV214nm--产物保留时间＝23分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为1096，实测值为1099。
b)包含DSPS(掺入了含巯基脂质结构)的充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg)和上述(a)的脂质结构(0.5mg，0.4mmol)加入到清洁小瓶内，并加入0.8ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃(加热期间振荡)，仍然热时用40mm滤器进行过滤。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。加帽混合器振荡小瓶45秒，然后置于转板上过夜。用去离子水充分洗涤所形成的微型气泡几次，利用Ellmans试剂分析巯基掺入情况。
c)具有荧光素-NHS和硫代-SMPB的运铁蛋白的修饰往4mg溶于PBS(1ml)中的运铁蛋白(Holo，人)溶液内加入0.5ml含1mg硫代-SMPB和0.5mg荧光素-NHS的DMSO溶液。室温下搅拌混合物45分钟，然后利用PBS作为洗脱液流过葡聚糖凝胶200柱。收集蛋白质组分，并在使用前存储在4℃下。
d)微泡与运铁蛋白的缀合添加1ml(c)经修饰的运铁蛋白蛋白质溶液至(b)的含巯基的微泡中。调整pH为9，接着让缀合反应在室温下进行2小时。在用去离子水充分洗涤微泡后，用Coulter计数器进行分析(97％的在1和5mm之间)并用荧光显微技术(高荧光性微泡)分析。
实施例50-包含DSPS掺入了缀合到硫醇化胰蛋白酶荧光素的PE-PEG2000-Mal的充气微泡a)Boc-NH-PEG2000-DSPE(t-丁基氨基甲酸酯聚(亚乙基乙二醇)二硬脂酰磷脂酰-乙醇胺)的合成将DSPS(31mg)加入到Boc-NH-PEG2000-SC(150mg)的三氯甲烷(2ml)溶液中，随后加入三乙胺(33μl)。41℃搅拌混合物10分钟直到原材料溶解。旋转蒸发溶剂，用乙腈(5ml)溶解残余物。冷却所形成的分散物至4℃并离心，随后过滤溶液并蒸发至干。由NMR(核磁共振)确认所形成产物的结构。
b)H2N-PEG2000-DSPE(氨基-聚(亚乙基乙二醇)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)的合成在环境温度下，搅拌溶解在4M盐酸二噁烷溶液(5ml)中的Boc-NH-PEG3400-DSPE(167mg)2.5小时。旋转蒸发除去溶剂，用三氯甲烷(1.5ml)溶解残余物，并以水(2×1.5ml)洗涤。在真空条件下蒸发有机相。TCL分析(氯仿/甲醇/水13∶5.0∶0.8)显示了一个茚三酮阳性点Rf＝0.6；核磁共振证实其结构。
c)Mal-PEG2000-DSPE(3-马来酰亚胺丙酸酯聚(亚乙基乙二醇)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)的合成添加N-琥珀酰胺-3-马来酰亚胺丙酸酯(5.6mg，0.018mmol)的四氢呋喃溶液(0.2ml)至溶解在四氢呋喃(1ml)和0.1M磷酸钠缓冲液pH7.5(2ml)中的H2N-PEG2000-DSPE(65mg，0.012mmol)溶液。加热混合物至30℃，接着对反应物进行TCL分析，随后在真空中除去溶剂。利用80∶20三氯甲烷∶甲醇作为洗脱液，在闪烁二氧化硅柱上纯化标题物质。由NMR(核磁共振)和质谱法确认纯化产物的结构。
d)掺APE-PEG2000-Mal的DSPS充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg)和上述(c)的PE-PEG2000-Mal(0.5mg)加入到清洁小瓶内，并加入1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。加热混合物5分钟至80℃，然后用40mm滤器进行过滤。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器上振荡小瓶45秒，用蒸馏水充分洗涤所形成的微型气泡三次。
e)荧光素-标记的胰蛋白酶的制备往5mg胰蛋白酶的PBS溶液(1ml)中加入0.2ml含有1mg荧光素-NHS的DMSO溶液。室温下搅拌混合物45分钟。将葡聚糖凝胶200柱充满经修饰的蛋白质混合物，并利用PBS以1ml/分钟的流速洗脱产物。收集蛋白质组分(5ml)并存储在4℃下。
f)硫醇化荧光素-标记的胰蛋白酶的制备添加1mgTraut试剂至(e)的蛋白质组分中，室温下另搅拌混合物1小时。将葡聚糖凝胶200柱充入4ml经Traut修饰的蛋白质，并利用PBS洗脱产物。收集具有最大荧光强度的蛋白质组分(总量为6ml)。
g)微泡与硫醇化荧光素-标记的胰蛋白酶的缀合在转板上将(d)的微泡置于1ml上述(f)的蛋白质溶液中温育。离心并撤除浮游物质，接着让缀合反应在pH7.3-7.8条件下进行10分钟。进一步重复三次该过程，接着以水洗涤小泡四次以除去未结合的蛋白。
D.小泡含有通过在PBS中的Arg-pNA衍生物切割所证实的活性酶。
E.通过Coulter和回波性测量分析小泡。
PEK-022-015小泡耐压总浓度 0.83直径1-3mm 40直径3-5mm 28直径5-7mm 13最大衰减频率3.32Mhz时的衰减4.93.5Mhz时的衰减 7.85.0Mhz时的衰减 7.2小泡是对压稳定的。
附图2阐述与阴性对照微泡(左曲线)相比的流动细胞计数数据。98％的小泡具荧光性。
实施例51-包含用于诊断和治疗的甲巯丙脯酸分子的充气微泡a)甲巯丙脯酸官能团化脂肽的合成
用手动起泡法从Fmoc-保护的Rink酰胺MBHA树脂开始以0.125mmol的规模合成上述结构。利用标准的TBTU/HOBt/DIEA方案进行连接。利用DIC预激活通过Lys侧-链连接溴乙酸(作为对称的酸酐)。将DMF中所溶解的甲巯丙脯酸利用DBU(作为碱)引入固-相。置于TFA(其含有5％EDT，5％水和5％乙甲基硫化物)中2小时从树脂上同时移走肽及去除侧-链保护基的保护作用。以10ml/分钟的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制备性HPLC纯化(超过60分钟)一份10mg的粗物质。冷冻干燥后，获得2mg纯化的组分(分析型HPLC，梯度70-100％B超过20分钟，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分钟检测--UV214nm--保留时间＝26分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物实测值M＋H为1265与预期值相同。
b)包含DSPS和含甲巯丙脯酸的化合物的充气微泡的制备添加1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于清洁小瓶内的DSPS(4.5mg)和(a)的产物(0.5mg)混合物中。超声处理混合物5分钟，并加热混合物5分钟至80℃(加热期间振荡)。冷却混合物并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器上振荡小瓶45秒，并用去离子水广泛地洗涤所形成的微泡。MALDI MS证明，在终溶液中未检测到任何水平的(a)的化合物。如下述利用MALDI质谱分析来确认含甲巯丙脯酸的脂肽掺入到微泡内的情况转移约50μl的微泡至含有90％甲醇(约100μl)的清洁小瓶内。超声处理混合物30秒，并用MALDI MS进行分析，结果表明该M＋H峰值与(a)的脂肽一致。
实施例52-包含DSPS和用于诊断和治疗的肾上腺素能受体的亲和性载体的充气微泡a)适于固相连接的带保护基的衍生物的合成i)甲基4-[(2，3-环氧)丙氧基]-乙酸苯酯的合成在85℃下，搅拌4-羟乙酸苯酯(4.98g，0.030mol)和环氧氯丙烷(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小时。冷却反应混合物，并蒸馏去掉过量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取残余物，以盐水洗涤，并干燥(Na2SO4)。过滤溶液并浓缩。对暗残余物进行色谱处理(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)而得到2.25g(34％)无色油。1H(300 MHz)和13C NMR(75MHz)谱与该结构对应。
ii)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]基乙酸甲酯的合成室温下，搅拌4-[(2，3-环氧)丙氧基]-乙酸苯酯(2.00g，9.00mmol)和异丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物过夜。浓缩溶液，将油残余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通过过滤及浓缩获得定量的黄色油，其可用于下一步骤而不需进一步纯化。通过1H和13C NMR分析证实该结构。
iii)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐的合成
100℃下加热溶解在6M盐酸(15ml)中的4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯(563mg，2.00mmol)溶液4小时。浓缩反应混合物，用水萃取残余物并冻干。1H和13C NMR谱与该结构对应，MALDI质谱法显示M＋H如预期值268。
iv)N-Boc-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氢钠溶液(0.60g，7.2mmol)中。添加二-叔-丁基碳酸氢钠(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析法监控反应进展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氢钠直到转化完全。将反应混合物倒在硫酸氢钾饱和水溶液中，将有机物质抽提到乙酸乙酯中。以水和盐水洗涤有机相，并干燥(Na2SO4)。过滤获得0.6g粗物质。层析法纯化产物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。浓缩溶液，用冰乙酸萃取残余物并冻干。产生415mg(56％)白色固体。通过1H和13C NMR分析法证实该结构。
b)氨酰心安官能团化脂肽的合成
用手动起泡法方法从Fmoc-保护的Rink酰胺MBHA树脂开始以0.125mmol的规模合成上述结构。利用标准的TBTU/HOBt/DIEA方案进行连接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及去除侧-链保护基的保护作用。沉淀醚得到粗物质，并以10ml/分钟的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制备性HPLC纯化(超过60分钟)一份10mg的粗物质。冷冻干燥后，获得38mg纯化的组分(分析HPLC，梯度70-100％B超过20分钟，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分钟检测--UV214nm--保留时间＝26分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物测得M＋H为1258，期望值为1257。
b)包含DSPS和含氨酰心安脂肽的充气微泡的制备添加1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于清洁小瓶内的DSPS(4.5mg)和(b)的产物(0.5mg)混合物中。超声处理混合物5分钟，并加热混合物5分钟至80℃(加热期间振荡)，然后冷却。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器上振荡小瓶45秒，并用去离子水充分洗涤所形成的微泡。MALDI MS表明在终溶液中未检测到任何水平的(b)的化合物。如下述利用MALDI质谱分析来确认含氨酰心安脂肽掺入到微泡内的情况转移约50μl的微泡至含有90％甲醇(约100μl)的清洁小瓶内。超声处理混合物30秒，进行MALDI MS(ACH-基质)分析，给出与相应的脂肽(b)一致的M＋H峰值。
d)体外分析如实施例21所详述的体外分析法试验微泡。观察到结合到细胞上的微泡逐渐积累。
实施例53-包含DSPS及由结合肝素硫酸盐的肽(KRKR)和用于导向的纤连蛋白肽(WOPPRARI)组成的脂肽以及含治疗应用的氨酰心安的脂肽的充气微泡a)由结合肝素硫酸盐的肽(KRKR)和用于导向的纤连蛋白肽(WOPPRARI)组成的脂肽的合成
利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上从Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂开始以0.25mmol的规模合成上述脂结构。在连接前利用HBTU预活化所有氨基酸和棕榈酸。将其置于TFA(其含有5％苯酚，5％EDT，5％茴香醚和5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及去除侧-链保护基的保护作用，得到150mg粗品。以9ml/分钟的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制备性HPLC纯化(超过40分钟)一份40mg的粗物质。冷冻干燥后，获得16mg纯化物质(分析型HPLC，梯度70-100％B，B＝MeOH，A＝0.01％TFA/水检测--UV260nm和荧光，Ex280，Em350--产物保留时间＝19.44分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为2198，实测值为2199。
b)适于固相连接的氨酰心安衍生物的合成i)4-[(2，3-环氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯的合成在85℃下，搅拌4-羟苯乙酸甲酯(4.98g，0.030mol)和环氧氯丙烷(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小时。冷却反应混合物，并蒸馏去掉过量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取残余物，以盐水洗涤，并干燥(Na2SO4)。过滤溶液并浓缩。对暗残余物进行色谱处理(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)而得到2.25g(34％)无色油。1H(300MHz)和13C NMR(75 MHz)谱与该结构对应。
ii)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯的合成室温下，搅拌4-[(2，3-环氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯(2.00g，9.00mmol)和异丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物过夜。浓缩溶液，将油残余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通过过滤及浓缩获得定量的黄色油，其可用于下一步骤而不需进一步纯化。通过1H和13C NMR分析法证实该结构。
iii)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐的合成100℃加热溶解在6M盐酸(15ml)中的4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯(563mg，2.00mmol)溶液4小时。浓缩反应混合物，用水萃取残余物并冻干。1H和13C NMR谱与该结构对应，MALDI质谱法显示M＋H如预期值268。
iv)N-Boc-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氢钠溶液(0.60g，7.2mmol)中。添加二-叔-丁基碳酸氢钠(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析法监控反应进展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氢钠直到转化完全。将反应混合物倒在硫酸氢钾饱和水溶液中，将有机物质抽提到乙酸乙酯中。以水和盐水洗涤有机相，并干燥(Na2SO4)。通过过滤获得0.6g粗物质。用层析法纯化产物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH85∶10∶5)。浓缩溶液，用冰乙酸萃取残余物和冻干。产生415mg(56％)白色固体。通过1H和13C NMR分析法证实该结构。
c)氨酰心安官能团化脂肽的合成
利用合适的氨基酸，棕榈酸及(a)的化合物，用手动起泡法从Fmoc-保护的Rink酰胺MBHA树脂开始以0.125mmol的规模合成上述结构。利用标准的TBTU/HOBt/DIEA方案进行连接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及去除侧-链保护基的保护作用。沉淀醚得到粗物质，并以10ml/分钟的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制备性HPLC进行纯化(超过60分钟)。冷冻干燥后，获得38mg纯化的组分(分析HPLC，梯度70-100％B超过20分钟，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分钟检测--UV214nm--保留时间＝25分钟)。利用MALDI质谱法(ACH基质)进一步鉴定产物观测M＋H为1258，期望为1257。
d)包含DSPS及由结合肝素硫酸盐的肽(KRKR)和纤连蛋白肽(WOPPRARI)组成的脂肽以及含氨酰心安的脂肽的充气微泡的制备添加1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于清洁小瓶内的DSPS(4.5mg)和(a)的产物(0.5mg)混合物中。超声处理混合物5分钟，并80℃下加热混合物5分钟(加热期间振荡)。过滤并冷却该溶液。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器上振荡小瓶45秒，并用去离子水充分洗涤所形成的微泡。如下述利用MALDI质谱分析来确认含氨酰心安脂肽掺入到微泡内的情况转移约50μl的微泡至含有90％甲醇(约100μl)的清洁小瓶内。超声处理混合物30秒，并进行MALDI MS分析，结果有两个M＋H峰值2202和1259，其分别对应于(a)的脂肽与(c)的脂肽。
d)体外分析如实施例21所详述的体外分析法试验微泡。观察到结合到细胞上的微泡逐渐积累。
实施例54-包含DSPS和用于诊断和治疗的肾上腺素能受体亲和性氨酰心安的脂肽衍生物的充气微泡a)N-十六烷基-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酰胺的合成i)4-[(2，3-环氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯的合成在85℃下，搅拌4-羟苯乙酸甲酯(4.98g，0.030mol)和表氯醇(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小时。冷却反应混合物，蒸馏去掉过量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取残余物，以盐水洗涤，并干燥(Na2SO4)。过滤溶液并浓缩。对暗残余物进行色谱处理(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)而得到2.25g(34％)无色油。1H(300MHz)和13C NMR(75 MHz)谱与该结构对应。
ii)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯的合成室温下，搅拌4-[(2，3-环氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯(2.00g，9.00mmol)和异丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物过夜。浓缩溶液，将油残余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通过过滤及浓缩获得定量产率的黄色油，其可用于下一步骤而不需进一步纯化。通过1H和13C NMR分析法证实该结构。
iii)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐的合成100℃下加热溶解在6M盐酸(15ml)中的4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯(563mg，2.00mmol)溶液4小时。浓缩反应混合物，用水萃取残余物并冻干。1H和13C NMR谱与该结构对应，MALDI质谱法显示M＋H如预期值268。
iv)N-Boc-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氢钠溶液(0.60g，7.2mmol)中。添加二-叔-丁基碳酸氢盐(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析监控反应进展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氢盐直到转化完全。将反应混合物倒在硫酸氢钾饱和水溶液中，将有机物质抽提到乙酸乙酯中。以水和盐水洗涤有机相，并干燥(Na2SO4)。过滤获得0.6g粗物质。用层析法纯化产物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。浓缩溶液，用冰乙酸萃取残余物和冻干。产生415mg(56％)白色固体。通过1H和13C NMR分析法证实该结构。
v)N′-Boc，N-十六烷基-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰胺的合成将N-Boc-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸(92mg，0.25mmol)与十六烷胺(60mg，0.25mmol)的DMF溶液(5ml)冷却至0℃。加入HOBt(39mg，0.25mmol)和N-(3-二甲基氨丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐(水溶性碳二亚胺)(48mg，0.25mmol)。0℃下搅拌反应混合物1小时，然后室温下过夜。将反应混合物倒在含有纯碱(2.5g)和氯化钠(4.0g)的水溶液(25ml)上。过滤沉淀物质，以水洗涤，用三氯甲烷萃取。以5％纯碱和水洗涤氯仿相，并干燥(Na2SO4)。过滤并浓缩溶液得到150mg黄白色的粗物质。用层析法纯化产物(二氧化硅，氯仿/甲醇95∶5)，得到118mg(80％)的白色物质。通过1H(500MHz)和13C(125MHz)NMR分析法证实该结构。MALDI质谱法进一步鉴定该产物，所测M＋H如预期值268。
VI)N-十六烷基-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰胺的合成添加三氟乙酸(1ml)至N′-Boc-N-十六烷基-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰胺(10mg)的二氯甲烷溶液(9ml)中。室温下搅拌反应混合物2小时。TCL(二氧化硅，氯仿/甲醇95∶5)显示原材料的转化是否完成。蒸发去掉溶剂，用水/乙腈萃取残余物并冻干，产生定量产率的白色固体物质。通过1H(500MHz)和13C(125MHz)NMR分析法证实该结构。用MALDI质谱法进一步鉴定该产物，所测M＋H为492以及M＋Na为514(符合预期值)。
b)包含DSPS和用于诊断和治疗应用的N-十六烷基-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰胺的充气微泡的制备添加1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶内的DSPS(4.5mg)和N-十六烷基-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰胺(0.5mg)混合物中。超声处理混合物5分钟，并在80℃下加热混合物5分钟(加热期间振荡)。过滤并冷却该溶液。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间，在加帽混合器中振荡小瓶45秒，用去离子水充分洗涤所形成的微泡。如下述利用MALDI质谱分析来确认(a)的化合物掺入到微泡内的情况转移约50μl的微泡至含有90％甲醇(约100μl)的清洁小瓶内。超声处理混合物30秒，并进行MALDI MS分析，出现492的M＋H峰值，其对应于N-十六烷基-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰胺的M＋H值。
实施例55-经DSPS和含叶酸的化合物(其用于诊断应用)包裹的充气微泡
a)含有叶酸的酯肽的合成
利用合适的氨基酸，棕榈酸及叶酸，用手动起泡法从Fmoc-保护的Rink酰胺MBHA树脂开始以0.125mmol的规模合成上述结构。利用标准的TBTU/HOBt/DIEA方案进行连接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及去除侧-链保护基的保护作用。沉淀醚得到粗物质，并利用MALDI质谱法进行分析，所出现M＋H峰值对应于该结构1435(预期值为1430)。通过分析性HPLC，梯度70-100％B超过20分钟，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分钟进一步鉴定该物质，所出现的峰值的保留时间为27分钟(检测UV368nm)。
b)包含DSPS和含叶酸脂肽的充气微泡的制备添加1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶内的DSPS(4.5mg)和(a)的产物(0.5mg)的混合物中。接着加入稀氨(pH8)和DMSO(40μl)，超声处理混合物5分钟，80℃下加热混合物5分钟(加热期间振荡)。过滤并冷却该溶液。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间，在加帽混合器上振荡小瓶45秒，随后用去离子水充分洗涤内含物。如下述利用MALDI质谱分析来确认(a)结构掺入到微泡内的情况转移约50μl的微泡至含有90％甲醇(约100μl)的清洁小瓶内。超声处理混合物30秒，并进行MALDI MS分析，出现对应于(a)结构的在1238的M＋H峰值。
c)体外分析如实施例21所详述的体外分析法试验微泡。观察到结合到细胞上的微泡逐渐积累。
实施例56-包含DSPS和用于诊断和治疗应用的苯丁酸氮芥的胆甾醇酯的充气微泡a)4-[4-二(2-氯代乙基)氨基]苯基]丁酸胆甾醇酯的合成添加DIC(170μl，1.10mmol)至苯丁酸氮芥(669mg，2.20mmol)的干燥二氯甲烷溶液(15ml)中。室温下搅拌混合物0.5小时，并添加至胆固醇(387mg，1.00mmol)和DMAP(122mg，1.00mmol)的二氯甲烷溶液(10ml)中。搅拌反应混合物过夜，然后倒在碳酸氢钠饱和水溶液中，进行相分离，以水和盐水洗涤有机相，并干燥(MgSO4)。过滤溶液并浓缩，用柱色谱纯化产物(二氧化硅，三氯甲烷)获得560mg(83％)的无色油。MALDI质谱法鉴定该结构，其M＋H符合预期值674。利用1H(500MHz)和13C(125MHZ)NMR分析法进行进一步鉴定，其光谱与该结构一致。
b)包含DSPS和用于诊断和/或治疗应用的苯丁酸氮芥的胆甾醇酯的充气微泡的制备添加1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶内的DSPS(4.5mg)和(a)的产物(0.5mg)的混合物中。超声处理混合物5分钟，并在80℃下加热5分钟(加热期间振荡)，然后冷却。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间，在加帽混合器上振荡小瓶45秒，随后用去离子水充分洗涤内含物。MALDI质谱法显示在终洗涤溶液中未检测到任何水平(a)的化合物。如下述利用MALDI质谱分析来确认苯丁酸氮芥的胆甾醇酯掺入到微泡内的情况转移约50μl的微泡至含有90％甲醇(约100μl)的清洁小瓶内。超声处理混合物30秒，并进行MALDI MS分析，出现对应于(a)结构的在668的M＋H峰值。
实施例57-包含DSPS和一种含氨酰心安及苯丁酸氮芥的胆固醇衍生物的脂肽(其用于诊断和治疗应用)的充气微泡a)适于固相连接的带保护基的氨酰心安衍生物的合成i)4-[(2，3-环氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯的合成在85℃下，搅拌4-羟苯乙酸甲酯(4.98g，0.030mol)和表氯醇(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小时。冷却反应混合物，蒸馏去掉过量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取残余物，以盐水洗涤，并干燥(Na2SO4)。过滤溶液并浓缩。对暗残余物进行色谱处理(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)得到2.25g(34％)无色油。1H(300MHz)和13C NMR(75MHz)谱与该结构对应。
ii)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯的合成室温下，搅拌4-[(2，3-环氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯(2.00g，9.00mmol)和异丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物过夜。浓缩溶液，将油残余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通过过滤及浓缩获得定量产率的黄色油，其可用于下一步骤而不需进一步纯化。通过1H和13C NMR分析法证实该结构。
iii)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐的合成100℃下加热溶解在6M盐酸(15ml)中的4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]乙酸苯酯(563mg，2.00mmol)溶液4小时。浓缩反应混合物，用水萃取残余物并冻干。1H和13C NMR谱与该结构对应，MALDI质谱法显示M＋H如预期值268。
iv)N-Boc-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氢钠溶液(0.60g，7.2mmol)。添加二-叔-丁基碳酸氢盐(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析监控反应进展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氢盐直到转化完全。将反应混合物倒在硫酸氢钾饱和水溶液中，将有机物质抽提到乙酸乙酯中。以水和盐水洗涤有机相，并干燥(Na2SO4)。过滤获得0.6g粗物质。用层析法纯化产物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。浓缩溶液，用冰乙酸萃取残余物并冻干。产生415mg(56％)白色固体。通过1H和13C NMR分析法证实该结构。
b)氨酰心安官能团化脂肽的合成
利用合适的氨基酸，棕榈酸及(a)的化合物，用手动起泡方法从Fmoc-保护的Rink酰胺MBHA树脂开始以0.125mmol的规模合成上述结构。利用标准的TBTU/HOBt/DIEA方案进行连接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及去除侧-链保护基的保护作用。从醚沉淀粗物质，并以10ml/分钟的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制备性HPLC进行纯化(超过60分钟)。冷冻干燥后，获得38mg纯化的组分(分析HPLC，梯度70-100％B超过20分钟，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分钟检测UV214nm，保留时间25分钟)。利用MALDI质谱法(ACH基质)进一步鉴定产物给出M＋H1258，预期值1257。
c)4-[4-二(2-氯代乙基)氨基]苯基]丁酸胆甾醇酯的合成添加DIC(170μl，1.10mmol)至苯丁酸氮芥(669mg，2.20mmol)的干燥二氯甲烷溶液中(15ml)。室温下搅拌混合物0.5小时，并添加至胆固醇(387mg，1.00mmol)和DMAP(122mg，1.00mmol)的二氯甲烷溶液(10ml)中。搅拌反应混合物过夜，然后倒在碳酸氢钠饱和水溶液中，进行相分离，以盐水洗涤有机相，并干燥(MgSO4)。过滤溶液并浓缩，用柱色谱纯化产物(二氧化硅，三氯甲烷)获得560mg(83％)的无色油。MALDI质谱法鉴定该产物，其M＋H符合预期值674。利用1H(500MHz)和13C(125 MHZ)NMR分析法进行进一步鉴定，其光谱与该结构一致。
d)包含DSPS和一种含氨酰心安及苯丁酸氮芥的胆固醇酯的脂肽的充气微泡的制备添加1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶内的DSPS(4.5mg)和(b)的产物(0.5mg)以及(c)的产物(0.5mg)的混合物中。超声处理混合物5分钟，并在80℃下加热5分钟(加热期间振荡)。过滤该溶液并冷却。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间，在加帽混合器中振荡小瓶45秒，随后用去离子水充分洗涤内含物。如下述利用MALDI质谱分析来确认(b)及(c)的化合物掺入到微泡内的情况转移约50μl的微泡至含有90％甲醇(约100μl)的清洁小瓶内。超声处理混合物30秒，并进行MALDI MS分析，出现668M＋H峰值(其对应于脂肽(b)及胆固醇酯(c)的值)。
e)体外分析如实施例21所详述的体外分析法试验微泡。观察到结合到细胞上的微泡逐渐积累。
实施例58-包含DSPS和含细胞导向氨酰心安及亲脂性甲巯丙脯酸硫醇酯(其具有治疗用途)的充气微泡a)适于固相连接的带保护基氨酰心安衍生物的合成i)4-[(2，3-环氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯的合成在85℃下，搅拌4-羟苯乙酸甲酯(4.98g，0.030mol)和表氯醇(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小时。冷却反应混合物，蒸馏去掉过量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取残余物，以盐水洗涤，并干燥(Na2SO4)。过滤溶液并浓缩。对暗残余物进行色谱处理(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)而得到2.25g(34％)无色油。1H(300MHz)和13C NMR(75 MHz)谱与该结构对应。
ii)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯的合成室温下，搅拌4-[(2，3-环氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯(2.00g，9.00mmol)和异丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物过夜。浓缩溶液，将油残余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通过过滤及浓缩获得定量产率的黄色油，其可用于下一步骤而不需进一步纯化。通过1H和13C NMR分析法证实该结构。
iii)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐的合成100℃下加热溶解在6M盐酸(15ml)中的4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯(563mg，2.00mmol)溶液4小时。浓缩反应混合物，用水萃取残余物并冻干。1H和13C NMR谱与该结构对应，MALDI质谱法显示M＋H如预期值268。
iv)N-Boc-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氢钠溶液(0.60g，7.2mmol)。添加二-叔-丁基碳酸氢盐(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析监控反应进展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氢盐直到转化完全。将反应混合物倒在硫酸氢钾饱和水溶液中，将有机物质抽提到乙酸乙酯中。以水和盐水洗涤有机相，并干燥(Na2SO4)。过滤获得0.6g粗物质。用层析法纯化产物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。浓缩溶液，用冰乙酸萃取残余物并冻干。产生为415mg(56％)白色固体。通过1H和13C NMR分析法证实该结构。
b)氨酰心安官能团化脂肽的合成
利用合适的氨基酸，棕榈酸及(a)的化合物，用手动起泡法从Fmoc-保护的Rink酰胺MBHA树脂开始以0.125mmol的规模合成上述结构。利用标准的TBTU/HOBt/DTEA方案进行连接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及去除侧-链保护基的保护作用。从醚沉淀粗物质，并以10ml/分钟的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制备性HPLC进行纯化(超过60分钟)。冷冻干燥后，获得38mg纯化的组分(分析HPLC，梯度70-100％B超过20分钟，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分钟检测UV214nm，保留时间25分钟)。利用MALDI质谱法(ACH基质)进一步鉴定产物观测M＋H为1258，期望为1257。
c)甲巯丙脯酸的胆烷酸硫醇酯的合成搅拌溶解在二氯甲烷(5ml)中的5-β-胆烷酸(361mg，1.00mmol)和DIC(77μl，0.50mmol)的混合物10分钟，然后添加至甲巯丙脯酸(130mg，0.600mmol)和DBU(180μl，1.20mmol)的二氯甲烷溶液(10ml)中。搅拌反应混合物过夜，然后倒在稀盐酸上。加入三氯甲烷(30ml)。进行相分离，以水和盐水洗涤有机相，并干燥(MgSO4)。过滤溶液并浓缩，接着用色谱仪纯化粗产物(二氧化硅，三氯甲烷/甲醇/乙酸95∶4∶1)。冻干乙腈/水/乙醇混合物可得到产物。得到137mg(49％)白色固体。利用1H(500 MHz)和13C(125 MHZ)NMR分析法鉴定该结构。MALDI质谱法进一步进行鉴定，其正性方式的M＋Na峰值为m/z584。
d)包含DSPS和含细胞导向氨酰心安及亲脂性甲巯丙脯酸硫醇酯(其具有治疗用途)的充气微泡的制备添加1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶内的DSPS(4.5mg)和(b)产物(0.5mg)以及(c)产物(0.5mg)的混合物中。超声处理混合物5分钟，并在80℃下加热5分钟(加热期间振荡)，然后冷却。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间，在加帽混合器上振荡小瓶45秒，随后用去离子水充分洗涤内含物。MALDI质谱法显示在终洗涤溶液中未检测到任何水平的化合物的(b)和(c)化合物。如下述利用MALDI质谱分析来确认(b)及(c)化合物掺入到微泡内的情况转移约50μl的微泡至含有90％甲醇(约100μl)的清洁小瓶内。超声处理混合物30秒，并进行MALDI MS分析，出现分别对应(b)和(c)结构的M＋H峰值。
e)体外分析如实施例21所详述的体外分析法试验微泡。观察到结合到细胞上的微泡逐渐积累。
实施例59-包含磷脂酰丝氨酸和生物素酰胺-PEG-β-Ala-胆固醇以及苯丁酸氮芥的胆固醇酯(其具有诊断和治疗用途)的充气微泡a)胆甾醇基N-Boc-β-丙氨酸盐的合成在惰性气体条件下，添加DIC(510μl)至Boc-β-Ala-OH(1.25g，6.60mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中。搅拌反应混合物30分钟，然后转移到盛有溶解了胆固醇(1.16g，3.00mmol)和DMAP(367mg，3.00mmol)的二氯甲烷溶液(15ml)的烧瓶内。搅拌反应混合物2小时，然后倒在硫酸氢钾水溶液中。在进行相分离后，用氯仿抽提水相。用硫酸氢钾水溶液和水洗涤合并的有机相，并干燥(MgSO4)。过滤溶液，接着用色谱仪纯化粗产物(二氧化硅，三氯甲烷/甲醇95∶1)，得到1.63g(97％)白色固体。利用1H(500MHz)NMR分析法鉴定该结构b)β-丙氨酸胆甾醇酯盐酸盐的合成室温下搅拌溶解了(a)的化合物(279mg，0.500mmol)的1M盐酸1，4-二噁烷溶液(5ml)4小时。浓缩反应混合物以获得定量β-丙氨酸胆甾醇酯盐酸盐。用1H(500MHz)NMR分析法和MALDI质谱法鉴定该结构，其Na峰值为482，预期值为481。
c)生物素-PEG3400-β-Ala-胆固醇添加三乙胺(42μl，0.30mmol)至β-丙酸胆固醇酯盐酸盐(15mg，0.03mmol)的氯仿/湿甲醇(2.6∶1，3ml)溶液中。室温下搅拌混合物10分钟，接着滴加生物素-PEG3400-NHS(100mg，0.03mmol)的1，4-二噁烷溶液(1ml)。室温下搅拌混合物3小时后，蒸发混合物至干燥，急骤层析法纯化残余物以获得白色晶体，产生102mg(89％)。利用MALDI质谱法和NMR(核磁共振)分析法证实该结构。
d)4-[4-[二(2-氯代乙基)氨基]苯基]丁酸胆固醇酯的合成添加DIC(170μl，1.10mmol)至苯丁酸氮芥(669mg，2.20mmol)的干二氯甲烷(15ml)溶液中。室温下搅拌反应混合物0.5小时，然后添加至溶解了胆固醇(387mg，1.00mmol)和DMAP(122mg，1.00mmol)的二氯甲烷溶液(10ml)内。搅拌反应混合物过夜，然后倒在碳酸氢钠水溶液上。在进行相分离后，用盐水洗涤合并的有机相，并干燥(MgSO4)。过滤溶液并浓缩，接着用柱色谱仪纯化产物(二氧化硅，三氯甲烷)，得到560mg(83％)无色油。利用MALDI质谱法鉴定该结构，其M＋H符合预期值674。利用1H(500MHz)和13C(125 MHZ)NMR(核磁共振)分析法进-步进行鉴定，其光谱对应于该结构。
e)充气微泡的制备添加1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶内的DSPS(4.5mg)和(b)产物(0.5mg)以及(c)产物(0.5mg)的混合物中。超声处理混合物5分钟，并在80℃下加热5分钟(加热期间振荡)，然后冷却。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间，在加帽混合器上振荡小瓶45秒，随后用去离子水充分洗涤内含物。MALDI质谱法显示在终洗涤溶液中未检测到任何水平(b)和(c)化合物。如下述利用MALDI质谱分析来确认(b)及(c)化合物掺入到微泡内的情况转移约50μl的微泡至含有90％甲醇(约100μl)的清洁小瓶内。超声处理混合物30秒，并进行MALDI MS(ACH-基质)分析，出现分别对应(b)和(c)结构的M＋H峰值。
实施例60-包含DSPS和含苯丁抑制素衍生物的脂肽(其用于诊断和治疗)的充气微泡a)含苯丁抑制素衍生物的脂肽的合成
利用合适的氨基酸，棕榈酸及(a)的化合物，用手动起泡法从Fmoc-保护的Rink酰胺MBHA树脂开始以0.125mmol的规模合成上述结构。利用标准的TBTU/HOBt/DIEA方案进行连接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及去除侧-链保护基的保护作用。从醚沉淀粗物质，并以10ml/分钟的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制备性HPLC进行纯化(超过60分钟)。冷冻干燥后，获得12mg纯化的组分(分析HPLC，梯度70-100％B超过20分钟，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分钟检测UV214nm，保留时间25分钟)。利用MALDI质谱法(ACH基质)进一步鉴定产物观测M＋H为1315，期望为1214。
b)包含DSPS和含苯丁抑制素衍生物的脂肽(其用于诊断和治疗)的充气微泡的制备添加1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶内的DSPS(4.5mg)和(a)的产物(0.5mg)的混合物中。超声处理混合物5分钟，并在80℃下加热5分钟(加热期间振荡)，然后冷却。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间，在加帽混合器上振荡小瓶45秒，随后用去离子水充分洗涤内含物。MALDI质谱法显示在终洗涤溶液中未检测到任何水平的(b)化合物。如下述利用MALDI质谱分析来确认含氨酰心安的脂肽掺入到微泡内的情况转移约50μl的微泡至含有90％甲醇(约100μl)的清洁小瓶内。超声处理混合物30秒，并进行MALDI MS(ACH-基质)分析，其M＋H峰值为1320(对应于(a)的脂肽)，预期值为1314。
c)体外分析如实施例21所详述的体外分析法检验微泡。观察到结合到细胞上的微泡逐渐积累。
实施例61-包含DSPS和含苯丁酸氮芥的脂肽(其用于诊断和治疗)的充气微泡a)含苯丁酸氮芥的脂肽的合成
利用合适的氨基酸，棕榈酸及(a)的化合物，用手动起泡法从Fmoc-保护的Rink酰胺MBHA树脂开始以0.125mmol的规模合成上述结构。利用标准的TBTU/HOBt/DIEA方案进行连接。利用DIC预激活通过Lys侧-链连接苯丁酸氮芥(以作为对称的酸酐)。置于TFA(其含有5％EDT，5％水，5％乙基甲基硫化物)中2小时从树脂上同时移走肽及去除侧-链保护基的保护作用。以10ml/分钟的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制备性HPLC进行纯化(超过60分钟)10mg等分试样的粗产物。冷冻干燥后，获得30 mg纯化的组分(分析HPLC，梯度70-100％B超过20分钟，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分钟检测UV214nm，保留时间25分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物观测M＋H为1295，期望为1294。
b)包含DSPS和含苯丁酸氮芥的脂肽(其用于诊断和治疗)的充气微泡的制备添加1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶内的DSPS(4.5mg)和(a)的产物(0.5mg)的混合物中。超声处理混合物5分钟，并在80℃下加热5分钟(加热期间振荡)，然后冷却。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间，在加帽混合器上振荡小瓶45秒，随后用去离子水充分洗涤内含物。MALDI质谱法显示在终洗涤溶液中未检测到任何水平的a)的化合物。如下述利用MALDI质谱分析来确认含苯丁酸氮芥的脂肽掺入到微泡内的情况转移约50μl的微泡至含90％甲醇(约100μl)的清洁小瓶内。超声处理混合物30秒，并进行MALDI MS(ACH-基质)分析，其M＋H峰值为1300(预期值为1294)，M＋Na峰值为1324(预期值为1317)。
c)体外分析如实施例21所详述的体外分析法试验微泡。观察到结合到细胞上的微泡逐渐积累。
实施例62-包含DSPS和含氨酰心安及苯丁酸氮芥的亲脂性衍生物的脂肽(其用于诊断和治疗)的充气微泡a)适于固相连接的带保护基的氨酰心安衍生物的合成i)4-[(2，3-环氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯的合成在85℃下，搅拌4-羟苯乙酸甲酯(4.98g，0.030mol)和环表氯醇(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小时。冷却反应混合物，蒸馏去掉过量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取残余物，以盐水洗涤，并干燥(Na2SO4)。过滤溶液并浓缩。对暗残余物进行色谱仪分析(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)而得到2.25g(34％)无色油。1H(300MHz)和13C NMR(75MHz)谱与该结构对应。
ii)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯的合成室温下，搅拌4-[(2，3-环氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯(2.00g，9.00mmol)和异丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物过夜。浓缩溶液，将油残余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通过过滤及浓缩获得定量产率的黄色油，其可用于下一步骤而不需进一步纯化。通过1H和13C NMR分析法证实该结构。
iii)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐的合成100℃下加热溶解在6M盐酸(15ml)中的4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯(563mg，2.00mmol)溶液4小时。浓缩反应混合物，用水萃取残余物并冻干。1H和13C NMR谱与该结构对应，MALDI质谱法显示M＋H如预期值268。
iv)N-Boc-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氢钠溶液(0.60g，7.2mmol)。添加二-叔-丁基碳酸氢盐(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析法监控反应的进展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氢盐直到转化完全。将反应混合物倒在硫酸氢钾饱和水溶液中，将有机物质被抽提到乙酸乙酯中。以水和盐水洗涤有机相，并干燥(Na2SO4)。过滤获得0.6g粗物质。用层析法纯化产物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。浓缩溶液，用冰乙酸萃取残余物并冻干。产率为415mg(56％)白色固体。通过1H和13C NMR分析法证实该结构。
b)氨酰心安官能团化脂肽的合成
利用合适的氨基酸，棕榈酸及(a)的化合物，用手动起泡法从Fmoc-保护的Rink酰胺MBHA树脂开始以0.125mmol的规模合成上述结构。利用标准的TBTU/HOBt/DIEA方案进行连接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及去除侧-链保护基的保护作用。从醚沉淀粗物质，并以10ml/分钟的流量及70-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝0.01％TFA/乙腈)，用制备性HPLC进行纯化(超过60分钟)。冷冻干燥后，获得38mg纯化的组分(分析HPLC，梯度70-100％B超过20分钟，其中A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分钟检测UV214nm，保留时间25分钟)。利用MALDI质谱法(ACH基质)进一步鉴定产物观测M＋H为1258，期望为1257。
c)N-[(s)-3-十六烷基巯-2-甲基丙酰]脯氨酸的合成添加DIEA(188μl，1.10mmol)至溶解了1-碘代十六碳烷(176mg，0.500mmol)和甲巯丙脯酸(120mg，0.550mmol)及DBU(165μl，1.10mmol)的四氢呋喃溶液中(5ml)。70℃下加热混合物2小时，然后浓缩。将残余物倒在硫酸氢钾的饱和水溶液上，用三氯甲烷抽提有机相。用水洗涤有机相，并干燥(MgSO4)。色谱(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH85∶10∶5)纯化该产物，冻干可得到105mg(48％)白色固体。利用1H(500MHz)和13C(125 MHZ)NMR分析法鉴定该结构。MALDI质谱法进一步进行鉴定，其负性方式的M-H值为m/z440(符合预期值)。
d)包含DSPS和含氨酰心安及苯丁酸氮芥的亲脂性衍生物的脂肽(其用于诊断和治疗)的充气微泡的制备添加1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶内的DSPS(4.5mg)和(b)的产物(0.5mg)以及(c)的产物(0.5mg)的混合物中。超声处理混合物5分钟，并在80℃下加热5分钟(加热期间振荡)，然后冷却。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间，在加帽混合器上振荡小瓶45秒，随后用去离子水充分洗涤内含物。MALDI质谱法显示在终洗涤溶液中未检测到任何水平的(b)和(c)化合物。如下述利用MALDI质谱分析来确认(b)及(c)化合物掺入到微泡内的情况转移约50μl的微泡至含有90％甲醇(约100μl)的清洁小瓶内。超声处理混合物30秒，并进行MALDIMS(ACH-基质)分析，出现分别对应(b)和(c)结构的M＋H峰值。
e)体外分析如实施例21所详述的体外分析法试验微泡。观察到结合到细胞上的微泡逐渐积累。
实施例63-包含DSPS和氨酰心安胆固醇衍生物(其用于诊断和治疗)的充气微泡a)4-[(2，3-环氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯的合成在85℃下，搅拌4-羟苯乙酸甲酯(4.98g，0.030mol)和环表氯醇(23.5ml，0.30mol)以及吡啶(121μl，1.5mmol)的混合物2小时。冷却反应混合物，蒸馏去掉过量的表氯醇。用乙酸乙酯萃取残余物，以盐水洗涤，并干燥(Na2SO4)。过滤溶液并浓缩。对暗残余物进行色谱处理(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯7∶3)而得到2.25g(34％)无色油。1H(300MHz)和13C NMR(75MHz)谱与该结构对应。
b)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯的合成室温下，搅拌4-[(2，3-环氧)丙氧基]-苯乙酸甲酯(2.00g，9.00mmol)和异丙胺(23ml，0.27mol)以及水(1.35ml，74.7mmol)的混合物过夜。浓缩溶液，将油残余物溶解在三氯甲烷中，并干燥(Na2SO4)。通过过滤及浓缩获得定量的黄色油，其可用于下-步骤而不需进一步纯化。通过1H和13C NMR分析法证实该结构。
c)4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐的合成100℃下加热溶解在6M盐酸(15ml)中的4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸甲酯(563mg，2.00mmol)溶液4小时。浓缩反应混合物，用水萃取残余物并冻干。1H和13C NMR谱与该结构对应，MALDI质谱法显示M＋H如预期值268。
d)N-Boc-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸的合成添加4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸盐酸盐(2.0mmol)的水溶液(2ml)至溶解在水/二噁烷(2∶1，15ml)中的碳酸氢钠溶液(0.60g，7.2mmol)。添加二-叔-丁基碳酸氢盐(0.48g，2.2mmol)的二噁烷溶液(5ml)。用TCL分析法监控反应进展(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)，并添加二-叔-丁基碳酸氢盐直到转化完全。将反应混合物倒在硫酸氢钾饱和水溶液中，将有机物质抽提到乙酸乙酯中。以水和盐水洗涤有机相，并干燥(Na2SO4)。过滤获得0.6g粗物质。用层析法纯化产物(二氧化硅，CHCl3/MeOH/AcOH 85∶10∶5)。浓缩溶液，用冰乙酸萃取残余物并冻干。产生415mg(56％)白色固体。通过1H和13C NMR分析法检验该结构。
e)N-Boc-β-丙氨酸胆甾醇酯的合成在惰性气体条件下，添加DIC(510μl)至Boc-β-Ala-OH(1.25g，6.60mmol)的二氯甲烷(15ml)溶液中。搅拌反应混合物30分钟，然后转换到盛有溶解了胆固醇(1.16g，3.00mmol)和DMAP(367mg，3.00mmol)的二氯甲烷溶液(15ml)的烧瓶内。搅拌反应混合物2小时，然后倒在硫酸氢钾水溶液上。在进行相分离后，用氯仿抽提水相。用硫酸氢钾水溶液和水洗涤混合的有机相，并干燥(MgSO4)。过滤溶液，接着用色谱仪纯化粗产物(二氧化硅，三氯甲烷/甲醇99∶1)，得到1.63g(97％)白色固体。利用1H(500MHz)NMR分析法证实该结构。
f)N-Boc-β-丙氨酸胆甾醇酯盐酸盐的合成室温下搅拌溶解了(a)的化合物(279mg，0.500mmol)的1M盐酸1，4-二噁烷溶液(5ml)4小时。浓缩反应混合物以获得定量产率的胆甾醇基β-丙氨酸盐盐酸盐。用1H(500MHz)NMR分析法和MALDI质谱法鉴定该结构，其M＋Na峰值为482，预期值为481。
g)N-Boc-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酰-β-丙氨酸胆甾醇酯的合成添加DIEA(26ml，0.15mmol)至N-Boc-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酸(55mg，0.15mmol)与β-丙氨酸胆甾醇酯盐酸盐(74mg，0.15mmol)的DMF溶液(5ml)中。添加HOBT(23mg，0.15mmol)和水溶性碳二亚胺(WSC)(29mg，0.15mmol)。室温下搅拌反应混合物过夜，然后倒在含纯碱(2.5g)和氯化钠(4.0g)水溶液上。用三氯甲烷提取沉淀物质。以水洗涤有机相，并干燥(MgSO4)。过滤溶液并浓缩，接着用色谱仪(二氧化硅，三氯甲烷/甲醇/乙酸95∶4∶1)纯化粗产物(132mg)。浓缩收集的组分，萃取到冰乙酸中然后冻干。得到83mg(69％)黄白色固体。利用1H NMR分析法证实该结构。
h)N-Boc-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯乙酰-β-丙氨酸胆甾醇酯三氟乙酸盐的合成添加三氟乙酸(2ml)至N-Boc-4-[2-羟基-3-[(1-甲乙基)-氨基]丙氧基]苯基乙酰-β-丙氨酸盐(40mg，0.05mmol)的干二氯甲烷溶液(4ml)中。搅拌反应混合物2小时，然后浓缩。冻干乙腈/水混合物获得产物，得到定量产率的白-黄色物质。MALDI质谱法鉴定该产物，其M＋H值如预期值708。
i)包含DSPS和氨酰心安胆固醇衍生物(其用于诊断和治疗)的充气微泡的制备添加1.0ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶内的DSPS(4.5mg)和(h)的产物(0.5mg)的混合物中。超声处理混合物5分钟，并在80℃下加热5分钟(加热期间振荡)，然后冷却。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间，在加帽混合器上振荡小瓶45秒，随后用去离子水充分洗涤内含物。MALDI质谱法显示在洗涤终溶液中未检测到任何水平的(h)的化合物。利用MALDI质谱分析来确认(h)化合物掺入到微泡内的情况。
j)体外分析如实施例21所详述的体外分析法试验微泡。观察到结合到细胞上的微泡逐渐积累。
实施例64-用于导向超声波造影的涂布运铁蛋白/抗生物素蛋白的多特异性充气微泡的制备本例子旨在制备包含可用于导向超声波/治疗的载体的微泡。
a)巯基-官能团化脂质分子(二棕榈酰-Lys-Lys-Lys-Aca-Cys.OH)的合成
利用1mmol氨基酸药筒，在ABI433A自动肽合成仪上从Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂开始以0.25mmol的规模合成上述脂结构。利用HBTU连接化学法预活化所有氨基酸和棕榈酸。将其置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及去除侧-链保护基的保护作用，得到250mg粗品。以9ml/分钟的流量及90-100％B的梯度(A＝0.1％TFA/水和B＝MeOH)，用制备性HPLC纯化(超过40分钟)一份40mg的粗物质。冷冻干燥后，获得24mg纯化物质(分析型HPLC，梯度70-100％B，B＝0.01％TFA/乙腈，A＝0.01％TFA/水检测--UV214nm--产物保留时间＝23分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物预期值M＋H为1096，实测值为1099。
b)包含DSPS(其掺入了含巯基脂质结构)的充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg)和上述(a)的脂质结构(0.5mg)加入到清洁小瓶内，并加入0.8ml1.4％丙二醇/2.4％甘油水溶液。加热混合物5分钟至80℃(加热期间振荡)，在仍然热时用40微米滤器进行过滤。冷却样品至室温并用全氟丁烷气体冲洗液面上空间。在加帽混合器上振荡小瓶45秒，然后置于转板上过夜。用去离子水充分洗涤所形成的微型气泡几次，利用Ellmans试剂分析巯基掺入情况。
c)用荧光素-NHS和硫-SMPB对运铁蛋白和抗生物素蛋白的修饰往2mg运铁蛋白(Holo，人)和2mg抗生物素蛋白的混合物的PBS溶液(1ml)中加入0.5ml含1mg硫-SMPB和0.5mg荧光素-NHS的DMSO溶液。室温下搅拌混合物45分钟，然后以PBS为洗脱液使其流过葡聚糖凝胶200柱。收集蛋白质组分，使用前存储在4℃下。
d)缀合了经修饰的运铁蛋白/抗生物素蛋白的微泡添加1ml(c)经修饰的运铁蛋白抗生物素蛋白蛋白质溶液至(b)的含巯基微泡。调整溶液pH至9，室温下让缀合反应进行2小时。在用去离子水充分洗涤后，对微泡进行Coulter计数分析(81％的在1-7微米之间)及荧光显微观察(观察到高度荧光性的微泡)。
实施例65-通过充气微泡的基因转移本例子旨在制备用于基因转移的导向微泡。
a)包含DSPS和涂布聚-L-赖氨酸的脂肽的充气微泡的制备称取DSPS(4.5mg)和实施例41的脂肽(0.5mg)置于两个2ml小瓶内。往每个小瓶内添加0.8ml丙二醇/甘油(4％)水溶液。80℃分别加热溶液5分钟并振荡，然后冷却溶液至环境温度，液面上空间用全氟丁烷冲洗。在加帽混合器中以4450摆动/分钟振荡小瓶45秒，并放置在转板上5分钟。混合小瓶内的内含物，对所形成的样品在2000rpm下离心洗涤5分钟。除去浮游物质，并加入相同量的蒸馏水。重复一次洗涤操作。将聚-L-赖氨酸HBr(20.6mg)溶解在2ml水中，然后取0.4毫升等分试样并加水补足为2ml。往1.2ml稀释的聚-L-赖氨酸溶液中添加0.12mlDSPS-脂肽的微泡悬液。温育后，用水充分洗涤以除去过量聚赖氨酸。
b)细胞转染在6孔平板上培养内皮细胞(ECV304)至均匀亚汇合层出现。在RPMI基质上制备终体积250μl的含50μgDNA(CLONTECH的增强绿色荧光蛋白质载体)和50μl(a)的微泡悬液的转染混合物。室温下放置混合物15分钟，然后添加1ml完全RPMI基质。除去培养皿中的基质，添加DNA-微泡混合物至细胞中。在细胞培养温箱中培养细胞(37℃)c)超声处理温育15分钟后，使所选择的孔暴露在连续的超声波下，0.5W/cm2，30秒。
d)培养和检查在细胞培养温箱中进一步培养细胞约4.5小时(37℃)。抽吸除去含DNA-微泡的基质，并添加2ml完全RPMI基质。检查前，培育细胞40-70小时。然后除去大多数基质，用荧光显微镜检查细胞。将该结果与对照实验(加入DNA或DNA-聚赖氨酸至细胞中)作比较。
实施例66-内皮细胞的漂浮(其通过具有特异结合内皮细胞的载体的微泡)实施本实验是为了显示本发明可用于分离微泡所导向的细胞。在Nunc培养瓶(chutney153732)中RPMI1640基质上培养人内皮细胞系ECV304(其来源于正常脐带(ATCC CRL-1988))，其中所说的基质加入了L-谷酰胺(200mM)，青霉素/链霉素(10,000U/ml和10,000μg/ml)和10％胎牛血清。当达到汇合时，用胰蛋白酶消化后，以1∶5至1∶7的分比再次培养细胞。将2百万个来自胰蛋白酶化的汇合培养物中的细胞分别添加至五根离心管内。然后将对照微泡或结合内皮细胞的微泡(如实施例21和实施例38所述而制备)按照每管2，4，6，8或10百万个小泡添加至离心管中。400g下离心5分钟后，用Coulter计数器计算管底部的细胞。发现4个或更多个微泡结合到细胞上使得细胞位于离心法管中顶端液体内。通过实施例38的微泡使得所有细胞漂浮，而用实施例21的微泡约50％的微泡漂浮。
实施例67-包含含内皮肽受体亲和性载体的脂肽(其用于导向超声波造影)的二硬脂酰-磷脂酰丝氨酸的充气微泡a)4′-[(3.4-二甲基-5-异噁唑)-氨磺酰]琥珀酸的合成往磺胺二甲基异噁唑(267mg，1.00mmol)的DMF溶液(10ml)中添加琥珀酐(1.00g，10.0mmol)和4-二甲基氨吡啶(122mg，1.00mmol)。80℃下搅拌反应混合物2小时，然后浓缩。用5％小苏打水溶液萃取残余物，以乙酸乙酯提取残余物。以稀释的盐酸酸化水溶液，用乙酸乙酯提取有机物质。利用稀释的盐酸，水，及盐水洗涤有机相，并用活性炭进行处理，干燥(MgSO4)。过滤并浓缩该溶液得到280mg(76％)白色固体。利用1H(300MHz)和13C(75MHZ)NMR(核磁共振)分析法鉴定该结构。利用MALDI质谱法(ACH基质)进一步进行鉴定，其M＋Na峰值m/z390，其M＋H峰值m/z406(均符合预期值)。
b)硫代异噁唑官能团化脂肽的合成
利用合适的氨基酸，棕榈酸及(a)的化合物，用手动起泡法从Fmoc-保护的Rink酰胺BMHA树脂开始以0.125mmol的规模合成上述结构。利用标准的TBTU/HOBt/DIEA方案进行连接。置于TFA(其含有5％EDT，5％水)中2小时从树脂上同时移走肽及去除侧-链保护基的保护作用。从醚沉淀粗物质。通过分析性HPLC分析粗产物(梯度70-100％B超过20分钟，A＝0.01％TFA/水，B＝0.01％TFA/乙腈，流速1ml/分钟检测UV214nm，保留时间25分钟)。利用MALDI质谱法进一步鉴定产物观测M＋H为1359，期望为1356。
b)包含(b)的化合物的充气微泡的制备添加1.0ml1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液至位于小瓶内的DSPS(4.5mg)和(b)的产物(0.5mg)的混合物中。超声处理混合物5分钟，并在80℃下加热5分钟(加热期间振荡)，然后冷却。用全氟丁烷气体冲洗液面上空间，在加帽混合器上振荡小瓶45秒，随后用去离子水充分洗涤内含物。MALDI质谱法显示在终洗涤溶液中未检测到任何水平(b)化合物。如下述利用MALDI质谱分析来确认(b)化合物掺入到微泡内的情况转移约50μl的微泡至含有90％甲醇(约100μl)的清洁小瓶内。超声处理混合物30秒，并进行MALDI MS(ACH-基质)分析，其M＋H峰值为m/z1359(对应于(b)的脂肽)。
权利要求
1.一种可导向的诊断和/或治疗活性剂，其含有包含充有气体的微泡(由形成膜的表面活性剂的单分子层稳定化)的报道物的含水载液悬液，其中所说的活性剂还包括至少一种载体。
2.按照权利要求书1的活性剂，其中所说的气体包括空气，氮气，氧气，二氧化碳，氢气，惰性气体，硫氟化物，六氟化硒，低分子量的碳氢化合物，酮，酯，卤代的低分子量碳氢化合物或任何上述的混合物。
3.按照权利要求2的活性剂，其中所说的气体包括全氟化的酮，全氟化的醚或全氟碳。
4.按照权利要求2的活性剂，其中所说的气体包括六氟化硫或全氟丙烷，全氟丁烷或全氟戊烷。
5.按照上述权利要求之任一的活性剂，其中所说的形成膜的表面活性剂物质包括非聚合的和非可聚合的形成壁的表面活性剂物质，聚合物表面活性剂物质或磷脂。
6.按照权利要求5的活性剂，其中至少75％的形成膜的表面活性剂物质包括单独带有净电荷的磷脂分子。
7.按照权利要求6的活性剂，其中至少75％的形成膜的表面活性剂物质包含一种或多种选自磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酰肌醇，磷脂酸和心肌磷脂的磷脂。
8.按照权利要求7的活性剂，其中至少80％的所说的磷脂包含磷脂酰丝氨酸。
9.按照上述权利要求之任一的活性剂，其中所说的形成膜的表面活性剂物质包括脂肽。
10.按照上述权利要求之任一的活性剂，其中所说的载体选自抗体；细胞粘着分子；细胞粘着分子受体；细胞因子；生长因子；肽激素和其片段；及细胞粘着分子，细胞因子，生长因子和肽激素的受体的非肽兴奋剂/拮抗剂以及非生物活性连接物；低核苷酸和修饰的低核苷酸；DNA-结合药物；蛋白酶底物/抑制剂；组合文库所产生的分子；生物活性小分子。
11.按照上述权利要求之任一的活性剂，其中所说的载体具有对靶的亲和性，其亲和性水平使得活性剂与靶相互作用，但并非牢固地结合在所说的靶上。
12.按照上述权利要求之任一的活性剂，其中所说的载体选自细胞粘着蛋白的配体和具有对应于内皮细胞表面的配体的细胞粘着蛋白。
13.按照上述权利要求之任一的活性剂，其中所说的载体被定位住，这样它们不容易暴露给靶。
14.按照上述权利要求之任一的活性剂，其中所说的载体与报道物共价偶连或连接。
15.按照权利要求1-13之任一的活性剂，其中所说的载体通过静电相互作用与报道物相连接。
16.按照权利要求1-13之任一的活性剂，其中所说的载体借助于抗生物素蛋白-生物素和/或链霉抗生物素蛋白-生物素的相互作用与报道物相连接。
17.按照上述权利要求之任一的活性剂，其还含有为放射性的或作为X光造影剂，光造影探针或旋转标记有效的组分。
18.按照上述权利要求之任一的活性剂，其还包含治疗化合物。
19.按照权利要求18的活性剂，其中所说的治疗化合物是抗肿瘤剂，血液制品，生物效应修饰剂，抗真菌剂，激素或激素类似物，维生素，酶，抗过敏剂，组织因子抑制剂，血小板抑制剂，凝聚蛋白质靶抑制剂，血纤蛋白形成抑制剂，纤溶启动子，抗血管生成药物，循环药物，代谢增强物，抗结核物，抗病毒物，血管舒张物，抗生素，消炎剂，抗原生动物物，抗风湿物，麻醉药，阿片剂，强心苷，神经肌肉阻断剂，镇静剂，局部麻醉剂，全身麻醉剂或遗传物质。
20.按照权利要求18或权利要求19的活性剂，其中所说的治疗化合物通过二硫化物基团与报道物共价偶连或连接。
21.按照权利要求18或权利要求19的活性剂，其中所说的亲脂性或亲脂性衍生化的治疗化合物通过疏水相互作用与稳定化报道物的充气微泡的表面活性剂单分子层相连接。
22.一种组合制剂，该制剂包含i)包含对所选择靶具有亲和性的前导向载体的第一可施用组合物；和ii)包含上述权利要求之任一的试剂的第二可施用组合物，其中所说的试剂包含对所说的前导向载体具有亲和性的载体。
23.按照权利要求22的组合制剂，其中所说的前导向载体是单克隆抗体。
24.一种组合制剂，该制剂包含i)包含权利要求1-20之任一的试剂的第一可施用组合物；和ii)包含可从所说活性剂的靶中取代或释放该活性剂的物质的第二可施用组合物。
25.一种组合制剂，该制剂包含i)包含按照权利要求20的试剂的第一可施用组合物；和ii)包含可还原性切割偶连或连接治疗化合物与报道物(它们存在于所说的第一可施用组合物的试剂中)的二硫化物基团的还原剂的第二可施用组合物。
26.一种制备按照权利要求1的可导向的诊断和/或治疗活性剂的方法，该方法包括使至少一种载体与含充气微泡(其由形成膜的表面活性剂单分子层稳定化)的报道物相偶连或连接，或利用形成膜的表面活性剂(其连接了至少一种载体)产生充气的报道物的微泡。
27.按照权利要求26的方法，其中治疗化合物也与报道物组合。
28.按照权利要求27的方法，其中含巯基的治疗化合物通过在氧化条件下的反应与含巯基的表面活性剂单分子层(其稳定化报道物的充气微泡)相连接从而产生二硫化物基团。
29.按照权利要求1-2l之任一的活性剂的用途，其作为可导向的超声造影剂。
30.一种获得人或非人动物体的增强的影像的方法，该方法包括施用权利要求1-21之任一的活性剂至所说人或非人动物体内，并产生至少一部分身体的超声，磁共振，X光，放射照相或光影像。
31.按照权利要求30的方法，该方法包括以下步骤i)施用对所选择靶具有亲和性的前导向载体至所说的身体内；然后ii)施用权利要求1-21之任一的活性剂，其中所说的试剂包含对所说的前导向载体具有亲和性的载体。
32.按照权利要求31的方法，其中所说的前导向载体是单克隆抗体。
33.按照权利要求30的方法，该方法包括以下步骤i)施用权利要求1-21之任一的活性剂至所说的身体内；然后ii)施用可从所说活性剂的靶中取代或释放该活性剂的物质。
34.按照权利要求30-33之任一的方法，其中所说的活性剂还包含治疗化合物。
35.按照权利要求34的方法，其中所说的治疗化合物通过二硫化物基团与报道物共价偶连或连接，随后施用包含可还原性切割所说的二硫化物基团的还原剂的组合物。
36.一种体外研究权利要求1-21之任一的活性剂导向的方法，其中表达靶的细胞被稳定化于流腔室中，使所说活性剂的载液悬液流过所说的腔室，并检查所说活性剂与所说细胞的结合。
37.按照权利要求36的方法，其中控制载液流量以模拟在体内所遇到的剪切速率。
全文摘要
本发明提供了一些可导向的诊断和/或治疗活性剂(例如超声造影剂),这些活性剂具有包含充气微泡(其由形成膜的表面活性剂单分子层稳定化)的报道物,该报道物至少与一种载体相偶连或相连接。
文档编号A61K49/22GK1234742SQ9719904
公开日1999年11月10日 申请日期1997年10月28日 优先权日1996年10月28日
发明者J·卡拉威斯, P·罗格斯德, A·霍斯特, H·托里沙格, A·尼维斯塔德, H·赫里布斯特, L·霍夫, A·库比特森, D·洛哈格, M·索巴肯 申请人:奈科姆成像有限公司