专利名称：氟酰褪黑素及其组合物和制剂的制作方法
技术领域：
本发明属于哺乳动物激素类似物的制备及生物调节的应用领域。具体来说是具有诱导睡眠和免疫调节作用的2-乙氧甲酰-5-甲氧-N-三氟乙酰色胺(氟酰褪黑素)及其组合物和制剂。
褪黑素(Melatonin)是1958年美国科学家Lerner首次从牛的松果腺中提纯并鉴定出来，其化学结构为乙酰5-甲氧基色胺(C13H16N2O2)，是松果腺分泌的主要激素，相继又进行化学合成，此后美国的Wurtman(1961),Reiter(1961)，加拿大的Brown(1971)和我国的李经才教授(1978)，到后来数以万计的各国科学家相继对松果腺及褪黑素功能进行深入研究。结果表明，机体松果腺分泌的激素褪黑素受光照调节，光照可抑制褪黑素分泌，因此，褪黑素在体素白天浓度非常低，夜晚则显著升高。褪黑素通过其浓度变化在体内表达环境周期信号，机体则通过感受褪黑素浓度来调节其功能，因而褪黑素在机素与环境之间信息传递过程中起关键作用。褪黑素可以调制机体功能内在运行规律，使其与环境周期同步，从细胞一直到整体水平时机体产生强大的调节作用，使机体维持内环境稳态。内环境稳态是生命活动赖以进行的基本保证，褪黑素维持内环境稳态，在生命科学上也称其为整合作用，以此整合作用为核心，褪黑素在不同的场合，表现出不同的生物活性。如校准生物钟功能，诱导正常睡眠，维持正常睡眠周期及睡眠时间，提高睡眠质量。褪黑素还有增强免疫，抗自由基，调节性功能及抗衰老作用。所有这些功能对提高机体生活质量有重要的意义。由于褪黑素是内源性生物活性物质，作用范围十分广泛，寻找在某些方面具有侧重的衍生物，将有更重要的应用价值。因此，世界专利IP89/01472和美国专利USP5,093,352公开了用于治疗抑郁症的褪黑素衍生物；中国专利CN1107701A公开的褪黑素衍生物，用于调节睡眠，所有已经公开的专利文献均未覆盖氟酰褪黑素及其类似物，本发明将公开如式Ⅰ结构的新的褪黑素衍生物，2-乙氧甲酰-5-甲氧-N-三氟乙酰色胺，用于提高免疫功能和诱导睡眠。本项发明所涉及的化合物，并未见于已经公开的文献和专利中。
本发明的目的是提供一种新的褪黑素衍生物，并将其组成组合物，制成制剂用于增强免疫功能并调节睡眠。
本发明的目的是通过如下方案实现的它是以褪黑素为先导合成的2-乙氧甲酰-5-甲氧-N-三氟乙酰色胺(氟酰褪黑素)，其结构如式Ⅰ化合物
式Ⅰ化合物式Ⅰ化合物与钙源，维生素B6或中枢抑制剂组成组合物、其中，各组分的重量配比如下氟酰褪黑素5-80；钙源0-90；维生素B60-5；中枢抑制剂0-20；其质0-5。
如上所述的制品其特征在于使用的钙源是任何一种食用或药用钙源或钙螯合物，在增补剂中常用的经典钙源如下碳酸钙、磷酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙、草酸钙、甘氨酸钙、动物骨钙、牡蛎钙、活性钙。其他形式的钙如果能被人体吸收的话也能被使用。
使用的中枢抑制剂包括巴比妥类，苯二氮茈卓类，r氨基丁酸等临床使用的中枢抑制剂。使用的维生素B6是食用或药用等级。
基质是一些食品和制药业常用的辅料。如微晶纤维素、淀粉、糊精、羟甲基纤维素纳、羟基丙基甲基纤维素等用于稀释或赋形的材料。
制剂为药学常用制剂，如片剂、控释片、胶囊、冲剂、贴剂、膜剂、膏剂等。
和以往的发明相比，本发明的优点在于1、合成了全新的褪黑素衍生物，在2位引入乙氧甲酰基，在色胺N处引入三氟乙酰基。
2、证实了将式Ⅰ化合物组成组合物有更好的效果。
3、将式Ⅰ化合物制成各种制剂。
4、证实了式Ⅰ化合物的诱导睡眠和免疫调节作用。
生物活性试验由2-乙氧甲酰-5-甲氧-N-三氟乙酰色胺(简称氟酰褪黑素)制成制剂并测试其作用如下Ⅰ、促进睡眠作用一、材料和方法1、受试物氟酰褪黑素片由沈阳药科大学提供，批号970806，含量3mg/片，为标示量的90-110％。临用时用0.3％吐温80水溶液溶解供试。
2、动物昆明种小鼠，由沈阳药科大学动物室提供，动物合格证号辽实动字527号。动物体重20-23g，雌雄各半，每笼十只群养，自由摄食饮水。
3、实验方法3.1．氟酰褪黑素片对小鼠行为活动的影响取40只小鼠，随机分为4组，每组10只。第一组灌胃(ig)给予氟酰褪黑素片溶剂0.3％吐温80水溶液，10ml/kg。第2-4组分别ig氟酰褪黑素片400,200,100mg/kg，容量10ml/kg。灌胃后，观察动物的活动状态，翻正反射是否消失及睡眠情况。
3.2．氟酰褪黑素片对小鼠自主活动的影响取小鼠60只，随机分为6组，每组10只。第一组ig氟酰褪黑素片溶媒10ml/kg，第2-5组分别ig，氟酰褪黑素片400,200,100,50mg/kg，第6组ig褪黑素400/mg/kg，容量为10ml/kg。灌渭30分钟后，分别将小鼠放入小动物自发活动记录仪中，记录10分钟动物自主活动次数。
3.3．对戊巴比妥钠睡眠时间的影响取小鼠60只，随机分为6组，每组10只，第一组ig氟酰褪黑素片溶媒，第2-5组ig氟酰褪黑素片50,25,5和0.5mg/kg，第6组ig褪黑素50mg/kg，容量为10ml/kg,30分钟后，全部小鼠均腹腔注射戊巴比妥钠45mg/kg，尔后记录各组小鼠的睡眠时间二、结果1、氟酰褪黑素片对小鼠行为活动的影响给予氟酰褪黑素片400mg/kg后30分钟，小鼠活动减少，大部分呈昏睡状态，部分(1-2只)动物仍有活动，翻正反射均不消失，动之即醒。给药后90分钟，小鼠仍呈闭眼休息状态，200mg/kg剂量组小鼠，用药后，活动减少不明显，100mg/kg剂量对小鼠的作用与对照组无明显区别。
2、氟酰褪黑素片对小鼠自发活动的影响氟酰褪黑素给药后，动物的活动减少，与对照组相比，三个剂量均可减少小鼠的自主活动次数，其中400,200mg/kg组与对照组相比有非常显著差异，P＜0.01；100mg/kg组有显著差异，P＜0.05。
表1、氟酰褪黑素片时小鼠自发活动的影响(X±SD)组别 剂量(mg/kg)自主活动次数(次/10分钟)对照组 1752±45氟酰褪黑素片 400 916±375**氟酰褪黑素片 200 1543±91**氟酰褪黑素片 100 1661±106*氟酰褪黑素片 50 1661±106*褪黑素片 400 1262±271**n=10，与对照组相比**p＜0.01,*P＜0.053、氟酰褪黑素片对戊巴比妥钠催眠时间的影响给予氟酰褪黑素片的动物，均显著延长戊巴比妥钠催眠时间(P＜0.01，表2)，提示氟酰褪黑素片具有增强中枢抑制药的作用。
表2．氟酰褪黑素片对戊巴比妥钠催眠时间的影响(X±SD)组别 剂量(mg/kg)睡眠时间(分)时照组17.5±6.7氟酰褪黑素片5069.2±10.9**氟酰褪黑素片2546.3±17.9**氟酰褪黑素片 529.5±7.6**氟酰褪黑素片 0.523.4±8.3**褪黑素片5052.9±11.5**n=10，与对照组相比**P＜0.01三、小结氟酰褪黑素片给小鼠口服100-400mg/kg，使动物的自主活动次数减少，呈镇静及昏睡状态，0.5-50mg/kg氟酰褪黑素与戊巴比妥钠同用，则显著延长戊巴比妥钠催眠时间。说明氟酰褪黑素片具有镇静、催眠、与中枢抑制药组成组合物可增强活性作用。
Ⅱ．免疫调节作用氟酰褪黑素(FAMT)及其它衍生物对环磷酰胺(CY)所致免疫低下小鼠碳粒廓清能力的影响小鼠80只，随机分为8组生理盐水组，腹腔注射(ip)生理盐水连续给药7天5ml/kg/d；CY组ip CY20mg/kg/d5天；FAMT+CY组，ip CY同时ip褪黑素40ug/kg/d7天；另5组ip5个褪黑素衍生物，给药方法同褪黑素。末次给药后12小时，测小鼠廓清指数和吞噬指数，结果见表3。由表3可见，TCMMT,FAMMT两组小鼠廓清指数及吞噬指数均显著高于CY组(P＜0.01)。说明TCMMT和FAMMT均能增强单核巨噬细胞系统的吞噬功能，使CY所致小鼠非特异性免疫功能低下得以显著提高。
表3．褪黑素衍生物对环磷酰胺(CY)所致免疫低下小鼠碳粒廓清能力的影响组别 廓清指数吞噬指数(K,×10-2) (a)NS 8.035±1.480 7.597±1.127CY 4.768±0.7967 5.979±0.2930MT+CY 5.421±1.278 6.654±0.6947TAMMT+CY5.334±1.811 5.767±0.8749TBMMT+CY6.271±1.456*6.925±0.7534TCMMT+CY9.565±2.211**7.467±0.9414**FAMMT+CY8.864±1.602**8.433±0.8685**FEMMT+CY5.508±1.725 6.162±0.8551*p＜0.05 vs CY group,**p＜0.01 vs CY groupⅠ．毒性实验昆明种健康小鼠，42日龄，体重18-21g，由沈阳药科大学动物室提供，动物合格证号辽实动字第527号。将动物按每组10只，随机分组后置于恒温(20±1℃)，恒湿(55±5％),12小时光照(07∶30-19∶30),12小时黑暗，隔音的动物室内，自由摄食，饮水，适应上述环境一周后用于实验。
用简化机率单位法测定LD50取100只小鼠，雌雄各半，按性别随机分成5组，每组雌雄各10只，各组按1∶0.7剂距，给药剂量分别为4000,2800,1960,1372,960mg/kg(氟酰褪黑素用0.3％CMC助溶)。均按20ml/kg容量灌胃不同浓度药物。用药前禁食给水一夜，给药后观察动物的中毒症状，记录14天内动物的死亡数，计算出LD50及95％可信限。
小鼠灌胃给药后，动物活动减少，高剂量组动物给药后15分，倦缩一团，偶有抽搐，继而翻正反射消失，呈麻醉状，死亡多发生在4小时内，对死亡动物进行解剖，尸检发现肠内胀气，余未见异常。用简化机率单位法计算LD50，急性毒性试验结果如表4表明表4．小鼠灌胃给药的LD50组别 剂量 对数剂量 动物数 死亡动 死亡率 机率单位LD及95％可信限(mg/kg)物数 (mg/kg)40003.6021 10 10 1.00 7.400雄28003.4472 10 6 0.60 5.52319603.2922 10 6 0.60 5.5232006.2±286.6性13723.1374 10 2 0.20 4.2589602.9823 10 0 0.00 2.60040003.6021 10 10 1.00 7.400雌28003.4472 10 6 0.60 5.52319603.2922 10 6 0.60 5.5232059.6±292.6性13723.1374 10 1 0.10 3.7189602.9823 10 0 0.00 2.600雄性小鼠的LD50为2006.2(1719.6-2292.8)mg/kg，雌性小鼠的为2059.6(1776.9-2352.2)mg/kg，无明显的性别差异。Ⅱ．制剂急性毒性用简化机率单位法测定LD50，由于给药容量的限制未能测出，故测定小鼠口服用药后的最大耐受量。将40只小鼠，雌雄各半，随机分为两组，分别给予最大浓度、最大允许体积的氟酰褪黑素片(588mg/kg)，尔后连续观察14天动物的行为变化及中毒表现。
小鼠灌胃给药后，从10分钟开始，动物活动减少、呈睡眠状，但无翻正反射消失，持续约5小时，尔后恢复正常，此后至14天，未见其他任何改变，推测褪黑素片的LD50大于588mg/kgⅢ．亚急性毒性实验为进一步揭示氟酰褪黑素片的毒性作用，本试验采取口服给予氟酰褪黑素片连续30天，观察小鼠用药后的变化及其对药物反应。
取60只小鼠，雌雄各半，随机分为3组，每组雌雄各10只，分别经口给予氟酰褪黑素片溶媒及氟酰褪黑素片50,200mg/kg，每天灌胃给药一次，连续30天，同时观察动物的行为变化及中毒表现。
小鼠口服给药后，高剂量组小鼠活动有所减少，4-5小时恢复，其他状态均无显著变化，体重正常增长(表5,6)，未见任何毒性反应及死亡，提示氟酰褪黑素片在200mg/kg以下剂量连续应用是安全的。
表5．氟酰褪黑素片对雄性小鼠体重的影响(X±SD)时间(天)对照组氟酰褪黑素片50mg/kg氟酰褪黑素片200mg/kg020.4±1.320.5±1.420.3±1.0122.1±1.520.9±1.621.5±1.6323.5±1.923.6±1.823.8±1.5525.3±1.725.1±1.724.9±1.01026.7±1.826.8±1.526.2±1.320 30.2±1.930.00±2.3 29.0±2.130 33.3±2.132.1±2.332.1±2.9n=10，与时照组比*P＞0.05表6．氟酰褪黑素片对雌性小鼠体重的影响(X±SD)时间(天)对照组氟酰褪黑素片50mg/kg氟酰褪黑素片200mg/kg020.3±1.020.6±1.2 20.9±1.31 21.2±1.221.5±1.521.1±1.13 22.4±1.422.3±0.922.2±1.25 23.4±1.323.1±1.423.0±1.61025.4±1.724.7±1.325.8±1.52027.9±1.627.7±1.828.0±1.63029.8±2.330.4±2.129.3±1.9n=10，与对照组比P＞0.05实施例下述实施例是为了更好阐述本发明，并不是用来限制发明的范围。
实施例1由2-乙氧甲酰-5-甲氧-N-三氟乙酰色胺(简称氟酰褪黑素)与维生素B6及其它辅料组成的组合物制成片剂。
氟酰褪黑素片处方氟酰褪黑素 3.0g维生素B6 10.0g碳酸钙75.5g微晶纤微素11.0g硬脂酸镁 适量制成 1000片制法将维生素B6粉碎，过6号筛，再将微晶纤微素置80-100℃烘干2小时备用。
按处方比例，称取原、辅料混合，再加入硬脂酸镁混匀，用6mm冲模(平面直角)，粉末直接压片处方依据处方中的维生素B6是谷氨酸脱羧酶的辅酶促进谷氨酸脱羧成GABA而加强氟酰褪黑素的诱导睡眠作用。故将其加入处方中。在氟酰褪黑素的结构中，有酰胺健，迂水易于失活。本方每片中主要成分(氟酰褪黑素、维生素B6)含量较小(共13mg)，可借助辅料的作用来弥补其物理性质的不足，这一点为考虑粉末直接压片，奠定了处方设计的基础。参照国外类似产品的处方，其处方中均未加糖、盐、淀粉、防腐剂及人工色素，亦不含谷物大豆、小麦、酵母和乳制品等。因而，我们设计处方时，也不加入上述物质，只选用无生理活性，具有较好的填充、压缩成型、粘和作用的、碳酸钙、微晶纤微素为主要辅料，加入适量硬脂酸镁，可压制出质量合格的片剂。
本品采用粉末直接压片工艺，可防止光、湿、热对氟酰褪黑素等的破坏，并可简化工序、将低成本。处方中采用的碳酸钙具有较好的流动性，且比重较大，压片时粉尘飞扬较少；加入适量的微晶纤微素，可增加片剂的崩解性能，增加片剂的可压性，防止碎片。试验证明，整个处方，工艺较为合理，适于工业化生产工艺说明1．所有原、辅料均需过6号筛，以利于物料混合，含量均匀。
2．原、辅料混合时，应严格按“等量递加稀释法”进行，保证氟酰褪黑素，维生素B6的含量均匀度符合要求。
3．生产中应注意防潮，避免光、热辐射，保证氟酰褪黑素等的稳定性。
4．选用包装材料注意防潮和避光。
实施例2． 氟酰褪黑素缓释片处方氟酰褪黑素 3.0g微晶纤微素 11.0g乙基纤微素 5.0g肠溶型丙烯酸树脂(Ⅰ)适量肠溶型丙烯酸树脂(Ⅱ)适量硬脂酸镁适量淀粉适量制成 1000片制法将氟酰褪黑素0.5g，淀粉10g和微晶纤维素3g过筛混合均匀用10％淀粉浆制颗粒的速释部分，另取乙基纤微素5.0g，肠溶型丙烯酸脂(Ⅰ)和肠溶型丙烯酸树脂(Ⅱ)适量用乙醇浸泡溶解，再取氟酰褪黑素2.5g微晶纤微素8g过筛混合均匀，用上述溶液制软材，过20目筛制粒，于50℃干燥，整粒，得缓释部分，将速释和缓释部分颗粒混合再加入硬脂酸镁混匀，用6mm冲模(平面直角)，压片。每片含氟酰褪黑素3mg。
权利要求
1．氟酰褪黑素及其组合物和制剂，其特征在于以褪黑素为先导合成的2-乙氧甲酰-5-甲氧-N-三氟乙酰色胺(氟酰褪黑素)，其结构如式Ⅰ化合物
式Ⅰ化合物
2.根据权利要求1所述的氟酰褪黑素及其组合物和制剂，其特征在于所述化合物是由式Ⅰ化合物、钙源、维生素B6或中枢抑制剂组成，其中各组分的重量配比如下氟酰褪黑素5-80；钙源0-90；维生素B60-5；中枢抑制剂0-20；基质0-5。
3．根据权利要求2所述的氟酰褪黑素及其组合物和制剂，其特征在于钙源是任何一种食用或药用钙源或钙螫合物，在增朴剂中常用的经典钙源如下碳酸钙、磷酸钙、柠檬酸钙、葡萄糖酸钙、草酸钙、甘氨酸钙、动物骨钙、牡蛎钙、活性钙，其他形式的钙如果能被人体吸收的话也能被使用。
4.根据权利要求2所述的氟酰褪黑素及其组合物和制剂，其特征在于所述的中枢抑制剂包括巴比妥类，苯二氮卓类，r氨基丁酸。
5．根据权利要求2所述的氟酰褪黑素及其组合物和制剂，其特征在于基质是一些食品和制药业常用的辅料，如微晶纤维素、淀粉、糊精、羟甲基纤维素钠、羟基丙基甲基纤维素。
6．根据权利要求l或2所述的氟酰褪黑素及其组合物和制剂，其特征在于其制剂为各种药用制剂。
全文摘要
本发明涉及的是具有诱导睡眠和免疫调节作用的2－乙氧甲酰－5－甲氧－N－三氟乙酰色胺(氟酰褪黑素)及其组合物和制剂。它可促进生物调理作用的发挥,它以褪黑素为先导合成的2－乙氧甲酰－5－甲氧－N－三氟乙酰色胺(氟酰褪黑素),其结构如式Ⅰ化合物。组合物是由式Ⅰ化合物、钙源、维生素B6或中枢抑制剂组成,其中各组分的重量配比如下:氟酰褪黑素5—80;钙源0—90;维生素B60—5;中枢抑制剂0—20;基质0—5。本发明可制成各种药用制剂。
文档编号A61K33/06GK1231175SQ9811389
公开日1999年10月13日 申请日期1998年4月8日 优先权日1998年4月8日
发明者李经才, 徐峰, 陈吉祥, 李绮云, 付爱玲 申请人:沈阳药科大学