处理白细胞的方法、白细胞组合物及其应用方法

专利名称：处理白细胞的方法、白细胞组合物及其应用方法
技术领域：
本发明涉及不能增殖但保留功能的细胞组合物，以及这些组合物的制备方法和应用。更特别地，本发明涉及制备用于转输的增殖抑制白细胞的方法。
背景技术：
施行骨髓移植(BMT)治疗多种恶性及非恶性血液病，包括白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、贫血和免疫缺陷病，如重度联合免疫缺陷(SCTD)、维-奥二氏综合征和再生障碍性贫血。
白血病是造血组织的恶性肿瘤。这些肿瘤可分为两种主要的类型慢性和急性。急性白血病的特征在于未分化的细胞群体(例如，急性淋巴细胞性白血病(或“ALL”)和急性骨髓性白血病(或“AML”))，而慢性白血病通常显示更成熟的形态学(例如，慢性髓细胞性白血病(或“CML”)和慢性淋巴细胞性白血病(或“CLL”))。美国1995年有大约25700例新的白血病病例，其中约4500例是CML。1996年美国诊断出大约7000例新的CML病例，其中约30％最终接受异体BMT(白血病协会白血病协会站点，1997)。预计约50％的BMT患者遭受白血病的复发。
白血病治疗的一般目的在于抑制异常形态的增殖，并恢复骨髓中的“正常”血细胞生成。治疗方案可包括化学治疗、放射治疗和骨髓移植的组合。在“属”同种异体骨髓移植(异体BMT)方案中，首先给予白血病患者重度骨髓抑制剂量的化学放射治疗。该治疗阶段用来根除所有白血病细胞及其先祖。抑制病理性造血生理学后，将功能上无作用的骨髓替换为同种异体无病的干细胞。在最佳条件下，移植的骨髓利于正常多克隆造血增殖的恢复。疾病控制的改善也依赖于移植物对白血病细胞的免疫介导的反应，称为移植物抗白血病(GVL)效应。
骨髓不是造血祖细胞的唯一来源。外周血和脐血也可作为干细胞的来源。参见McCullough，新一代血液成分，输血(Transfusion)35374(1995)。可系统施用营养因子(如粒细胞-集落刺激因子)，来提高外周血干细胞的增殖，从而产生骨髓的替代品，用于收获造血祖细胞。
遗憾地，成功BMT的主要障碍是移植物抗宿主疾病(GVHD)、感染和原发疾病的复发。GVHD和感染引起移植后前100天中10-30％的发病率和死亡率(《基础与临床免疫学》(Basic and ClinicalImmunology)，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编)，Appleton & Lange，Norwalk CT，1994)。如果BMT失败，残余肿瘤细胞的无限制增殖可导致“复发”。参见Slavin等人，“用免疫活性淋巴细胞及其活化细胞因子对最小残余疾病的免疫治疗”，癌症研究(Cancer Investigation)，10221(1992)。过去在这种情况下的医学治疗选择非常有限。例如，第二次骨髓移植和/或细胞毒性药物的广泛应用与极低的存活率相关。
然而，由对移植生物学的更充分的理解得出一种治疗策略。对有或无T细胞排除下的BMT的研究显示，对于能用于CML患者最小残余疾病或“全面”复发的治疗的抗白血病治疗而言，T细胞是重要的。基于这种理解，骨髓移植后用供体白细胞输入(DLI)对白血病患者的治疗成为一种公认的治疗。参见Kolb等人，血液(Blood)762462(1990)；Lim，S H.等人，美国血液学杂志(Am.J.Hem.)5461-67，1997；Giralt，S.A.等人，肿瘤学现代观点(Cur.Op.Onc.)889-95，1996。白细胞的转输也已被用作骨髓移植失败后的过继免疫治疗，来诱导永久的缓解。参见，J.Mccullough，新一代血液成分，输血，35374(1995)。DLI对于CML的治疗特别有效，但也可用于AML、ALL和CLL的治疗。DLI也已用于脊髓发育不良(MDS)、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病和多发性骨髓瘤的治疗。输入的细胞似乎引起对受体恶性细胞的免疫应答。根据对bcr-abl重排(费城染色体)的PCR分析，大约70％的复发为慢性期的CML患者在DLI后达到持久的细胞遗传免除，并成为残余疾病阴性的(Drobyski，W.R.等人，血液822310-2318，1993)。
然而，该方法具有危险，因为患者中的80％发生GVHD，56％发生骨髓发育不良。这是治疗失败的两个主要原因，导致可达20％的反应患者的死亡(Champlin，R.等人，血液学学报(Act.Haemat.)95157-163，1996)。GVHD由转输的BMT或DLI中存在的供体T淋巴细胞引起，增殖并定居于宿主组织。一旦增殖，供体T细胞即攻击宿主组织，引起病理症状。
DLI后疾病的根除被认为是由于移植物对肿瘤细胞的免疫反应，即GVL效应(Barrett，J.等人，肿瘤学现代观点，889-95，1996)。GVL效应的机理尚未完全搞清。它是由来源于供体的T细胞实现的，因为T细胞排除的BMT导致白血病复发的更高发病率。免疫应答是发生该效应所必需的，与同种异体BMT相比，同源BMT后更高的复发率在实验中证明了这一点(Duell，T.，国际医学年报(Ann.Int.Med.)126184-192，1997)。在日本，人群的高均一性导致无效的DLI治疗，因为随机供体和宿主不是充分同种异体的(Takahashi，K.等人，柳叶刀(Lancet)343700-702，1994)。
临床结果表明，GVL效应可与致病性GVHD区分。用T细胞排除的同种异体BMT治疗的患者比用BMT和标准GVHD预防治疗的患者显示更高的复发率，甚至当控制GVHD发病率数时仍如此(Horowitz，M.M.等人，血液75555-562，1990)。也有许多报道的病例，观察到CML的免除而没有GVHD的发病(Duell，T.，国际医学年报126184-192，1997)。在动物模型中，GVHD与GVL的区分是可实现的(参见，例如，Johnson，B.D.等人，骨髓移植(Bone Marrow Transplant.)11329-336，1993；Glass，B.等人，英国血液学杂志(Br.J.Hem.)93412-420，1996；Johnson，B.D.等人，血液853302-3312，1995)。
为了避免急性GVHD，用几种技术清除在BMT中存在的供体T淋巴细胞或成熟淋巴细胞。然而，当前没有有效的骨髓处理来完全避免GVHD，因为在大多数情况下GVL效应被减弱，导致更高的复发率(Kantarjian，H.M.等人，血液873069-3081，1996)。人及动物模型的某些实验方法包括，T细胞亚群的排除，UVB照射(Greenfeld，J.I.等人，外科研究杂志(J.Sur.Res.)60137-141，1996)，或T细胞排除随后再加入一定量的T细胞，滴定一定量T细胞的GVHD的缺乏(Drobyski，W.R.等人，血液，822310-2318，1993)。一种策略中，用一种“自杀基因”转染供体T细胞，该基因是提供对药物丙氧鸟苷的敏感性的疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因。如果观察到GVHD症状，则给予患者丙氧鸟苷以在体内消除T细胞，直到症状消退(Bordignon，C.等人，人类基因治疗(Hum.Gen.Ther.)6813-819，1995；Bonini C.等人，科学(Science)2761719-1724，1997)。另一种“自杀基因”法应用编码凋亡信号传递蛋白(Ariad Pharmaceuticals)的FAS基因。在FAS系统中，用一种二聚剂如FK1012诱导FAS产生，杀伤表达该基因的供体细胞。
“自杀基因”法尽管从治疗残余癌症后消除不需要的T细胞的观点来看也许是有吸引力的，但也有许多明显的缺点。首先，用GVHD症状作为开始药物治疗的信号。因此，GVHD应能开始并必须可关闭。其次，用来消除T细胞的药物必须全身施用，从而使整个身体与药物接触达到使GVHD受控所必需的一定时间。丙氧鸟苷具有毒性副作用，HSV-tk蛋白是免疫原性的。此外，因为需要保护患者免于GVHD的严重形式，所以免疫抑制预防仍是绝对必要的。同样，在某些慢性GVHD例子中，证明丙氧鸟苷的施用不是完全有效的(Bonini C.等人，科学2761719-1724，1997)。这或许是由于该方法的防止误解的说明，即只有增殖的细胞是丙氧鸟苷敏感的。此外，甚至增殖的细胞也能通过邻近HSV-tk细胞附近存在的正常细胞提供的酶辅助而逃脱丙氧鸟苷的作用(Good Samaritan效应)。
对于FAS系统，缺点包括合成的困难以及诱导FAS产生的二聚剂的不溶性。二聚剂与宿主中FKBP蛋白的结合可限制可用的药物。
此外，与基因治疗有关的技术及实践考虑使得难以实行和控制技术的应用。转染细胞的产生被低效率所困扰，这使当出现GVHD迹象时，被处理细胞群体的均一性以及完全杀伤细胞的能力成为问题。细胞必须能增殖数周时间，这意味着在收获细胞与转染细胞可用于输注的时间之间有一个延迟。最后，并且也是最重要地，输入人体中的细胞可能含有修饰的遗传物质，它有可能对宿主长期具有有害作用。
电离辐射(γ-辐射或X-辐射)或UV线(UVCλ＝200-280nm；UVBλ＝280-320nm；UVAλ＝320-400nm)已被用来处理血液制品来诱导细胞中的DNA损伤。当前公认的用于输血相关的GVHD预防的方法是γ-辐射处理(2500 cGy)。用于防止TA-GVHD的γ-辐射的临床剂量导致活T细胞减少105-106倍。然而，γ-辐射和电离辐射对于核酸通常不是特异的。由于其高能量，γ-辐射和UVC也攻击蛋白质和其它细胞成分，引起明显的非特异性损伤(Deeg，H.J.等人，血细胞(Blood Cells)18151-162，1992)。为了防止GVHD，用UVB消除大鼠淋巴细胞的增殖而保留BM祖细胞和原始造血干细胞的生存力用于植入。在4000J/cm2的UVB处理剂量时，CTL活性降低但仍存在(Gowing，H.等人，血液871635-1643，1996)。然而，UVB辐射也导致明显的细胞损伤，特别是当使用宽发射光谱的灯时(Gowing，H.等人，血液871635-1643，1996；Pamphilon，A.A.等人，血液772072-2078，1991)。已经报道了导致较低细胞生存力和免疫应答诱导的表面分子化学修饰和膜破裂，这或许是由于UVB诱导蛋白质和脂类尤其不饱和键的化学改变的能力。这些限制是由于UVB不是只对核酸有选择性，而是修饰吸收280-320nm的任何化学基团这一事实。
用于人白细胞处理、在光敏剂8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)存在下的UVA辐射显示，在体外混合淋巴细胞培养反应中抑制外周血白细胞的刺激能力和增殖(Kraemer，K.H.等人，皮肤病学研究杂志(J.Inv.Derm.)77235-239，1981；Kraemer，K.H.等人，皮肤病学研究杂志7680-87，1981)。然而，如这些报道中所述，UVA加补骨脂素处理导致表面抗原表达、细胞因子合成(IL-1、IL-6、IL-8和INF)和细胞因子mRNA转录的抑制(Gruner，S.等人，组织抗原(Tiss.Ant.)27147-154，1986；Neuner，P.等人，光化学与光生物学(Photochem.Photobiol.)59182-188，1994)。因此，以前的研究中所述的光化学处理(PCT)条件，尽管抑制增殖并减少非特异的细胞损伤，但也灭活T细胞的免疫功能；这些处理条件不可能为了转输目的，产生有效提供任何免疫保护或诱导GVL效应的细胞。最后，对脾和髓细胞的UVA加8-MOP处理已成功地用于鼠模型中GVHD的降低(Ullrich，S.E.，皮肤病学研究杂志96303-308，1991)。如同以前所有报道一样，该研究只针对供体白细胞的GVHD方面，而不为白细胞提供免疫保护或GVL功能。
显然，存在对新方法的需要，来抑制同种异体组织相容性障碍间的GVHD诱导，而不需要与药物的系统接触。这种方法可对无免疫应答的个体提供某种免疫保护，和/或允许对残余癌的杀伤，但应能防止输入细胞在宿主中的增殖。
在此描述并要求专利保护的本发明，通过提供制备不诱导GVHD但保留白细胞功能的白细胞的方法，针对并克服了与现有技术相关的这些和其它问题。通过以下的详细描述，本发明的方法所具有的这种及其它优点将是显然的。
发明概述本发明提供了一种有效方法，用于处理同种异体供体的白细胞，从而产生不能增殖但保留生存力和有效促进疾病细胞或病原体破坏的免疫功能的白细胞。由于经处理的白细胞不能增殖，所以当引入同种异体宿主时它们不能诱导GVHD(在同源或自体输血时，GVHD不是问题)，因此，它们能理想地用于对于多种临床适应症尤其癌症的治疗的DLI中，以及为无免疫应答的哺乳动物提供免疫功能。
本发明的多个方面包括下列方面一种分离的细胞群体，其含有一种白细胞群体，其中该白细胞群体的一部分是不增殖的，使得该细胞群体不能在同种异体宿主中引发移植物抗宿主疾病(GVHD)；并且该白细胞群体的一部分保留免疫学活性，包括促进疾病细胞或病原体破坏的能力。优选地，该群体中至少90％的白细胞是不增殖的。
前述实施方案的白细胞群体的特征进一步在于1)优选地包含T细胞、NK细胞和抗原呈递细胞；2)经适当刺激后能合成和/或分泌细胞因子，如IL-2、IFN-γ、IL-10和GM-CSF；3)能表达特征为T细胞激活和免疫功能的表面标记，诸如尤其是CD4、CD8、CD16和CD56；以及4)与未处理的白细胞群体相比，显示提高的杀伤功能与增殖功能的比值。
本发明的白细胞群体总体上不能增殖，但保留免疫学活性。该白细胞群体尤其将有下列活性1.促进疾病细胞、受感染细胞或病原体的破坏。
2.有利于第二种细胞群体的植入。第二个细胞群体可以是一种细胞悬液或有组织的细胞集合，如一块组织或器官。这些细胞可包括例如造血细胞、髓细胞、白细胞、骨髓细胞、胰岛细胞、肝细胞、神经元细胞、心肌细胞、间充质细胞和内皮细胞。
3.促进免疫重建。
4.免疫治疗。
5.混合嵌合状态(mixed chimerism)的治疗。
6.促进移植物抗白血病(GVL)效应。
在一种实施方案中，该白细胞群体对于促进癌细胞的破坏是有效的。优选地，癌细胞选自慢性骨髓性白血病(CML)细胞、慢性髓单核细胞性白血病(CmML)细胞、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞、急性骨髓性白血病(AML)细胞、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)细胞、多发性骨髓瘤(MM)细胞、何杰金氏淋巴瘤细胞和非何杰氏淋巴瘤细胞。在优选实施方案中，癌细胞为慢性骨髓性白血病(CML)细胞或多发性骨髓瘤细胞。
在另一种实施方案中，该白细胞群体能有效地促进疾病细胞的破坏，其中疾病细胞是一种受感染的细胞。受感染细胞包括被病毒感染的细胞。优选地，感染细胞的病毒选自巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腺病毒(Ad)和卡波西肉瘤相关疱疹病毒。
在第三种实施方案中，该白细胞群体对于促进病原体的破坏是有效的。病原体包括细菌、真菌和寄生虫。
在另一种实施方案中，该白细胞群体对于促进第二种细胞群体的植入是有效的。用于植入的细胞可以是，例如，造血细胞、髓细胞、白细胞、骨髓细胞、胰岛细胞、肝细胞、神经元细胞、心肌细胞、间充质细胞和内皮细胞。另外，植入的第二种细胞群体可包括实体器官或其一部分。
本发明也提供用多种方法筛选的上述白细胞群体的亚群。该亚群包括淋巴细胞和T淋巴细胞；并能通过基于例如表面标记表达的阳性和阴性选择而获得这些亚群。优选的表面标记包括CD8、CD4、CD16和CD56。从全血中筛选白细胞群体亚群的方法包括白细胞电泳(leukophresis)和红细胞去除。
在另一种实施方案中，本发明提供了应用上述细胞群体的多种治疗方法，包括供体白细胞输注、白细胞回加、免疫重建、过继免疫治疗、混合嵌合状态的治疗以及增强第二种移植细胞群体植入的方法。对于增强第二种移植细胞群体植入的方法，能在第二种细胞群体移植之前、移植同时或之后将本发明的细胞群体引入宿主中。
本发明也提供了制备经处理的白细胞群体的方法，其中该白细胞群体总体上是不增殖的，并且不能在同种异体宿主中引起移植物抗宿主疾病(GVHD)，该方法包括下列步骤i)提供一种含有白细胞群体的样品；和ii)使该样品与能与核酸形式共价键的化合物以一定量结合，使得该化合物能在每108个白细胞基因组DNA碱基对中形成约1-104个加合物，从而抑制增殖但保留免疫学活性，包括白细胞群体促进疾病细胞或病原体破坏的能力。
在一种优选实施方案中，该化合物以足以在每108个白细胞基因组DNA碱基对中形成约5-103个加合物的量存在。优选地，该方法导致经处理的白细胞群体内至少90％的T细胞增殖被抑制。
优选地，能与核酸形成共价键的化合物进一步包含一种能与核酸非共价结合的核酸结合部分。
在一种实施方案中，该化合物包含核酸结合部分；能与核酸反应形成共价键的部分；以及共价连接核酸结合部分与效应物部分的一种脆性连接体。优选地，核酸结合部分是一种芳族嵌入物而效应物部分是一种芥子基(mustard)。
在制备经处理的白细胞群体的方法的一种优选实施方案中，能与核酸形成共价键的化合物含有一种可光活化部分，其在电磁刺激后能与核酸形成共价键。当使用具有可光活化部分的化合物即可光活化化合物时，该方法进一步包括下列步骤使与该化合物混合的白细胞样品暴露于光线下，以光活化可光活化部分，从而导致可光活化部分与白细胞基因组DNA形成共价键。
在前述方法的一种实施方案中，具有可光活化部分的化合物选自呋喃香豆素、放线菌素、蒽环酮、氨茴霉素、苯并二吡喃酮、芴、芴酮、单星脂肪蓝、norphillin A、有机染料；菲啶、吩噻嗪硫鎓盐、吩嗪、吩噻嗪、叠氮基苯、喹啉和噻吨酮、吖啶和椭圆玫瑰树碱。优选的呋喃香豆素是补骨脂素。优选的补骨脂素包括PAP、8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)、4’-氨甲基4，5’，8-三甲基补骨脂素(AMT)、5-甲氧基补骨脂素和三氧杂啉(trioxalene)4，5’，8-三甲基补骨脂素。
当用来处理白细胞的化合物是补骨脂素时，该补骨脂素优选地以10-4-150μM的浓度存在，并使白细胞样品暴露于波长为200-450nm、优选地320-400nm的紫外线下。优选地，以10-3-100J/cm2的剂量提供紫外线。白细胞样品将暴露于紫外线下1秒到60分钟的一段时间。
在一种优选实施方案中，根据以上实施方案制备经处理的白细胞群体的方法，使用通式
的补骨脂素(此处被称为S-59)及其盐。S-59将以10-4-150μM、更优选地10-3-150μM的浓度使用。使与S-59混合的白细胞样品暴露于波长为200-450nm、优选地320-400nm的紫外线下。优选地将与S-59混合的白细胞样品暴露于剂量为10-3-100J/cm2、更优选地3J/cm2的紫外线下。为了光活化S-59，优选地将白细胞样品暴露于紫外线下1秒到60分钟、优选地1分钟的一段时间。优选地以每毫升10-109个细胞、更优选地每毫升102-108个细胞、最优选地每毫升2×106个细胞的细胞密度提供白细胞样品。
提供根据前述方法产生的白细胞群体，包括特别用S-59处理的白细胞群体。
本发明的再另一方面为促进疾病细胞或病原体破坏的方法，包括将用上述方法产生的白细胞群体与含有疾病细胞或病原体的同种异体细胞群体相混合。该方法能在体外或体内进行。在一种优选实施方案中，通过供体白细胞向宿主中的输入使白细胞群体与哺乳动物宿主的同种异体细胞群体在体内混合。优选地，对患有BMT后白血病或多发性骨髓瘤复发的哺乳动物宿主实施供体白细胞输注。
在促进疾病细胞或病原体破坏的方法的一种优选实施方案中，疾病细胞是癌细胞。包括来源于下列癌症的癌细胞慢性骨髓性白血病(CML)细胞、慢性骨髓单核细胞性白血病(CmML)细胞、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞、急性骨髓性白血病(AML)细胞、急性淋巴母细胞性白血病(AML)细胞、多发性骨髓瘤(MM)细胞，何杰金氏淋巴瘤细胞和非何杰金氏淋巴瘤细胞。在一种最优选的实施方案中，癌细胞是慢性骨髓性白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞。
另一类优选癌细胞是选自乳腺癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、黑素瘤细胞、肾癌细胞、成神经细胞瘤细胞、头癌细胞和颈癌细胞的癌细胞。
在促进疾病细胞或病原体破坏的方法的另一种优选实施方案中，疾病细胞是一种受感染细胞。优选的受感染细胞包括被一种病毒如巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腺病毒(Ad)或卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染的细胞。
在促进疾病细胞或病原体破坏的上述方法的又另一种实施方案中，用对疾病细胞或病原体特异的一种或多种抗原表位刺激白细胞群体，来扩大对抗原特异的细胞毒性T细胞的数量。刺激或抗原特异的T细胞扩增能在体内、离体或在体外进行。进行体内刺激的方法是在从供体中分离白细胞群体之前，用对疾病细胞或病原体特异的抗原接种白细胞供体。在疾病为CML的情况中，优选地用CML细胞的bcr-abl抗原刺激白细胞群体。在多发性骨髓瘤的情况中，能用患者骨髓瘤细胞的独特型抗原接种白细胞供体。
在促进疾病细胞或病原体破坏的前述方法的又另一种实施方案中，用一种促分裂原刺激白细胞群体。优选地用一种促有丝分裂组合物如豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)加离子霉素或植物凝集素在体外进行刺激。
附图简述

图1显示用不同浓度的S-59(正方形)、AMT(三角形)和8-MOP(圆形)光化学处理(PCT)后(UVA＝1J/cm2)增殖T细胞的减少(参见实施例1)。
图2显示在MLR试验中用不同药物剂量的S-59处理的效应细胞的3H-胸苷掺入(参见实施例2)。
图3显示用不同药物剂量的S-59光化学处理的效应细胞在MLR中的IL-2产生水平(参见实施例2)。
图4显示用不同药物剂量的S-59光化学处理的效应细胞在MLR中的IFN-γ产生水平(参见实施例2)。
图5显示用不同浓度的S-59和0.5J/cm2UVA对PC中的白细胞PCT后，随PCT后时间而变的产生的IL-8水平(参见实施例2)。
图6显示用不同剂量的AMT和1J/cm2UVA PCT后，随处理后时间而变化的CD69标记表达的水平(参见实施例3)。
图7显示在PC中用多种补骨脂素光化学处理后补骨脂素-DNA加合物的形成。S-59(正方形)；AMT(三角形)；8-MOP(圆形)；1.9J/cm2UVA(参见实施例3)。
图8显示S-59+UVA处理对被处理细胞增殖的影响，在MLR试验中根据3H胸苷掺入测定。NR表示未处理的细胞；UV表示无S-59时用UVA照射的细胞。也显示了在三种不同浓度的S-59存在下用3J/cm2UVA照射细胞时获得的结果。详见实施例14。
图9显示用抗-CD3抗体使被处理细胞激活后测定的，S-59+UVA处理对被处理细胞增殖的影响。详见实施例14。
图10A显示用S-59+UVA光化学处理并在MLR中刺激的人PBMC的IL-2产生。通过夹心ELISA测定。详见实施例14。
图10B显示用S-59+UVA光化学处理并在MLR中刺激的人PBMC的IFN-γ产生。通过夹心ELISA测定。
图11A显示用抗-CD3激活后于不同时间(小时)测定的经处理的及对照细胞中的CD69表达。
图11B显示用抗-CD3激活后于不同时间(小时)测定的经处理的及对照细胞中的CD25表达。
图12显示用抗-CD3激活后于不同时间(小时)测定的经处理的及对照未处理细胞中的CD40L表达。
图13显示光化学处理、激活的白细胞的细胞毒性T细胞活性，根据与经处理的白细胞共温育的靶细胞的51Cr释放来测定。
图14显示接受MHC-错配骨髓移植与S-59+UVA处理的脾细胞、然后在移植三天后用白血病细胞攻击的受照射鼠中，平均体重的测定。如图所示，在0.01μM S-59存在下使脾细胞暴露于UVA下不同时间长度。
图15显示在有或无经处理的白细胞输注时接受骨髓移植的白血病攻击的小鼠中GVL活性的分析。GVL活性用无白血病存活百分率证明(括号中给出了存活比)。
图16显示S-303处理的效应细胞增殖能力的分析，在MLR中与γ-灭活的同种异体刺激细胞共培养后6-7天，根据3H-胸苷掺入测定。
图17显示MLR上清液中的IFN-γ水平，其中在共培养之前用不同浓度的S-303处理效应细胞。
发明详述缩写使用下列缩写BMT骨髓移植DLI供体白细胞输注LDA有限稀释分析MLR混合淋巴细胞反应PA光化学抑制的；PCT光化学处理；PI-DLI光化学灭活的供体白细胞输注；PUVA补骨脂素及紫外线A照射。
PAP4’-和5’-伯氨基取代的补骨脂素S-59一种具有下式的伯氨基取代的补骨脂素
PBSC外周血干细胞PC血小板浓缩物TA-GVHD转输相关的移植物抗宿主疾病
PHA植物凝集素定义“同种异体”是指相同种的遗传上不同的成员之间存在的关系，即这些成员不是同源的。
“宿主”可与“受体”交换作用，是指同种异体供体白细胞的哺乳动物受体。通常，宿主是人，但也包括其它哺乳动物，如小鼠、狗、猫、猴、马等。
“白细胞”是指任何白细胞，包括谱系祖细胞。“抗原呈递细胞”包括巨噬细胞，和在外周血中少量存在的树突细胞，以及它们各自的前身细胞。白细胞存在于循环血液中和骨髓中，以及网状内皮系统的髓细胞形成、淋巴和网状部位。
在此使用的“白细胞群体”是指含有超过一种白细胞细胞型的白细胞群体，并且至少包括T细胞、抗原呈递细胞和NK细胞。
“供体白细胞”指对于宿主动物不是内源的而来源于一种同种异体供体的白细胞。对于体外和非人类应用，白细胞群体和供体白细胞可来源于哺乳动物，包括啮齿类动物、兔、狗等等。
“纯化的”意思是，白细胞群体已从身体中分离，并被处理使得基本上不含非白细胞的细胞型，并且优选地不含其它污染物，如白细胞来源中存在的细胞残片，该来源一般为外周血、骨髓甚至脾细胞。优选地，纯化白细胞群体，使其含有少于13％的红细胞(RBC)，更优选地少于5％，甚至更优选地少于1％。在一种最优选的实施方案中，血细胞比容水平低于0.5％。以下描述了白细胞纯化方法。
“经处理的白细胞”指已暴露于或接触一种能与核酸形成一个或更多共价键的化合物的白细胞。白细胞能通过PCT或用烷化剂化合物“处理”。“光化学灭活的”或“光化学抑制的”(PA)或“PCT抑制的”白细胞指甚至在刺激后仍不能增殖的PCT白细胞，并不意味着白细胞在蛋白质表达和免疫功能方面被灭活。
本发明的白细胞群体含有但不限于“不增殖的”细胞。如果在DNA复制中细胞被抑制，从而甚至在用试剂如促分裂原、细胞因子、抗原、抗体或其它增殖刺激物刺激后仍不能分裂产生新细胞，则这种细胞是“不增殖的”。本发明的方法导致制剂中每种白细胞的复制均抑制不是必需的。对于本发明，只要能增殖的少部分白细胞不足以在同种异体宿主中引起GVHD，则在纯化的群体内至少90％、更优选地至少95％的白细胞中，白细胞群体增殖受到抑制就足够了。在一种最优选的实施方案中，群体内99％或更多的白细胞是不增殖的。例如，通过有限稀释试验(LDA)或单独通过3H-胸苷掺入法，或如以下实施例所述作为MLR试验的一部分，能测定增殖活性。在一种最优选的实施方案中，群体中的T细胞被增殖抑制到LDA检测的下限。已表明这些试验结果预示经处理的白细胞在体内增殖的能力。
“移植物抗宿主疾病”或“GVHD”起因于存在于转输BMT或DLI中的供体T细胞的克隆扩展、增殖和定居于宿主组织。已证实GVHD的发生与严重程度与可克隆T细胞的存在有关(参见Kernan，N.A.等人，血液68770-773，1986)。在与供体HLA-匹配的患者中，GVHD的发生起因于次要组织相容性抗原。GVHD的发病是由于免疫抑制的患者中免疫功能的缺乏，这是BMT成功所必需的条件。供体T细胞能在该环境中不受攻击地增殖，并攻击宿主组织，引起病理症状。在细胞水平上，宿主的抗原呈递细胞与供体T细胞在主要组织相容性复合体(MHC)I和II的范围内相互作用，并诱导其对携有宿主特异性(次要)抗原的细胞的激活。这导致激活T细胞的克隆增殖，其攻击宿主组织并释放细胞因子。T细胞分泌的细胞因子也激活宿主的多种其它效应细胞，这通过细胞因子的另外产生(细胞因子潮)加重组织损伤。参见，例如Burakoff，S.J.等人，移植物抗宿主疾病免疫学、病理生理学与治疗。于Brinkhous KMS，S.A.(编)《血液学》(Hematology)第12卷(第一版)，纽约，Marcell Dekker，Inc.，1990，725页。
当诊断有GVHD时，通常给予患者高剂量的免疫抑制药物来抑制GVHD。然而，这些药物也使移植的白细胞在GVL方面无效，并且患者可复发为白血病。
白细胞群体引起GVHD的能力可如以下实施例4所述在体内测定，或者通过有限稀释试验(LDA)在体外测定，或者如以下实施例5所述通过MLR测定。根据LDA测定，如果群体中的可克隆T细胞数量为未处理白细胞对照群体(GVHD和增殖的阳性对照)中存在的10-3-10-4，则判断该白细胞群体不能引起GVHD。在体内，白细胞群体的同种异体受体中GVHD临床症状(实施例4所述症状)的缺乏表明该群体不能引起GVHD。
如果一种白细胞群体包括这样的白细胞，其能直接或间接参与能有效地从身体中杀伤或清除目标疾病细胞(或病原体)、或限制疾病细胞(或病原体)增殖的免疫应答，则认为该群体“对于促进疾病细胞或病原体的破坏是有效的”。不是白细胞群体中存在的每种白细胞都能促进破坏，但总体上该群体应在此方面有效。
应当认识到，疾病细胞或病原体能通过任何机制被破坏。通过经处理的白细胞能介导破坏的特定机制限制处理白细胞的方法不是本发明的目的。疾病细胞可被T细胞或NK细胞通过细胞溶解而破坏，而且也能被其它机制杀伤，如被诱导经历凋亡。疾病细胞或病原体也能被依赖抗体的细胞介导细胞毒性(ADCC)、巨噬细胞的吞噬作用所破坏，或通过哺乳动物中天然存在的任一免疫机制被网状内皮系统所清除。通过杀伤其存活所依赖的宿主细胞，能间接破坏驻留于宿主细胞内的病原体。在标准免疫学教科书如《基础与临床免疫学》第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编)，Appelton & Lange，Norwalk CT，1994中，讨论了免疫系统使机体摆脱恶性细胞、受感染细胞或病原体的机制。“有效”处理的供体白细胞可以是一种效应细胞，如细胞毒性T细胞(CTL)、NK细胞或一种巨噬细胞，其直接杀伤靶疾病细胞或病原体，或诱导疾病细胞经历凋亡。此外，通过刺激其它白细胞，例如来自于移植的骨髓、以前DLI的白细胞，或宿主自身的白细胞，经处理的供体白细胞能介导破坏，从而进行杀伤或清除。通过表面抗原表达、细胞因子分泌或任何适当的机制能对其它白细胞进行刺激。经MHC-限制和/或非MHC限制(如NK细胞)的机制能发生细胞溶解。
白细胞群体促进疾病细胞或病原体破坏的效能可通过多种试验测定，如以下实施例所述的MLR或51Cr释放试验。例如，根据在51Cr释放试验中介导白血病细胞杀伤的能力证明了细胞溶解的效能。对于本发明，如果在适当试验中(例如51Cr释放试验)，白细胞群体显示比阴性对照群体至少高约20％的水平的溶细胞能力，则认为该群体对促进疾病细胞的破坏是有效的。以下提供了用于杀伤的疾病细胞和病原体类型。
通常，促进破坏的效能需要白细胞群体保持一定的蛋白质合成水平，以使得包括信号转导分子(如细胞因子)的蛋白质能产生并分泌。优选地，在质膜上也有表面抗原包括受体，粘附分子和协同刺激分子的表达。细胞生存力和膜完整性对于介导GVL效应是重要的。“细胞生存力”在此定义为循环中即血流和其它组织中的存活率。
尽管某些细胞因子的产生可被抑制，但优选地细胞因子产生保持在用上述化合物处理之前的至少70％、更优选地80％、甚至更优选地高于90％，最优选地高于95％的水平。优选地，白细胞群体包括在刺激下能至少分泌白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)的白细胞。由于这些细胞因子在T细胞激活和GVHD/GVL中的明确作用，它们是相关的。其它相关细胞因子包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-10(IL-10)。例如，用本实施例以下部分所述的细胞因子测定试剂盒(例如，R & D Systems的试剂盒)能容易地测定细胞因子的分泌。
在纯化白细胞群体中的白细胞上表达的表面抗原(也被称为表面标记)取决于特定的细胞型。优选地，该群体包括表达下列表面抗原的白细胞CD2、CD28、CTLA4、CD40配体(gp39)、CD18、CD25、CD69(淋巴细胞激活标记)和CD16/CD56、抗原，已知它们参与T细胞与NK细胞激活有关的相互作用和免疫功能。优选地，白细胞也表达其它表面标记，包括MHC I类和II类、CD8、CD4、CD3/TcR(T细胞受体)、粘附分子如CD54(ICAM-1)、LFA-1和VLA-4，及其它共同刺激分子。可用多种测定法能检测及测定表面抗原的表达，例如通过标准FACS-SCAN分析用对特定抗原特异的抗体染色细胞并检测已被直接或间接标记的抗体。本领域所知的其它方法包括表面抗原的免疫沉淀和免疫印迹。
在此使用的“疾病细胞”是指癌细胞、受感染细胞或任何类型病变的细胞，它们可能存在于体内或体外。癌细胞或恶性细胞可能来源于任何类型的癌症、是任何组织或细胞型来源的。这些恶性或癌细胞包括但不限于下列恶性肿瘤的细胞白血病，包括慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴母细胞性白血病(ALL)；多发性骨髓瘤(MM)；非何杰金氏淋巴瘤和何杰金氏病(淋巴瘤)；实体瘤，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、结肠癌、黑素瘤、肾细胞癌、成神经细胞瘤和头颈肿瘤。受感染细胞包括被下列任何微生物感染的细胞细菌、真菌、寄生虫或其它任何病原微生物。
“病原体”被定义为含有核酸并且能引起人类、其它哺乳动物或脊椎动物疾病的任何媒介。病原体的实例包括引起人类、其它哺乳动物或脊椎动物疾病的细菌、病毒、原生动物、真菌、酵母、霉菌和支原体。病原体的遗传物质可以是DNA或RNA，遗传物质可以作为单链或双链核酸存在。病原体可能位于细胞之外，或驻留于细胞内，如巨噬细胞中的HIV所例证的。
术语供体白细胞“输注”和“转输”在此可交换地使用，是指相同的方法。
“光剂量”或“PCT剂量”，以J/cm2的单位确定，是指PCT过程中白细胞样品接受的每单位区域的总光能。通过改变光线强度和细胞样品暴露于光线的时间能改变光剂量。
以mW/cm2单位测定的光线“强度”是指每秒每单位样品接受的光能。
“可光活化部分”在此被定义为一种随电磁辐射经受化学改变的部分。当含有可光活化部分的化合物被电磁辐射光活化时，光活化部分与核酸形成共价键，形成一种化合物核酸复合体，在此称作“加合物”。
“芳族嵌入物”是指一种具有芳香环结构、能插入核酸中的化合物或其部分。芳族嵌入物包括但不限于蒽、吖啶、萘、萘甲酸，等等。
在此使用的“分离的细胞群体”包括在细胞正常驻留的生物之外存在的细胞群体。
在此使用的“免疫学活性”是指免疫系统的细胞如T细胞、B细胞、NK细胞、抗原呈递细胞(APC)及其它细胞所表达的功能，这些功能包括但不限于细胞因子的合成与分泌、细胞介导的细胞毒性、抗体的合成与分泌、抗原及抗原片段的加工和呈递、表示免疫细胞特征的表面标记的表达。引入作为参考本申请中引用的参考文献，包括专利、公布的专利申请及其它出版物，在此引入作为参考。优选实施方案描述以下总结了本发明的多个优选方面，并在随后的详细描述及实施例中进一步描述并说明。
本发明提供一种方法，用于处理分离的白细胞群体，以使该群体的一部分不能增殖到该群体可引起最小GVHD的程度，但仍保留能有效促进疾病细胞或病原体破坏的足够的免疫功能。“最小GVHD”意思是，GVHD的程度不足以引起哺乳动物的死亡，或消除白细胞群体促进疾病细胞或病原体破坏和/或介导GVL效应的能力。
GVHD明确地与供体T细胞的克隆扩展有关，原则上，去除、灭活或杀伤白细胞的任何处理对其都是有效的。另一方面，GVL与供体白细胞的免疫应答有关，并且可能是细胞溶解作用、抗原呈递、特异性细胞因子合成或以上组合的结果。对于观察到GVL效应需要供体白细胞的某些功能是完整的。在避免GVHD的尝试中对供体白细胞功能的灭活也使供体BM或白细胞不能有效地为无免疫应答者或BMT宿主提供必要的免疫功能。
为了使处理能在同种异体宿主中消除GVHD而仍提供免疫保护和/或诱导GVL效应，必须选择性地去除白细胞的增殖能力，而保留一定水平的白细胞功能。本发明提供了具有这些特征的白细胞群体。
本发明的分离的白细胞群体提供了优于以前所述及使用的群体的许多优点。一个明显的优点是，消除GVHD的发病将允许供体白细胞向患者中的安全输入。因此，缺乏免疫系统或具有嵌合免疫系统的宿主能接受大剂量的经处理的供体白细胞和/或多次DLI，从而提高了疾病治疗的效能。以前，GVHD的威胁限制了输入的白细胞的量。
非增殖性白细胞群体能有效地为宿主提供对抗癌症和感染的充分免疫防御。这些白细胞可用于治疗复发的血液恶性肿瘤，如慢性骨髓性、急性骨髓性、急性淋巴细胞性、多发性骨髓瘤及其它形式的白血病和骨髓瘤，作为BMT后治疗的一部分或作为BMT的一种备择方法。DLI引起的GVL效应不仅可用于去除最小残余疾病，而且也能用于较高恶性细胞荷载的治疗，尤其是因为白细胞扩展的缺乏允许更大量细胞的安全输入。本发明的经处理的白细胞群体也可用于对免疫调节治疗敏感的某些实体瘤(例如乳腺癌和肾细胞癌)的治疗，并且可用于防止匹配及错配异体BMT过程中的移植排斥。以下详述了在治疗中该经处理的白细胞适用的其它多种临床适应症。
本发明的处理白细胞的方法包括下列步骤。可从骨髓、脐血或全血中获得白细胞。最方便的白细胞来源是外周血。科学文献中描述了从其它来源分离白细胞的方法。例如，通过红细胞去除或白细胞电泳处理全血来纯化并富集白细胞。得到的纯化白细胞群体大约99％不含红细胞，与白细胞相比红细胞有不同的大小和密度，易于通过这些方法去除。
然后将白细胞群体与化合物混合，并在能有效抑制白细胞增殖而不损害细胞生存力和完整性的条件下处理。去除未反应的化合物，或者随时间延长该化合物可变为无活性的，而不必要去除。在一种优选实施方案中，“化合物”是指能与一种核酸形成共价键的化合物。共价键的形成在每108个白细胞基因组DNA碱基对中可形成大约1-104个加合物，优选地5-103个加合物，最优选地103个加合物。重要的是，处理条件使得对蛋白质及其它细胞成分的非特异性损伤减至最小并避免膜损伤。大多数经处理的白细胞的膜完整性对于发生GVL效应是必要的。这些处理条件也能有效地使经处理的白细胞在引入同种异体宿主中后不能引起GVHD，或者使之在体外MLR试验中无反应性。另外，经处理的白细胞应保持对于完成免疫功能、尤其对于促进疾病细胞或病原体在体内(或体外)的破坏有效的蛋白质表达。
以下公开了能与核酸、优选地双链DNA形成共价键的适当化合物的性质。这些化合物可含有一种能与核酸形成共价键的部分，该部分是可光活化的或化学反应性的。该化合物通过与基因组DNA形成共价键、进而干扰DNA聚合酶的功能并使白细胞不能增殖，来抑制细胞的增殖能调节化合物与白细胞核酸形成的共价加合物的数量，使得该化合物能抑制增殖，但保留对促进疾病细胞或病原体的破坏有效的免疫功能。应用烷化剂化合物，通过调节化合物浓度以及在去除未结合的化合物之前白细胞与化合物接触的时间长度，能调节这一作用。所需的浓度取决于特定化合物的性质，如在水溶液中的溶解度和DNA结合常数。一般以每108个白细胞基因组DNA碱基对中能有效产生大约1-104个共价结合化合物的加合物、优选地约5-103个加合物、更优选地约102-103个加合物的浓度使用该化合物。理想地，处理白细胞群体的条件在每108个基因组DNA碱基对中将产生大约103个加合物。能有效获得本发明的白细胞组合物的最低化合物浓度是优选的浓度。
应用可光活化化合物，通过调节化合物浓度、光线波长和暴露于光线的时间长度能调节PCT作用。以下详述了使用补骨脂素及其它可光活化化合物进行PCT的条件。
处理条件的目的是在每108个白细胞基因组DNA碱基对中产生大约1-104个共价结合化合物的加合物、优选地约5-104个加合物、更优选地约102-103个加合物。理想地，该处理条件在每108个基因组DNA碱基对中将产生大约103个加合物。例如，通过使用如以下实施例所述的放射性标记的DNA结合化合物，能测量由处理产生的化合物-DNA加合物的数量。
能在白细胞处理中使用的另一种类型的化合物是一种作为DNA复制抑制剂的小分子。如上所述，这种小分子复制抑制剂可任选地含有一种连接体(脆性的或相反)和一种效应物部分。DNA复制的任何步骤都能作为抑制的目标，包括起点识别复合体(ORC)的形成、ORC对起点的补充、复制的起始、延伸等。另外，有利于复制过程的酶的抑制剂，如解旋酶和拓扑异构酶，也是有用的。拓扑异构酶抑制剂的实例包括，例如喜树碱和道诺霉素。
为了使白细胞样品与化合物混合，可将本发明的化合物以几种形式引入白细胞悬液(白细胞样品)中。可以作为水、盐水中的水溶液、合成培养基(如“SterilyteTM3.0”)或悬浮白细胞的溶液引入化合物。以下提供了适于重悬浮白细胞的溶液(输血级和非输血级)。“合成培养基”在此被定义为水性合成血液或血液制品贮存培养基。另外能以含或不含佐剂的干燥制剂提供化合物。然后搅拌细胞悬液混合该化合物。
将待用化合物处理的白细胞重悬浮于生理平衡溶液中，如血浆、合成培养基或其组合物。能以200mL-1L的体积提供白细胞。用于处理的白细胞优选地包含于一种反应容器如血袋中。血袋为本领域所知。
通过体外及体内试验能监测用化合物处理对白细胞群体生存力及功能的影响，从而确定使增殖和GVHD活性减至最小而使细胞毒性功能和/或GVL效应达到最大的最佳处理条件。最佳条件将随所用化合物的性质而不同，并由疾病或病原体所证实。对于可光活化化合物，最优选的PCT条件包括最低化合物浓度和最低光剂量，其足以提供增殖被抑制但能有效促进疾病细胞或病原体破坏的白细胞群体。将如下表征经处理的白细胞群体。
将评价经处理的白细胞群体的细胞生存力。如本实施例以下部分所述，例如，通过PCR分析检测对供体白细胞特异的序列，能在体内测定细胞的生存力。优选地，该白细胞群体具有至少3周的细胞生存力。处理后白细胞的快速清除可影响其诱导抗白血病反应的能力。被处理白细胞的膜完整性对于发生GVL效应也是必要的。通过台盼蓝或碘化丙锭染料排除法能测定膜完整性。如果使用，在使具有完整细胞膜的白细胞数达到最大的光剂量和/或化合物浓度方面，优化PCT方法。
如以下本实施例所述，例如，通过有限稀释试验(LDA)或混合淋巴细胞反应(MLR)试验能测定增殖活性。混合淋巴细胞反应(MLR)试验中的白细胞活性预示被处理的白细胞在体内介导GVHD的能力。此外，通过监测已输入经处理的白细胞的MHC匹配动物中的GVHD症状和/或GVHD诱导的发病率和死亡率能确定GVHD。
通过监测细胞因子合成、表面抗原性标记的表达和溶解靶细胞的能力，能确定白细胞活性。利用合适的抗原特异性抗体和标准FACS-SCAN分析测定表面抗原性标记的表达。作为共价结合化合物浓度和(若使用时)PCT光剂量的函数测定抗原性标记CD2、CD28、CTLA4、CD40配体(gp39)、CD18、CD25、CD69(淋巴细胞激活标记)和CD16/CD56的存在，已知它们参与与T细胞和NK细胞激活相关的相互作用及免疫功能。假如PCT对蛋白质作用温和，PCT条件下表面分子的稳定性预计不受影响。选择处理条件例如PCT，使得它们不能相反地影响表面分子的表达或使细胞因子的产生降低至希望水平(以上公开的优选水平)之下。
例如，在51Cr释放试验中通过人或小鼠白血病细胞系的溶解，能测定预示GVL活性的溶细胞活性。如Choudhury等人，血液891133-1142，1997所述能在体外测定抗白血病效应，或者如Johnson等人，血液853302-3312，1995所述在体内测定。对实体瘤的活性能用例如实体瘤的鼠模型来检测。介导受感染细胞或病原体溶解的能力能在动物模型中用受感染动物来测定。GVHD和GVL能力也能如以下实施例4及5所述在体内测定。
以下实施例中描述了所有上述试验。由于鼠与人之间免疫应答的相似性，使用鼠模型进行的实验预示人的应答。例如，GVL效应在鼠和人系统中都得到很好证明。这些试验的结果预示DLI处理的宿主中的体内生物学反应。
根据动物模型的试验结果，对有代表性数量的患者测试确定有效的化合物浓度，并使用导致患者疾病缓解的最有效化合物浓度。对大多数患者使用的条件是最优选的。这些患者一般是BM移植后的患者。
根据这些试验和检测的结果，确定最佳处理条件是可能的，该条件将产生不能增殖和引发GVHD，但能有效地促进疾病细胞或病原体破坏的白细胞群体。被处理的白细胞群体应当具有GVL活性。白细胞供体的选择对于DLI，供体与白细胞输注的宿主(受体)必须是同种异体的。HLA-A及-B是HLA I基因，而HLA-DR是HLA II基因。这些基因的每一种都以多种不同的等位基因形式存在。由于每一个体固有两个拷贝的染色体6(含有HLA基因)，所以个体能表达最高可达6个的不同HLA-A、-B和-DR蛋白质(每一基因座两个不同等位基因的产物)。优选地，同种异体供体在HLA-A、B和DR的6个HLA基因座的3个或更多上是基因型相同的。在“单倍体相同的”移植中，供体和宿主在6个HLA基因座的3个上匹配。理想地，供体和受体在HLA-A、B和DRB1上相同。通过美国国家骨髓供体程序(NMPD)能搜索到HLA-匹配的无关供体。
当前，对于接受未修饰的非T细胞排除移植的已达55岁的患者，患者与供体的HLA-A、B和DRB1基因必须相同。36岁或更年轻的患者能从HLA-A、-B或-DR相差不超过1个次要抗原匹配的供体移植。HLA-A或B次要匹配被定义为属于相同交叉反应组的两种抗原。HLA-DR次要匹配被定义为表达相同DR特异性但DRB1等位基因不同的两种单元型。对于合适的同种异体供体的方案，参见O’Reilly，R.等人，异体骨髓移植用于缺少供体的患者的方法，于《血液学》-1996，美国血液学协会教育计划，第132-146页。白细胞的制备本发明的白细胞群体的起始材料能由例如地区性血液处理中心提供，其类似于现有的处理外周血干细胞以及造血干细胞的其它来源(如骨髓)的中心。能在用于进行处理的任何合适的设施输入(能在多种设施包括当地血液中心或医院血库进行输入)并处理供体的白细胞。此外，输入的白细胞能连夜运往优质生产规范(GMP)的细胞处理设施进行处理和质量保证试验。然后将用于DLI的经处理的白细胞通过当日快递送往患者所在医院，用于对患者施用。此外，能使用本领域所知的方法冷藏处理的白细胞，如控制在10％DMSO中的冷冻速度，并贮存于液氮中(参见Russel等人，骨髓移植19861-866，1997)。当需要移植时，融化冷冻的白细胞，洗涤去除DMSO。
一种用于纯化白细胞制剂的常规方法包括通过密度梯度离心从全血中分离。这一般包括通过Ficoll梯度离心分离富含T细胞的白细胞。参见，例如，Longley和Stewart，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)12133-38，1989。该方法如下进行(1)仔细地在Ficoll上层加新抽取的血样(例如50-200毫升)，使得界面不受干扰；(2)通过吸出位于梯度界面的不透明细胞带(离心后)收集白细胞；和(3)洗涤收集的细胞，使之不含Ficoll。在该系统中沉淀红细胞和粒细胞。为了去除Ficoll，一般通过离心并弃上清液，洗涤细胞一次或多次。该方法产生纯化的白细胞制剂，即基本上不含红细胞的制剂。
存在制备大量白细胞制剂的自动化方法。例如，本发明构思了根据使用说明书用白细胞电泳仪(例如，COBE Spectra Apheresis System，COBE BCT，Inc.Lakewood，CO)处理血液。优选地，使用产生具有最低百分血细胞比容的白细胞制剂的输入(apheresis)仪。白细胞电泳后，用适当溶液(如上所述的血浆、输血级溶液等)洗涤并稀释白细胞制剂，使之达到低于0.5％的最终血细胞比容。如果以上步骤不能充分降低血细胞比容水平，则用Percoll分离作为进一步的纯化步骤。作为白细胞电泳的一种备择方法，红细胞去除法对于本领域的技术人员是众所周知的。
如果基本上只含有T细胞和NK细胞或其它白细胞混合物的白细胞群体是所希望的，则能利用例如用鉴定特异性细胞表面标记的适当抗体的阳性和/或阴性选择，通过荧光激活细胞分选法(FACS)，从白细胞制剂中分离所选的细胞亚群。能用于筛选的表面标记的实例包括但不限于CD4、CD8、CD16和CD56。这些细胞分离法在本领域中众所周知，参见，例如，Ed Harlow和David Lane，《抗体实验室手册》(Antibody，A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1988。
将纯化的白细胞群体悬浮于如上公开的适当溶液中。能立即处理纯化的白细胞群体，或冷藏用于以后的处理。在对于增殖灭活的制剂中，将纯化、混合的白细胞制剂重悬浮于等渗溶液如血浆、合成培养基或此两者的组合物中。一般以每毫升10-109个细胞、优选地104-107细胞/ml、理想地2×106细胞/ml的细胞密度制备纯化的白细胞群体。
本发明构思了经处理的白细胞的制备和施用或应用的多种方案。可收集外周血(或另外的白细胞来源包括骨髓或脐血)，并冷冻直到用于增殖灭活处理，处理时融化细胞并洗涤使之不含冷藏剂，任选地加工以获得纯化的白细胞制剂，并进行处理。随后能将经处理的白细胞群体输入患者。下列备择方案也是可能的i)外周血的收集、加工、白细胞处理和输注；ii)收集、加工、白细胞处理、经处理的细胞的冷冻、洗掉冷藏剂和输注；iii)用靶抗原接种供体以扩展抗原特异性T细胞、从接种的供体收集外周血、加工、处理并输注；iv)用靶抗原对供体白细胞体外致敏以扩展抗原特异性T细胞、白细胞处理和输注。化合物在本发明的一种实施方案中，能与核酸形成共价键的化合物适于获得本发明的白细胞群体的目的。这些化合物优选地包含一种与核酸非共价结合的部分，以及能与核酸反应形成共价键的相同或不同的部分。该化合物优选地具有下列性质i)对核酸的高结合亲和力；ii)在水溶液中的可溶性；和iii)穿透白细胞膜的能力。能与核酸形成共价键的部分包括化学反应性部分，其不需要外部刺激来激活并可与核酸反应，和可光活化的部分，其只在以电磁辐射形式刺激后才与核酸反应。
在此使用时，术语“烷化剂化合物”是指一种化合物，其包含至少一种化学反应性部分，该部分在没有外部刺激如光刺激时能与核酸反应形成共价键。
能与核酸形成共价键的化合物还可能是可光活化的。在此定义的“可光活化化合物”包括一种在被某种波长的光线刺激光活化后能与核酸形成共价键的部分。
优选地，该化合物包含能与核酸反应形成共价键的部分，和能与核酸非共价结合的部分。在本发明的范围内，能与核酸结合的部分也可以作为能与核酸共价反应的部分，并且可以是例如可光活化的。
在一种实施方案中，烷化剂化合物包含核酸结合部分；能与核酸反应形成共价键的部分(“在此被称为效应物部分”)；和共价连接核酸部分与效应物部分的脆性连接体。在一种优选实施方案中，在水溶液中，适当pH值时，这些化合物具有一段时间的活性，其间它们能与核酸结合并反应。该阶段后，化合物分解为不再能与核酸很好地结合也不能与之反应的产物。
这些烷化剂化合物的化学结构可被大致地描述为一种能与脆性连接体共价键合的锚，共价连接于一种效应物上。“锚”，也被称为“核酸结合部分”被定义为能与核酸生物聚合体(DNA、RNA或其合成类似物)非共价结合的部分。“效应物”或“效应物部分”被定义为一种能通过与核酸形成共价键的机制与该核酸反应的部分。“脆性连接体”被定义为一种用来共价连接锚与效应物的部分，其在某些条件下降解，使锚与效应物不再共价连接。锚-脆性连接体-效应物的排列使化合物能与核酸特异结合(由于锚的结合能力)。这使效应物进入附近与核酸反应。
优选地，核酸结合部分选自芳族嵌入物、吖啶、吖啶衍生物、椭圆玫瑰树碱、2-多胺、沟结合剂和疏水或择形结合剂。在优选实施方案中，脆性连接体含有一种功能性单位，其选自正向酯、反向酯、正向硫代酯、反向硫代酯、正向及反向硫羰酸酯、正向及反向二硫代羧酸、硫酸酯、正向及反向磺酸酯、磷酸酯和正向及反向膦酸酯基。效应物部分优选地含有一种官能团，选自芥子基、芥子基相当物、环氧化物、醛和甲醛合成体。
当烷化剂化合物与白细胞组合物在生理pH下结合形成一种反应混合物时，该化合物的效应物部分与所接触的核酸反应。不能与核酸反应的效应物部分逐渐被溶剂水解。脆性连接体的水解与效应物-核酸反应和效应物水解同时发生。理想的是脆性连接体以低得足以使白细胞增殖失活的速率分解；即，脆性连接体的分解速率低于该化合物与白细胞核酸反应的速率。经过足够长的时间后，该化合物分解为锚(其也可带有脆性连接体片段)和效应物-核酸分解产物(脆性连接体片段也可能仍与效应物连接)，或者分解为锚(其也可带有脆性连接体片段)和水解的效应物分解产物(脆性连接体片段也可能仍与效应物连接)。不与锚或效应物保持连接的化合物降解后，也能产生脆性连接体的其它片段。本发明的烷化剂化合物的确切实施方案确定锚分解产物或效应物分解产物是否带有脆性连接体片段，或者是否产生脆性连接体的其它片段，这些片段不与锚或效应物分解产物结合。
优选的烷化剂化合物是在脆性连接体分裂后产生低诱变性分解产物的化合物。效应物水解后化合物的诱变性主要归因于锚部分，因为该锚与核酸相互作用，并且可能具有干扰核酸复制的能力，即使效应物部分水解后仍如此。脆性连接体分裂后，锚片段具有大大降低的诱变性。
在本发明的其它实施方案中，在一段时间后从反应混合物中去除能与核酸形成共价键的化合物。最佳反应时间可以经验地确定，如下文实施例中所述。在共同拥有的美国专利申请系列号08/779,830、08/779,885和09/003,113中以及在1998年7月8日申请的共同拥有的美国专利申请代理人目录号28217-20004.21和28217-20004.22中，提供了用于从反应混合物中去除化合物的方法和组合物。上一句所提及的所有专利申请的公开内容在此都完全引入作为参考。此外，也向反应混合物中加入能与化合物反应并使之失活的猝灭剂。在1998年1月6日申请的共同拥有的美国临时专利申请系列号60/070,597和1998年7月6日申请的美国专利申请代理人目录号28217-20006.00中，公开了典型的猝灭剂和方法；其公开内容在此都完全引入作为参考。
多种类型适用于作为锚、连接体和效应物。能在烷化剂化合物中使用的锚基团的实例包括但不限于嵌入物(包括芳族嵌入物)、小沟结合剂、大沟结合剂、通过静电相互作用或疏水相互作用结合的分子以及通过序列特异性相互作用结合的分子。以下是可能的锚基团的非限制性列表吖啶(及吖啶衍生物，例如硫酸原黄素、吖啶黄素、二吖啶、吖啶酮、苯并吖啶、喹吖因)、放线菌素、蒽环酮、紫红菌素、道诺霉素、噻吨酮(及噻吨酮衍生物，例如竹桃霉素D)、氨茴霉素、丝裂霉素、棘霉素(醌霉素A)、三骨菌素、椭圆玫瑰树碱(及二聚体、三聚体及其类似物)、norphilin A、芴(及衍生物，如芴酮、芴二胺)、吩嗪、菲啶、吩噻嗪(例如氯丙嗪)、吩噁嗪、苯并噻唑、呫吨和噻吨、蒽醌、蒽吡唑、苯并噻喃吲哚、3，4-苯并芘、1-芘基环氧乙烷、苯并蒽、苯并二吡喃酮、喹啉(例如氯奎、奎宁、苯基喹啉、氨甲酰)、呋喃香豆素(例如补骨脂素和异补骨脂素)、乙锭、丙锭、coralyne和多环芳香烃及其环氧乙烷衍生物；偏端霉素、纺锤霉素、其它lexitropsin、Hoechst 33258及其它Hoechst染料、DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)、berenil和三芳基甲烷染料；黄曲霉毒素；精胺、亚精胺及其它多胺；和核酸或类似物，它们通过序列特异性相互作用如三股螺旋形成、D-环形成和与单链标靶的直接碱基配对来结合。这些化合物的衍生物也是锚基的非限制性实例，其中化合物衍生物包括但不限于，在任何位置带有一种或多种任何种类的取代基的化合物，该化合物氧化或还原产物，等等。
能在本发明中使用的连接体的实例包括但不限于含有如下官能团的化合物，如酯(其中该酯的羰基碳位于锚与酯的sp3氧之间；该排列也叫做“正向酯”)、“反向酯”(其中该酯的sp3氧位于锚与该酯的羰基碳之间)、硫代酯(其中该硫代酯的羰基碳位于锚与该硫代酯的硫之间，也叫做“正向硫代酯”)、反向硫代酯(其中该硫代酯的硫位于锚与该硫代酯的羰基碳之间，也叫做“反向硫代酯”)、正向及反向硫羰酸酯、正向及反向二硫代羧酸、硫酸酯、正向及反向磺酸酯、磷酸酯、正向及反向膦酸酯基。“硫代酯”表示-C(＝O)-S-基；“硫羰酸酯”表示-C(＝S)-O-基，“二硫代羧酸”表示-C(＝S)-S-基。对于被称为“正向”和“反向”的基团，正向是这样的官能团方向，其中在官能团水解后，产生的酸性官能团可与锚部分共价连接，而产生的醇或硫醇官能团可与效应物部分共价连接。反向是这样的官能团方向，其中在官能团水解后，产生的酸性官能团可与效应物部分共价连接，而产生的醇或硫醇官能团可与锚部分共价连接。
能在本发明中使用的效应物的实例包括但不限于芥子基、芥子基相当物、环氧化物、醛、甲醛合成体和其它烷化及交联剂。芥子基被定义为含有单或双卤乙胺基和单卤乙硫醚基。芥子基相当物被定义为通过类似于芥子基的机制(即，通过形成一种吖丙啶鎓中间物，或者通过含有或形成一种氮丙啶环，它能与亲核物质反应)反应的基团，如单或双甲磺酰基乙胺基、单甲磺酰基乙硫醚基、单或双甲苯磺酰基乙胺基和单甲苯磺酰基乙硫醚基。甲醛合成体被定义为能在水溶液中分解为甲醛的任何化合物，包括羟甲胺如羟甲基甘氨酸。美国专利号4,337,269和国际专利申请WO 97/02028中给出了甲醛合成体的实例。
用下列通式I、II和III描述能用来制备本发明的白细胞的烷化剂化合物。
通式I为
其中至少R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9之一是如下所述的-V-W-X-E，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9的剩余者独立地选自-H、-R10、-O-R10、-NO2、-NH2、-NH-R10、-N(R10)2、-F、-Cl、-Br、-I、-C(＝O)R10、-C(＝O)-O-R10和-O-C(＝O)-R10，其中-R10独立地为H、-C1-8烷基、-C1-8杂烷基、-芳基、-杂芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3杂烷基-芳基、-C1-3烷基-杂芳基、-C1-3杂烷基-杂芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3杂烷基、-杂芳基-C1-3烷基、-杂芳基-C1-3杂烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3杂烷基、-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3烷基、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3杂烷基、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3杂烷基或-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3杂烷基；V独立地为-R11-、-NH-R11-或-N(CH3)-R11-，其中-R11-独立地为-C1-8烷基-、-C1-8杂烷基-、-芳基-、-杂芳基-、-C1-3烷基-芳基-、-C1-3杂烷基-芳基-、-C1-3烷基-杂芳基-、-C1-3杂烷基-杂芳基-、-芳基-C1-3烷基-、-芳基-C1-3杂烷基-、-杂芳基-C1-3烷基-、-杂芳基-C1-3杂烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3杂烷基-、-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3烷基-、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3杂烷基-、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3杂烷基-或-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3杂烷基-；W独立地为-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-、-O-S(＝O)2-O-、-S(＝O)2-O-、-O-S(＝O)2-、-O-P(＝O)(-OR10)-O-、-P(＝O)(-OR10)-O-、-O-P(＝O)(-OR10)-；X独立地为-R11-；并且E独立地选自-N(R12)2、-N(R12)(R13)、-S-R12和
其中-R12为-CH2CH2-G，其中每个G独立地为-Cl、-Br、-I、-O-S(＝O)2-CH3、-O-S(＝O)2-CH2-C6H5或-O-S(＝O)2-C6H4-CH3；其中R13独立地为-C1-8烷基、-C1-8杂烷基、-芳基、-杂芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3杂烷基-芳基、-C1-3烷基-杂芳基、-C1-3杂烷基-杂芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3杂烷基、-杂芳基-C1-3烷基、-杂芳基-C1-3杂烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3杂烷基、-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3烷基、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3杂烷基、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3杂烷基或-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3杂烷基；及其所有的盐和立体异构体(包括对映异构体和非对映异构体)。
根据通式I的一种优选组合物是化合物S-303，其中V为-NHR11-，R11为-CH2CH2-，W为-C(＝O)-O-，X为-CH2CH2-，E为-N(R12)2，R12为-CH2CH2G，G为-Cl。参见共同拥有的PCT申请US98/00531。通式II为
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地选自-H、-R10、-O-R10、-NO2、-NH2、-NH-R10、-N(R10)2、-F、-Cl、-Br、-I、-C(＝O)R10、-C(＝O)-O-R10和-O-C(＝O)-R10，其中-R10独立地为H、-C1-8烷基、-C1-8杂烷基、-芳基、-杂芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3杂烷基-芳基、-C1-3烷基-杂芳基、-C1-3杂烷基-杂芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3杂烷基、-杂芳基-C1-3烷基、-杂芳基-C1-3杂烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3杂烷基、-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3烷基、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3杂烷基、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3杂烷基或-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3杂烷基；R20为-H或-CH3；并且R21为-R11-W-X-E，其中-R11-独立地为-C1-8烷基-、-C1-8杂烷基-、-芳基-、-杂芳基-、-C1-3烷基-芳基-、-C1-3杂烷基-芳基-、-C1-3烷基-杂芳基-、-C1-3杂烷基-杂芳基-、-芳基-C1-3烷基-、-芳基-C1-3杂烷基-、-杂芳基-C1-3烷基-、-杂芳基-C1-3杂烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3杂烷基-、-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3烷基-、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3杂烷基-、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3杂烷基-或-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3杂烷基-；W独立地为-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-、-O-S(＝O)2-O-、-S(＝O)2-O-、-O-S(＝O)2-、-O-P(＝O)(-OR10)-O-、-P(＝O)(-OR10)-O-、-O-P(＝O)(-OR10)-；X独立地为-R11-；并且E独立地选自-N(R12)2、-N(R12)(R13)、-S-R12和
其中-R12为-CH2CH2-G，其中每个G独立地为-Cl、-Br、-I、-O-S(＝O)2-CH3、-O-S(＝O)2-CH2-C6H5或-O-S(＝O)2-C6H4-CH3；其中R13独立地为-C1-8烷基、-C1-8杂烷基、-芳基、-杂芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3杂烷基-芳基、-C1-3烷基-杂芳基、-C1-3杂烷基-杂芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3杂烷基、-杂芳基-C1-3烷基、-杂芳基-C1-3杂烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3杂烷基、-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3烷基、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3杂烷基、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3杂烷基或-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3杂烷基；及其所有的盐和立体异构体(包括对映异构体和非对映异构体)。
通式III为
其中至少R44、R55、R3、R4、R5和R8之一是-V-W-X-E，而R44、R55、R3、R4、R5和R8的剩余者独立地选自-H、-R10、-O-R10、-NO2、-NH2、-NH-R10、-N(R10)2、-F、-Cl、-Br、-I、-C(＝O)R10、-C(＝O)-O-R10和-O-C(＝O)-R10，其中-R10独立地为H、-C1-8烷基、-C1-8杂烷基、-芳基、-杂芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3杂烷基-芳基、-C1-3烷基-杂芳基、-C1-3杂烷基-杂芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3杂烷基、-杂芳基-C1-3烷基、-杂芳基-C1-3杂烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3杂烷基、-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3烷基、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3杂烷基、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3杂烷基或-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3杂烷基；V独立地为-R11-、-NH-R11-或-N(CH3)-R11-，其中-R11-独立地为-C1-8烷基-、-C1-8杂烷基-、-芳基-、-杂芳基-、-C1-3烷基-芳基-、-C1-3杂烷基-芳基-、-C1-3烷基-杂芳基-、-C1-3杂烷基-杂芳基-、-芳基-C1-3烷基-、-芳基-C1-3杂烷基-、-杂芳基-C1-3烷基-、-杂芳基-C1-3杂烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3烷基-、-C1-3烷基-芳基-C1-3杂烷基-、-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3烷基-、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3杂烷基-、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3杂烷基-或-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3杂烷基-；W独立地为-C(＝O)-O-、-O-C(＝O)-、-C(＝S)-O-、-O-C(＝S)-、-C(＝S)-S-、-S-C(＝S)-、-C(＝O)-S-、-S-C(＝O)-、-O-S(＝O)2-O-、-S(＝O)2-O-、-O-S(＝O)2-、-O-P(＝O)(-OR10)-O-、-P(＝O)(-OR10)-O-、-O-P(＝O)(-OR10)-；X独立地为-R11-；并且E独立地选自-N(R12)2、-N(R12)(R13)、-S-R12和
其中-R12为-CH2CH2-G，其中每个G独立地为-Cl、-Br、-I、-O-S(＝O)2-CH3、-O-S(＝O)2-CH2-C6H5或-O-S(＝O)2-C6H4-CH3；其中R13独立地为-C1-8烷基、-C1-8杂烷基、-芳基、-杂芳基、-C1-3烷基-芳基、-C1-3杂烷基-芳基、-C1-3烷基-杂芳基、-C1-3杂烷基-杂芳基、-芳基-C1-3烷基、-芳基-C1-3杂烷基、-杂芳基-C1-3烷基、-杂芳基-C1-3杂烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3烷基、-C1-3烷基-芳基-C1-3杂烷基、-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3烷基、-C1-3杂烷基-芳基-C1-3杂烷基、-C1-3烷基-杂芳基-C1-3杂烷基或-C1-3杂烷基-杂芳基-C1-3杂烷基；及其所有的盐和立体异构体(包括对映异构体和非对映异构体)。
应当理解，在上述通式I中，吖啶核是锚部分，-V-W-X-基团包括脆性连接体、E基团为效应物基团。同样，在上述通式III中，补骨脂素核是锚部分，-V-W-X-基团包括脆性连接体、E基团为效应物基团。通式II是通式I的子集。
实施例7-12说明这些化合物的合成，用于产生本发明的白细胞。
在本发明的一种实施方案中，以前在共同拥有的美国专利号5,399,719(其公开内容在此完全引入作为参考)中公开的4’-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(“S-59”)也可用于对白细胞群体的光化学处理。
适用于本发明方法的可光活化化合物包括呋喃香豆素、放线菌素、蒽环酮、氨茴霉素、苯并二吡喃酮、芴和芴酮、单星脂肪蓝、norphillinA、有机染料、菲啶、吩噻嗪硫鎓盐、吩嗪、吩噻嗪、叠氮基苯、喹啉和噻吨酮。在此所述的可光活化化合物的优选种通常是指呋喃香豆素。补骨脂素及衍生物补骨脂素是属于呋喃香豆素组的平面芳香族有机化合物。补骨脂素存在于自然中，主要在植物中，包括椴树、丁香、芹菜、欧防风和无花果。至于人类，补骨脂素已经用于对白癫风、牛皮癣和蕈样肉芽肿治疗的光化学疗法。关于补骨脂素光化学的综述，参见Parsons，B.J.，光化学与光生物学32813-821，1980。以下显示了补骨脂素的基本结构。
特别地，本发明考虑补骨脂素，[7H-呋喃(3，2-g)-(1)-苯并吡喃-7-酮，或6-羟基-5-苯并呋喃丙烯酸的b-内酯]，它是线性的
其中附加于中心芳香部分的两个氧残基具有1，3方向，另外其中的呋喃环部分连接于两个环的香豆精系统的位置6上。补骨脂素衍生物由线性呋喃香豆素在位置3、4、5、8、4’或5’的取代所产生。
关于安全问题，补骨脂素已存在于我们的饮食中。无长波长UVA照射时，补骨脂素是相对无活性的。测得UVA激活的补骨脂素的有效半衰期为几毫秒。照射后剩余的所有药物都回复为无活性状态，从而限制其副作用。
以前用于病原体灭活的方案需要在暴露于光线之前及光照期间从反应中去除分子氧，来防止照射过程中产生的氧自由基对血液制品的损伤。参见L.Lin等人，血液74517(1989)；Wiesehahn的美国专利号4,727,027。本发明的方法能用来在氧存在下抑制白细胞的增殖。此外，应用本发明的方法使用的新型补骨脂素，不需要降低分子氧的浓度。优选的补骨脂素具有低诱变性和高核酸结合亲和力。
8-甲氧基补骨脂素(在文献中有不同的名称，例如，花椒毒素、甲氧补骨脂素、8-MOP)是一种天然存在的补骨脂素，在埃姆斯试验中具有低诱变性。
4’-氨甲基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(AMT)是最有反应性的核酸结合补骨脂素衍生物之一，可在每3.5个DNA碱基对中产生可达1个的AMT加合物(S.T.Issacs，G.Wiesehahn和L.M.Hallick，NCI专论(NCI Monograph)6621，1984)。
“4’-伯氨基取代的补骨脂素”或“4-PAP”被定义为这样的补骨脂素化合物，其具有通过总长为2-20个碳的烃链与补骨脂素4’位置连接的NH2基，其中这些碳的0-6个独立地被NH或O所取代，取代的每一点与取代的其它点至少隔开两个碳，与补骨脂素至少隔开一个碳。4’-伯氨基取代的补骨脂素可以在补骨脂素的4、5’和8位置上具有其它的取代，这些取代包括但不限于下列基团H和(CH2)nCH3，其中n＝0-6。
“5’-伯氨基取代的补骨脂素”，在此也用缩写“5-PAP”表示，被定义为这样的补骨脂素化合物，其具有通过总长为1-20个碳的烃链与补骨脂素5’位置连接的NH2基，其中这些碳的0-6个独立地被NH或O取代，取代的每一点与取代的其它点至少隔开两个碳，与补骨脂素至少隔开一个碳。5’-伯氨基取代的补骨脂素可以在补骨脂素4、4’和8位置上具有其它的取代，这些取代包括但不限于下列基团H和(CH2)nCH3，其中n＝0-6。美国专利号5,585,503、5,578,736、5,556,993和5,399,719中公开了4-PAP和5-PAP的实例(包括S-59)以及它们的合成方法。
优选的补骨脂素包括5’-伯氨基取代的补骨脂素和4’-伯氨基取代的补骨脂素(在此通称为PAP)、8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)、4’-氨甲基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(AMT)、5-甲氧基补骨脂素(5-MOP)和三氧杂啉4，5’，8-三甲基补骨脂素。AMT、5-MOP、8-MOP和三氧杂啉是可商业获得的。
最优选的补骨脂素是具有以上所示结构式的S-59(见缩写S-59)。S-59是一种能通过嵌入与核酸可逆结合的合成补骨脂素。一旦用UVA照射，嵌入的S-59即形成单加合物并与RNA和DNA链间交联。S-59光化学处理是核酸特异的，S-59易于穿过细胞膜和核膜。S-59兼具高水溶性和核酸结合亲和力的特点，对于核酸加合物的形成具有高的量子产量。这使较低补骨脂素浓度能用于PCT，在无非特异性细胞损伤的情况下抑制增殖。对S-59的诱变性和基因毒性研究证明了对于用来净化血液制品中的病原体的浓度而言40000-67000倍的安全限度。最后，用于PCT的S-59剂量大大低于呋喃香豆素(包括补骨脂素的化学基团)的平均每日饮食摄入量(Wagstaff.D.J.Reg.Tox.Pharm.14261-272，1991)。
在一种实施方案中，用一种可光活化化合物处理含有一种白细胞群体的细胞群体，该化合物含有一种在光活化后能与核酸形成共价键的部分。因此，为了与核酸形成共价键，可光活化化合物必须用光线活化。光线包括紫外线(UVA、UVB、UVC)和可见光。在一种实施方案中，用于PCT的波长范围为200-450nm。在一种优选实施方案中，用于PCT的光线波长为320-400nm。
优选地，用波长为320-400nm的UV线光化学处理该细胞群体。单纯的UVA照射对细胞引起最小的损伤。
在一种实施方案中，可光活化化合物包括一种补骨脂素分子。应用适当浓度补骨脂素和UVA线剂量的PCT将引起增殖抑制，而保持白细胞的免疫原性功能，例如，该功能可有效地促进疾病细胞、受感染细胞或病原体的破坏，诱导抗白血病反应，便于第二种细胞群体的植入，促进免疫重建，利于免疫治疗及治疗混合嵌合状态。补骨脂素反应性不仅特别针对细胞中的核酸之于蛋白质，而且对于DAN之于RNA分子也有不同的补骨脂素结合亲和力，这是由于使得能更好嵌入DNA中的核酸结构的不同(Cimino，G.D.等人，生物化学年述(Ann.Rev.Biochem.)541151-1193，1985)。另外，利用该技术，能区别性地修饰转录活性(相比无活性)基因，这是由于可影响补骨脂素结合的不同构象和组蛋白结合状态。因此，如PCT的处理具有主要在DNA合成(复制)水平上干扰细胞功能的能力，对转录有较小的影响，对蛋白质合成有最小的影响或无影响。例如，在PCT的情况中，根据所用的补骨脂素浓度和UVA线剂量确定干扰的水平。
与可光活化化合物混合的白细胞样品用一种光活化装置光化学处理。通常，适用于本PCT方法的光活化装置包括下列部分(a)一种装置，用于提供适当波长的电磁辐射，以引起可光活化化合物的活化；(b)在光活化期间支持多种样品的装置，它与提供辐射的装置有固定的关系；和(c)在光活化期间使样品温度保持于希望的温度范围内的装置。
在一种实施方案中，该光活化装置能够发射出特定强度的电磁辐射光谱，包括200-450nm、优选地320-400nm的波长。使用光活化装置内的适当滤波器能选择特定的波长。在Hearst等人的美国专利号5,184,020和5,503,721及WO 96/39820中公开了一种合适的光活化装置以及利用该装置光活化可光活化化合物的方法。可以使用的其它光活化装置包括General Electric F20TI2-BLB型荧光UVA灯泡(Alter，H.J.等人，柳叶刀241446(1988))和伦敦P.W.Allen Co.制造的A405-TLGW/05型长波长紫外线灯。用补骨脂素对白细胞的光化学处理在水中或在如以下实施例所述的适当溶剂中制备补骨脂素贮存液。
将补骨脂素贮存液加入纯化的供体白细胞群体悬液中至希望的终浓度。以上述制备方法，用8-MOP饱和的PAS制备用8-MOP处理的单位。在光活化装置中用UVA线照射纯化的供体白细胞，至10-3-100J/cm2的终剂量。照射期间搅拌样品。在照射之前采取白细胞样品作为对照。
一般而言，向纯化的白细胞制剂中加入浓度为10-4-150μM、优选地10-3-150μM的PAP。白细胞的细胞密度一般为约10-109细胞/ml，优选地约103-108细胞/ml，更优选地约104-107细胞/ml，最优选地约2×106细胞/ml，在一种优选实施方案中，利用波长为320-400nm的紫外线对与S-59混合的白细胞进行PCT。将光活化方法限于大于320nm的波长使直接核酸损伤减到最小，因为高于313nm时核酸的吸收很小。细胞优选地将接受约10-3-100J/cm2、更优选地1-3J/cm2的光剂量。在一种最优选的实施方案中，光剂量为3J/cm2。照射一般为1-50mW/cm2的光强度。白细胞样品暴露于UV线的时间为约1秒到60分钟，优选地约3分钟，更优选地约1分钟。
PCT后，如上及实施例所述测定白细胞样品增殖及参与白细胞活性的效能。主要是测定下列参数细胞生存力、增殖能力、细胞因子分泌和表面抗原表达。治疗应用本发明的经处理的白细胞群体是不增殖的但保留免疫学活性，如下所述具有多种预防及治疗用途。一般地，接受含有经处理的白细胞群体的DLI的个体包括但不限于移植患者，如BM后移植患者或预期进行实体器官移植的患者。经处理的白细胞不能引起GVHD这一事实使得在DLI中能施用更大量的白细胞(即更大的细胞剂量)，从而使治疗的效能达到最大。
经处理的白细胞可用于供体白细胞输注(DLI)，尤其是对异体BMT患者或无免疫应答患者(如患有CLL的老年患者)提供免疫活性。使用经处理的白细胞的DLI可用于缓解包括下列的多种病症白血病，包括慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CmML)、急性骨髓性白血病(AML)和急性淋巴母细胞性白血病(ALL)；多发性骨髓瘤(MM)；非何杰金氏淋巴瘤和何杰金氏淋巴瘤；大细胞淋巴瘤(LCL)；和EB病毒诱导的B淋巴增生性疾病(EBV-BLPD或EBV-诱导的淋巴瘤)；
实体瘤，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌和结肠癌、黑素瘤、肾细胞癌、成神经细胞瘤、头颈肿瘤；再生障碍性贫血；脊髓发育不良；免疫缺陷，例如常见多种免疫缺陷、SCID、维-奥二氏综合症；粒性白细胞缺乏症；混合嵌合状态；和遗传病。
DLI可以用于预防或治疗目的的多种形式(a)对所有同种异体移植的过继免疫治疗；(b)对于免疫抑制或免疫缺陷患者的免疫重建；(c)对不适于移植的老年白血病患者的治疗(d)BMT少量或小型移植。
BMT少量方案是两个步骤的方法，包括i)使用最小条件方案和供体干细胞对移植耐受性的诱导；和ii)重复用DLI的治疗。该方案避免了化学治疗方案的毒性。BMT少量方案适用于下列适应症不能正常地适于移植的患者，尤其是老年患者(＞65岁)；CLL患者，其中大多数严重无免疫应答。BMT少量方案降低了毒性、GVHD和感染。以下实施例13中描述了一种典型的BMT少量方案。
(e)CD34选择的/T细胞排除的同种异体移植加同时的DLI。
与CD34+选择的细胞(为了富集干细胞及祖细胞的选择)同时提供的DLI可用于提供对感染的过继免疫治疗，如CMV、EB病毒(EBV)、腺病毒(Ad)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒引起的感染，和真菌感染，并可用于治疗白血病，例如CML。
(f)混合嵌合状态的治疗。
(g)补救化学治疗或化学抗性白血病。
在本发明的一种实施方案中，在单倍体相同的(单倍)移植中施以PA-DLI。一般地，单移植需要几乎完全的T细胞排除，导致严重的、持续的免疫抑制。PA-DLI可用于保持宿主的免疫活性；另外，可为癌症的治疗提供GVL效应。
在优选实施方案中，本发明的无GVHD能力但保留某些免疫功能的白细胞，在DLI中用于复发性癌症的缓解或同种异体BMT后最小残余疾病的去除，尤其是CML和急性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。对CML的bcr-abl蛋白质特异的大量供体CTL有助于复发CML中DLI的效能。如果通过医生常规用来监测癌细胞存在的方法能检测到恶性细胞，则确定癌症患者患有“复发”。
在另一种实施方案中，在诱导化学治疗(化学治疗的最初一轮)期间白血病患者的治疗中使用含有非增殖性白细胞的DLI，来避免重度骨髓抑制方案并消除最小残余疾病。在该安排中使用DLI，能降低诱导期间所用化疗药物的有毒剂量。
在本发明的一种实施方案中，PA-DLI也能用于实体器官的移植(例如肾脏、心脏、皮肤)，作为一种提高异体移植物寿命和供体器官接受的机会的方法。由于供体器官中过客白细胞的存在，在异体移植中大多发生器官排斥。由于不能增殖且不能介导GVHD，DLI(使用器官供体的白细胞)可作为移植前耐受方案，用于将以其它方式诱导器官排斥的免疫应答的抑制。对于实体器官移植的宿主的耐受包括下列步骤在器官移植过程之前或期间，用相当水平的重度骨髓抑制方案进行含或不含供体干细胞的PA-DLI输入，使供体细胞能在循环中存活。DLI可便于该方案中供体干细胞的植入，允许宿主中的混合嵌合状态。
在所有类型的移植和植入情况中，能在移植之前、同时或之后对宿主施用经处理的白细胞。能在这些时间中的任何时间进行多次经处理的细胞群体的输注。
不增殖的、免疫功能性的白细胞对于由于高龄或comorbid病而禁忌传统异体BMT的患者的DLI特别重要。患有癌症的老年患者(＞65岁)不是异体BMT的主要候选者，部分地是由于移植不能很好地重建老化的免疫系统，并由于该方法的严格性。当前，对控制老年患者中的癌症有效的唯一选择是化学治疗，其副作用对于这些患者是无法忍受的。本发明的经处理的白细胞提供一种十分需要的备择方法，用于治疗老龄患者癌症并提供对机会感染的免疫防御。DLI对于破坏癌细胞而不引起伴随的GVHD是有用的。
有些治疗情况中，在用上述化合物处理供体白细胞群体之前，扩展供体白细胞亚群尤其是抗原特异性T细胞和前身细胞是所希望的。能用对疾病细胞(例如，肿瘤相关抗原)或病原体特异的抗原刺激白细胞群体，来扩展/富集对该抗原特异的细胞毒性及辅助T细胞的数量。通过在从被刺激的供体中分离白细胞之前用适当抗原接种供体，能在体内进行刺激；此外，在用化合物处理白细胞群体之前能在体外进行对分离白细胞的刺激。
例如，用多发性骨髓瘤患者的IgG接种的供体含有高水平的骨髓瘤特异的前身CTL。因此，对于治疗多发性骨髓瘤(MM)中的应用，从这些接种的供体中制备白细胞是优选的。Hsu，FJ等人，国家医学(Nat.Med.)252-58，1996中描述了为了用非何杰金氏淋巴瘤免疫患者而用肿瘤相关肽对树突细胞脉冲。在Stingl，G.等人，今日免疫(Immunol.Today)16330-333，1995中综述了用肽/抗原对树突细胞脉冲的技术。Pardoll，D.等人，免疫(Immunity)3165-169，1995中描述了cDNA免疫(用合适的cDNA转染树突细胞)。在用于CML治疗的过继免疫治疗中，在分离供体白细胞之前，能用bcr-abl肽接种供体，用于通过本发明的方法治疗及随后的输注。例如，ten Bosch，G.等人，血液883522-3527，1996描述了用于接种的有效的及免疫原性的肽。在另一种实施例中，在根据本发明的方法治疗之前，用前列腺特异性抗原(PSA)在体内或体外预刺激用于前列腺癌治疗的供体白细胞。这样的接种能用于增加前身T细胞群体和/或对其它肿瘤特异性抗原、病毒抗原及其它病原体抗原特异的T细胞群体。
用合适的抗原接种的供体的白细胞可用于为无免疫应答的患者提供对机会感染的免疫防御的预防或治疗，这些机会感染如巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒或腺病毒(Ad)感染。一种实例中，能对CMV抗原接种供体，分离其白细胞，并根据本发明的方法处理，以在DLI中用来治疗由于免疫抑制而患CMV感染的患者。无免疫应答的患者包括处于免疫抑制药物治疗中的患者，如器官移植患者(BM及其它器官)、HIV或EBV感染的人体、癌症患者和具有免疫缺陷病的个体。
也能在体外刺激供体白细胞(也被称为离体的扩展)来扩大前身细胞集合。例如，在多发性骨髓瘤情况中，在治疗阻断GVHD活性之前，通过与由树突细胞呈递的患者特异的MM抗原在体外一起培养，能刺激供体白细胞。
也能利用离体的或体外刺激扩展抗白血病T细胞群体用于CML的治疗。在CML中，染色体9上的c-abl癌基因向染色体22上的断点簇区(bcr)的经典易位(t(9；22)(q34；q11))产生bcr-abl融合基因及bcr-abl210kD融合癌蛋白质的表达。bcr-abl融合蛋白质是CML特异的，bcr-abl蛋白质的两种主要变体是良好表征的抗原。能进行体外刺激来扩展bcr-abl蛋白质特异的T细胞，例如，如Choudhury，A.等人，血液891133-1142，1997；ten Bosch，G.等人，血液883522-3527，1996及Mannering等人，血液90290-297，1997所述。代表断点区或接点(新的接点氨基酸序列)的肽能作为免疫原，用于对来源于健康供体的人T细胞的体外免疫(参见，ten Bosch，G.等人，1996，如上文；Mannering等人，1997，如上文)。产生的CD4+T细胞识别来源于同种异体CML患者的bcr-abl表达细胞。在另一种方法中，能从CML患者的外周血细胞中体外产生树突细胞(DC)，并作为抗原呈递细胞用于抗白血病T细胞的离体扩展(Choudhury等人，1997，如上文)。一般来说，供体抗原呈递细胞(APC)能用表现疾病细胞特征的抗原脉冲，或者能与疾病细胞(例如，灭活的肿瘤细胞)协同培养；然后可在向受体中输入供体白细胞之前使这些APC接触供体白细胞。此外，供体白细胞与疾病细胞(或疾病细胞抗原)的直接接触能用来扩展供体淋巴细胞中的T细胞群体。
用来扩展T细胞的“抗原”可以是多肽、脂类或碳水化合物部分(或任何组合，如糖蛋白)，并能从疾病细胞或病原体中分离或重组产生。含有多肽的抗原不需要组成全长的蛋白质，只要它包括至少一种表位即可。该抗原能作为全长蛋白质或其片段或作为重组产生的融合蛋白质包含于疫苗组合物中，可与或者不与一种佐剂结合或以其它方式呈递。疫苗能采用多种形式表达抗原的疾病细胞，或其细胞膜制剂；或者病原体，优选地为灭活形式。制备疫苗的方法在文献中有讲授，参见，例如，Harlow，如上文。免疫和体外(离体)刺激和前身细胞群体扩展的方法在本领域中已知，参见，例如，Choudhury，A.等人，血液891133-1142，1997；ten Bosch，G.等人，血液883522-3527，1996；Mannering等人，血液90290-297，1997。
对于体内应用，白细胞一般在血浆、合成培养基或其它生理缓冲溶液中施用，剂量为每次输注每kg大约105-1011个白细胞，体积大约为50-500ml或更多。这些参数随治疗和疾病而不同，并由治疗患者的医生来决定。标准DLI实践是以每kg体重107-108个细胞的剂量施用白细胞。能与化学治疗结合施行DLI。
对于体内应用，本发明的白细胞一般是静脉内施用的。
在BMT后90天内GVHD通常是明显。为了缓解癌症复发患者中的疾病，优选地在复发诊断后1周-3月内进行DLI。对于异体BMT后的过继免疫治疗，能从BMT之前到几年后进行DLI作为维持治疗。对于接受DLI代替BMT的癌症患者，优选地在癌症诊断不久后即施以DLI。在不进行BMT时，能在化学及放射方案或其它治疗方案之前、期间或之后进行DLI。在所有指标中，DLI的适当时间安排将由在疾病治疗方面熟练的医生来确定。
治疗成功的评价DLI后，就常规方法后的GVHD监测宿主或患者。在输注后90天内GVHD通常是明显的。临床GVHD症状包括皮疹、肿胀和肝、肠、肺及关节损伤、严重的腹泻和黄疸。能测定患者胆红素和肝功能酶的水平，并且也能进行肝脏的活组织检查。能定期对接受DLI的患者监测详细病史、身体检查、综合实验室评价，包括完全血细胞计数和差别血细胞计数、尿分析、血液尿素氮肌酸酐、胆红素、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转移酶(ALT)、碱性磷酸酶、Na+、K+、Cl-、清蛋白、总蛋白质、葡萄糖和放射显影检查。癌症状况能通过例如骨髓抽取检查和活组织检查、细胞遗传检查(包括免疫组化分析)和分子分析来评价。
对于本发明，如果有可见的或可测量的疾病症状或疾病引起的症状的好转，则本发明经处理的白细胞的受体病情缓解(病情指恶性肿瘤或感染)。症状及评价其好转的方法随病情而不同，但为临床医生所熟悉。用来评价治疗成功的一种有用的终点是100天的死亡率。
本发明的方法和组合物也可用于非DLI情况中GVHD的预防。这些包括但不限于血小板转输及血小板贮存过程中细胞因子积累引起的发热、非溶血性输血反应。
本方法及本发明的经处理的、不增殖的白细胞也具有体外用途。例如，PCT方法是在原代培养物或具有分化能力的细胞系(如祖细胞和干细胞)中抑制DNA合成而不影响细胞生物合成的最低侵入性方法。因此，能在试验中用处理条件来制备分离的干细胞、白细胞或其它细胞系，从而检测细胞分化或发育步骤是否取决于增殖/DNA合成。这些研究可以鉴定沿分化或发育途径的靶分子，并且有利于抑制或促进分化的药物的发展。例如，也能用经处理的白细胞作为单向MLR试验中的刺激细胞，来刺激有增殖能力的同种异体细胞的免疫应答，而刺激细胞本身不同时增殖。使用能与DNA形成共价键的化合物的PCT及有关处理，将代替当前辐射或丝裂霉素C的应用，来实现刺激细胞的细胞抑制(cytostatis)。对于体外应用，能单独或作为测定试剂盒的一部分来提供经处理的白细胞或其它细胞的组合物。该测定试剂盒能用于MLR或用于分化测定。为此目的，经处理的细胞一般以冷冻形式提供。此外，试剂盒可提供用于制备白细胞或具有上述特征的其它细胞的试剂和说明书。这些试剂包括一种或多种能与DNA形成共价键的化合物。例如，一种用于PCT的试剂盒将包括一种或多种可光活化化合物，优选地为PAP或吖啶，更优选地为S-59。
下列实施例是为了说明在此所述的本发明而不是限制其范围。对该方法的有些修改对于本领域的技术人员而言是易于明白的，并且包含于权利要求书中。
实施例多种试验根据3H胸苷掺入的增殖测定法在一种典型测定中，在测试化合物(例如DNA复制抑制剂或促分裂原)的存在或不存在下，在96孔板中将细胞培养预期的一段时间。使用大约20Ci/mmol比活的3H胸苷制备一般含有1μCi/50μl/孔的介质。将该介质/标记物加入细胞中，并将细胞于37℃温育约4-6小时或更长。为方便起见，用一种多通道细胞收集器将细胞转移到滤纸片上，并洗掉游离的(未掺入的)标记物。然后干燥该滤片，转移至小瓶，并浸于闪烁液中。然后可将小瓶置于自动计数器中，计数氚全范围，确定一式三份样品的每分钟平均计数(cpm)。化合物-DNA加合物的测定用3H标记的PAP测定DNA修饰的程度。向纯化的白细胞样品中加入PAP至希望的终浓度。以适当的UV线剂量照射小型-PL2410塑料容器中的20mL等份。对照样品在无UVA时只用PAP处理。照射后，纯化白细胞DNA。通过测定260nm的吸光度测定每一样品的DNA含量。由DNA样品的放射性计算每1000个碱基对(bp)的补骨脂素加合物的数量。标准曲线使3H计数的量与加合物的数量相关。PCR抑制试验聚合酶链反应(PCR)方法在本领域中众所周知。参见K.B.Mullis等人，美国专利号4,683,195和4,683,202，在此引入作为参考。可用该试验来估计PAP-DNA加合物对特定核酸序列的模板功能的作用。
为了获得HLA-DQα基因座中的242bp序列或对β-珠蛋白基因座中的439bp序列，PCR扩增由光化学处理的或γ照射的血小板浓缩物获得的DNA样品(1μg)。连续稀释(1∶10)然后扩增对照(未处理的)DNA。不稀释地扩增处理的DNA。PCR扩增进行35个循环。该试验提供了一种方法，用于将细胞增殖试验所测定的功能性T细胞增殖抑制与核酸的直接修饰相关联。
下列实施例1-4表明，PCT对被处理白细胞性质的影响与白细胞DNA的修饰及聚合酶活性的抑制相关。其次，对血小板浓缩物中白细胞的PCT处理能防止鼠转输模型中转输激活的GVHD。
实施例1T细胞的光化学灭活实施例1证明，PCT能以依赖剂量的方式灭活白细胞。作为例子，补骨脂素，可使用S-59、AMT和8-MOP。PCT的剂量依赖性随所用补骨脂素的性质而不同，S-59是所试最有效的。
表征了应用S-59(正方形)、4’-氨甲基4，5’，8-三甲基补骨脂素[AMT](三角形)和8-甲氧基补骨脂素[8-MOP](圆形)的光化学处理对血小板浓缩物(PC)中白细胞的剂量相关的作用，结果显示于图1中。血小板浓缩物如美国专利号5,593,823所述制备并处理，该专利在此引入作为参考。在LDA试验中将来自于光化学处理的及未处理的合并随机供体PC的白细胞加于板上。在1焦耳/cm2UVA的恒定光剂量下使用不同浓度的三种补骨脂素。用0.05μM S-59、1.0μM AMT和10.0μM 8-MOP灭活T细胞至LDA的检测下限(用箭头标出)。这些数据清楚地表明，在抑制T细胞增殖方面，与AMT和8-MOP相比，S-59是更好的光试剂。
实施例2混合白细胞反应从4个个体中抽取外周血置于抗凝剂柠檬酸葡萄糖(ACD)试管中。通过在Ficoll上的密度梯度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。合并三名供体的PBMC，用作异体刺激物。剩余个体的PBMC用作效应物。刺激物和效应物PBMC用补加有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI洗两次，重悬浮于补加培养基中。
使刺激物PBMC暴露于血库137铯辐射体的2500cGyγ辐射下。然后将刺激物细胞以含有1.0×105个细胞的100μL等份加于96孔圆底平板中。
效应物细胞如下经受应用S-59的PCT。将效应物细胞重悬浮于30mL上述细胞培养基中，并向细胞悬液中加入水性S-59贮存液(溶解于水中)至图2、图3或图4中所说明的终浓度。S-59贮存液的浓度和使用体积依希望的S-59终浓度而不同。然后将含有S-59的30mL细胞溶液转移到小PL2410袋中，用3J/cm2剂量的UVA线照射。对于图3，光剂量为3.0J/cm2。然后离心细胞，重悬浮于细胞培养基中，以含有1.0×105个细胞的100μL等份加板，并与刺激物细胞混合为每孔200μL的终体积。
然后在37℃、5％CO2下温育培养板。温育1、2及7天后取出MLR的上清液样品，贮存于-80℃，用于随后的细胞因子分析。用来测定细胞增殖的孔温育6天。6天温育后，用来测定细胞增殖的所有孔接受1μCi3H胸苷。在3H胸苷存在下温育24小时后，将细胞收获于玻璃纤维纸上。然后通过液体闪烁计数定量掺入的3H胸苷的量。图2显示了用不同浓度S-59光化学处理的效应细胞的3H胸苷掺入的结果。
用R&D Systems提供的ELISA测定试剂盒按照使用说明书进行被处理细胞的细胞因子IL-2和IFN-γ合成的分析。图3和图4分别显示IL-2和干扰素-γ产生的结果。图4中，对第7天采取的细胞培养基进行IFN-γ分析。
实施例3PCT的白细胞功能调节实施例3表明，用于PCT的补骨脂素浓度和光剂量能调节根据细胞因子合成和表面标记表达(例如CD69淋巴细胞活化标记表达)确定的白细胞活性。该数据提供了证据表明，能滴定UVA光剂量和可光活化化合物的浓度，来获得对于阻断白细胞群体中的T细胞增殖及保持白细胞活性都有效的适当范围，正如细胞因子合成和表面标记表达所证明的。a.PCT对细胞因子合成的调节以0.5J/cm2UVA的恒定光剂量用不同浓度S-59的PCT后也测定了IL-8的合成(见图5)。发现用随S-59浓度逐渐增加的PCT能调节IL-8合成。在S-59浓度范围内以1.0J/cm2UVA时也获得相似的行为(数据未显示)。这些结果表明，细胞因子的合成能被用于PCT的补骨脂素浓度和光剂量所调节。b.PCT处理后白细胞上CD69表达的调节借助于CD69的荧光抗体和FACS扫描分析，测定被PMA和钙离子载体激活后白细胞对CD69表达的诱导(见图6)。用不同浓度AMT和1J/cm2UVA光化学处理后随时间的变化测定CD69的表达。也发现PCT对CD69表达诱导的影响是依赖补骨脂素剂量的，在AMT浓度越来越高时，CD69的表达显示更大的抑制。在本研究中为S-59的低剂量时，诱导保持不变。
实施例4PCT引起的DNA修饰实施例4表明，PCT对所处理白细胞性质的影响与白细胞DNA修饰和聚合酶活性的抑制相关。
利用3H放射性标记的S-59、AMT和8-MOP加1.9J/cm2UVA以及对经处理的白细胞的分离DNA的闪烁计数，在合并的随机供体PC的光化学处理后测定白细胞基因组DNA上的补骨脂素加合物(图7)。用150μM S-59、AMT和8-MOP的光化学处理分别诱导12.0、6.0和0.7个加合物/1000bp DNA。PCT后被处理白细胞基因组DNA上加合物的相对数量与PCT对白细胞功能的影响相关，并且证明该影响是DNA修饰的直接后果。PCR抑制试验中对DNA聚合酶DNA扩增的抑制(数据未显示)显示对PCT过程中所用补骨脂素浓度的相同依赖性。
由在此用于研究PCT对白细胞体外影响的所有生物学及分子参数得出的结果是一致的。通过有限稀释分析对白细胞功能的估计、细胞因子产生的测定及补骨脂素诱导的DNA损伤的定量显示，PCT以剂量依赖的方式灭活白细胞。使用适当的剂量，能控制白细胞的功能如细胞因子的产生或抗原性标记的表达。另外，在所试的三种补骨脂素中，S-59在灭活白细胞方面是最有效的。S-59抑制T细胞增殖的剂量范围大约为3.5log单位。因此，能抑制白细胞增殖和伴随的GVHD但保留免疫功能的剂量窗口大于其它灭活方法所提供的。
实施例5鼠转输模型中TA-GVHD的预防下列鼠转输模型是很好表征的模拟人TA-GVHD临床综合征的模型(Fast，LD等人，血液82292，1993)。根据预期的体外结果，使用该体内模型，通过将纯合亲本(A株，H-2a)的脾细胞转输到免疫活性杂合F1杂交受体(B6AF1株，H-2a/b)中，来估计S-59光化学处理对TA-GVHD抑制的影响。
经外侧尾静脉将大约108个的供体(A或F1)脾细胞输入每一受体(F1)中。由密度梯度离心获得的脾细胞用作活T细胞的来源。使用三个转输组(1)处理对照组(F1→F1)将B6AF1脾细胞输入B6AF1受体中；(2)阳性TA-GVHD对照组(A→F1)将供体A脾细胞输入B6AF1受体中；(3)S-59光化学处理组(PCT A→F1)用150μM S-59和3焦耳/cm2UVA处理供体A的脾细胞，然后输入B6AF1受体中。
转输后2周内监测受体的TA-GVHD的生物学证据。用双色荧光激活流式细胞仪分析受体脾细胞的供体T细胞移植。该试验中，用pan-T细胞、抗-CD3抗体也用抗H-2b抗体染色脾T细胞。根据与抗H-2b抗体反应的缺乏检测供体A的T细胞。在对照实验中，F1→F1受体的超过99％的CD3阳性脾细胞都用抗H-2b抗体标记。平行地，用51Cr裂解试验测定受体脾脏中细胞毒性淋巴细胞(CTL)的存在。将脾细胞与51Cr标记的EL-4细胞(H-2b)以150∶1的效应物靶比值在37℃下温育4-6小时。根据靶细胞的裂解和51Cr向培养基中的释放来测定CTL的细胞毒性。
结果表明，尽管在本研究期间对照F1→F1组中的受体仍然健康，但A→F1组中的受体在供体脾细胞输入2-3周后发展TA-GVHD的生物学症状。TA-GVHD的特征在于脾大、供体T细胞(H-2a)的移入(28.6±11.3％)和受体脾脏中CTL的存在(35±18.7％51Cr裂解)(表1)。
转输两周后通过测定脾脏∶体重比值来估计脾大。转输三周后通过胸腺细胞结构的评价来检测免疫缺陷的发展。胸腺发育不全是与TA-GVHD相关的获得性免疫缺陷的可靠指标。
也监测受体的GVHD临床症状，包括体重、姿势、活动、皮肤完整性、毛皮质地、白细胞计数、红细胞计数和血小板计数。F1→F1组中健康动物的每周体重随时间增加，而A→F1组中动物的平均体重不随时间增加。
A→F1组中动物的平均临床得分(0-2级，健康动物为0级)随时间增加，表明TA-GVHD表面上是明显的并逐渐地加重。PCT A→F1组中的动物类似于对照F1→F1组中的动物，仍然健康并且没有可见的TA-GVHD临床表现。当转输后超过10周时在A→F1组中观察到25％的死亡率，而对照F1→F1和PCT A→F1组中的所有动物都保持健康。
表1
1.S.D.＝标准差2.转输两周后测定3.转输三周后测定在盲编后制备组织切片并检查其组织学异常。对肝脏评价淋巴浸润液的存在与胆管破坏及血管内皮炎症和浸润。就淋巴小囊的保留或破坏评价脾的组织学。评价皮肤切片的皮下区和附器中的淋巴浸润。评价骨髓切片每一主要谱系脊髓、细胞胞类和巨核细胞的细胞结构和成熟。在盲试中，A→F1小鼠在肝、脾、骨髓和口腔粘膜中发展GVHD的组织学证据。相反，光化学处理的供体细胞(PCT-A)或同源细胞(F1)的受体不显示组织学异常。
用浓度为50nM-150μM的S-59和3J/cm2UVA处理的输入细胞的几组小鼠的转输，在该范围内显示完全的GVHD抑制。这表明GVHD能被PCT体内抑制的剂量窗口类似于体外试验所获得的。
体外和体内数据的结论为，在3.5对数单位的S-59浓度中，对白细胞的PCT处理在体外能抑制其增殖并且在体内抑制TA-GVHD。对于相同的浓度范围，观察到体外白细胞功能(细胞因子合成和表面分子表达)的依赖剂量的调节。
实施例6本实施例描述了一种方法，用来确定适于抑制GVHD而保留DLI的GVL效应的PCT条件，例如用于在对同种异体BMT后复发白血病患者的治疗。实验目的总结如下。
A.在PCT中使用的补骨脂素浓度范围的确定，以防止体外淋巴细胞的增殖，从而抑制GVHD。
B.体外光化学处理的白细胞表型的表征，以确定细胞生存力和预示产生体内GVL效应的T细胞及NK细胞表面抗原的表达。
C.对体外经处理的白细胞的细胞因子表达的定性及定量分析。
D.鼠白血病模型中体内经处理的白细胞-DLI对GVHD抑制的证明。用补骨脂素对白细胞的光化学处理如下所述制备补骨脂素的贮存液。通过在10mL蒸馏水中溶解50mgAMT粉末制备15mM的AMT贮存液。剧烈混合该溶液，并通过0.2μm针筒式滤膜过滤。使用Shimadzu UV160U分光光度计测定溶液在250nm的吸光度，来确定滤过液中AMT的浓度。用25000M-1cm-1的消光系数值计算AMT的浓度。
通过在蒸馏水中溶解S-59粉末制备S-59补骨脂素的贮存液。剧烈混合该溶液，并通过0.2μm针筒式滤膜过滤。使用Shimadzu UV160U分光光度计测定溶液在250nm的吸光度，来测定滤过溶液中S-59的浓度。用25400M-1cm-1的消光系数值计算S-59的浓度。
8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)在水溶液中是溶解度较差。因此，使用以8-MOP饱和的PAS溶液(PAS，可从Baxter获得，是一种人工血液代用品，由pH7.2、300mOsm的乙酸钠、柠檬酸三钠、氯化钠磷酸缓冲液组成)制备用8-MOP和紫外线处理的白细胞制剂。通过在100mLPAS中悬浮100mg 8-MOP制备其饱和溶液。在黑暗容器中于室温下将该溶液搅拌16小时。通过0.2μm滤膜过滤得到的溶液，以除去任何不溶的8-MOP。使用Shimadzu UV160U分光光度计测定248nm的吸光度，来测定8-MOP的终浓度。用22900M-1cm-1的消光系数值计算8-MOP的浓度。
向纯化的供体白细胞群体悬液中加入补骨脂素贮存液至希望的终浓度。按上述制备方法，使用8-MOP饱和的PAS制备用8-MOP处理的单位。在光活化装置中用UVA线照射纯化的供体白细胞至10-3-100J/cm2的终剂量。在照射过程中以70转/分钟搅拌该单位。在照射之前采取白细胞样品用作对照。
以10-4-150μM的浓度向纯化的白细胞制剂中加入S-59。白细胞将具有10-108细胞/mL、优选地107细胞/mL、更优选地2×106细胞/mL的细胞密度。
使与S-59混合的白细胞群体样品暴露于波长为200-450nm、优选地320-400nm的紫外线下。细胞优选地接受约10-3-100J/cm2的光剂量。在一种优选实施方案中，光剂量为3J/cm2。UV线暴露的时限约为1秒到60分钟，优选地约1分钟。
PCT后，如上及实施例中所述，测定白细胞样品增殖及参与白细胞活性的能力。应测定下列参数细胞生存力和完整性；增殖活性；表面抗原表达；细胞因子分泌；GVHD和GVL活性。
下列试验能用于烷化剂处理的或光化学处理的白细胞。A.体外白细胞的剂量反应动力学i)有限稀释试验(LDA)该试验直接测定可克隆的T细胞数量，它在体内直接与GVHD的发病率和严重程度相关(Keman，N.A.等人，血液68770-773，1986)。FDA使用LDA对血液制品的γ照射建立通用规程。该试验按照Pelsynski，M.等人，血液831683-1689，1994的方法进行。简言之，在用不同浓度药物和恒定剂量光线PCT处理后测定人白细胞增殖细胞的数量。用合并的致死性γ-照射的异体刺激细胞来刺激生长。增殖对照包括未处理的白细胞(作为增殖的阳性对照)和接受致死性γ-照射的PCT前的白细胞(阴性对照)。根据分离的增殖集落的数量测定生长。对人白细胞测定所用剂量与被增殖抑制的细胞数之间的相关性。从该实验获得的剂量反应预计类似于对于血小板浓缩物中的白细胞所获得的。
如下进行LDA。通过白细胞电泳从外周血中分离白细胞。刺激活T细胞，使之在含有RPMI培养基的微量滴定板的孔中增殖，培养基中补加有胎牛血清(FBS)、植物凝集素(PHA)、重组白细胞介素-2(rIL-2)和T细胞生长因子(TCGF)。每一孔中也含有从10个个体的PBMC合并物制备并用5000cGyγ射线照射的105个异体刺激细胞。
将每一未处理的对照样品的白细胞以两个独立的系列稀释。在每孔中加入含有一个系列的105、104、103、102、101和100个细胞或第二系列的300、100、33、11和4个细胞的100μL等份。每一稀释度以10个重复样本加入板中。培养含有1.1×107个总白细胞的光化学处理的样品的11mL等份，来检测活T细胞。将该样品的100μL等份不稀释地加入110孔中。
将微量滴定板在CO2培养箱中37℃温育3周。温育0.5、1及2周后，对每孔饲以TCGF、FBS、rIL-2和PHA。在3周温育期的最后，就T细胞克隆的存在对每孔评分。将含有一个或多个T细胞克隆的孔评分为阳性。不含T细胞克隆的孔被评分为阴性。用基于泊松分布的最小卡方分析计算每一样品的T细胞频率。用下列公式计算T细胞减少系数T细胞减少系数＝f对照/f处理，其中f对照和f处理分别为对照和经处理的样品的T细胞频率。
对照等份或者不处理或者只用UVA或只用S-59处理。一个等份以2500cGy临床剂量的γ射线照射。向其余等份中加入S-59至终浓度为10-4μM-150μM。然后以10-3-100焦耳/cm2的UV光剂量照射。ii)混合淋巴细胞反应(MLR)试验该试验也被称为MLC试验，按照Kraemer，K.H.等人，皮肤病学研究杂志77235-239，1981和Kraemer，K.H.等人，皮肤病学研究杂志7680-87，1981的方法进行。至于该试验的基本原理和控制，参见《基础与临床免疫学》，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr和Tristram G.Parslow(编)，Appleton & Lange，Norwalk，CT，1994，246-247页。它间接测定异体刺激诱导的淋巴细胞中DNA合成。当在组织培养中合并两种HLA-不同的个体的淋巴细胞时，细胞膨大、合成DNA并增殖，而HLA-相同的细胞仍然静止。根据3H-胸苷向增殖细胞内核酸的掺入测定诱导的DNA合成。然后收获细胞，洗去未结合的放射性，并在β计数器中计数内化的放射性。
在单路MLR中测定白细胞的效应物及刺激物功能。包括标准、适当的阳性和阴性对照。通过将效应细胞与致死性γ-照射的合并人白细胞(刺激细胞)一起温育来测定效应功能。在致死性γ-照射以阻断胸苷摄取后，通过与正常合并的人白细胞一起温育来测定被处理白细胞(用PCT或其它烷化剂化合物处理)的刺激功能。将获得的随处理剂量而变的结果与双道MLR相比较。
尽管MLR将提供LDA所提供的信息的一部分，但它能够提供关于被处理白细胞刺激其它细胞的能力的信息。MLR中被处理白细胞的刺激能作为一种抗白血病免疫应答诱导的模型，其在BMT转输患者中被DLI激活。该情况中，抗白血病的免疫应答(GVL效应)可被BMT中存在的宿主或供体细胞起动。B.受处理白细胞的表型特征i)表面抗原性标记表达利用合适的荧光标记抗体(Pharmingen)和标准FACS-SCAN分析测定PCT或烷化剂处理对表面抗原性标记表达的影响。如Coligan，J.E.等人，《免疫学通用方案通用方案》，纽约，John Wiley & Sons，Inc.，1991中所述，利用合适的荧光标记抗体(Pharmingen)和标准FACS-SCAN分析，作为处理剂量的函数测定抗原性标记CD2、CD28、CTLA4、CD40配体(gp39)、CD18、CD25、CD69和CD16/CD56的存在，已知这些标记参与与T细胞和NK细胞激活及免疫功能相关的相互作用。假如对蛋白质的PCT及相关处理性质温和，则在处理条件下表面分子的稳定性预计不受影响；然而，其表达的诱导预计是剂量依赖的。
关于被处理的人淋巴细胞在增殖、表面标记表达、细胞因子合成和细胞毒性方面的表征，见实施例14。ii)白血病细胞系裂解为了测定受处理细胞诱导的直接GVL效应，研究对一系列人及小鼠白血病细胞系(可从ATCC获得)的溶细胞能力。按照Jiang，Y.Z.等人，骨髓移植8233-238，1991的条件进行该实验。如Coligan，J.E.等人，《免疫学通用方案通用方案》，纽约，John Wiley & Sons，Inc.，1991所述，在标准条件下用51Cr标记白血病细胞。根据上清液中51Cr放射性的释放测定达到的所有裂解，并与作为背景和总裂解的对照相比较。监测处理剂量对受处理T细胞的溶细胞能力的影响。通过加入渐增数量的经处理的白细胞并观察是否发生裂解来进行该实验。能用T细胞亚群重复该实验。尽管白血病系的直接裂解提供了GVL效应的一种直接机制，但其缺乏可能意味着DLI诱导GVL效应的一种间接机制。因此，另外，通过测定细胞因子产生如IFN-γ、IL-2或GM-CSF的产生能测定细胞毒性。iii)体内细胞生存力为了估计体内经处理的细胞的生存力，在不同剂量的处理后，将雄性小鼠的白细胞输入雌性同源或异源受体中。利用对脾细胞转输后希望的时点采取的血液样品所进行的PCR方法(Goodarzi，M.O.等人，输血35145-149，1995)，监测循环中经处理的细胞的存在。该方法检测只存在于雄性(供体)细胞中的Y-染色体特异性基因序列的存在，具有每50μL宿主血液1-5个细胞的敏感度。该实验将测定对活动物中输入细胞的清除的影响，以及处理剂量与体内细胞循环之间的关系。如Johnson等人，斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)45511-514，1997所述，通过在输注之前对白细胞的PKH-26标记也能检测体内经处理的白细胞的生存力。C.细胞因子合成的定量及定性表征利用可商业获得的Elisa试剂盒(R&D Systems)，在效应细胞与刺激细胞协同培养之后对培养上清液进行定量及定性细胞因子测定。按照Elisa厂商提供的说明书进行试验。将对每一样品的吸光度测定与每一测定试剂盒提供的细胞因子标准产生的标准曲线相比较，估计结果。作为化合物浓度的函数和—在PCT的情况下—光剂量及处理与测定之间的时间间隔的函数对处理的白细胞进行细胞因子测定。由于在T细胞激活和GVHD/GVL中的明确作用而测定IL-1、 IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ细胞因子。
对待处理的白细胞细胞因子合成的确定在测定细胞通过细胞因子产生作为免疫应答诱导物起作用的能力中是重要的；它也可用作对生化功能和蛋白质合成的测定。
关于被处理的人淋巴细胞在增殖、表面标记表达、细胞因子合成和细胞毒性方面的表征，见实施例14。D.体内鼠模型对于证明GVHD抑制和GVL效应诱导的应用对于研究移植物抗宿主疾病和移植物抗白血病效应，小鼠是非常完善的模型。为了分别估计经处理的白细胞对GVHD和GVL的影响，使用在Johnson，B.D.等人，骨髓移植11329-336，1993和Johnson，B.D.等人，血液853302-3312，1995中所述的移植鼠模型。该模型中，亚致死地照射(9Gy)雌性AKR/J小鼠(H-2k)，然后给予MHC-匹配雌性B10.BR供体(H-2k)的107个BM细胞加3×107个脾细胞。这种处理显示引起急性GVHD临床症状并在50天内死亡。输入的脾细胞的消除导致混合嵌合体的完全存活，而未BMT导致50％的死亡率。本实施例中，在转输之前对鼠脾细胞进行处理，以根据死亡率测定检测处理对GVHD的抑制，并且也提供抑制GVHD发病的最低剂量。脾细胞是小鼠血液白细胞的公认替代品，因为小鼠的血液容积对于这些实验而言太小。
为了评估处理细胞的GVL反应性，BMT 21天后，向受体输入例如PA异体脾细胞，然后在7天后用AKR白血病细胞攻击。据所知，BMT恢复后(28天)5×104AKR白血病细胞向小鼠的输入引起白血病和白血病攻击25天后95％的死亡率(Johnson，B.D.等人，移植54104-112，1992)。相反，BMT 21天后异体脾细胞的输入显示，在7天后用AKR细胞攻击后可诱导GVL效应。该作用过程导致70天后70％的存活率。如果证明有GVHD的预防，则转输前脾细胞的处理使得在无GVHD时能检测到GVL的诱导。其测定是根据输入经处理的脾细胞的BMT受体的存活率，该受体用AKR细胞攻击。
作为处理剂量的函数检测使用待处理的白细胞的DLI对白血病攻击存活率的影响，并与进行未处理脾细胞输注的对照组相比较。利用如Johnson，B.D.等人，骨髓移植11329-336，1993所述的PCR测定法，检测存活小鼠的嵌合状态和白血病荷载。
该实验模型中，通过死亡前对血液的白细胞计数或PCR分析能诊断白血病的死因，因为白血病可引起AKR白血病细胞的扩展。对AKR白血病细胞特异性标记特异的引物可用于PCR分析。根据低白细胞计数和脾萎缩以及通过特有的临床症状(毛皮和姿势的改变、粘性粪便等)诊断GVHD引起的死亡。通过注射更少或更大量的AKR白血病细胞检测PA-DLI对最小残余疾病或更高肿瘤荷载的效能。
根据本发明例如通过PCT法对白细胞的处理，如果在不引起GVHD的条件下，在施以白血病攻击后能诱导用处理细胞DLI处理的小鼠存活率统计学显著的提高，则认为这对诱导GVL效应是有效的。存活动物的遗传型应该也是完全嵌合的，因为在人类中这与无病长期存活的更高发病率有关。在最初BMT后100天内，存活率的提高易于证明。
将在上述对于供体白细胞的条件下处理脾细胞。
关于鼠模型系统中在无GVHD时引起的经处理的白细胞GVL效应的情况，见实施例15。
实施例7-12
下列具体实施例是为了说明在本发明方法中有用的代表性烷化剂化合物的制备方法，提供关于对专业人员有用的化合物的有关资料，并且说明测定化合物有效性的方法。除非另外提出，在CDCl3中Varian 200MHz仪器上记录所有NMR谱；报告相对于四甲硅烷(TMS)的化学位移。用Perkin Elmer FTIR记录IR谱。用5mM含水H3PO4作为A流动相A，用5mM CH3CN作为流动相B，用YMC C8柱以梯度模式进行HPLC。在DMSO或乙醇中制备样品，并在注射前保持于≤15℃。
表2显示用于不同化合物的化合物号的名称。
表2
实施例7N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐(化合物IV)的合成步骤A.N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[双(2-羟乙基)氨基]乙酯在N2下于-15℃，向干THF中的N-(叔丁氧羰基)-β-丙氨酸(20.3g，107mmol)和4-甲基吗啉(13.0mL，12.0g，119mmol)的搅拌溶液(200mL)中加入氯甲酸异丁基酯(13.9mL，14.6g，107mmol)，导致白色沉淀(4-甲基吗啉·HCl)的立即形成。在-15℃下搅拌反应混合物5分钟，随后将反应混合物转移到烧瓶中，该烧瓶中含有-15℃下干THF中的三乙醇胺(48.3g，324mmol)的搅拌溶液(150mL)。将反应混合物加温到23℃，并搅拌另外1.5小时，随后通过真空抽滤去除沉淀。然后在真空中从滤液中去除THF，在水(500mL)与EtOAc(5×150mL)之间分配剩余的粘性黄色油。在Na2SO4上干燥合并的有机层。真空中溶剂的去除产生25.8g(75％)的希望产物N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[双(2-羟乙基)氨基]乙酯，为一种暗黄色的油。1H NMRδ5.32(brs，1H)，4.18(t，J＝5.4Hz，2H)，3.58(t，J＝5.1Hz，4H)，3.37-3.23(m，2H)，2.80(t，J＝5.4Hz，2H)，2.69(t，J＝5.1Hz，4H)，2.51(t，J＝6.0Hz，2H)，1.41(s，9H)未发现羟基质子。13CNMRδ173.0，156.4，79.8，63.3，60.2，57.3，54.1，36.7，35.3，28.8.步骤B.N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[双(2-叔-丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯在N2下将由步骤A获得的N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[双(2-羟乙基)氨基]乙酯(22.7g，70.9mmol)与咪唑(11.1g，163mmol)的乙腈搅拌溶液(70mL)冷却至0℃。然后加入叔丁基二甲基氯硅烷(534mg，3.54mmol)，并在0℃下将反应混合物搅拌另外5分钟。将反应混合物加温到23℃，搅拌2小时，随后通过真空抽滤除去产生的白色沉淀(咪唑·HCl)。在真空中从滤液中除去乙腈，在饱和盐水(600mL)与EtOAc(3×200mL)之间分配剩余的物质。在Na2SO4上干燥合并的有机层。真空中溶剂的去除产生35.2g(90％)的希望产物N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[双(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯，为一种黄色的油。1HNMRδ5.29(brs，1H)，4.14(t，J＝6.0Hz，2H)，3.65(t，J＝6.3Hz，4H)，3.37(表观q，2H)，2.85(t，J＝6.0Hz，2H)，2.71(t，J＝6.3Hz，4H)，2.49(t，J＝5.9Hz，2 H)，1.42(s，9H)，0.88(s，18H)，0.03(s，12H)；13C NMRδ172.7，156.3，79.7，63.3，62.4，57.7，54.3，36.7，35.3，28.9，26.4，18.7，-4.9.步骤C.β-丙氨酸2-[双(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯向含有从步骤B获得的N-(叔丁氧羰基)β-丙氨酸2-[双(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯(3.01g，5.48mmol)的烧瓶中，加入纯三氟乙酸(5mL)，导致CO2气体的放出。搅拌反应混合物5分钟，在真空中去除三氟乙酸。在饱和NaHCO3(100mL)与EtOAc(3×30mL)之间分配剩余的物质。在Na2SO4上干燥合并的有机层。真空中溶剂的去除产生2.45g(100％)的希望产物β-丙氨酸2-[双(2-叔-丁二甲基甲硅烷氧乙基)氨基]乙酯，为一种暗黄色的油。1H NMRδ4.12(t，J＝6.0Hz，2H)，3.63(t，J＝6.4Hz，4H)，2.96(t，J＝6.2Hz，2H)，2.84(t，J＝6.0Hz，2H)，2.69(t，J＝6.4Hz，4H)，2.44(t，J＝6.2Hz，2H)，0.86(s，18H)，0.03(s，12H)未发现胺质子。13C NMR(CDCl3)δ173.0，63.4，62.6，57.9，54.4，38.4，38.1，26.4，18.7，-4.9.步骤D.N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-羟乙基)氨基]乙酯通过室温下在10mL CHCl3中搅拌12.5小时，使β-丙氨酸2-[双(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)氨基]乙酯(736mg，1.64mmol)与9-甲氧基吖啶-2-羧酸甲酯(669mg，2.50mmol)反应。然后过滤掉沉淀(吖啶酮)，在饱和水性NaHCO3(100mL)与CHCl3(3×35mL)之间分配滤过液。在Na2SO4上干燥合并的有机层，并在真空中浓缩，产生1.61g粘性褐色的油。通过在N2下将粗中间物溶解于3.0mL THF中，并在冷却至0℃后立即用HF/吡啶(1.0mL)处理，来进行对产生的二醇的脱保护。搅拌1小时使溶液升温至室温。在真空中去除挥发物，在饱和水性NaHCO3(100mL)与CHCl3(3×35mL)之间分配残余物。干燥合并的有机层，浓缩产生649mg黄褐色的固体。制备型TLC(C-18，CH3CN)得到20％产率的希望的二醇，N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-羟乙基)氨基]乙酯(根据HPLC，纯度＞80％)；1H NMRδ8.82(s，1H)，8.21-7.94(m，2H)，7.94-7.72(m，2H)，7.59(表观t，1H)，7.23(表观t，1H)，4.30-4.18(m，2H)，4.18-4.05(m，2H)，3.89(s，3H)，3.69-3.50(m，4H)，2.92-2.73(m，4H)，2.73-2.55(m，4H)步骤E.N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-羟乙基)氨基]乙酯向二氯化合物的转化，是通过类似于Peck等人(美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)1959，813984)的方法实现的。将溶于纯SOCl2(6mL)中从步骤D获得的产物(41mg，0.090mmol)的黄色溶液在室温下搅拌20小时。然后在真空中除去SOCl2得到一种黄色固体(二盐酸盐)。然后在饱和NaHCO3(50mL)与CH2Cl2(3×20mL)之间分配该物质。在Na2SO4上干燥合并的有机层。在真空中溶剂的去除产生35.4mg游离碱的二氯化合物，为一种橙色的胶。1H NMRδ8.82(s，1H)，8.20-7.83(m，4H)，7.5(表观t，1H)，7.25(表观t，1H)，4.36-4.15(m，4H)，3.93(s，3H)，3.48(t，J＝6.9Hz，4H)，3.06-2.77(m，4H)，2.86(t，J＝6.9Hz，4H)未发现胺质子。13CNMRδ172.3，166.6，155.2，146.5，144.6，133.1，131.6，128.7，124.6，124.3，116.1，114.3，63.7，57.2，53.5，52.9，46.3，42.5，35.2.
未发现其它的碳。通过加入1M醚中的HCl从CH2Cl2中沉淀HCl盐，得到N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐(化合物IV)，为一种黄色的固体(根据HPLC纯度为81％)。
以相似的方法制备N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐(化合物V)。在步骤D中用9-甲氧基吖啶代替9-甲氧基吖啶-2-羧酸甲酯，获得为一种黄色油的中间体二醇(7.1％)(根据HPLC纯度为74％)。1H NMRδ8.14(d，J＝7.5Hz，2H)，7.93(d，J＝8.6Hz，2H)，7.52(表观t，2H)，7.23(表观t，2H)，4.36-4.08(m，4H)，3.76-3.5(m，4H)，3.08-2.60(m，8H)未发现胺及羟基质子。
将中间体二醇(37.3mg，0.0793mmol)的亚硫酰氯溶液(4.0mL)在23℃下搅拌7.5小时。在真空中去除亚硫酰氯，得到一种黄色的油。将该物质溶解于乙醇(～4mL)中，并在真空中除去溶剂。然后将该物质溶解于CH2Cl2(4mL)中并在真空中除去溶剂；该步骤重复两次。然后用己烷(3×4mL)研磨该物质，得到40.0mg为黄色吸水性玻璃状固体形式的产物(根据HPLC纯度为42％)。通过在饱和NaHCO3与CH2Cl2之间分配，随后在Na2SO4上干燥合并的有机层，并在真空中除去溶剂，将有些物质转化为游离胺用于分析目的。1H NMRδ8.21-8.00(m，4H)，7.66(表观t，2H)，7.38(表观t，2H)，4.26-4.12(m，2H)，4.12-3.98(m，2H)，3.43(t，J＝6.9Hz，4H)，2.96-2.68(m，8H)未发现胺质子。
按上述方法，但用N-(叔丁氧羰基)-4-氨基丁酸代替N-(叔丁氧羰基)-β-丙氨酸，制备N-[(2-甲酯基吖啶-9-基)] 4-氨基丁酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐(化合物VI)(根据HPLC纯度为78％)。1H NMRδ8.89(s，1)，8.12(表观t，2)，7.93-7.80(m，2)，7.59(表观q，1)，7.36-7.20(m，1)，4.16(t，2，J＝5.7Hz)，4.07-3.92(m，2)，3.97(s，3)，3.46(t，4，J＝6.9Hz)，2.93-2.80(m，6)，2.60(t，2，J＝6.5Hz)，2.29-2.12(m，2)未发现胺质子。
实施例8用3-[N，N-双(2-叔丁基二甲基甲硅烷基氧乙基)]氨基丙醇代替实施例7步骤A中的三乙醇胺，然后从步骤C继续，制备N-(2-甲酯基吖啶-9-基)β-丙氨酸3-[双(2-氯乙基)氨基]丙酯二盐酸盐(化合物VIII)(根据HPLC纯度为63％)。1H NMRδ8.91(s，1)，8.20-7.93(m，4)，7.18(表现t，1)，7.39(表观t，1)，4.30(m，4)，3.96(s，3)，3.48(t，4，J＝6.9Hz)，2.88-2.60(m，2)，2.83(t，4，J＝6.9Hz)，2.62(t，2，J＝6.7Hz)，1.85-1.68(m，2)未发现胺质子。
实施例9在实施例7中合成的化合物也能用下列方法制备N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐(化合物V)的合成方法II步骤A.N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸甲酯二盐酸盐合并9-氯吖啶(11.7g，《有机合成》(Organic Synthesis)，Coll.第三卷，第57页)、β-丙氨酸甲酯盐酸盐(9.9g)和甲醇钠(3.26g)，加入60mL甲醇。用磁力搅拌器搅拌该混合物，并回流5.5小时。消除热度，并在尚温时(≤35℃)过滤悬液。用大约10mL另外的甲醇漂洗固体盐，浓缩合并的深绿色滤液，产生21g潮湿的黄绿色固体。
将该固体溶解于350mL煮沸的2-丙醇中，使之在室温下结晶。用大约15mL 2-丙醇和15mL己烷漂洗产生的结晶，然后风干，产生15.5g亮黄色产物N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸甲酯盐酸盐(产量为78.5％)。
1H NMRδ1.9(brs，2H)；3.24(t，J＝7.0Hz，2H)；3.76(s，3H)；4.45(brs，2H)；7.23(app.t，J＝8Hz，2H)；7.49(app.t，J＝8Hz，2H)；8.11(d，J＝8.4Hz，2H)；8.30(d，J＝8.4Hz，2H)；9.68(brs，0.5H).IR1574(s)，1691(s)，1726(s)，2336(m)，2361(m)，3227(m).步骤B.N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-羟乙基)氨基]乙酯二盐酸盐在甲苯(750mL)、饱和水性Na2CO3(200mL)与H2O(50mL)之间分配由步骤A获得的N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸甲酯盐酸盐。用甲苯(3×250mL)再次萃取水层，合并有机层并用饱和水性Na2CO3(50mL)洗涤。通过旋转蒸发使甲苯的体积降至大约100mL。然后加入三乙醇胺(30mL)形成一种部分不能混合的系统。然后加入NaOMe(50mg)的MeOH溶液(2mL)。通过室温搅拌及旋转蒸发从反应混合液中快速除去溶剂。除去溶剂后，将反应混合液真空下另外放置1-1.5小时，产生糖浆状溶液。
在CH2Cl2(200mL)与盐水(200mL)之间分配粗混合物，除去过量的三乙醇胺。用CH2Cl2(5×100mL)抽提盐水层。合并有机层，用盐水(50mL)洗涤，然后用0.5M HCl(2×100mL)抽提。合并酸性水层并用CH2Cl2(50mL)洗涤。在CH2Cl2(200mL)存在下用粉末K2CO3使酸溶液变为碱性。分离有机层，用CH2Cl2(5×100mL)再次抽提水层。用盐水(50mL)洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥，并解吸得到不含二醇的粗胺(5.02g)，一种黄色粘胶。根据NMR，该物质与实施例1中用备择方法制备的物质相同。
将上述粗制品的一部分(0.400g)与异丙醇(100mL)剧烈搅拌，并用1MHCl乙醚溶液酸化。冷却浆液，弃去首批沉淀。除去一半溶剂后，第二组结晶产生N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-羟乙基)氨基]乙酯二盐酸盐，为一种明黄色的晶态固体(0.200g)，根据HPLC纯度＞95％。
1H NMRδ8.11(表观t，4H)，7.69(表观t，2H)，7.41(表观t，2H)，4.23(t，J＝5.4Hz，2H)，4.03(t，J＝5.9Hz，2H)，3.58(t，J＝5.2Hz，4H)，2.73(t，J＝5.4Hz，2H)，2.70(t，J＝5.9Hz，2H)2.68(t，J＝5.2Hz，4H).未发现胺及羟基质子。
13C NMRδ173.3，151.7，149.4，130.5，129.5，124.0，123.4，118.4，63.5，60.1，57.3，54.0，46.6，35.8.步骤C.N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐向步骤B获得的N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-羟乙基)氨基]乙酯二盐酸盐(113mg，0.24mmol)的CH3CN溶液(0.5ml)中(搅拌悬液)加入SOCl2(0.5mL)。在23℃下搅拌得到的黄色溶液16小时，随后在真空中去除挥发物。剩余的橙色油溶解于EtOH(～2mL)中，在真空中除去EtOH，得到一种黄色固体。然后用己烷(2×3mL)研磨该物质。在真空中去除残余溶剂，得到123mg希望的物质N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐(根据HPLC，纯度为93％)，为一种黄色固体。1H NMRδ8.09(表观t，J＝8.8Hz，4H)，7.66(表观t，J＝7.6Hz，2H)，7.38(表观t，J＝7.7Hz，2H)，4.14(t，J＝5.9Hz，2H)，4.00(t，J＝5.8Hz，2H)，3.43(t，J＝6.9Hz，4H)，2.87(t，J＝6.9Hz，4H)，2.77(t，J＝5.9Hz，2H)，2.69(t，J＝5.8Hz，2H).未发现胺质子。13C NMRδ173.0，151.5，149.4，130.5，129.6，124.1，123.4，118.6，63.5，57.3，53.5，46.7，42.5，35.7.IR(HCl盐的KBr沉淀)3423，3236，2939，2879，1736，1634，1586，1572，1540，1473，1272，1173cm-1.
实施例10N-(4-甲氧基-吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐，化合物IX。
N-(4-甲氧基-吖啶-9-基)β-丙氨酸甲酯的制备方法是将1.4g(5.84mmol)4，9-二甲氧基吖啶、0.89g(6.42mmol)β-丙氨酸甲酯盐酸盐和20mL甲醇混合，然后加热，在N2下回流12小时。然后在真空中浓缩该反应物，溶解于CHCl3-异丙醇中(50mL，4∶1v/v)，并用50％NH4OH(2×25mL)和盐水(1×25mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机层，在真空中浓缩产生1.24g(68％)甲酯(根据HPLC，纯度＞74％)，为黄色的油；Rf(SiO2，乙酸乙酯)＝0.25；IR(薄膜)3363，2947，1730，1611，1573，1518，1484，1463，1423，1420，1246，1170，1081cm-1；1H NMRδ2.70(t，2H，J＝5.7Hz)，3.74(s，3H)，4.00(t，2H，J＝6.3Hz)，4.11(s，3H)，6.98(d，1H，J＝7.4Hz)，7.36(m，2H)，7.65(m，2H)，8.12(d，2H，J＝8.5Hz)；13C NMR)δ35.7，46.9，52.3，56.5，107.2，115.3，119.8，123.5，124.1，130.0，151.4，173.6.
在实施例3步骤B所述条件下将其转化为二醇，产生647g黄色油。对粗混合物的HPLC分析显示85％的产率(λ＝278nm)；Rf(SiO2，20％甲醇-乙酸乙酯)＝0.17；IR(薄膜)3337，2947，2828，1726，1616，1569，1522，1484，1463，1420，1348，1250，1174，1127，1081，1043cm-1；1H NMRδ2.7(m，8H)，3.55(m，4H)，3.97-4.08(m，2H)，4.08(s，3H)，4.19(t，2H，J＝5.5 Hz)，6.96(d，1H，J＝7.4Hz)，7.29(m，2H)，7.61(m，2H)，8.10(m，2H)；13C NMRδ36.0，46.9，53.7，56.4，57.1，60.1，63.3，107.4，115.7，119.1，119.6，123.2，123.5，123.9，128.5，130.0，140.8，147.4，151.6，151.7，154.3，173.3.
如实施例3步骤C所述，将其转化为N-(4-甲氧基-吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐与亚硫酰氯。使用乙酸乙酯随后用10％甲醇-乙酸乙酯对粗产物急速过滤(SiO2)，在有些产物的明显柱上降解后得到58mg黄色油；Rf(SiOux，乙酸乙酯)＝0.26；IR(薄膜)3405，2955，2828，1726，1616，1577，1518，1463，1416，1348，1246，1174，1123，1081，1013cm-1；1H NMRδ2.69-2.99(m，8H)，3.45(t，4H，J＝6.7 Hz)，4.03(m，2H)，4.09(s，3H)，4.16(t，2H，J＝5.9Hz)，6.97(d，1H，J＝7.7Hz)，7.32(m，2H)，7.65(m，2H)，8.12(d，2H，J＝8.7Hz).
通过在真空中浓缩反应液与共沸去除过量亚硫酰氯(2×5mL甲苯)，能以粗品形式分离二盐酸盐。HPLC分析表明原材料完全消耗而4-甲氧基吖啶(RT＝22.3分钟)是主要的杂质。1H NMR(CD3OD)δ3.18(t，2H，J＝6.4Hz)，3.71(m，6H)，4.04(m，4H)，4.18(s，3H)，4.51(m，2H)，7.17(m，2H)，7.56(m，2H)，7.91-8.15(m，2H)，8.55(d，1H，J＝8.8Hz).
同样地从3-氯-9-甲氧基-4-甲基吖啶制备N-(3-氯-4-甲基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐，化合物X。游离碱的1HNMRδ7.96-8.17(m，3H)，7.29-7.52(m，3H)，4.19(t，J＝5.8Hz，2H)，4.00(s，3H)，3.89(t，J＝5.1Hz，2H)，3.47(t，J＝6.8Hz，4H)，2.91(t，J＝6.8Hz，4H)，2.83(t，J＝5.8Hz，2H)，2.67(t，J＝5.5Hz，2H).
同样地从6-氯-2，9-二甲氧基吖啶制备N-(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯二盐酸盐，化合物XIII。游离碱的1HNMRδ7.96-8.17(m，3H)，7.29-7.52(m，3H)，4.19(t，J＝5.8Hz，2H)，4.00(s，3H)，3.89(t，J＝5.1Hz，2H)，3.47(t，J＝6.8Hz，4H)，2.91(t，J＝6.8Hz，4H)，2.83(t，J＝5.8Hz，2H)，2.67(t，J＝5.5Hz，2H).
实施例11[N，N-双(2-氯乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯二盐酸盐，化合物XI。步骤A.β-丙氨酸[N，N-双(2-三异丙基甲硅烷基氧基)乙基]乙酯将β-丙氨酸乙酯盐酸盐(1.99g，12.9mmol)、K2CO3(6.0g，43.4mmol)和碘乙基三异丙甲硅烷基酯(9.47g，28.9mmol)的乙腈溶液(175mL)的浆液回流5-7天。溶剂真空蒸发后，用CH2Cl2研磨固体。用稀释的Na2CO3(含水)然后用盐水洗涤有机层，在无水Na2SO4上干燥。通过硅胶层析(1∶4 EtOAc/己烷)纯化粗产物，得到5.60g油状[N，N-双(2-三异丙基甲硅烷氧基)乙基]β-丙氨酸乙酯(83.1％)。1H NMRδ4.12(q，J＝7.1Hz，2H)，3.73(t，J＝6.8Hz，4H)，2.92(t，J＝7.3Hz，2H)，2.70(t，J＝6.6Hz，4H)，2.46(t，J＝7.4Hz，2H)，1.4-0.9(m，45H，包括1.25(3H)时的三联体和1.06及1.05时的单体)步骤B.[N，N-双(2-三异丙基甲硅烷基氧基)乙基]-β-丙氨酸在乙醇中搅拌由上述步骤A获得的β-丙氨酸[N，N-双(2-三异丙基甲硅烷氧基)-乙基]乙酯(5.60g，10.8mmol)和氢氧化锂(0.59g，14.1mmol)，并回流3小时。除去溶剂，在CH2Cl2与稀释的NaHCO3(含水)之间分配粗产物。用盐水洗涤有机层，在无水Na2SO4上干燥，解吸后得到[N，N-双(2-三异丙基甲硅烷基氧基)乙基]-β-丙氨酸，为一种淡黄色的油(5.03g，95.1％产量)。1H NMRδ3.90(t，J＝5.5Hz，4H)，3.04(t，J＝6.2Hz，2H)，2.92(t，J＝5.5Hz，4H)，2.50(t，J＝6.1Hz，2H)，1.06(s，42H).步骤C.[N，N-双(2-羟乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯于N2下在CH2Cl2(1mL)中搅拌由以上步骤B获得的[N，N-双(2-三异丙基甲硅烷氧基)乙基]-β-丙氨酸(51.0mg，0.104mmol)。在冰浴上冷却时，逐滴加入SOCl2(0.5mL)，并搅拌反应液2.25小时。解吸反应混合液除去过量SOCl2后，加入干燥的CH2Cl2(0.5mL)，并于N2下在冰浴中冷却该溶液。加入预冷的9-(3-羟基)丙胺基-6-氯-2-甲氧基-吖啶(29.0mg，91.5mmol)CH2Cl2浆液(1mL)。0.5小时后，在CH2Cl2与含水NaHCO3之间分配该混合物。用盐水洗涤有机层，以无水Na2SO4上干燥并解吸。用己烷研磨获得的胶，解吸己烷提取物，获得一种极粗的三异丙基甲硅烷基保护的原材料与产物的混合物(53.5mg)。
为了去除三异丙甲硅烷基，在冰冷的THF(1mL)中搅拌一部分保护的粗二醇(33.1mg)。加入HF/吡啶(0.5ml)后，在充满N2的气囊中在环境温度下搅拌混合物2.5小时。在CH2Cl2与NaHCO3(含水)之间分配反应混合物，用稀释的NaHCO3(含水)洗涤有机层数次，除去过量的HF/吡啶。用盐水初步干燥后用无水Na2SO4干燥，除去溶剂得到粗二醇(13.1mg)。
将其与另外的粗二醇(5.0mg)合并，通过以95CH2Cl2/5iPA/1 TFA作为洗脱液的C-18制备型TLC纯化，获得二醇TFA盐。将盐在CH2Cl2与NaHCO3(含水)之间分配后，用盐水干燥有机层，然后用无水Na2SO4干燥，并解吸获得二醇的游离碱，[N，N-双(2-羟乙基)]β-丙氨酸、3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯(5.0mg)。1H NMRδ7.92-8.25(m，3H)，7.23-7.47(m，3H)，430(t，J＝5.7Hz，2H))，3.98(s，3H)，3.81(t，J＝6.2Hz，2H)，3.64(t，J＝4.9Hz，4H)，2.86(t，J＝6.1Hz，2H)，2.67(t，J＝4.9Hz，4H)，2.51(t，J＝5.9Hz，2H)，2.04(明显的五联体，2H)步骤D.[N，N-双(2-氯乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯二盐酸盐，化合物质XI将以上获得的[N，N-双(2-羟乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯(4.0mg，0.0073mmol)溶解于CH2Cl2(1mL)中，在冰/水浴中冷却。加入冰冷的SOCl2(0.1mL)，将反应液在室温下搅拌4小时。解吸反应混合液除去溶剂，用己烷研磨，并在CH2Cl2与NaHCO3(含水)之间分配。用盐水干燥有机层，然后用无水Na2SO4干燥并解吸，获得为一种黄色胶的二氯化合物。1H NMRδ7.8-8.2(m，3H)，7.2-7.5(m，3H)，4.35(t，J＝5.9Hz，2H)，3.85-4.10(3.99，s，OMe和3.9-4.0，m，NHCH2，总5H)，3.48(t，J＝6.9Hz，4H)，2.9-3.0(m，6H)，2.49(t，J＝6.6Hz，2H)，2.1-2.3(m，2H).
在预冷的CH2Cl2中搅拌游离胺，用1M HCl乙醚溶液酸化，并用少数几滴甲醇解吸，获得希望的化合物，[N，N-双(2-氯乙基)]β-丙氨酸3-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]丙酯二盐酸盐(2.5mg)，(3.5mg，81％)，为一种黄色固体。
以与前述步骤C相同的方法，但使用6-氯-9-(2-羟基)乙胺基-2-甲氧基-吖啶代替6-氯-9-(3-羟基)丙胺基-2-甲氧基-吖啶，制备类似的二醇。1H NMRδ7.96-8.13(m，3H)，7.20-7.47(m，3H)，4.76(t，J＝4.9Hz，2H)，3.99(s，3H)，3.92-4.14(m，2H)，3.60(t，J＝5.1Hz，4H)，2.78(t，J＝6.1Hz，2H)，2.63(t，J＝5.1Hz，4H)，2.45(t，J＝6.0Hz，2H).
通过类似于步骤D的步骤，其转化为[N，N-双(2-氯乙基)]β-丙氨酸2-[(6-氯-2-甲氧基吖啶-9-基)氨基]乙酯二盐酸盐，化合物XII。1H NMRδ7.94-8.20(m)，7.20-7.50(m)，4.42(CH2OC＝O)，3.90-4.10(OCH3，NHCH2)，3.46(CH2Cl)，2.82(N(CH2)3)，2.39-2.56(CH2C＝O).
实施例124，5’，8-三甲基-4’-补骨脂素乙酸酯盐酸盐，化合物XIV步骤A.4，5’，8-三甲基-4’-补骨脂素乙酸[N，N-双(2-羟乙基)]-2-氨乙基酯在100℃下搅拌4，5’，8-三甲基-4’-补骨脂素乙酸甲酯(250mg，0.832mmol)、三乙醇胺(12mL)和1M乙醚中的HCl(2mL)2小时。使得到的澄清褐色溶液冷却至室温，并在CH2Cl2与饱和NaHCO3(含水)之间分配。用饱和NaHCO3(含水)漂洗有机层数次。用无水Na2SO4干燥后，在真空中去除溶剂，在CH2Cl2与1M含水HCl之间分配残余物。用CH2Cl2漂洗水层数次，然后在有机溶剂存在下用K2CO3使之变为碱性。用水漂洗含有中性产物的有机层数次，然后干燥并浓缩。酸碱抽提过程的重复可产生一种米黄色固体的希望产物(84.3mg，24.3％)1HNMRδ7.53(s，1H)，6.24(s，1H)，4.23(t，J＝5.4Hz，2H)，3.69(s，2H)，3.56(t，J＝5.3Hz，4H)，2.82(t，J＝5.4Hz，2H)，2.69(t，J＝5.3Hz，4H)，2.57(s，3H)，2.51(d，J＝1.1Hz，3H)，2.47(s，3H).步骤B.4，5’，8-三甲基-4’-补骨脂素乙酸[N，N-双(2-氯乙基)]-2-氨乙基酯盐酸盐向冰冷的上述二醇(9.8mg，0.023mmol)CH2Cl2混合液(1mL)中加入亚硫酰氯(0.2mL)，并在氮下于室温搅拌过液。浓缩得到的浆液，然后用己烷研磨，得到为一种灰白色固体的希望产物(6.2mg，53.9％)1H NMR(CD3OD)δ7.71(s，1H)，6.28(s，1H)，4.56(t，J＝4.8Hz，2H)，3.95(t，J＝6.1Hz，4H)，3.89(s，2H)，3.60-3.83(m，6H)，2.54(s，3H)，2.53(s，3H)，2.50(s，3H).
实施例13典型BMT小量或微移植方案在用异体外周血干细胞移植之前给显示CLL的患者施行一种非分离的预备方案。移植之后用DLI支持，这是达到最大移植物抗恶性肿瘤反应所必需的。轻度毒性的预备方案是基于氟达拉滨(FAMP)的，并根据恶性肿瘤类型加以改进。对于晚期的和以前处理的CLL，对患者施用300mg/m2/dx3的FAMP和30mg/m2/dx3的环磷酰胺。用由30mg/m2/dx3的FAMP、25mg/m2/d/CIx4的顺铂和0.5gm mg/m2/dx2的Ara-c组成的方案处理Richter和大细胞淋巴瘤(LCL)。除了对LCL处理外，不进行GVHD预防。该方案是为了产生嵌合状态，并使植入成为可能，而降低常规诱导治疗的毒性。能在移植1个月后施以DLI来加强移植。成功的移植为以后施用的DLI作了准备，对于增强移植物抗白血病反应和加速免疫恢复是必要的。
实施例14应用人外周血淋巴细胞的体外研究为了表征特定类型的被处理细胞群体，检查了经受PCT并在体外培养的人外周血淋巴细胞(PBL)的几个特征。这些包括生存力、T细胞增殖、细胞因子合成及分泌、表面抗原表达、体外细胞毒性和Fas配体表达。生存力用台盼蓝排除法测定在3J/cm2UVA下接受10nM S-59的PBL的生存力。2天后存活率为75％，3天后为50％，4天后为25％。在有关实验中，观察到被处理淋巴细胞的依赖剂量的存活率。增殖根据3H-胸苷向异体刺激的T细胞DNA中的掺入来测定淋巴细胞的增殖。从三名供体中分离外周血单核细胞(PBMC)，合并，γ-照射(2500cGy)，以防止自身刺激，并在MLR中用作刺激细胞。从第4名供体中分离的PBMC作为效应细胞。效应细胞在3J/cm2UVA下用0.05、0.5或5nM 4’-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(“S-59”)处理，并与刺激细胞协同培养。对照、未处理的效应细胞也与刺激细胞协同培养。培养6天后，向培养液中加入3H-胸苷，一天后收获细胞，通过闪烁计数分析细胞样品测定3H-胸苷的摄入。图8显示，根据MLR中的3H-胸苷摄入所测定的被处理白细胞的增殖，在0.1nM-10nMS-59之间以剂量依赖的方式被消除，10nM S-59时增殖被完全抑制。
也可用一种备择方法分析被处理白细胞的增殖能力，该方法中用表面结合的抗-CD3抗体激活被处理细胞。在该试验中，PBMC或未被处理、或在3J/cm2UVA剂量下用0.0001、0.001或0.01μM S-59处理、或在无S-59时照射。然后在附着抗-CD3抗体的培养板中在5％CO2、37℃下温育细胞，来诱导T细胞的多克隆激活，并在培养1、2及3天后测定3H-胸苷的掺入。结果(图9)显示在所有处理条件下增殖能力依赖剂量的降低，和10nM S-59时增殖的完全抑制。细胞因子产生如前对于增殖分析的部分中所述，在MLR中培养人淋巴细胞。在3.0J/cm2UVA下用不同浓度的S-59(0.05、0.5或5nM)处理效应细胞。培养2、4、6及7天后采取MLR细胞培养基样品。用夹心酶联免疫吸附试验测定这些样品的IL-2和IFN-γ水平，并用分光光度法定量结果。标准溶液用于建立将浓度(pg/ml)与吸光度相关联的标准曲线，由它来确定试验样品中的细胞因子浓度。
图10A显示对IL-2产生的分析。未处理的淋巴细胞及用较低浓度S-59(即，0.005和0.5nM)处理的淋巴细胞的IL-2分泌在培养2天时达到最高，然后由于IL-2被群体中增殖淋巴细胞消耗而下降。相反，在用5nM S-59处理的淋巴细胞中，IL-2不被非增殖的淋巴细胞消耗，而在第4、6及7天时仍以相当高的水平存在于培养基中。
刺激PBMC的IFN-γ产生不受S-59+UVA处理的影响或被略微提高。见图10B。IL-2和IFN-γ的综合结果显示，在增殖被抑制的条件下，被处理细胞仍然能合成并分泌与T细胞激活有关的细胞因子。表面抗原表达分析了被处理淋巴细胞上表面标记表达的分析。经Ficoll梯度离心获得淋巴细胞，并通过用表面结合的抗-CD3抗体体外刺激来激活。应用CD69、CD25(IL-2受体)或CD40L的荧光抗体，通过荧光激活细胞分类(FACS)分析测定被激活、处理的淋巴细胞的表面抗原表达。作为激活后时间的函数测定表达，并与未处理细胞的表达相对比。
CD69是淋巴细胞激活的一种早期标记。图11A显示，用1nM或10nM S-59+3J/cm2UVA处理的细胞在处理后高达48小时的时间内具有类似于或略高于未处理细胞的表面CD69水平。因此，尽管被处理的细胞不能增殖，但与激活有关的信号传递途径仍具功能性。
CD25是IL-2受体，略晚(激活后)于CD69检测到其表达。图11B显示，与未处理的细胞相比，在用1nM或10nM S-59+3J/cm2UVA处理的细胞中，表面CD25基本上不受影响。
T细胞上的CD40配体(CD40L)识别B细胞表面上表达的CD40分子，作为T细胞激活过程的一部分。T细胞上CD40L表达的抑制能诱导细胞无应答性或无反应性。因此，处理后CD40L在T细胞上未受干扰的表达是正常T细胞激活的指征。用抗-CD3抗体使经处理的细胞激活后检查PCT对CD40L表达的影响(图12)。该分析的结果表明，对于随后增殖能力被消除的处理条件，被处理细胞的CD40L表达与在未处理细胞中观察到的紧密平行。
总之，在增殖严重降低或完全抑制的条件下(见图8及9，本实施例)，早期T细胞激活标记CD69和IL-2受体CD25的表达仍基本上不受影响；而CD40L水平与未处理的细胞平行。应当指出，一旦经抗原或促有丝分裂刺激，CD69即在淋巴细胞上短暂表达，CD69的继续表达需要新的转录。因此，在经处理的非增殖细胞中观察到高CD69水平，这进一步支持了处理不能不可逆地抑制基因表达这一见解。细胞毒性T细胞功能通过在MLR中产生对γ照射灭活的同种异体“刺激”细胞的细胞毒性T细胞，来估计S-59+UVA处理对T细胞裂解功能的影响。然后测定这些细胞毒性T细胞裂解51Cr-标记的靶细胞的能力，这些靶细胞从用来提供灭活的刺激细胞的相同供体中获得。
细胞毒性T细胞的产生从两种供体中取出外周血(100mL)，一种被称为“刺激物”，另一种被称为“效应物”。经Ficoll梯度离心从两种群体中分离PBMC。通过将效应PBMC以5×106细胞/ml的细胞密度置于组织培养瓶中1小时，来耗贫效应PBMC中的单核细胞。γ-照射(2500cGy)刺激PBMC阻断细胞分裂。将单核细胞耗贫的效应物与照射的刺激物分开重悬浮于RPMI完全培养基中至1×106细胞/ml的浓度。然后合并等体积的效应物与刺激细胞悬液用于MLR，并在5％CO2培养箱中37℃温育7天。
靶细胞的制备从为MLR提供刺激细胞的相同供体中抽取外周血(50ml)。如上分离PBMC，以1×106细胞/ml的浓度重悬浮于RPMI培养基中，然后用2μg/ml PHA-M(植物凝集素-M)和10单位/ml的重组IL-2在37℃下刺激7天。
用51Cr对靶细胞的标记在200μCi Na251CrO4存在下37℃温育靶细胞2小时，然后洗涤三次除去未掺入的标记物。
对效应细胞的光化学处理(PCT)将效应细胞(如上所述单核细胞耗贫的)分为四个等份，将每一份重悬浮于30ml含1％牛血清白蛋白的PBS中。向三份中加入S-59至0.1、0.01或0.001μM的终浓度；其余等份用作未处理的对照。将含有S-59的样品转移至30ml 2410血袋中，在Baxter/Fenwall UVA照射装置中用3J/cm2UVA照射每一样品。
CTL测定如下测定被处理的效应细胞群体的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性。重悬浮被处理的细胞(或对照未处理细胞)至1ml终体积中5×106细胞/ml的终浓度，进行连续两倍稀释获得2.5×106、1.25×106和0.625×106细胞/ml的终浓度。向圆底96孔微量滴定板的三孔的每孔中加入重悬浮的经处理的效应细胞和每一经处理的效应细胞稀释度(“效应细胞”)的100μl样品。然后向每孔效应细胞中加入含有5×103个细胞的100μl标记靶细胞样品(如上所述制备)，产生100∶1、50∶1、25∶1和12.5∶1的效应细胞靶细胞比值，在37℃下温育混合物4小时。温育后，以250×g离心培养板5分钟，从每孔中取出100μl上清液。在γ计数器上定量上清液中51Cr的量。对每组三个孔计算平均51Cr cpm和标准差。
对照稀释未标记的靶细胞，并以与效应细胞相同的比例用标记的靶细胞加板，来测定51Cr的自发释放。标记的靶细胞也与RPMI和1％Triton X-1000(每个3孔)一起温育，来测定51Cr的最大释放。对每组三个孔计算平均51Cr cpm和标准差。
结果图13显示对于经处理的和未经处理的白细胞，在不同效应物靶(或未标记的靶标记的靶)比值时的51Cr释放。这些结果表明，用能阻断增殖的S-59剂量和UVA处理的白细胞保留了溶细胞功能。因此，不能增殖的被处理白细胞不仅具有与未处理细胞相同的表型(如表面标记和细胞因子表达所示)，而且具有相似的功能性质。
总之，对被处理白细胞群体的增殖、表面标记表达、细胞因子合成及CTL活性的分析显示了被处理细胞的下列特性1.一旦经处理，即可观察到增殖能力的剂量依赖的抑制。
2.被处理细胞保留细胞因子合成、细胞表面抗原表达和体外细胞毒性。
因此，如此所述处理的白细胞群体及相当的细胞群体能有利于供体细胞(如造血细胞和造血干细胞)向非重度骨髓抑制的宿主中的植入。可实现这一点的一种机制是通过经处理的白细胞群体对供体特异耐受性的诱导。
实施例15鼠模型系统中被处理白细胞在无GVHD时GVL效应的准备进行实验研究S-59+UVA处理对MHC-错配的B6/AKR鼠模型系统中供体淋巴细胞GVL活性的影响。使供体脾细胞通过细孔滤网，获得未分离的脾细胞的单细胞悬液，然后用0.01μM S-59和不同剂量的UVA处理(0.5分钟、1分钟、2分钟及8分钟)。将1×107个处理的供体脾细胞与5×106个排除T细胞的骨髓细胞一起(C57BL/6、H-2b、Thy1.2+)注射入经受1100R全身辐射的AKR、H-2k、Thy1.1+宿主中。移植3天后用250个AKR-M2白血病细胞攻击每组小鼠(每组6只动物)。观察移植动物的GVHD临床症状、白血病复发及死亡。另外，移植后每3-4天记录一次移植动物的体重。
结果总结于表3和图14及15中，表明能获得UVA+S-59剂量的适当范围，其在MHC-错配移植中能有效地保留GVL活性而降低GVHD。例如，向排除T细胞的骨髓中加入未处理的或温和处理的(0.5分钟UVA+0.01μM S-59；照射剂量＝1.8 J-nM/cm2)淋巴细胞在移植受体中导致轻度到重度GVHD(根据这些组动物中降低的体重而证明；图14)。相反，用1分钟UVA+0.01μM S-59(照射剂量＝3.7 J-nM/cm2)处理的淋巴细胞能有效地保留GVL活性(白血病攻击70天后，3只中有3只存活者)而无GVHD症状。见表3及图15。用1分钟UVA+0.01μM S-59处理的动物的体重(图14)也表明无GVHD。如果用相同的S-59浓度及更高的UVA剂量(2及8分钟UVA，分别相当于7.5和30 J-nM/cm2的照射剂量)处理细胞，则供体淋巴细胞的GVL活性消除。在这些情况下，移植后20天内3只小鼠中有3只死亡，见图15。
表3施用PCT白细胞的B6/AKR嵌合体中的GVL活性
注意-所有组都在第1天照射并接受MHC-错配的骨髓移植，和第0天经处理的脾细胞(如适用)。
-如果进行白血病攻击，则在第3天。
-MST＝存活时间的中值，单位为天。
-范围＝死亡天数(移植后)(X＝存活)
从这些结果能得出结论，向排除T细胞的骨髓中加入用适量S-59+UVA处理的白细胞能在主要MHC-错配鼠模型系统中防止GVHD。此外，适当处理的白细胞的加入有利于供体植入，并导致MHC-错配移植宿主中的稳定嵌合状态。最后，被处理白细胞的GVL活性保留。因此，用S-59+UVA对白细胞的处理是一种调节供体淋巴细胞的免疫学活性以支持同种异体移植的新方法。
实施例16S-303对人淋巴细胞增殖及T细胞功能的影响在MLR试验中对经处理的异体刺激T细胞进行测定。从为了防止自身刺激而以2500cGy剂量γ辐射的供体中分离外周血单核细胞(PBMC)，用作刺激细胞。从不同供体分离的PBMC用作效应细胞。用0.1、0.2、0.3、0.4或0.5μM的N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯(S-303)在室温下处理浓度为2×106细胞/ml的效应细胞大约15分钟，用含有1％牛血清白蛋白的PBS洗两次。将S-303处理的及未处理的效应细胞与γ-辐射的刺激细胞以1∶1的比例协同培养。
淋巴细胞增殖的测定方法包括，协同培养开始6天后向协同培养物中加入3H-胸苷，于第7天收获细胞，及测定细胞中3H cpm的掺入。对协同培养开始24及48小时后采取的培养上清液进行夹心ELISA，分析细胞因子的产生。
对S-303处理细胞的增殖能力的分析(图16)显示，S-303处理的异体刺激效应细胞中3H-胸苷的掺入，在用0.1μM S-303处理的细胞中降低，而在用浓度为0.2μM或更高的S-303处理的细胞中完全被阻断。因此，在S-303处理的白细胞中观察到淋巴细胞增殖的剂量依赖的抑制。
作为对S-303处理白细胞的细胞因子产生的测定，估计γ干扰素(IFN-γ)的产生。图17显示，在用0.1μM及0.2μM S-303处理的细胞中，IFN-γ分泌不受影响，其中增殖分别严重降低及完全抑制(见图16)。用0.3μM S-303处理的细胞，其中淋巴细胞的增殖完全被抑制(图16)，产生对照水平大约的28％的IFN-γ(图17)。
总之，S-303预处理以剂量依赖的方式抑制异体刺激的人淋巴细胞的增殖，如在MLR中测定的。此外，在增殖被完全抑制的条件下(例如，用0.2μM S-303对效应细胞的处理)，IFN-γ的合成不受影响。因此，能获得能产生在刺激后不能增殖但保留免疫学活性的淋巴细胞的S-303处理条件。
尽管为了理解的清晰性，以图表和实施例的方式相当详细地描述了上述发明，但本领域的技术人员应当明白，在不背离本发明的精神的情况下可进行多种改变和修改。因此，不应把上述描述和实施例看作限制本发明的范围。
权利要求
1.一种待用于向同种异体受体中引入的分离的细胞群体，该细胞群体中含有一种白细胞群体，其中该白细胞群体的一部分是不增殖的，使得该受体中移植物抗宿主疾病(GVHD)的诱导被抑制，并且其中该白细胞群体的一部分保留免疫学活性。
2.权利要求1的细胞群体，其中白细胞群体含有T细胞、NK细胞和抗原呈递细胞。
3.权利要求1的细胞群体，其中在适当刺激后该白细胞群体的一部分即产生细胞因子。
4.权利要求3的细胞群体，其中细胞因子选自IL-1、IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-10和GM-CSF。
5.权利要求1的细胞群体，其中该白细胞群体的一部分表达一种表面标记，该表面标记选自CD2、CD28、CTLA4、CD40配体(gp39)、CD18、CD25、CD69(淋巴细胞激活标记)和CD16/CD56、MHC I类和II类、CD8、CD4、CD3/TcR(T细胞受体)、CD54(ICAM-1)、LFA-1和VLA-4。
6.权利要求1的细胞群体，其中该群体中超过90％的白细胞是不增殖的。
7.权利要求1的细胞群体，其中通过接触抗原或促分裂原刺激白细胞。
8.权利要求1的细胞群体，其中白细胞在促进疾病细胞的破坏方面有效。
9.权利要求1的细胞群体，其中白细胞在促进受感染细胞的破坏方面有效。
10.权利要求1的细胞群体，其中白细胞有利于第二种细胞群体的植入。
11.权利要求10的细胞群体，其中第二种细胞群体选自造血细胞、髓细胞、白细胞、骨髓细胞、胰岛细胞、肝细胞、神经元细胞、心肌细胞、间充质细胞和内皮细胞。
12.权利要求10的细胞群体，其中第二种细胞群体是一种器官。
13.权利要求1的群体，其中该白细胞群体含有第一种淋巴细胞亚群。
14.权利要求13的群体，其中第一种淋巴细胞亚群含有第二种T淋巴细胞亚群。
15.权利要求14的群体，其中根据表面标记的表达获得第二种亚群。
16.权利要求15的群体，其中表面标记选自CD8、CD4、CD16和CD56。
17.权利要求1的群体，其中通过选自白细胞电泳和红细胞去除的方法从全血中获得白细胞群体。
18.一种用于供体白细胞输注的方法，其中该方法包括在骨髓移植之后向受试哺乳动物中引入根据权利要求1的细胞群体。
19.一种增强移植细胞群体的植入的方法，其中该方法包括在移植之前向受试哺乳动物中引入根据权利要求1的细胞群体。
20.一种增强移植细胞群体的植入的方法，其中该方法包括在移植时向受试哺乳动物中引入根据权利要求1的细胞群体。
21.一种增强移植细胞群体的植入的方法，其中该方法包括在移植之后向受试哺乳动物中引入根据权利要求1的细胞群体。
22.根据权利要求20的方法，其中移植的细胞群体含有造血干细胞。
23.根据权利要求21的方法，其中移植的细胞群体含有造血干细胞。
24.一种用于免疫重建的方法，其中该方法包括向受试哺乳动物中引入根据权利要求1的细胞群体。
25.一种用于过继免疫治疗的方法，其中该方法包括向受试哺乳动物中引入根据权利要求1的细胞群体。
26.一种用于混合嵌合状态治疗的方法，其中该方法包括向受试哺乳动物中引入根据权利要求1的细胞群体。
27.一种制备根据权利要求1的细胞群体的方法，其中该方法包括(a)形成一种体外反应混合物，其含有白细胞群体和一种能与核酸形成共价键的化合物；和(b)在能产生一种含有白细胞群体的细胞群体的条件下温育该反应混合物；其中一部分白细胞群体是不增殖的，使得受体中移植物抗宿主疾病(GVHD)的诱导被抑制，并且其中该白细胞群体的一部分保留免疫学活性。
28.根据权利要求27的方法，其中免疫学活性包括疾病细胞、受感染细胞和病原体的破坏。
29.根据权利要求27的方法，其中该化合物以一定量存在，使得该化合物在每108个白细胞基因组DNA碱基对中形成约1到约104个加合物。
30.根据权利要求27的方法，其中该化合物以一定量存在，使得该化合物在每108个白细胞基因组DNA碱基对中形成约5到约103个加合物。
31.根据权利要求27的方法，其中未反应的化合物被去除。
32.根据权利要求31的方法，其中通过向反应混合物中加入猝灭剂去除未反应的化合物。
33.一种根据权利要求27的方法制备的细胞群体。
34.一种细胞群体，其性质相当于根据权利要求33的群体。
35.一种细胞群体，其性质相当于根据权利要求1的群体。
36.根据权利要求27的方法，其中被处理的白细胞群体内至少90％的T细胞中增殖被抑制。
37.根据权利要求27的方法，其中该化合物含有一种能与核酸非共价结合的核酸结合部分。
38.根据权利要求27的方法，其中该化合物含有(a)一种核酸结合部分；(b)一种能与核酸形成共价键的效应物部分；和(c)一种共价连接核酸结合部分与效应物部分的脆性连接体。
39.权利要求38的方法，其中核酸结合部分是一种芳族嵌入物，而效应物部分是一种芥子基。
40.根据权利要求39的方法，其中该化合物是具有通式
的N-(吖啶-9-基)β-丙氨酸2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯(S-303)及其盐。
41.权利要求27的方法，其中该化合物也是一种复制抑制剂。
42.权利要求27的方法，其中该化合物也是一种拓扑异构酶抑制剂。
43.权利要求42的方法，其中该化合物选自喜树碱和道诺霉素。
44.权利要求27的方法，其中该化合物含有一种可光活化部分，其在电磁刺激后与核酸形成共价键。
45.权利要求44的方法，其中该方法进一步包括使反应混合物暴露于光下，光活化该可光活化部分，从而导致可光活化部分与白细胞基因组DNA间共价键的形成。
46.权利要求45的方法，其中该化合物选自呋喃香豆素、放线菌素、蒽环酮、氨茴霉素、苯并二吡喃酮、芴、芴酮、单星脂肪蓝、norphillin A、有机染料；菲啶、吩噻嗪硫鎓盐、吩嗪、吩噻嗪、叠氮基苯、喹啉和噻吨酮、吖啶和椭圆玫瑰树碱。
47.权利要求46的方法，其中呋喃香豆素是一种补骨脂素。
48.权利要求47的方法，其中补骨脂素选自PAP、8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)、4’-氨基甲基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(AMT)、5-甲氧基补骨脂素(5-MOP)和三氧杂啉4，5’，8-三甲基补骨脂素。
49.权利要求47的方法，其中使该反应混合物暴露于波长为200-450nm的紫外线下。
50.权利要求49的方法，其中使该反应混合物暴露于波长为320-400nm的紫外线下。
51.权利要求50的方法，其中使该反应混合物暴露于剂量为10-3-100J/cm2的紫外线下。
52.权利要求51的方法，其中使该反应混合物在紫外线下暴露1秒-60分钟的一段时间。
53.权利要求52的方法，其中补骨脂素以10-4-150μM的浓度存在。
54.权利要求53的方法，其中该补骨脂素为具有通式
的4’-(4-氨基-2-氧杂)丁基-4，5’，8-三甲基补骨脂素(S-59)及其盐。
55.权利要求54的方法，其中S-59的浓度为10-3-150μM。
56.权利要求55的方法，其中使该反应混合物暴露于波长为200-450nm的紫外线下。
57.权利要求56的方法，其中使该反应混合物暴露于波长为320-400nm的紫外线下。
58.权利要求57的方法，其中使该反应混合物暴露于剂量为10-3-100J/cm2的紫外线下。
59.权利要求58的方法，其中使该反应混合物暴露于剂量为3J/cm2的紫外线下。
60.权利要求58的方法，其中使该反应混合物在紫外线下暴露1秒-60分钟的一段时间。
61.权利要求60的方法，其中使该反应混合物在紫外线下暴露大约1分钟的时间。
62.权利要求61的方法，其中白细胞群体的细胞密度为每毫升10-109个细胞。
63.权利要求62的方法，其中白细胞群体的细胞密度为每毫升2×106个细胞。
64.一种根据权利要求38的方法产生的细胞群体。
65.一种根据权利要求40的方法产生的细胞群体。
66.一种根据权利要求41的方法产生的细胞群体。
67.一种根据权利要求46的方法产生的细胞群体。
68.一种根据权利要求54的方法产生的细胞群体。
69.一种根据权利要求59的方法产生的细胞群体。
70.一种根据权利要求63的方法产生的细胞群体。
71.一种促进疾病细胞或病原体破坏的方法，包括将权利要求1的白细胞群体与含有疾病细胞或病原体的同种异体细胞群体相混合。
72.一种促进疾病细胞或病原体破坏的方法，包括将权利要求70的白细胞群体与含有疾病细胞或病原体的同种异体细胞群体相混合。
73.权利要求72的方法，其中该疾病细胞是一种癌细胞。
74.权利要求73的方法，其中该癌细胞选自慢性骨髓性白血病(CML)细胞、慢性骨髓单核细胞性白血病(CmML)细胞、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)细胞、急性骨髓性白血病(AML)细胞、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)细胞、多发性骨髓瘤(MM)细胞、何杰金氏淋巴瘤细胞和非何杰金氏淋巴瘤细胞。
75.权利要求74的方法，其中癌细胞为慢性骨髓性白血病细胞。
76.权利要求74的方法，其中癌细胞为多发性骨髓瘤细胞。
77.权利要求73的方法，其中癌细胞选自乳腺癌细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、睾丸癌细胞、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、黑素瘤细胞、肾癌细胞、成神经细胞瘤细胞、头癌细胞和颈癌细胞。
78.权利要求71的方法，其中疾病细胞是受感染细胞。
79.权利要求78的方法，其中受感染细胞被病毒感染。
80.权利要求79的方法，其中该病毒选自巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、腺病毒(Ad)和卡波西肉瘤相关疱疹病毒。
81.权利要求71的方法，其中通过将供体白细胞输入所述宿主中使白细胞群体与哺乳动物宿主的同种异体细胞群体于体内相混合。
82.权利要求81的方法，其中该哺乳动物宿主患有骨髓移植后白血病或多发性骨髓瘤的复发。
83.权利要求71的方法，其中刺激白细胞群体以扩展对疾病细胞或病原体抗原特异的细胞毒性T细胞的数量。
84.权利要求83的方法，其中在从供体中分离白细胞群体之前在体内进行刺激。
85.权利要求84的方法，其中通过用抗原对白细胞供体接种进行刺激。
86.权利要求85的方法，其中疾病细胞是CML细胞，并用CML细胞的bcr-abl抗原接种白细胞供体。
87.权利要求85的方法，其中疾病细胞是多发性骨髓瘤细胞，并用骨髓瘤细胞的独特型抗原接种白细胞供体。
88.权利要求83的方法，其中离体地进行刺激。
89.权利要求83的方法，其中刺激起因于白细胞群体与疾病细胞间的接触。
90.权利要求83的方法，其中刺激起因于白细胞群体与抗原呈递细胞之间的接触，其中该抗原呈递细胞已经接触疾病细胞。
91.权利要求83的方法，其中刺激起因于白细胞群体与抗原呈递细胞之间的接触，其中该抗原呈递细胞已经接触疾病细胞的一种抗原。
92.一种制备根据权利要求1的细胞群体的方法，其中该方法包括(a)形成一种含有白细胞群体和复制抑制性化合物的体外反应混合物；和(b)在一定条件下温育该反应混合物，该条件能产生一种含有白细胞群体的细胞群体，其中该白细胞群体的一部分是不增殖的，使得受体中移植物抗宿主疾病(GVHD)的诱导被抑制，并且该白细胞群体的一部分保留免疫学活性。
93.权利要求92的方法，其中该化合物是一种拓扑异构酶抑制剂。
94.权利要求93的方法，其中该化合物选自喜树碱和道诺霉素。
95.一种制备经处理的白细胞群体的方法，其中该白细胞群体总体上是不增殖的，并且不能在同种异体宿主中引起移植物抗宿主疾病(GVHD)，其包括下列步骤i)提供纯化的白细胞群体的样品；和ii)使白细胞样品与能与核酸形成共价键的化合物以一定的量结合，使得该化合物在每108个白细胞基因组DNA碱基对中形成约1-104个加合物，从而抑制增殖但保留白细胞群体促进疾病细胞或病原体破坏的有效性。
96.一种制备用于混合淋巴细胞反应的刺激细胞的方法，其中根据权利要求27的方法处理含有白细胞群体的细胞群体，并用经处理的细胞群体作为刺激细胞。
97.一种确定增殖是否为细胞功能所必需的方法，包括下列步骤(a)形成一种体外反应混合物，其含有一种细胞群体和一种能与核酸形成共价键的化合物；(b)在一定条件下温育该反应混合物，该条件能产生一种不能DNA合成但能够RNA及蛋白质生物合成的细胞群体；并观察细胞群体，确定细胞功能是否行使。
98.权利要求97的方法，其中该细胞功能是分化。
全文摘要
本发明提供了处理白细胞的方法与组合物,用于抑制白细胞的增殖并使它们不能引发移植物抗宿主疾病(GVHD),但能有效地增强同种异体供体细胞的植入,促进疾病细胞或病原体的破坏。也提供了白细胞组合物及这些组合物在缓解疾病中的应用方法,其有利于多种类型的免疫重建和免疫治疗,并增强同种异体供体细胞的植入。
文档编号A61K35/14GK1270630SQ98809097
公开日2000年10月18日 申请日期1998年7月21日 优先权日1997年7月21日
发明者W·M·格林曼, J·A·格拉斯, S·塔利布, A·斯塔西诺波劳斯, D·J·海, J·E·赫尔斯特 申请人:塞鲁斯公司