专利名称：2′,3′－双脱氧－3′硫胞苷在治疗乙型肝炎药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗乙型肝炎(简称乙肝)的化合物的应用，特别涉及核苷类化合物在治疗乙肝的应用。
众所周知，乙肝是公认的世界“三大顽症”之一，素有第二“艾滋病”、“亚癌症”之称，其传染性很强，对人的健康威胁很大。我国现有乙肝患者约2800万人，成为严重的社会问题。但是，对乙肝的治疗，目前尚无特效的方法和药物。α-干扰素被认为是目前治疗乙肝的最好药物，适用于治疗慢性肝炎，通过干扰病毒DNA的复制，再通过人体的新陈代谢来达到逐步降低人体内被感染细胞的数量而缓解炎症。但是，使用干扰素治疗的疗程很长，通常需每两天注射300万单位，疗程六个月，药费昂贵，非常人之所能负担，而且临床疗效也不太理想，特别对母婴传播或新生儿感染HBV-DNA者，由于婴儿体内源性干扰素产生不受影响，干扰素治疗基本无效。也有使用免疫调控药物治疗乙肝的方法，国内采用中医药物调节人体免疫功能，或者采用猪芩多糖并用乙肝疫苗方法，提高机体免疫功能，增强对HBV复制的抑制，但需每天肌肉注射，十分不方便，疗效也不显著。核苷类化合物2′,3′-双脱氧鸟嘌呤核苷目前被用作为抗乙肝的药物，但疗效不理想。
本发明的目的是提供-种能更有效地抑制乙肝病毒的核苷类化合物，用以配制疗效显著，服用方便的抗乙肝药物。
本发明是核苷类化合物2′,3′-双脱氧-3′硫胞苷在治疗人体乙肝病毒的应用，包括结构如下的化合物及其衍生物。
2′,3＇-双脱氧-3′硫胞苷这一化合物由两个对映体组成，即左旋(右旋)-顺式-4-氨基-1-(2-羟甲基-1,3-恶噻兰-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(简称3Tc)，化合物的分子式为C8H11N3O3S，分子量为229.3。Belleau et al曾报道过这是一种可用来抑制爱滋病的化合物(第五届国际爱滋病会议，加拿大、蒙特利尔，1989，论文摘要T.C.O.l)，Coates et al报道通过2′,3′双脱氧-3′硫胞苷的两个立体对映体均能在体外抑制人体免疫缺陷病毒。本发明通过动物和人体乙肝病毒试验表明，具有上述
图1结构的化合物无论是外消旋混合体还是独立对映体均能在体内和体外有效地抑制乙肝病毒。这一结构化合物对于治疗乙肝的效用是通过其对HBV DNA反转录酶的抑制来破坏HBV-DNA的复制而达到的。当服用结构式为
的化合物后，化合物的5′位在细胞间被磷酸化后形成了图1结构化合物的三磷酸酯代谢物(T-TP)，而大大加强了其穿透人体细胞膜的能力并使其在肝细胞内的浓度升高。T-TP进入细胞内后，其5′位三磷酸酯基团排挤掉胞内其他天然核苷化合物而落入病毒DNA反转录酶的受位上，导致DNA反转录酶的合成受阻，从而使病毒DNA的复制中止。同时T-TP也抑制病毒DNA聚合酶的活动，破坏HBV-DNA的合成。T-TP在胞内的半衰期为10.5～15.5小时。
结构式为
化合物的衍生物，是指其在药物学上可接受和认可的酯类、盐类或酯盐类。其酯类通常由羟基-OH与羧基反应而得到，而-CH2-基可由下述基团量换氢，直链或支链烷基(如乙基、正丙基、叔丁基、正丁基)，烃氧烷基(如甲氧甲基)，芳烷基(如苯基)，芳氧烷基(如苯氧基甲基)，芳香基，可置换的二氢吡啶基(如正甲基二氢吡啶基)，磺基酯如烷基或芳烷磺酰基(例如甲烷磺酰基)，硫酸酯，氨基酸酯(如L-缬氨酰或L-异亮氨酰)以及单、双或三磷酸酯等。上述烷基部分均可包含1-16个碳原子，通常是1～4个碳原子并可包含一个或多个双键。盐类可包括碱金属(如钠)、碱土金属(如镁)或铵。如图1结构的2′,3。双脱氧-3′硫胞苷是市售商品，也可通过如下步骤合成丙烯醇与氯化正丁基二苯硅烷反应得丙烯基硅烷醚(94％)；丙烯基硅烷醚溶于氯甲烷(-78℃)臭氧化，加温至室温搅拌过夜、水洗、烘干、浓缩得出硅烷甘醛(96％)。
硅烷甘醛溶于甲苯，加入硫乙醇酸反应，然后以饱和碳酸氢钠洗涤，再以二乙醚提取。提取物水洗、烘干、过滤、浓缩再结晶得出2-(正丁基二苯硅烷氧基)-甲基-5-氧基-1,2-恶噻兰(84％)。
上述-1,2-恶噻兰溶于甲苯，冷却至-78℃搅拌30分钟，加入醋酸酐，过夜搅拌加入水，室温下搅拌1小时，然后以二乙醚稀释过滤浓缩而析出2-(正丁基二苯硅烷氧基)-甲基-5-乙酰氧基-1,3-恶噻兰(64％)。
上述-1,3-恶噻兰溶于二氯乙烷，室温下加入硅烷化胞嘧啶，搅拌10分钟，四氯化锡滴定加入，5小时后浓缩，浓缩物加入三乙胺研磨而得出胞嘧啶硅烷醚中间体(80％)。
上述中间体溶于四氢呋喃，滴定加入正丁基硝基氟溶液，混合物搅拌1小时，真空浓缩，浓缩物加入乙醇/三乙胺(2∶1)而层析出白色固体2′,3。双脱氧-3′硫胞苷(89％)。
其衍生物来源可通过对恶噻兰戊环上的2-羟甲基团的置换而得到。
2′,3′-双脱氧-3′硫胞苷及其衍生物在治疗乙肝的过程中，服用的适当剂量为0.1～750mg/kg体重/日，最佳剂量为1～20mg/kg体重/日，这些化合物可作为药物配方中的活性成分，通过单位剂量服用，其单位剂量可包含10～5000毫克，最佳剂量为50～700毫克。配制药物时，可加上通常使用的一种或多种药学上认可的载体及有选择地加上其他治疗性或预防性的药物成分。服用方式可采用口服、直肠用、鼻用、阴道用或肠胃外用等多种方式，药剂也可制成分离制剂单位。口服药物可制成胶囊、扁囊或片剂；也可制成粉剂或粒剂、溶剂、悬浮剂或乳剂。活性成分也可制成丸制、糖浆或膏剂等。直肠用可制成栓剂，鼻用可制成液体喷剂、粉剂或滴剂。阴道用可制成子宫栓、阴道塞、乳膏乳胶药膏或喷剂，加上活性成份。肠胃外用可制成安瓿浸剂等。上述各种药剂组成中也可包含其他已知的治疗药剂(如抗菌剂或抗病毒药)进行联合治疗使用。
本发明2′,3。双脱氧-3′-硫胞苷治疗乙肝的效果可通过下述对动物及人体抗乙肝病毒的试验并与常用抗乙肝药物α-干扰素和2′,3′-双脱氧鸟嘌呤核苷比较的结果得到证明。
A．动物(北京鸭)乙肝病毒试验结果使新生北京鸭感染上乙肝病毒(HBV)。感染后5～7天从鸭里取血样。使用斑点杂化法检测DHBV DNA(鸭乙肝病毒脱氧核糖核酸)。从呈阳性反应的鸭里取出肝脏并用以产生受乙肝病毒感染的鸭原肝细胞培养物。培养两天后加入抗病毒药于培养基里。培养液每天换一次。再定时取出肝细胞，提取DNA(脱氧核糖核酸)。
DNA在硝基纤维素纸上点样并按下列步骤以32磷标记法检测鸭乙肝病毒DNA。从受乙肝病毒感染的肝细胞里提取DNA，在硝基纤维素滤纸上点样。DNA从6cm直径的细胞培养皿里提取。在感染组里，肝细胞依以下间隔取样，第2天、6天、8天、10天、14天、18天和20天。而在第14天、第18天和第20天里取双样。在治疗组里，肝细胞在第8天、14天和第20天取样。抗病毒药剂在培养的第2天起加入培养皿中，并在培养基每2天换一次的情况下保持加入药的浓度。使用标准苯酚法来提取胞内DNA，培养皿(直径6cm)里的肝细胞约为5×106个，在一种缓冲液里溶解缓冲液里含有0.2％十二烷基硫酸钠150mM Tris BCLpH8.0,10mM乙二胺四乙酸，5mM乙二醇四乙酸和150mM氯化钠。在37℃，两小时条件下，肝细胞溶胞物在0.5mg/ml的键霉蛋白酶E里消化，同时加入提取液使其蛋白质纯化，提取液的组成为苯酚加入等量的20mMTris HCL液pH7.5,0.5mM乙二胺四乙酸和0.1％ 8-羟基喹啉。浓缩的乙酸铵(pH7.0,2.5M)加入到液体里，可产生一种0.25MZ酸铵溶液，再加入两份量的100％乙醇可沉淀出核酸。核酸用乙醇洗涤后干燥得到DNA。DNA在一种特制液里溶解。这种特制液含有12.5mM Tris HCl,pH7.5,10mM乙二胺四乙酸，30％乙二醇和0.01％溴酚兰。取十二分之一的DNA在硝基纤维素滤纸上点样用于分析。
测试的抗病毒药按活性分级以从0(无活性)到++++(高活性)。
用于本试验的抗病毒药是结构式为
化合物的外消旋体和左旋对映体，用于对照的是目前已知的两种抗乙肝病毒药剂2′,3′-双脱氧-鸟嘌呤核苷(ddG)和干扰素α-2B，结果如表1所示。
表1化合物体外抗鸭乙肝病毒的活性结构式为
之化合物外消旋体10ug/ml++++左旋对映体10ug/ml ++++2′,3′-双脱氧鸟嘌呤核苷10ug/ml++INFα-2b50万U/ml +++
B．人体乙肝病毒试验结果(一)人体受乙肝病毒感染之肝细胞置于培养皿单层培养，培养基为10％牛胚胎血清。
抗病毒药按1mg/ml比例在PBS(磷酸盐缓冲液Sigma公司提供)里配制成液体药剂，加乙醇进一步稀释至10ug/ml。
从培养皿里取出培养基并换入新鲜的含有药物的培养基。每两天交换培养基一次，共七次十四天，每个培养皿加4ml液体药剂(在培养基里)六个培养皿一个试验组。
取出的培养基里的肝细胞用1ml PBS洗涤，再按4ml/培养皿比量加入RIPA缓冲液[注]洗涤，肝细胞破碎后转移至试管。RIPA缓冲液配制0.15M氯化钠，1％脱氧胆酸钠，1％三硝基苯，0.1％十二烷基硫酸钠，0.01M Tris HCL PH7.4。
1ml氯仿加入每个试管里用温动搅拌器混匀，然后再加入1ml苯酚于每个试管，离心后移出1ml的液层。
0.2M乙酸铵加入并与2.5倍份的冰冻乙醇混合，混合物-20℃过夜沉积出DNA。DNA离心后以冰冻乙醇洗涤一次然后干燥。
DNA溶于200μ乙二胺四乙酸缓冲液(1mM)里4℃过夜，声音处理20秒，每样20μ在尼龙膜上点样，以斑点杂化法来检测HBV DNA结果如表二所示。
表二图1化合物体外抗人体乙肝病毒的活性结构式为
之化合物抗乙肝病毒活性外消旋体10ug/ml++++左旋对映体10ug/ml ++++2′,3′-双脱氧鸟嘌呤核苷10ug/ml++INFα-2b(50万U/ml) +++C．人体乙肝病毒试验结果(二)把受人体乙肝病毒基因组感染的肝细胞在RPM培养基里培养成活。RPM培养基的成份为5％牛胚胎血清蛋白，2mM谷氨酸和50ug/ml庆大霉素硫酸盐。定期检查培养情况，肝细胞在24个组织培养皿里成活至融合，在用药前维持融合状况2～3天。
抗病毒药在无菌水里溶解，浓度应比用药浓度高100倍，药液需要在培养基稀释。
融合细胞的培养基用药前24小时更换。在10天的用药期间内，培养基应每天更换。在10天的用药期后把培养基收集起来，并贮在-70℃冰冻，用作乙肝病毒DNA分析。为分析胞外肝病毒DNA,0.2ml的培养基样品在25℃下1M氢氧化钠和10倍份的SSC溶液里孵化20分钟(1倍份的SSC液是0.15M氯化钠/0.01M柠檬酸钠，pH7.2)，然后浸到硝基纤维素膜上。用0.5ml的1MTris缓冲液(PH7.2)和2M的氯化钠来双次洗涤样品，使其中和，第一次洗时加上0.5ml的20倍份SSC液。滤膜在2倍份的SSC中冲洗然后在80℃真空烘干1小时。
提纯的乙肝病毒DNA片段用32磷标记并解码。使用斑点杂化法来检测乙肝病毒DNA，使用扫描仪来定量分析32磷。结果见表三。
表三化合物体外抗人体乙肝病毒的活性IC50μ
之化合物 5.62’，3’一双脱氧鸟嘌呤核苷lOug/m]2.2INFa-2b 2.9
权利要求
1.核苷类化合物在治疗人体乙型矸炎药物的应用，其特征是应用的化合物为2′,3′-双脱氧-3′硫胞苷，包括结构为
的化合物及其衍生物，用之作为活性成分，配制成可服用的用于治疗乙肝病毒的药剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述结构的化合物包括两个对映体，即左旋(右旋)-顺式-4-氨基-1-(2-羟甲基-1,3-恶噻兰-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征是其衍生物为药物学上可接受的酯类、盐类或酯盐类。
4.根据权利要求1或2或3所述的应用，其特征是服用的方式是口服、直肠用、鼻用、阴道用或肠胃外用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征是服用的有效成份的适当剂量为0.1～750mg/kg体重/日。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是服用的有效成份的最佳剂量是1～20mg/kg体重/日。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征是药剂有效成份的单位剂量为10～5000毫克。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是药剂有效成份的最佳单位剂量为50～700毫克。
全文摘要
核苷类化合物2′，3′－双脱氧－3′硫胞苷在治疗乙型肝类药物上的应用,包括结构如式的化合物及其衍生物无论是其外消旋混合体还是独立对映体均能在体内和体外有效地抑制乙肝病毒,用以作为活性组分,可配制成易于服用的治疗乙肝药剂,服用方式为口服、直肠用、鼻用、阴道用或肠胃外用等。服用剂量为0.1～750毫克/公斤体重/日,药剂单位剂量为10～5000毫克。通过试验表明,其抑制乙肝病毒的活性优于目前常用的治疗乙肝药物。
文档编号A61K31/70GK1231895SQ9811317
公开日1999年10月20日 申请日期1998年4月15日 优先权日1998年4月15日
发明者姜伟, 朱作才, 邱炜卫 申请人:姜伟, 朱作才, 邱炜卫