专利名称：k受体的阿片样肽的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及合成的阿片样肽，具体涉及作为高选择性κ受体活化剂的阿片样肽，更具体地说涉及如下活化剂，它(a)不会穿透到脑内，并且(b)具有长期的体内抗伤害感受活性。
背景技术：
κ阿片样物质受体(KOR)存在于脑，脊索，中枢和外周神经末梢，(躯体和内脏)一级感觉传入神经细胞体，以及免疫细胞。激活KOR的分子一般称之为κ活化剂。
已知，激活脑内KOR会产生镇痛作用。基于这一发现，人们试图开发脑透过性非肽类κ活化剂，用作新的镇痛剂以避免作用于μ阿片样物质受体(MOR)的吗啡类似物的副作用(便秘，呼吸抑制，依赖性和成瘾性)。已经在动物和人体内确认这类化合物具有镇痛活性而没有“μ阿片样物质”的副作用。然而，全身性κ活化剂的开发却中断了，因为它们被显示也具有一定的副作用，例如多尿、嗜睡和烦躁，这些都是由脑内κ受体介导的。
除脊柱上的KOR之外，外周和脊索内的KOR也会产生镇痛作用。然而，外周和脊索内的KOR与全身性κ活化剂的任何副作用都不相关。所以，只要能够产生不进入脑内的κ受体阿片样活化剂(通过外周给予或脊髓给予)，就能够获得安全的新镇痛剂。
在小肠和结肠中度局部炎症所致痛觉过敏模型中，κ活化剂都具有外周抗伤害感受作用，而应激性肠综合征(IBS)，包括局部内脏超敏反应(可能与炎症相关)引起的剧烈内脏疼痛，也是外周κ活化剂的作用靶。除胃肠道之外，表现出涉及一级感觉传入神经活化和/或致敏(即局部炎症)的病理情况的其他内脏也被认为是所述κ受体的阿片样物质适宜的作用靶。κ活化剂还通过抑制一级传入神经释放物质P抑制躯体组织内的神经性炎症，而且还知道它对免疫系统具有作用，主要的对免疫细胞的抑制作用。
特别需要的是如下肽不进入脑内，与对MOR相比具有很高的KOR亲和性，具有很强的效力和效果，在体内具有长期的持续作用。美国专利5，610，271公开了含有4个D型异构氨基酸残基的四肽，它们结合KOR，但这些肽并不具备所有上述优良特性。
发明概述本发明揭示了一类肽，它们对KOR具有高度的选择性，具有长期的体内活性，没有任何明显的脑透过作用。这些肽含有一段4个D型异构氨基酸序列，其C末端是单取代或双取代的酰胺。所述化合物的通式为H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-取代酰胺其中，Xaa1是(A)D-Phe，(CαMe)D-Phe，D-Tyr，D-Tic或D-Ala(环戊基或噻吩基)，A是H，NO2，F，Cl或CH3；Xaa2是(A’)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal，D-Tyr或D-Trp，A’是A或3，4Cl2；Xaa3是D-Nle，(B)D-Leu，D-Hle，D-Met，D-Val，D-Phe或D-Ala(环戊基)，B是H或CαMe；Xaa4是D-Arg，D-Har，D-nArg，D-Lys，D-Ily，D-Arg(Et2)，D-Har(Et2)，D-Amf，D-Gmf，D-Dbu，D-Orn或D-Ior。优选的酰胺包括乙酰胺，酰吗啉，硫代酰吗啉，4-吡啶甲基酰胺，哌嗪(piperazide)，丙酰胺，环丙酰胺，二乙基酰胺和取代苯甲酰胺。
具体地说，本发明提供了合成的阿片样肽酰胺或其药学上认可的盐，它们与κ阿片样物质受体的亲和力至少是与μ阿片样物质受体亲和力的1，000倍，并且在体内给予后具有长期作用，所述肽的通式为H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中，Xaa1是(A)D-Phe，(CαMe)D-Phe，D-Tyr，D-Tic或D-Ala(环戊基或噻吩基)，A是H，NO2，F，Cl或CH3；Xaa2是(A’)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal，D-Tyr或D-Trp，A’是A或3，4Cl2；Xaa3是D-Nle，(B)D-Leu，D-Hle，D-Met，D-Val，D-Phe或D-Ala(环戊基)，B是H或CαMe；Xaa4是D-Arg，D-Har，D-nArg，D-Lys，D-Ily，D-Arg(Et2)，D-Har(Et2)，D-Amf，D-Gmf，D-Dbu，D-Orn或D-Ior。Q是NR1R2，吗啉基，硫代吗啉基，(C)哌啶基，哌嗪基，4-单取代或4，4-双取代哌嗪基或ε-赖氨酰基，R1是低级烷基，取代低级烷基，苄基，取代苄基，氨基环己基，2-噻唑基，2-吡啶甲基，3-吡啶甲基，4-吡啶甲基，ω-(酰氨基)-聚亚甲基或聚(氧亚乙基)，R2是H或低级烷基；C是H，4-羟基或4-氧基。
另一方面，本发明包括上述化合物在治疗内脏疼痛之类，尿意频数之类或IBD或自身免疫病人患者，或类似非人哺乳动物中的用途。
优选实施例的简要描述有关肽的命名参见Schroder ＆ Lubke，The Peptides，Academic Press，1965，其中，根据常规表示方法，N末端在左边，C末端在右边。如果某氨基酸残基具有异构体，若非另作说明，则本发明中的氨基酸代表其L异构型。
如上所述，本发明提供不仅具有强KOR亲和力而且具有长期体内生物活性的KOR选择性肽。所述κ选择性阿片样肽与KOR的结合亲和力是与MOR的至少1，000倍，许多化合物则高出至少10，000倍，有些高出20，000倍或以上。然而，对许多适应症来说，除上述高选择性之外，κ活化剂还应该没有明显的脑透过性，而且具有长期体内抗伤害感受活性。所以，除上述选择性之外，优选化合物没有明显的脑透过性，同时保持至少1小时的基本活性，较好的化合物可保持至少2小时的显著活性，更好的化合物则表现出上述显著活性至少3小时以上。
以下缩写用于全文，意义一致。D-Nle表示D-正亮氨酸，D-Hle表示D-高亮氨酸。D-Har表示D-高精氨酸，D-nArg表示D-正精氨酸，它比D-Arg短一个碳原子。D-Nal表示丙氨酸的D异构体，在β碳上被萘基取代。较好的是使用D-2Nal，即萘连接在环结构的2位上；然而，也可以使用D-1Nal。D-Cpa和D-Fpa分别表示氯-D-Phe和氟-D-Phe，优选D-4Cpa，D-2Fpa，D-3Fpa和D-4Fpa。D-Npa表示硝基-D-Phe，D-Mpa表示甲基-D-Phe。D-3，4Cpa表示3，4-二氯-D-Phe。D-Acp表示D-Ala(环戊基)。D-Orn表示D-鸟氨酸，D-Dbu表示α，γ-二氨基丁酸。CML表示Cα甲基Leu，CMP表示CαMePhe。D-4Amf表示D-4(NH2CH2)Phe，D-Gmf表示D-Amf(脒基)，即4位被CH2NHC(NH)NH2取代的的D-Phe。D-Tic表示D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸。Ala(Thi)中，Thi表示噻吩基，它最好连接在丙氨酸的2位，虽然3-噻吩基也可以。Ily和Ior分别表示异丙基Lys和异丙基Orn，它们的侧链氨基被异丙基烷基化。
低级烷基表示C1至C6，包括环烷基，优选C1至C4，包括环丙基和环丁基。Me，Et，Pr，Ipr，Bu，Pn和Bzl表示甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，戊基和苄基。Cyp表示环丙基，Cyb表示环丁基。虽然最好是连接在烷基链的末端，但也可以连接在链的其他位置，例如3-戊基也可以称为乙基丙基。Ahx表示6-氨基-己基，即(CH2)6-NH2。4Acx表示4-氨基环己基，hEt表示羟乙基，即-CH2-CH2OH。取代苄基包括4Nbz和4Abz，分别表示4-硝基苄基和4-氨基苄基，Aeb表示4-(2-氨基-2-羧基乙基)苄基，即 2-，3-和4-吡啶甲基(2Pic，3Pic和4Pic)表示通过2-，3-或4-位亚甲基连接的甲基吡啶基团。Mor表示吗啉基，即 ，Tmo表示硫代吗啉基， Pip表示哌啶基，4-HyP和4-OxP表示4-羟基哌啶-1-基和4-氧基哌啶-1-基。Ppz表示哌嗪基。Ecp表示4-乙基氨基甲酰基-哌嗪-1-基；Pcp表示4-苯基氨基甲酰基-哌嗪-1-基。也可使用季铵，例如4，4-二甲基哌嗪-1-基(Dmp)或其他二-低级烷基取代。
2Tzl表示2-噻唑基，即 Ely表示ε赖氨酰基，即L-赖氨酸的侧链氨基通过酰胺键与C末端连接。
如上所述，R1可以是ω(酰氨基)聚亚甲基或聚(氧亚乙基)，例如Aao，Aoo，Hoh，Ghx或Gao。Aao表示8-(乙酰氨基)-3，6-二氧辛-1-基，即CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-NH-Ac。Aoo表示8-氨基-3，6-二氧辛-1-基，即CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-NH2。Hoh表示6-(L-氢乳清酰氨基)己-1-基，即(CH2)6-NH-(氢乳清酰基)；L-氢乳清酸是C4N2H5(O)2-COOH。Ghx表示6-(D-葡糖酰氨基)己-1-基，即(CH2)6-NH-CO-(CHOH)4-CH2OH。Gao表示6-(D-葡糖酰氨基)-3，6-二氧辛-1-基，即CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-NH-CO-(CHOH)4-CH2OH。
D-Phe或取代D-Phe最好位于1位。苯环可在2，3和/或4位被取代，一般优选2或4位的氯代或氟代。还可以甲基化α碳原子。也可以使用与D-Phe类似的等价残基，包括D-Ala(噻吩基)，D-Ala(环戊基)，D-Tyr和D-Tic。2位残基最好是D-Phe或取代D-Phe，该取代优选苯环4位碳上的取代或3位和4位上的取代。或者，可以使用萘基取代的D-丙氨酸，以及D-Trp和D-Try。3位最好是D-Nle，D-Leu，D-CML，D-Hle，D-Met或D-Val；然而，也可以使用D-Ala(环戊基)或D-Phe。4位一般优选D-Arg(可被二乙基取代)和D-Orn(可在δ氨基位置被例如异丙基烷基化)；然而，也可以是D-nArg和其他等价残基，例如D-Lys(也可以在ε氨基位置被烷基化)和D-Har(可以被二乙基取代)。而且，还可以使用D-Gmf，D-Dbu，D-4Amf和D-His。
虽然预计采用4D氨基酸序列将获得持久的生物作用，但出人意料的是，非取代酰胺的作用持续时间很短，只有在C末端加入一个取代酰胺才获得了持久的作用。单取代的形式可以是甲基，乙基，丙基，环丙基或吡啶甲基，以及羟乙基、噻唑基、氨基环己基、苄基和取代苄基等其他相当的残基。通常，单取代酰胺优选低级烷基或吡啶甲基。除单取代酰胺之外，还可以是二烷基取代，例如二乙基氨基；然而，所述取代C末端是吗啉基，硫代吗啉基或哌啶基，后者可以是非取代的，或被4-羟基或4-氧基所取代。也可以使用哌嗪基或4-单取代或4，4-二取代哌嗪基，例如ε-赖氨酰基。
我们发现，结合通常是因为四肽的氨基酸序列，较好的是，选择性κ受体阿片样肽与κ受体结合亲和力的Ki等于或低于2nM。被认为主要为连接C末端的酰胺结构所致作用持久性可用前文所述抗伤害感受试验来测试，最好的肽其基本生物活性可持续2或3小时，同时对脑没有明显的影响。
上述阿片样肽的一个优选亚类具有如下通式H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe(非取代或被CαMe，2F，4F或4Cl取代)，或D-Ala(环戊基或噻吩基)；Xaa2是(A’)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp，A’是H，4F，4Cl，4NO2或3，4Cl2；Xaa3是D-Nle，D-Leu，D-CML，D-Met或D-Acp；Xaa4是D-Arg，D-Arg(Et2)，D-Lys，D-Ily，D-Har，D-Har(Et2)，D-nArg，D-Orn，D-Ior，D-Dbu，D-Amf和D-Gmf。Q是NR1R2，Mor，Tmo，Pip，4-Hyp，Oxp或Ppz，R1是Me，Et，Pr，Bu，hEt，Cyp，Bzl或4-吡啶甲基，R2是H或Et。
上述κ阿片样肽另一个优选亚类具有如下通式H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe，D-4Fpa，D-2Fpa，D-4Cpa，D-Acp或D-Ala(Thi)；Xaa2是D-Phe，D-4Fpa，D-4Cpa，D-3，4Cpa，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp；Xaa3是D-Nle，D-Met，D-CML或D-Leu；Xaa4是D-Arg，D-Lys，D-Har，D-nArg或D-Orn；Q是NR1R2，Mor，Tmo，Pip，4-Hyp或Ppz，，R1是Et，Pr，Bu，Cyp，hEt，Bzl或4-Pic，R2是H或Et。
上述阿片样肽另一个优选亚类具有如下通式H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe，D-4Fpa，D-2Fpa，D-Acp或D-Ala(2Thi)；Xaa2是(A)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp，A是4F或4Cl；Xaa3是D-Nle，D-Met或D-Leu；Xaa4是D-Arg，D-Har，D-nArg，D-Lys，D-Orn或D-Gmf；Q是NHR1，Mor，Tmo，Pip或Ppz，，R1是Et，Pr或4-Pic。
上述阿片样肽另一个优选亚类具有如下通式H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe，D-4Fpa，D-2Fpa或D-Ala(2Thi)；Xaa2是(A)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp，A是3，4Cl2或4Cl；Xaa3是D-Nle或D-Leu；Xaa3是D-Arg，D-Orn或D-Gmf；Q是NHR1，Mor，Tmo，Pcp，Ppz或N(Et)2，R1是Et，Pr，Cyp，4-Pic，Aeb或Hoh。
已经证明，以上阿片样肽类及其亚类因为4位氨基酸残基的C末端具有取代酰胺，其体内抗伤害感受活性得以延长。这一出人意料的特征使得这些肽特别有价值，因为其中某些的体内活性可持续3小时以上。某些具有以上序列但只有单一C末端酰胺的四肽也表现出对KOR选择性高于对MOR；然而，它们一般只有短期作用。完全可以预计，上述肽如果在合成时使其C末端具有取代酰胺例如酰吗啉，则将表现出延长的作用期。与此一致的发现是，当四肽伯酰胺表现出与KOR的高亲和力选择性结合时，合成时被相应取代的酰胺例如乙基酰胺和酰吗啉，表现出以小时计的抗伤害感受活性延长，即至少1小时，但不明显进入脑内。
虽然以上以通式形式给出了优选的氨基酸序列，但是肽化学领域一般技术人员都知道，其中的一个或多个氨基酸可以被保守氨基酸所取代，例如，碱性氨基酸之间相互取代，或疏水性氨基酸之间相互取代，例如，D-Ile取代D-Leu，各种残基还可以如本领域所知进行修饰；例如，可如下修饰D-Phe(前文所述)在3位或4位或这两个位置引入卤原子或硝基，或者在α碳上甲基化。可认为上述修饰将产生等效的κ受体阿片样肽。
肽可用各种合适的方法合成，例如完全固相技术，或经典溶液加成，或部分固相技术，或片段缩合技术。例如，完全固相肽合成技术(SPPS)可参见教科书Stewart ＆ Young，Solid-Phase Peptide Synthesis，第2版，PierceChemical Company，Rockford，Illinois，1984，其实例参见美国专利4，105，603。片段缩合技术的实例是美国专利3，972，859，其他合成方法的实例则有美国专利3，842，067和3，862，925。经典溶液加成技术的详细描述可参见Bodanzsky等，Peptide Synthesis，第2版，John Wiley＆Sons，New York，1976。
与偶联型肽化学合成一样的是需保护待偶联氨基酸的所有不稳定侧链，而且通常还需保护α氨基，这样，加成就发生在加入的单个氨基酸或二肽或三肽的羧基。这样的保护基是本领域所熟悉的，常用叔丁基氧基羰基(Boc)，苄基氧基羰基(Z)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)作为SPPS或经典溶液合成法中的优选α氨基保护基，虽然也可使用许多其他α氨基保护基。
采用SPPS时，C末端氨基酸残基与固相树脂支持体例如O-CH2-聚苯乙烯支持体，0-CH2-苄基-聚酰胺树脂支持体，-NH-二苯甲基胺(BHA)树脂支持体，或-NH-对甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂支持体偶联。在需要非取代酰胺时，一般优选BHA或MBHA，因为剪切后将直接得到C末端酰胺。在需要N-甲基酰胺时，可用N-甲基BHA树脂获得。其他单取代酰胺的合成方法参见W.Kornreich等，Int.J.Peptide Protein Res.，25414-420，1985，和美国专利4，701，499。C末端为二取代酰胺的肽，例如N-吗啉基或N-哌啶基，宜通过经典溶液合成法或溶液内的片段缩合来制备。
合成后，上述四肽易于用本领域熟悉的用于纯化短肽的方法来纯化，例如反相高效液相层析(RP-HPLC)或其他适合的方法。这样的纯化方法参见J.Rivier等，J.Chromatography，288303-328，1984，和C.Miller和J.Rivier，Peptide Science，Biopolymers，40265-317(1996)，固相合成或其他方法合成后的纯化实例参见美国专利5，098，995。
可用许多试验来测试四肽是否具有高KOR选择性，强抗伤害感受活性，持久的体内生物活性，而且不渗透入脑。受体试验是本领域所熟悉的，目前已经克隆了小鼠、大鼠、豚鼠和人的KOR。除gpKOR之外，克隆KOR十分相似，都含约380个氨基酸。hKOR的氨基酸序列与rKOR和mKOR的同源性分别为93.9％和93.4％。相比之下，hKOR与hMOR和人δ阿片样物质受体(hDOR)则明显不同，氨基酸序列一致性分别是60.2％和59.1％。KOR及其他阿片样物质受体是经典的、7-跨膜区、G蛋白结合受体(Gi)。这些克隆受体方便了对特定侯选肽的筛选；例如，为了确定选择性，可用KOR和MOR进行筛选。人KOR，MOR和DOR已可在海马神经母细胞瘤衍生的小鼠癌细胞系(HN.9.10)中稳定表达，并可得到和用于体外筛选。还有许多被广泛认可的体内试验已成为普遍的标准试验，用于测定某阿片样化合物的抗伤害感受活性。这些试验通常使用小鼠，包括摆尾试验，夹抓试验，乙酸扭体试验，夹尾试验和浸尾试验。Vonvoigtlander，P.F.等，J.Pharm.Exper.Therapeutics，2247-12(1983)描述了许多用于阿片样化合物的这类试验。
结合亲和力指配体与受体之间的相互作用力。为了测定与阿片样物质受体的结合亲和力，采用竞争性结合试验来评价本发明的肽。上述试验是用稳定转化细胞系(HN9.10，衍生自小鼠的海马神经母细胞瘤)中表达的克隆人κ(hKOR)和μ(hMOR)阿片样物质受体进行的。在这些研究中，不断提高测试化合物的浓度，取代放射性标记的、对所研究受体具有高度亲和力和选择性的配体的特异性结合。3H-U-69，593和3H-DAMGO分别在hKOR和hMOR研究中用做配体。这两种受体都有市售(HEN-Dupont)。DAMGO是[D-Ala2，MePhe4，Gly-ol5]-脑啡肽的首字母缩写。放射性配体的亲和力定义为饱和实验中产生最大特异性结合值半数时的放射性陪体浓度(KD)。3H-U-69，593对hKOR的KD和3H-DAMGO对hMOR的KD分别是0.3nM和3.OnM。被测化合物(非标记即冷配体)的亲和力在竞争性结合实验中根据以下公式计算抑制常数Ki来测定Ki=IC501+(F/KD)]]>其中，IC50=对放射性配体的特异性结合产生50％抑制的非标记配体浓度F=游离放射性配体浓度KD=饱和实验中测得的放射性配体的亲和力。
在低浓度受体，特定条件下进行上述试验时，被测化合物的算得Ki与其解离常数KD十分接近，代表了占据50％结合位点所需的配体浓度。在阿片样物质中，纳摩尔或亚纳摩尔级的低Ki值被认为说明是高亲和力配体。优选类似物具有约2纳摩尔(nM)或更低的对KOR的Ki，Ki等于或低于1nM则更好。因为KOR受体在体内广泛存在，κ受体的阿片样肽将在许多外周活动调节中具有重要作用，如果它们具有高度的KOR选择性，它们的副作用将极小，因而在生理学上将是优良的药物。
上述适用KOR和MOR的结合试验实施简便，可方便地用已初步鉴定或合成的肽进行，以确定它们是否具有KOR选择性和高亲和力。所述结合试验可用本领域技术人员熟悉的多种方式进行，以上常用类型试验的一个详细例子参见Perrin，M.等，Endocrinology，1181171-1179。
以下实施例将进一步描述本发明。然而，不应将这些实施例理解成是对本发明构思或范围的限定，本发明的构思和范围由权利要求书来限定。
实施例1以熟悉的肽合成法正确合成以下通式的肽H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NHEt。例如，先用经典溶液化学法合成三肽(α-氨基保护基)-D-Phe-D-Phe-D-Nle(羧基保护基)。例如，可如下制备该三肽。将H-D-Nle-Ome溶于DMF，加入N-乙基吗啉(NEM)之类调节pH。然后，该溶液与含NEM的Boc-保护的D-Phe-OH的DMF溶液混合。向该反应混合物中加入活化剂或偶联剂，例如六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三(二甲基氨基)-鏻(BOP)或N，N’-二异丙基碳二酰亚胺(DIC)和N-羟基苯并三唑(HOBt)的混合物。该反应完成后，将介质蒸干，然后适当纯化产物并重结晶。然后用三氟乙酸(TFA)去除Boc保护基，将二肽重新溶于DMF。加入含NEM的Boc保护D-Phe的DMF溶液。用BOP重复以上反应，生成三肽，蒸干溶液后纯化并重结晶。所得产物为Boc-D-Phe-D-Phe-D-Nle-OCH3。然后用合适的方法将甲基酯转化为游离酸，例如通过将其溶解在二噁烷或DMSO与水的混合物中并加入氢氧化钠。反应完全后，分离，纯化和重结晶，得到三肽Boc-D-Phe-D-Phe-D-Nle-OH。
将该三肽溶于含NEM的DMF，与D-Arg(Tos)-NHEt反应，仍以BOP作为偶联剂。或者，如果需要，用80％的水合肼溶液处理以生成酰肼，如此将三肽甲基酯转化为叠氮化合物，然后分离，并用亚硝酸钠和无机酸的DMF溶液处理。叠氮化合物立即在含三乙胺的DMF溶液中与D-Arg(Tos)-NHEt反应。反应完成后，将混合物蒸干，然后适当纯化和重结晶。然后D-Arg的N末端和侧链去保护，再次纯化和重结晶，生成所需的四肽乙基酰胺(肽No.1)。
使用两种移动相含0.1％三氟乙酸水中的乙腈梯度和pH7的三乙胺磷酸盐缓冲液中的乙腈梯度，进行反相HPLC，和用pH2.5磷酸盐缓冲液的毛细电泳，判断该肽是否均一。据估计，所述方法所得肽的纯度高于98％。电喷射离子化质谱和离子阱分析显示，假分子离子[MH]+的m/z为609.4，与该四肽算得m/z质量609.5一致。假分子离子的片段分析显示一系列离子的m/z比例与所制备结构的预计氨基酸序列一致。
如前所述用表达人KOR和MOR的细胞进行结合试验。如前所述，通过竞争性取代hKOR的3H-U-69，593和hMOR的3H-DAMGO测定被测化合物与在小鼠海马神经母细胞瘤(HN．9．10)细胞内稳定表达的hKOR和hMOR的亲和力。汇总至少3次实验的数据，用合适的程序，例如Munson和Rodbard的LIGAND程序(Anal．Biochem，107220—230，1980)，计算抑制解离常数(Ki)(95％置信限)。根据竞争性置换结合放射性配体测得，克隆KOR以高亲和力结合肽No．1，测得的Ki约为0．05±0．02nM。与表达人MOR的相同稳定转化癌细胞相比，亲和力差异显著，后者的Ki为1890±990nM。因此，肽No．1结合hKOR比结合hMOR强38，000倍。
在小鼠乙酸扭体实验(见后文)中测试所述肽显示ED50约O．09mg／kg，而且，该肽在3小时后仍持续表现出50％以上的抗伤害感受作用。因此认为肽N0．1具有持久的作用期。
实施例2如实施例1所述合成并测试以下通式的阿片样肽H-D-Phe-D-Nle-D-Arg-Q，见表A。
肽2至15被认为具有持久的抗伤害感受活性。
实施例3
如实施例1所述合成并测试以下通式的阿片样肽H-Xaa1-Xaa2-Xaa3Xaa4-Q，见表B。
肽16至39被认为具有持久的抗伤害感受活性。
实施例4如实施例1所述合成并测试以下通式的阿片样肽H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q，见表C。
肽40至53被认为具有持久的抗伤害感受活性。
实施例5如实施例1所述合成并测试以下通式的阿片样肽H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q，见表D。
肽54至58被认为具有持久的抗伤害感受活性。
实施例6如实施例1所述合成并测试以下通式的阿片样肽H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-D-Arg-Q，见表E。
肽59至65被认为具有持久的抗伤害感受活性。
实施例7如实施例1所述合成并测试以下通式的阿片样肽H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q，见表F。
表F中的阿片样肽被认为，与MOR相比，具有高度的KOR选择性，并具有体内抗伤害感受活性。
实施例8如实施例1所述合成并测试以下通式的阿片样肽H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q，见表G。
肽88至104被认为具有持久的抗伤害感受活性。
实施例9选择表A-G中已鉴定的肽特别接受进一步的体内试验以确定起阿片样物质作用的持续期，试验结果见后文表H。为了引用方便，沿用了前文诸表中的肽编号和K／u比数据。体内试验采用小鼠扭体试验(WT)，该试验非常适合测定抗伤害感受活性的持续时间。该试验的详细描述参见G．A．Bentley等，Br．J．Pharmac.，73∶325-332，1981，它选用购自Harlan的清醒的雄性ICR小鼠，体重在20-30g之间。实验前，给小鼠禁食12-16小时。通过腹膜内注射(i.p.)乙酸稀释液诱导伤害感受行为，即扭体，进行监测。每kg体重用10ml 0.6％乙酸水溶液。评估给予乙酸后15分钟内的扭体情况。第一步，3至4次增量给药测试化合物，在统一的预处理时间(注射乙酸前5分钟)通过静脉途径给予。通过这一步测定强度(WT-ED50)和次最大有效剂量(约80-90％抗伤害感受作用)。第二步，在不同的预处理时间(注射乙酸前5分钟，60分钟，120分钟和180分钟)给予各肽的次最大有效剂量，用于测定作用的持续期。整个试验中，将只给予载体而不给予侯选肽的小鼠作为对照。计数注射乙酸起15分钟内的扭体次数，并如下计算，以百分比表示生物活性即抗伤害感受作用 因为各化合物的最大有效剂量很可能不同，所以不能直接比较，因此，如本领域所知，对结果进行了数学校正，得到表H中的可比数值。表H中，1，2和3小时后保留的抗伤害感受活性表示为注射前5分钟该活性的百分比。数值高于100％说明抗伤害感受活性比实验开始时更高。感觉上，阿片样肽应在1小时内缓解扭体至少25％，才可被认为具有持久的体内活性。
除用该试验测定抗伤害感受活性持续时间之外，它还被用来测定肽的(短期)体内生物效力。该数值列于WT-ED50栏，单位为mg/kg体重。该值反映小鼠15分钟内扭体次数减少50％(与对照相比)所需的剂量。
阿片样肽作为镇痛剂或被用于治疗其他与KOR系统相关的疾病。它们优于具有副作用(例如便秘、呼吸抑制和瘙痒)的吗啡等μ活化剂。特别好的是，这些阿片样肽基本上不透过血脑屏障，因而避免了可能产生的副作用。所述化合物在脑透过方面的安全性通过比较它们激发外周效应的能力和激发中枢效应的能力来评估。用前文所述小鼠扭体试验(WT)来测定外周效应。用摆尾试验(TF)测定作用于脑内κ受体而产生的中枢效应。
摆尾试验测定急性躯体痛感，用于评估中枢作用性镇痛剂的作用强度和持续时间。将尾巴浸入52℃水中产生的伤害感受造成尾巴的迅速回撤，又称摆尾。中枢作用性镇痛化合物将以剂量相关方式延长尾巴回撤的滞后期。有关该试验参见Vanderah，T.W.等，J.Pharm.Exper.Therapeutics，262190-197，1992。
用脑透过指数(BPI)来评价安全性BPI=TF-ED50WT-ED50]]>其中ED50分别是静脉给药时，在小鼠扭体试验(WT-ED50)和小鼠摆尾试验(FT-ED50)中产生最大效果半值的剂量。BPI越高，脑透过越低，化合物用于本申请前述用途时的安全限度愈宽(没有脑副作用)。优选阿片样肽的BPI等于或高于100，更好的高于300。全身性非肽类κ活化剂(例如Enadolin和U-69，593)的BPI低于5，说明发生了明显的脑透过，临床使用时产生的副作用(多尿、嗜睡和烦躁)也证明了这一点。以下表I中的是一些代表性阿片样肽的BPI
因为这些肽与KOR牢固结合，它们还可以在体外试验中用于研究受体和检测特定组织样品中存在何种受体。因此，就此而言，它们可以用于诊断，并有可能用于体内诊断。
通常，这些阿片样肽可用于治疗内脏痛，获得抗伤害感受作用，也可以用于治疗类风湿关节炎。它们尤其适用于治疗腹部术后症状，例如消化紊乱和疼痛。它们还被认为可有效治疗IBS，尿意频数，失禁，以及局部炎症造成肠或其他内脏疼痛等其他适应症，例如炎性肠病(IBD)和痛经。阿片样肽减轻免疫应答的能力可能有利于抵抗IBD及其他适应症，例如自身免疫病。在急性和慢性炎症情况下，给予所述肽将产生局部镇痛活性。它们可用于治疗具有疼痛相关性腹胀、噁心或暂时性肠抑制等症状的消化梗阻，例如可能由痉挛性收缩引起的肠梗阻。阿片样肽还能够产生外周镇痛作用，并可定向缓解术后疼痛和诸如胃肠道及内脏组织炎症等引起的慢性疼痛，还可缓解戒除药瘾期间的疼痛。
本发明化合物可以药学上认可的无毒盐的形式给予，例如本领域熟悉的加酸盐。所述加酸盐例如盐酸盐，氢溴酸盐，硫酸盐，磷酸盐，硝酸盐，草酸盐，延胡索酸盐，葡糖酸盐，鞣酸盐，双羟水杨酸盐，马来酸盐，乙酸盐，柠檬酸盐，苯甲酸盐，琥珀酸盐，藻酸盐，苹果酸盐，山梨酸盐，酒石酸盐等。如果要以片剂形式给予活性成分，该片剂可含药学上认可的无毒稀释剂，这包括黏合剂，例如西黄蓍胶，玉米淀粉或明胶。等渗盐溶液、磷酸盐缓冲液、甘露醇或葡萄糖溶液形式的静脉注射也有效。
药物组合物一般含有效量的肽和药学上认可的常规载体或稀释剂。通常，组合物含抗伤害感受量，即有效抑制痛感的量。静脉给药时，剂量一般为1-10mg肽/kg体重。组合物可在需要时给予；例如，可每隔3-6小时重复给予一次。本发明化合物的性质允许口服生效，然而，口服剂量可能较高。如果需要长期传递所述阿片样肽，例如一次给药后1周或更长时间，可采用缓释、贮库或植入体剂型。例如美国专利3，773，919所述，一种适合的缓释贮库型注射制剂含分散于或包含于降解缓慢、无毒或非抗原性聚合物(例如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物)中的所述肽或其盐。还已知，可通过硅胶植入体实现缓释给药。
以上化合物可通过静脉、皮下、肌内、透皮、鼻内、肺内、口服、局部、直肠内、阴道内或脊髓给药给予包括人在内的哺乳动物，以获得抗伤害感受作用，例如逆转腹膜刺激引起的暂时性胃肠抑制。它们可用于缓解术后疼痛。有效剂量随给予形式和所治哺乳动物具体种类而异。一例典型剂型是pH3-8，例如pH6的含肽抑菌水溶液，连续胃肠外给予该溶液，使剂量约在每日每公斤体重0.3μg至3mg之间。以上化合物被认为具有良好的体内耐受性，它们尤其适合以抑菌水溶液等形式通过皮下注射来给予。
虽然，以上描述了本发明的优选实施例，显然，本领域一般技术人员可在权利要求所界定的范围内进行多种修改。例如，在本发明肽中可采用不显著减损肽效果的、本领域已知的其他取代。2位可采用其他取代的D-Phe，例如(4Br)D-Phe或(2，4-Cl2)D-Phe。D-Ily(Bu)和D-Lys(Et2)都是D-Ily和D-Arg(Et2)的等价物。如果需要，可将四肽N末端预先甲基化。可用二氨基化合物作为接头形成2个四肽酰胺的二聚体。已被成功应用的接头有1，6-二氨基己烷，1，5-二氨基-3-噁戊烷和1，8-二氨基-3，6-二氧辛环。所得二聚体被认为与对应单体等效。
权利要求
1．一种合成阿片样肽酰胺或其药学上认可的盐，它与κ阿片样物质受体的亲和力是与μ阿片样物质受体亲和力的至少1，000倍，并在体内给予后具有持久的作用，所述肽的通式为H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中，Xaa1是(A)D-Phe，(CαMe)D-Phe，D-Tyr，D-Tic或D-Ala(环戊基或噻吩基)，A是H，NO2，F，Cl或CH3；Xaa2是(A’)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal，D-Tyr或D-Trp，A’是A或3，4Cl2；Xaa3是D-Nle，(B)D-Leu，D-Hle，D-Met，D-Val，D-Phe或D-Ala(环戊基)，B是H或CαMe；Xaa4是D-Arg，D-Har，D-nArg，D-Lys，D-Ily，D-Arg(Et2)，D-Har(Et2)，D-Amf，D-Gmf，D-Dbu，D-Orn或D-Ior；Q是NR1R2，吗啉基，硫代吗啉基，(C)哌啶基，哌嗪基，4-单取代或4，4-双取代哌嗪基或ε-赖氨酰基，R1是低级烷基，取代低级烷基，苄基，取代苄基，氨基环己基，2-噻唑基，2-吡啶甲基，3-吡啶甲基，4-吡啶甲基，ω-(酰氨基)-聚亚甲基或聚(氧亚乙基)，R2是H或低级烷基；C是H，4-羟基或4-氧基。
2．根据权利要求1所述合成肽，其中Xaa2是D-Phe，Xaa3是D-Leu或D-Nle，Xaa4是D-Arg或D-Orn。
3．根据权利要求1或2所述合成肽，其中Q是NHR1，R1是乙基，丙基，丁基，环丙基或环丁基。
4．根据权利要求1或2所述合成肽，其中Q是吗啉基或硫代吗啉基。
5．根据权利要求1或2所述合成肽，其中Q是NHR1，R1是4-吡啶甲基。
6．根据权利要求1或2所述合成肽，其中Q是N(Et)2，NH(Aeb)，Ppz或Pcp。
7．根据权利要求1或2所述合成肽，其中Q是NHR1，R1是Aao，Aoo，Hoh，Ghx或Gao。
8．根据权利要求1-7中任一项所述合成肽，其中的Xaa1是D-Phe，D-Ala(2-噻吩基)或D-4Fpa。
9．根据权利要求1所述合成肽，其中Xaa4是D-Gmf。
10．根据权利要求1所述合成肽，其中Xaa2是D-4Cpa或D-3，4Cpa。
11．一种药物组合物，含抗伤害感受量的权利要求1-10中任一项所述的合成肽和药学上认可的液体或固体载体。
12．一种治疗方法，包括给予一定量的权利要求11所述药物组合物，所述量的组合物能够(a)在发生内脏痛、类风湿关节炎、腹部术后症状或急慢性疼痛时获得抗伤害感受作用，或(b)抵抗尿意频数、失禁或消化道梗阻，或(c)抵抗IBD或自身免疫病。
13．根据权利要求1所述的合成阿片样肽，具有等于或低于0.5mg/kg的WT-ED50，所述肽的通式为H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe(非取代或被CαMe，2F，4F或4Cl取代)，或D-Ala(环戊基或噻吩基)；Xaa2是(A’)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp，A’是H，4F，4Cl，4NO2或3，4Cl2；Xaa3是D-Nle，D-Leu，D-CML，D-Met或D-Acp；Xaa4是D-Arg，D-Arg(Et2)，D-Lys，D-Ily，D-Har，D-Har(Et2)，D-nArg，D-Orn，D-Ior，D-Dbu，D-Amf和D-Gmf；Q是NR1R2，Mor，Tmo，Pip，4-Hyp，Oxp或Ppz，，R1是Me，Et，Pr，Bu，hEt，Cyp，Bzl或4-吡啶甲基，R2是H或Et。
14．根据权利要求13所述合成肽，其中Xaa2是D-Phe，D-4Cpa或D-3，4Cpa，Xaa3是D-Leu或是D-Nle，Xaa4是D-Arg，D-Orn或D-Gmf。
15．根据权利要求13或14所述合成肽，其中Q是NHR1，R1是Et，hEt。Pr或4-吡啶甲基。
16．根据权利要求13或14所述合成肽，其中Q是N(Et2)或NH(Aeb)。
17．根据权利要求13或14所述合成肽，其中Q是吗啉基或硫代吗啉基。
18．根据权利要求13或14所述合成肽，其中Q是NHR1，R1是乙基或4-吡啶甲基。
19．根据权利要求13或14所述合成肽，其中Q是Ppz，Pcp或NH(Hoh)。
20．根据权利要求13-19中任一项所述合成肽，其中的Xaa1是D-Phe，D-Ala(2-噻吩基)或D-Fpa。
21．根据权利要求1所述合成肽，具有通式之一H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NHEt，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-吗啉基，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NH-4-吡啶甲基，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NHPr，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-硫代吗啉基，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NEt2，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NHMe，H-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Orn-吗啉基，H-D-4Fpa-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NH-4-吡啶甲基，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NH-环丙基，H-D-Ala(2Thi)-D-3，4Cpa-D-Leu-D-Arg-吗啉基，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Gmf-吗啉基，H-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Orn-NH(Aeb)，H-D-Phe-D-Phe-D-Leu-D-Lys-吗啉基，H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-哌嗪基，和H-D-Phe-D-Phe-D-Nle-D-Arg-NH(Hoh)。
22．根据权利要求1所述的合成阿片样肽，具有等于或低于0.5mg/kg的ED50，所述肽的通式为H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe，D-4Fpa，D-2Fpa，D-Acp或D-Ala(2Thi)；Xaa2是(A)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp，A是4F或4Cl；Xaa3是D-Nle，D-Met或D-Leu；Xaa4是D-Arg，D-Har，D-nArg，D-Lys，D-Orn或D-Gmf；Q是NHR1，Mor，Tmo，Pip或Ppz，R1是Et，Pr或4-Pic。
23．根据权利要求1所述的合成阿片样肽，具有等于或低于0.5mg/kg的ED50，所述肽的通式为H-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Q其中Xaa1是D-Phe，D-4Fpa，D-2Fpa或D-Ala(2Thi)；Xaa2是(A)D-Phe，D-1Nal，D-2Nal或D-Trp，A是3，4Cl2或4Cl；Xaa3是D-Nle或D-Leu；Xaa4是D-Arg，D-Orn或D-Gmf；Q是NHR1，Mor，Tmo，Pcp，Ppz或N(Et)2，R1是Et，Pr，Cyp，4Pic，Aeb或Hoh。
全文摘要
本发明提供了一类对κ阿片样物质受体(KOR)具有高选择性,具有持久的外周作用,而且基本上不进入脑内的肽,它具有4个D型氨基酸残基构成的序列,其C末端是单取代或二取代的酰胺。代表性化合物与KOR的亲和力是与μ阿片样物质受体(MOR)亲和力的至少1000倍,ED
文档编号A61P1/04GK1283201SQ98812582
公开日2001年2月7日 申请日期1998年12月22日 优先权日1997年12月23日
发明者J·L·朱尼英, P·J·M·里弗, C·D·施泰英阿特, J·S·迪亚斯, J·A·特罗内尔, T·W·范德阿 申请人:凡林有限公司