甲肝－麻疹二联疫苗及其生产方法

专利名称：甲肝－麻疹二联疫苗及其生产方法
技术领域：
本发明涉及甲型肝炎-麻疹二联疫苗组合物及其冷冻干燥制剂。本发明进一步涉及制备所说的甲型肝类-麻疹二联疫及其冷冻干燥制剂的方法。
自1991年由联合中国儿童基金会和世界卫生组织等国际组织发起并推行“儿童疫苗计划”(Children’s vaccine initiative,CVI)以来，世界上许多从事疫苗研究与开发的实验室和公司都在致于新疫苗的研制。这些新疫苗应该是多价的、热稳定的，并且是可以以口服或气雾形式接种的。从临床应用角度看，人们希望通过使用联合疫苗，经一次注射即可免疫接种能够有效地预防两种或多种疾病的两种或多种病毒和/或细菌抗原，以降低接种费用、减少保健医生和防疫部门的工作量、简化计划免疫档案的保管，从而改善目前婴幼儿童免疫接种率低的现状。近年来，已被批准的新型联合疫苗是全细胞白百破(白喉、破伤风类毒素和百日咳联合制剂)与流感嗜血杆菌B组合而成的四联疫苗。另外，鉴于用同一个注射器投用混合疫苗制品的可行性，有关原则也已应用于在人体不同部位同时接种不同疫苗制剂的所谓“混合与配比”程序。然而，迄今为止尚没有涉及甲肝疫苗与其他病毒减毒活疫苗如麻疹疫苗组合以制备二联病毒活疫苗的报导，特别是还没有在同一敏感宿主细胞株内，相继接种两种病毒以制备二联病毒减毒活疫苗的报导。
因此，本发明的一个目的是提供甲型肝炎-麻疹二联疫苗组合物，所说的二联疫苗组合物含有彼此互不干扰的，分别具有预防有效的病毒滴度的甲型肝炎减毒活病毒和麻疹减毒活病毒，并且含有或不含病毒疫苗保护剂。
根据本发明的甲型肝炎-麻疹二联疫苗组合物，其中甲型肝炎活疫苗的有效病毒滴度为105.5-6.5TCID50/ml，麻疹活疫苗的有效病毒滴度为103.5-5.0TCID50/ml。
根据本发明的甲型肝炎-麻疹二联疫苗组合物，所说的二联疫苗组合物是冷冻干燥形式的。
根据本发明的甲型肝炎-麻疹二联疫苗组合物，其中所说的病毒活疫苗保护剂由重量/体积比(w/v)为0-2％的人血清白蛋白、0.5-1％的明胶、5-10％的海藻糖、0.75-1.5％的谷氨酸钠、0.05-0.1％的抗坏血酸、0.5-2.8％的尿素、5-10％山梨醇和0.5-1％的肌醇组成。
本发明的另一个目的是提供生产甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗的方法，该方法包括将按常规方法增殖得到的病毒滴度为105.5-6.5TCID50/ml的甲型肝炎减毒活疫苗原液与病毒滴度为103.5-5.0TCID50/ml的麻疹减毒活疫苗原液按适当比例混合。
本发明的再一个目的是提供利用同一宿主细胞基质生产甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗的方法，该方法包括以下步骤1)分别提供按常规方法传代减毒的甲型肝炎活疫苗病毒毒种和减毒的麻疹活疫苗病毒毒种；2)用步骤1)中提供的减毒的甲型肝炎活疫苗病毒接种人胚肺二倍体细胞并在适当条件下培养所说的细胞以增殖病毒，当甲型肝炎病毒感染细胞的阳性感染率达到75％以上时，再次接种步骤1)提供的麻疹减毒活疫苗病毒并继续培养之；3)当甲型肝炎病毒感染细胞的阳性率达到90％以上，并且90％以上的二倍体基质细胞出现麻疹病毒所致的典型细胞病变时，收获细胞并分离细胞培养物上清，得到所需的甲型肝炎-麻疹二联活病毒疫苗原液。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的甲型肝炎病毒感染二倍体细胞基质的感染率是用标准的免疫荧光法监测的。
根据本发明这一目的的另一个优选实施方案，其中所说的方法进一步包括将按步骤3)得到的含甲型肝炎-麻疹减毒二联活疫苗病毒原液按大约1∶1的比例与适当的病毒活疫苗保护剂混合，并按常规方法冷冻干燥之。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的病毒活疫苗保护剂基本上由重量/体积比(w/v)为0-2％的人血清白蛋白、0.5-1％的明胶、5-10％的海藻糖、0.75-1.5％的谷氨酸钠、0.05-0.1％的抗坏血酸、0.5-2.8％的尿素、5-10％的山梨醇和0.5-1％的肌醇组成。
本发明的再一个目的是提供制备如上文限定的甲型肝炎-麻疹二联活疫苗的冷冻干燥制剂的方法，该方法包括1)分别提供具有有效病毒滴度的甲型肝炎病毒活疫苗原液和麻疹病毒活疫苗原液，以得到混合的悬液形式的甲型肝炎-麻疹二联病毒活疫苗；2)在步骤1)中所述的二联病毒活疫苗原液中，按大约1∶1(v/v)的比例加入如上文限定的病毒活疫苗保护剂并均匀混合之；3)冷冻干燥步骤2)中得到的疫苗组合物。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的步骤3)包括首先将所说的疫苗组合物于大约-20至-50℃的温度下预冷冻3至6小时，然后在适当的冻干装置中于28-35℃下真空干燥10至20小时。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的甲肝病毒有效滴度为105.5-6.5TCID50/ml，麻疹病毒有效滴度为103.5-5.0TCID50/ml。
本发明提供由彼此不干扰的，分别有适当的病毒滴度的甲型肝炎减毒活病毒和麻疹减毒活病毒组成的甲型肝炎-麻疹二联疫苗组合物，该二联疫苗组合物可以含有或不含有病毒活疫苗保护剂。
麻疹是一种由麻疹病毒经呼吸道传播的，并且经初次免疫和加强免疫接种后即可获得终生免疫效果的严重传染病。一般在婴儿8-9月令进行初次免疫接种，并在12月令左右进行再次加强接种，从而使被接种者获得终生免疫力。由于儿童计划免疫(EPI)工作的推行，麻疹将成为继脊髓灰质炎后第二个在全球范围被彻底消灭的传染病。目前在中国普遍使用的麻疹疫苗是基于麻疹病毒株长-47或沪-191的活疫苗，并且大多是利用鸡胚原始细胞株进行传代培养的。然而，我们的研究表明，使用人胚肺二倍体细胞单层或细胞悬液作为麻疹病毒传代增殖的基质细胞将有利于病毒的增殖和病毒抗原性的保留。
另一方面，如众所周知，甲型肝炎是一种由自然界广泛存在的甲型肝炎病毒引起的全球性高发病率急性传染病。近年来，我们的实验室使用自己开发的减毒甲型肝炎病毒株H-V-1作为种子病毒，并利用人胚肺二倍体细胞作为基质细胞株，实现了甲肝减毒活疫苗的工业化大规模生产，取得了大量研究与生产实践经验。到目前为止，已使用该疫苗接种易感人群达8000万人份以上，其不仅具有极好使用安全性，而且一次免疫接种的保护率可达95％以上，二次免疫接种的保护率达到100％。
我们在长期研究和生产实践中发现，人二倍体细胞不仅是甲型肝炎病毒的良好宿主，而且也是麻疹疫苗病毒株的良好宿主。特别是，我们发现麻疹病毒在人胚肺二倍体宿主细胞内的增殖速度更快。具体地说，我们已不可预先地发现，在人胚肺二倍体细胞基质上首先接种甲肝减毒活疫苗毒种后，在适当的培养基中将细胞培养大约2-3周，当甲型肝炎病毒增殖到足够高的病毒滴度(例如大约105.5-6.5TCID50/ml)时，接种麻疹减毒活病毒并继续培养。大约一周后，两种活病毒几乎同时达到相应的高增殖水平。然后可分离得到含有两种减毒活病毒的二联疫苗原液。这一发现构成了我们使用在同一宿主细胞株(例如人胚肺二倍体细胞株)增殖两种减毒活疫苗病毒株，以制备甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗的基础。
当然也可以分别制备两种有适当病毒滴度的病毒疫苗原液，并按适当的比例混合两种减毒的活病毒原液，以制得悬液形式的甲肝-麻疹二联减毒活疫苗。这里所说的适当病毒滴度，一般是指甲肝病毒滴度为105.5-6.5TCID50/ml，麻疹病毒滴度为103.5- 5.0TCID50/ml。
因此，本发明进一步提供利用同一宿主或基质细胞生产甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗的方法，该方法包括1)分别提供按常规方法传代减毒的甲型肝炎活疫苗病毒毒种和减毒麻疹活疫苗病毒毒种；2)用步骤1)中提供的减毒的甲型肝炎活疫苗病毒接种人胚肺二倍体细胞并在适当条件下培养所说的细胞以增殖病毒，当甲型肝炎疫苗感染细胞的阳性感染率达到75％以上时，接种步骤1)中提供的麻疹减毒活疫苗病毒，并继续培养之；3)当甲型肝炎病毒感染细胞的阳性率达到90％以上，并且90％以上的二倍体基质细胞出现麻疹病毒所致的典型细胞病变时，收获细胞并分离细胞培养物上清，得到所需的甲型肝炎-麻疹二联活病毒疫苗原液。
为了制备本发明的甲型肝炎-麻疹二联疫苗，首先按照已知方法分别制备甲型肝炎减毒活疫苗病毒原液和麻疹减毒活疫苗病毒原液。为此，例如可以按照中国专利92114998.0中描述的方法，制备基于甲型肝炎H-V-1病毒株的减毒活疫苗种子病毒(毒种)。同时，按照中国生物制品标准化委员会制定的生物制品规程(1995版)，使用长-47或沪-191麻疹病毒株制备种子病毒。
甲型肝炎病毒可在许多培养的组织细胞例如人胚肺二倍体细胞内增殖，但增殖速度相对较慢，而且不会引起形态学上明可见的细胞病变。相反，麻疹病毒不仅可在许多原代或继代细胞内增殖，而且增殖周期相对较短，在同样时间内病毒的增殖产率较高，并且可产生典型的融合巨细胞细胞样病变。特别是我们的实验进一步表明，人胚肺二倍体细胞是上述甲型肝炎疫苗病毒株和麻疹疫苗病毒株的敏感主细胞，因此我们选用人胚肺二倍体细胞作为甲肝病毒和麻疹病毒的优选的共同宿主细胞株，用于制备本发明的甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗。
为此目的，首先按常规方法将人胚肺二倍体细胞株扩增传代至足够的细胞密度，例如在培养容器内生长成致密的细胞单层。以0.02至10感染复数(m.o.i.)向该细胞基质内接种甲肝减毒活疫苗毒种，于大约32-35℃条件下培养，并使用已知的免疫荧光法直接监测病毒感染细胞的感染率。约2-3周后，当被病毒感染的细胞中75％以上呈现免疫荧光阳性时，更换含有2-8％小牛血清的MEM维持液，并按0.01-10m.o.i.接种麻疹减毒活疫苗毒种。
接种后，将相继感染甲型肝炎病毒和麻疹病毒株的人胚肺二倍体细胞置于33-35℃孵箱中继续培养。根据细胞生长旺盛程度每3-5天更换一次培养基，并逐日观察细胞形态学变化。当80-100％被感染细胞出现麻疹病毒感染所致的典型细胞病变效应(CPE)，并且甲肝病毒感染阳性率达到90％以上时，将细胞培养物移至2-8℃无菌环境下冷释放1-3天。然后低温(-20℃以下)冷冻收存细胞。
或者，作为另一种可代用的操作方法，亦可在甲型肝炎病毒感染细胞的免疫荧光反应阳性率达到75％以上时弃去维持液，并用平衡盐溶液(BSS)洗冲细胞以除去小牛血清。然后换成含有0.01-0.25％(w/v)人血清白蛋白的Eagle氏MEM或其他适宜的培养基(例如199综合培养基)，并按0.01至10m.o.i.接种除去了小牛血清的新鲜麻疹病毒活疫苗毒种。将所得培养物置于33-35℃下培养并逐日取样观察麻疹病毒感染所致的典型CPE。当CPE发展到80-100％，并且甲肝病毒感染的细胞阳性率达到90％以上时，将细胞培养置于2-8℃条件下冷释放1-3天，然后收集并低温(-20℃以下)冷冻保存之。
然后，经三次冻融和超声处理，破碎按上述方法制备的细胞，离心除去细胞碎片并收集上清液，即得到悬液形式的甲型肝炎-麻疹二联疫苗。
当然，也可以在分别制得有适当病毒滴度的甲型肝炎病毒活疫苗原液和麻疹病毒活疫苗原液后，按照适当的体积比例混合两种有所需病毒滴度的减毒活疫苗原液，以制得悬液形式的甲肝-麻疹二联减毒活疫苗。这里所说适当病毒滴度一般是指甲肝病毒滴度为105.5-6.5TCID50/ml，麻疹病毒滴度为103.5-5.0TCID50/ml。
本发明进一步提供制备如上文限定的甲型肝炎-麻疹二联活疫苗的冷冻干燥制剂的方法，该方法包括1)分别提供甲型肝炎病毒活疫苗原液和麻疹病毒活疫苗原液，并按适当的比例混合之，得到混合的悬液形式的甲型肝炎-麻疹二联病毒活疫苗原液；2)在步骤1)中所述的病毒活疫苗原液中，按大约1∶1(v/v)的比例加入如上文限定的病毒活疫苗保护剂并均匀混合之；3)冷冻干燥步骤2)中得到的疫苗组合物。
本发明进一步提供了冷冻干燥的甲肝一麻疹二联疫苗及其生产方法。为此，可以按照中国专利申请98120633.6中所述的方法，将如此制得的悬液形式的甲肝-麻疹二联疫苗制备成冷冻干燥制剂，以避免由于悬液态疫苗必须于低温冷藏条件下(即通过所谓“冷链”)运输、贮存和使用，而使病毒活疫苗的大规模推广使用，特别是在经济欠发展地区及热带和亚热带地区推广使用时所受到的限制。
为了将按上述方法制得的悬液形式的甲肝-麻疹二联疫苗制备成冷冻干燥制剂，可以将已制得的悬液形式的甲肝-麻疹二联减毒活疫苗制剂与冻干病毒活疫苗保护剂按照大约1∶1(v/v)的比例混合。于无菌条件下分装后，将所得混合物置于适当的冷冻干燥装置内进行冻干处理，以得到本发明的冻干形式的甲型肝炎-麻疹减毒活疫苗组合物。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的冷冻干燥包括首先将悬液形式的甲型肝炎-麻疹减毒活疫苗组合物于大约-30℃至-50℃，最好于大约-40℃的温度下预冷冻3至6小时，然后于大约28至35℃的温度下真空干燥约10至20小时，以得到冷冻干燥的甲肝-麻疹二联减毒活疫苗。
根据本发明的另一个优选实施方案，其中所说的冷冻干燥保护剂基本上由重量/体积比(w/v)为0-2％的人血清白蛋白、0.5-1％的明胶、5-10％的海藻糖、0.75-1.5％的谷氨酸钠、0.05-0.1的抗坏血酸、0.5-2.8％的尿素、0.2-1的山梨醇和0.5-1％的肌醇组成。
在如上文所述的本发明的活病毒疫苗保护剂中，人血清白蛋白和明胶主要发挥蛋白质和胶体支架作用，为悬液或冻干后的活病毒提供空间支持和部分营养保护作用。海藻糖具有稳定细胞和蛋白质结构、抵御高温破坏的功能。研究证明，在海藻糖存在下干燥处理的抗体、酶、病毒等生物材料，当重新水合后均能恢复其活力(RoserB.,FoodSci & Techno1.2(7):166-169,1991；Roser B.,Biopharm.4(8):47-53,1991；Roser B.,ColaceC.,New Scientist,138:24-28,1993)。利用海藻糖干燥处理小儿麻痹疫苗已获得了成功。谷氨酸钠等碱性氨基酸盐、尿素、山梨醇和肌醇，以及抗坏血酸，在本发明的冻干保护剂中则主要起到调整pH、稳定水合状态或脱水过程中的渗透压，以及抗氧化等作用。
然而应特别提出的是，我们的实验表明，当用于某些无包膜的病毒，如甲型肝炎病毒，麻疹病毒，以及脊髓灰质炎病毒时，所说的冻干保护剂中可以不含有人血清白蛋白，而仍可具有良好的冷冻干燥效果。因此，在制备本发明甲型肝炎-麻疹二联疫苗冻干制剂时，所使用的冻干保护剂中也可以不加入价格较昂贵的人血清白蛋白。
可以在适当的容器内，按常规试剂配制方法配制本发明的病毒疫苗保护剂，但在混入海藻糖、明胶、山梨醇或肌醇之前，应将这些物质于37℃下预加热24-48小时，并且在分装待冻干的疫苗前0.5-2小时将保护剂与待冻干疫苗以大约1∶1(v/v)的比例混合均匀。可使用常规冷冻干燥装置将分装好的上述混合液于-30至-50℃下预冻3至6小时，然后于28至35℃下真空干燥10至20小时。冻干过程中，疫苗冻干混合物的共融温度低于-40℃。
为了证实本发明的病毒疫苗保护剂在冷冻干燥的病毒活疫苗生产中的保护作用，及其对冷冻干燥的病毒活疫苗储存稳定性的影响，我们以本发明的甲肝-麻疹二联病毒活疫苗为例，对其在加入和不加入本发明冻干保护剂的条件下，冻干前和冻干后的病毒滴度，以及冻干保护剂对疫苗的储存稳定性的影响进行了一系列的比较试验。试验结果显示，本发明的病毒活疫苗保护剂不仅在冷冻干燥处理过程中对病毒活性具有极好的保护作用，而且可以显著地提高甲肝-麻疹二联减毒活疫苗在冻干状态下和提高的温度下的储存稳定性。
实验结果表明，本发明的甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗具有极好的特异性。我们使用按本发明方法制备的冷冻干燥的甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗，分别进行体外甲肝病毒纯毒试验和麻疹病毒纯毒试验。结果表明，本发明的冷冻干燥的二联疫苗样品中，甲肝病毒和麻疹病毒在与它们的相应抗血清标准品反应后，均被高效价特异性抗体完全中和。
我们使用恒河猴为被试对象所进行的体内试验进一步表明，本发明的冷冻干燥形式的甲肝-麻疹二联减毒活疫苗在灵长类动物体内表现有极好的使用安全性和免疫原性。试验结果显示，在给成年健康恒河猴注射适当量的本发明的甲肝-麻疹二联疫苗8周后，未见动物出现麻痺和其他任何神经系统症状，中枢神经系统的组织病理学检查也未见任何异常改变。另外，对活体动物在静脉接种本发明的二联疫苗前、后所做的连续肝脏组织病理学检查和血清谷丙转氨酶(SGPT)测定，也未发现任何有意义的阳性病理学反应。同时发现，动物在接种二联疫苗后，第二周出现血清抗HAVIgM和抗麻疹病毒IgM抗体，但到第8周时逐渐消失。而特异性抗HAV和抗麻疹病毒血凝抑制(HI)抗体则在第二周出现50％阳性率，第4周两种血凝抑制抗体的阳性率均达到100％。另外，分别检测动物接种疫苗前和接种疫苗后8周血清的甲肝和麻疹病毒中和抗体滴度，显示均大于1∶2血清稀释度。
最后，为了证明人体内接种本发明的甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗的适用性，我们进一步对8-12月令的健康婴儿进行了同时接种甲型肝炎减毒活疫苗(H-L-1)和冻干的麻疹减毒活疫苗(长-47)的临床观察。结果发现，所有275名受试对象在72小时观察期间内均未出现局部红肿过敏反应，而且在长达72天的观察期间内也未见有明显的全身性不良反应。统计学处理结果显示，单独接种任何一种疫苗和联合使用两种疫苗后，两组间所产生的抗甲型肝炎病毒抗体和抗麻疹病毒抗体阳性率无显著性差异。接种后两组受试者所产生的两种抗体的几何平均滴度(GMT)也没有显著性差异。
因此，可以据此推测，有可能将彼此互不干扰的甲型肝炎疫苗和麻疹疫苗制成二联甚至多联疫苗制剂，并纳入儿童计划免疫。例如，特别是对于甲型肝炎的高发病地区的婴幼儿可在10-13月令时，注射预防有效量的本发明的甲型-麻疹二联疫苗，以完成甲型肝炎的初次免疫和麻疹的加强免疫，从而达到早期预防两种疾病的目的。
实施例1甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗的制备首先按常规方法使用Eagle氏极限基本培养基(MEM)培养人胚肺二倍体细胞。约5天后，待细胞增殖形成致密单层时，以大约4.5m.o.i.向所得细胞基质内接种如中国专利92114998.0中所述的甲型肝炎病毒L-A-1减毒株。补加维持液(加有5％小牛血清的MEM培养基)后继续培养细胞，使之适应传代。连续培养3周，每周更换一次新鲜培养基，并以直接免疫荧光法(IF)定时监测甲肝病毒的增殖水平。3周后，当被感染的细胞中的75％呈现免疫荧光阳性时，再次更换维持液，并按大约4.5m.o.i.接种麻疹病毒长-47减毒株。
然后将相继感染了甲型肝炎病毒和麻疹病毒的人胚肺二倍体细胞置于34℃孵箱中继续培养。每4天更换一次培养基，并逐日取细胞样品于高倍显微镜下观察细胞形态变化。当大约50％细胞出现麻疹病毒所致的典型细胞病变时，离心(2000rpm,4℃,15分钟)分离细胞并用Eagle氏MEM培养基洗掉残留的小牛血清。然后将细胞重新悬浮于不含小牛血清的Eagle氏MEM培养基(疫苗夜)中，继续培养直到细胞病变发生率达到100％，并且甲肝病毒感染细胞的阳性率达到95％时，终止培养并将细胞培养物置于4℃下冷释放约72小时。将冷释放后的细胞培养物置于-20℃下保存。
将低温冻存的细胞反复冻融三次，并超声处理10分钟以破碎细胞。离心(2000rpm,4℃,15分钟)除去细胞碎片后，收集上清即得到悬液态的甲肝-麻疹二联疫苗。实施例2甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗冻干制剂的制备首先按下述方法配制用于制备甲肝-麻疹二联疫苗冻干制剂的病毒疫苗保护剂将医用明较0.8g溶加于300ml蒸馏水中，加热煮沸使之溶解后，于大约116℃高压蒸汽灭菌40分钟，然后室温冷却至30℃。向所得明胶溶液内加入1.0g使用0.22mm滤器过滤除菌的人血清白蛋白(长春生物制品所生产)，并充分搅拌均匀。然后，分别取海藻糖8.0g、谷氨酸钠1.0g、抗坏血酸0.1g、尿素2.5g、山梨醇8g和肌醇0.6g、并依次加入到大约500ml蒸溜水中。然后在振动搅拌下将此混合物于37℃预加热24小时。次日，将混合物冷却至室温(25℃)后与上述明胶-血清白蛋白溶液混合，加入蒸馏水补足体积并用0.1N HCL调PH至7.0。再次过滤除菌后得到所需的病毒活疫苗冻干保护剂。
将此冻干保护剂与按实施例1所述方法制备的悬液态甲肝-麻疹二联活疫苗按1∶1体积混合，无菌分装于开口小瓶(2ml/瓶)内并置于密闭的真空冷冻干燥器(FS150-SS20C型，Full Co.,USA)内进行冻干处理。首先将疫苗组合物于大约-40℃下预冻4小时，然后升温至32℃真空干燥15小时，从而得到冷冻干燥的甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗。实施例3冷冻干燥的甲肝-麻疹二联减毒活疫苗的贮存稳定性本实施例通过对本发明的甲肝-麻疹二联减毒活疫苗于冻干前和冻干后。以及在4℃、室温(25℃)和37℃条件下贮存不同时间后所作的病毒滴度分析，说明本发明甲肝-麻疹二联疫苗冻干保护剂在疫苗冻干过程中和冷冻干燥后对疫苗的保护作用。
取连续五批(HM 1-5)二联疫苗样品，于冻干前和冻干后，以及冻干的疫苗在4℃、25℃、37℃温度下贮存不同时间后，分别检测二联疫苗中甲肝病毒和麻疹病毒的滴度。
由于麻疹病毒感染人胚肺二倍体细胞产生细胞病变效应(CPE)，所以在测定甲肝病毒滴度时应首先中和麻疹病毒。为此，对二联冻干疫苗样品进行10×系列稀释，取10-2稀释度的样品0.1ml并加入按使用说明书稀释的抗麻疹病毒血清(中国药品生物制品捡定所监制)0.9ml，混合后置4℃下保温过夜以中和麻疹病毒。再次对此被中和后的疫苗样品进行10倍系列稀释，并用10-5稀释度的病毒液接种预培养的人胚肺二倍体细胞。按前述方法培养4周后收获细胞，常规破碎细胞并离心收集溶胞产物。然后用ELSA和IF法检测甲肝病毒滴度，并用Reed-Muench方法计算TCID50值。
为了检测本发明甲肝-麻疹二联疫苗的麻疹病毒滴度，首先分别将疫苗样品和麻疹病毒参照品(中国药品生物制品检定所)进行10×系列稀释，用10-4稀释度的病毒悬液(1ml)接种FL细胞(一种人羊膜细胞系)并于34℃培养细胞1周，然后按上述常规方法检测麻疹病毒滴度。
本实施例的结果如下列表1和表2中所示。
表1甲肝-麻二联癌苗冻干前和冻干后病毒滴度比较
>*表中所给出的数据为单位体积的病毒滴度值(Log TCID50/ml)。表2冻干甲肝-麻疹二联疫苗在不同温度下的贮存稳定性
*表中所给出的数据为单位体积的病毒滴度值(Log TCID50/ml)。
从表1和表2所示的结果可以看出，在病毒疫苗冻干保护剂存在下，本发明的甲肝-麻疹二联减毒活疫苗的病毒滴度冻干后比冻干前虽有所下降，但所有五批样品中两种病毒滴度的下降值均不大于0.5Log TCID50/ml。另外，本发明的甲肝-麻疹二联疫苗的冻干制剂于4℃下贮存12个月，室温(25℃)下贮存3个月，以及37℃下贮存7天，两种病毒的滴度几乎没有任何统计学上有意义的改变。因此，我们有理由相信，本发明所使用的病毒疫苗冻干保护剂对于二联疫苗的冻干过程中，以及冻干后的贮存稳定性均具有良好的保护作用。特别是本发明的二联疫苗在经冻干处理后，其贮存稳定性甚至好于甲肝或麻疹病毒单价减毒活疫苗的冻干制品(参见中国专利申请98120633.6)。实施例4证明二联减毒活疫苗安全性和免疫原性的动物实验以敏感动物恒河猴为实验对象，检测动物接种本发明的甲肝-麻疹二联疫苗前、后的临床表现并检查肝脏和脑组织病理学改变，以及血清血凝抑制抗体(或中和抗体)的滴度变化，借以评价二联疫苗的使用安全性和免疫原性。
每组5只体重1.5-4.5kg的血清抗HAV和抗麻疹病毒抗体阴性成年恒河猴，以静脉内途径接种甲肝-麻疹二联疫苗样品1.0ml，同时向每只动物每侧颅内丘脑部位穿刺接种疫苗样品0.5ml。接种后观察动物是否出现麻痺和其他神经系统相关异常表现，连续观察21天。于接种后0、4和8周进行肝组织穿刺对动物肝脏组织进行活体组织病理学检查；同时于接种后0、2、3、4、6和8周采血检测血清谷丙转氨酶(SGPT)水平，以及血清抗甲肝病毒和抗麻疹病毒抗体。其中分别以两种单价疫苗作为阳性对照。最后一次组织穿刺和采血后，麻醉下处死动物并分离动物脑组织，以进行脑组织病理学检查。
为了检测动物血清中和抗体滴度(活性)，将两种已知疫苗病毒分别稀释至102Log TCDI50/ml病毒滴度。在用本发明的二联减毒疫苗接种动物前后，分别采集动物血清，于56℃加热30分钟将血清灭活，按不同稀释度稀释血清并与等体积上述病毒稀释液混合，以中和血清中的抗病毒抗体。然后用所得中和反应产物分别接种人胚肺二倍体细胞和FL细胞，并于接种细胞后7天和28天按本领域技术人员已知的常规方法判定结果。
本实施例的结果如下列表3和表4中所示。其中表3中给出接种1,3,5三个批号的甲肝-麻疹二联疫苗后0至4周血清SGPT水平(以改良法检测，＞25单位/ml为SPGT异常升高)，以及血清抗HAV抗体和抗麻疹病毒血凝抑制(HI)抗体阳性率(数据以5只动物中抗体阳性动物数的形式给出)。表3动物接种二联疫苗后0-4周血清转氨酶水平和抗甲肝及抗麻疹抗体阳性率
所给出的数据为5只动物中在接种后相应周数时呈阳性抗体反应的动物数。表4 动物接种甲肝-麻疹二联疫苗前和接种后血清中和抗体滴度<
所给出的数据分别为4只或8只动物中在相应血清稀释度下呈阳性抗体反应的动物数。
从表3和表4所示结果可以看出，在接种本发明的甲肝-麻疹二联疫苗4周后，所有被试动物的血清转氨酶均为阴性。而且，活体组织学检查表明，所有被试动物均未发现肝组织的异常病理学改变。临床观察和脑组织理学检查也未见任何外周和中枢神经系统的异常表现。实验结果显示，动物在接种甲肝-麻疹二联疫苗后8周血清抗甲型肝炎病毒中和抗体在1∶8稀释条件下均为阳性。另外，我们还检测了动物在接种疫苗后作为原发性感染指征的血清lgM抗体的改变，结果显示接种后2周血清lgM呈阳性反应，但到第8周时LgM逐渐消失(数据未示出)。实施例5证明甲肝-麻疹二联减毒活疫苗安全性和免疫原性的人体试验为了进一步证实本发明的甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗的人体临床适用性，本实施例进一步观察了人体同时接种甲肝和麻疹两种病毒疫苗的临床效果。
选择8至12月令健康婴儿共275人，随机分成三组单价甲肝减毒活疫苗接种组(H)、单价麻疹减毒活疫苗接种组(M)，和甲肝与麻疹减毒活疫苗联合接种组(HM)。所使用的甲肝减毒活疫苗(L-A-I)和麻疹减毒活疫苗(长-47)(均由卫生部长春生物制品所生产)的病毒滴度分别为6.5 Log TCID50/ml和4.0Log TCID50/ml。按常规每人臂部皮下注射甲肝疫苗1.0ml和/或麻疹疫苗0.2ml。接种后72小时内定时观察受试者注射部位的局部反应及42天内的全身反应(体温变化)，并按弱、中、强记录出现阳性反应的人数。免疫接种后4和8周采血检测血清GPT(正常值≤120单位)。使用ELISA试剂盆(Ablott Kit ELISA，美国亚培公司)检测血清抗甲肝病毒抗体和抗麻疹HI抗体。
结果显示，同时接种甲肝和麻疹疫苗的103人中，除1.94％出现弱全身反应，0.97％出现中度全身反应(相应的H组中，弱和中度全身反应均为0.07％)外，其它被试者均未出现任何局部和全身性反应。
抗体滴度分析结果显示，在接种单价甲肝疫苗或联合接种甲肝和麻疹疫苗8周后，HM组抗甲肝抗体阳性率为92.27％。H组为93.66％，两间无显著性差异(X2=0.021,P＞0.05)。两组受试者的抗体几何平均滴度(GMT)分别为5.333±1.025和5.105±0.778，两组间也无显著性差异(t=0.165,P＞0.05)。
另外，在接种单价麻疹疫苗或联合接种甲肝和麻疹疫苗8周后，HM组抗麻疹病毒HI抗体阳性率为98.05％,M组为96.66％，两组间抗体阳性率无显著性差异(X2=0.021,P＞0.05)。两组受试者的抗体几何平均滴度(GMT)分别为16.43±0.289和14.25±0.311，两组间也无显著性差异(t=0.165,P＞0.05)。
权利要求
1．甲型肝炎-麻疹二联疫苗组合物，所说的二联疫苗组合物含有彼此互不干扰的，分别具有预防有效的病毒滴度的甲型肝炎减毒活病毒和麻疹减毒活病毒，并且含有或不含病毒疫苗保护剂。
2．根据权利要求1的甲型肝炎-麻疹二联疫苗组合物，其中甲型肝炎活疫苗的有效病毒滴度为105.5-6.5TCID50/ml，麻疹活疫苗的有效病毒滴度为103.5-5.0TCID50/ml。
3．根据权利要求1的甲型肝炎-麻疹二联疫苗组合物，所说的二联疫苗组合物是冷冻干燥形式的。
4．根据权利要求1至3中任何一项的甲型肝炎-麻疹二联疫苗组合物，其中所说的病毒活疫苗保护剂由重量/体积比(w/v)为0-2％的人血清白蛋白、0.5-1％的明胶、5-10％的海藻糖、0.75-1.5％的谷氨酸钠、0.05-0.1％的抗坏血酸、0.5-2.8％的尿素、5-10％山梨醇和0.5-1％的肌醇组成。
5．生产甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗的方法，该方法包括将按常规方法增殖得到的病毒滴度为105.5-6.5TCID50/ml的甲型肝炎减毒活疫苗原液与病毒滴度为103.5-5.0TCID50/ml的麻疹减毒活疫苗原液按适当比例混合。
6．利用同一宿主细胞基质生产甲型肝炎-麻疹二联减毒活疫苗的方法，该方法包括以下步骤1)分别提供按常规方法传代减毒的甲型肝炎活疫苗病毒毒种和减毒的麻疹活疫苗病毒毒种；2)用步骤1)中提供的减毒的甲型肝炎活疫苗病毒接种人胚肺二倍体细胞并在适当条件下培养所说的细胞以增殖病毒，当甲型肝炎病毒感染细胞的阳性感染率达到75％以上时，再次接种步骤1)提供的麻疹减毒活疫苗病毒并继续培养之；3)当甲型肝炎病毒感染细胞的阳性率达到90％以上，并且90％以上的二倍体基质细胞出现麻疹病毒所致的典型细胞病变时，收获细胞并分离细胞培养物上清，得到所需的甲型肝炎-麻疹二联活病毒疫苗原液。
7．根据权利要求6的方法，其中所说的甲型肝炎病毒感染二倍体细胞基质的感染率是用标准的免疫荧光法监测的。
8．根据权利要求6的方法，其中所说的方法进一步包括将按步骤3)得到的含甲型肝炎-麻疹减毒二联活疫苗病毒原液按大约1∶1的比例与适当的病毒活疫苗保护剂混合，并按常规方法冷冻干燥之。
9．根据权利要求6的方法，其中所说的病毒活疫苗保护剂基本上由重量/体积比(w/v)为0-2％的人血清白蛋白、0.5-1％的明胶、5-10％的海藻糖、0.75-1.5％的谷氨酸钠、0.05-0.1％的抗坏血酸、0.5-2.8％的尿素、5-10％的山梨醇和0.5-1％的肌醇组成。
10．制备根据权利要求6至9中的任何一项的甲型肝炎-麻疹二联活疫苗的冷冻干燥制剂的方法，该方法包括1)分别提供具有有效病毒滴度的甲型肝炎病毒活疫苗原液和麻疹病毒活疫苗原液，以得到混合的悬液形式的甲型肝炎-麻疹二联病毒活疫苗；2)在步骤1)中所述的二联病毒活疫苗原液中，按大约1∶1(v/v)的比例加入如权利要求9所限定的病毒活疫苗保护剂并均匀混合之；3)冷冻干燥步骤2)中得到的疫苗组合物。
11．根据权利要求10的方法，其中所说的步骤3)包括首先将所说的疫苗组合物于大约-20至-50℃的温度下预冷冻3至6小时，然后在适当的冻干装置中于28-35℃下真空干燥10至20小时。
12．根据权利要求10的方法，其中所说的甲肝病毒有效滴度为105.5-6.5TCID50/ml，麻疹病毒有效滴度为103.5-5.0TCID50/ml。
全文摘要
本发明公开了含有预防有效的病毒滴度的甲型肝炎－麻疹二联减毒活疫苗及其冷冻干燥制剂。本发明还公开了基于同一宿主细胞基质生产甲型肝炎－麻疹二联减毒活疫苗的方法,以及利用病毒疫苗保护剂生产所说的甲型肝炎－麻疹二联减毒活疫苗的冷冻干燥制剂的方法。
文档编号A61K47/42GK1217212SQ98124548
公开日1999年5月26日 申请日期1998年11月12日 优先权日1998年11月12日
发明者王鹏富, 刘景晔, 李光谱, 南一范, 王美桦, 王玮, 郭建君, 谢宝生, 宋宗明, 屈翠波, 刘丽莎, 黄金凤, 万宗举 申请人:卫生部长春生物制品研究所