专利名称：：肿瘤抗原肽衍生物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新的肿瘤抗原肽衍生物。虽然长期以来不了解CTL攻击自身肿瘤细胞的靶分子，但是免疫学和分子生物学的最近进展已经逐渐揭示了这类靶分子。准确地说，已经发现CTL利用T细胞受体(TCR)识别称为肿瘤抗原肽的肽和主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原(MHCⅠ类抗原，在人类称为HLA抗原)之间的复合物，由此攻击自身肿瘤细胞。肿瘤抗原肽产生自肿瘤特异性蛋白即肿瘤抗原蛋白。因此，该蛋白在细胞内合成，然后在细胞质被蛋白酶体降解为肽。另一方面，在内质网形成的MHCⅠ类抗原(HLA抗原)当结合至上述肿瘤抗原肽时，从高尔基体内侧转运到高尔基体外侧即成熟侧，然后携带到它们作为抗原提呈的细胞表面。肿瘤特异性CTL识别作为抗原提呈的该复合物，并通过细胞毒性效应或产生淋巴因子呈现其抗肿瘤效应(Rinsho-Menneki，27(9)1034-1042，1995)。因为这一系列作用的阐明，已经成为可能的是，通过使用在患者中增强肿瘤特异性CTL的肿瘤抗原蛋白或肿瘤抗原肽作为所谓的癌症疫苗来治疗肿瘤。作为这样的肿瘤抗原蛋白，T.Boon等于1991年首次鉴定了来自人黑素瘤细胞并命名为MAGE的蛋白(Science，2541643-1647，1991)，此后从黑素瘤细胞已经鉴定了数个另外的肿瘤抗原蛋白。如T.Boon等的综述(J.Exp.Med.，183725-729，1996)，迄今鉴定的肿瘤抗原蛋白可以分为以下四类。属于第一类的肿瘤抗原蛋白对于正常组织仅在睾丸组织中表达，而对于肿瘤组织它们表达于黑素瘤、头颈部癌症、非小细胞肺癌、膀胱癌以及其它肿瘤。上述的MAGE和组成12个以上成员的家族的类似蛋白(J.Exp.Med.，178489495，1993)以及BAGE(Immunity，2167-175，1995)和GAGE(J.Exp.Med.，182689-698，1995)属于此类肿瘤抗原蛋白，所有这些肿瘤抗原蛋白均已经在黑素瘤细胞中鉴定。虽然部分该类肿瘤抗原蛋白高表达于黑素瘤，但是其表达仅在10-30％的非黑素瘤的特定肿瘤患者观察到，因此它们不能广泛用于各种肿瘤的治疗或诊断。属于第二类的肿瘤抗原蛋白仅表达于正常组织中的黑素细胞和视网膜以及肿瘤组织中的黑素瘤。由于这些组织特异性蛋白高表达于黑素瘤，所以它们可以用作黑素瘤特异性肿瘤抗原蛋白。酪氨酸酶(J.Exp.Med.，178489-495，1993)、MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，913515，1994)、gp100(J.Exp.Med.，1791005-1009，1994)和gp75(J.Exp.Med.，181799-804，1995)属于该类肿瘤抗原蛋白。编码这些蛋白的基因均已经从黑素瘤细胞克隆。已经证实单独分离的Me1an-A(J.Exp.Med.，18035，1994)与MART-1相同。然而，这类肿瘤抗原蛋白不能广泛用于各种肿瘤的治疗或诊断，因为它们不在非黑素瘤的肿瘤中表达。属于第三类的肿瘤抗原蛋白因为肿瘤特异性突变使其表达为CTL识别的肿瘤抗原肽。突变的CDK4(Scence，2691281-1284，1995)、β-连环蛋白(J.Exp.Med.，1831185-1192，1996)和MUM-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，927976-7980，1995)属于该类肿瘤抗原蛋白。在CDK4和β-连环蛋白中，单个氨基酸突变增加了该肽与MHCⅠ类抗原的结合亲和力，这使其可以被T细胞识别。在MUM-1中，正常不被翻译的内含子因为突变而被翻译，所产生的肽被T细胞识别。然而因为这类突变发生的频率低，所以它们不能广泛用于各种肿瘤的治疗或诊断。属于第四类的肿瘤抗原蛋白广泛表达于正常组织而且也被CTL识别，其实例包括从黑素瘤细胞鉴定的P15(J.Immunol.1545944-5955，1995)。迄今已知的肿瘤抗原蛋白或肽已经以以下方式鉴定。首先提供一组肿瘤细胞和攻击该肿瘤细胞的CTL(通常由获得所述肿瘤细胞的同一患者的淋巴细胞建立)。然后，将该组细胞用来直接鉴定肿瘤抗原肽或确定编码肿瘤抗原蛋白的基因，从该编码基因鉴定相应的肿瘤抗原肽。在直接鉴定肿瘤抗原肽的方法中，在酸性条件下提取结合至肿瘤细胞中MVIHCⅠ类抗原的肿瘤抗原肽，并用高效液相层析分离成为各种肽。然后，通过用所产生的肽对表达MHCⅠ类抗原但是不表达肿瘤抗原蛋白(例如同一患者的B细胞)的细胞施以脉冲并检测与CTL的反应性，从而鉴定肿瘤抗原肽。由此鉴定的肽的序列然后通过例如质谱法检测。这样已经从黑素瘤细胞鉴定了与gp100相同的Pmel17分子衍生的肿瘤抗原肽(Science，264716-719，1994)。在首先获得肿瘤抗原蛋白编码基因、然后鉴定相应的肿瘤抗原肽的方法中，可以用分子生物学技术克隆所述基因。将MHCⅠ类抗原基因和从肿瘤细胞制备的cDNA共转染入不表达肿瘤抗原蛋白的细胞(例如COS细胞)以瞬时表达。然后根据其与CTL的反应性重复筛选表达产物以分离肿瘤抗原蛋白的编码基因。这样已经克隆了编码上述MAGE、酪氨酸酶、MART-1、gp100和gp75的基因。根据肿瘤抗原基因的信息，以下方法可以用来实际推断和鉴定结合至MHCⅠ类抗原(HLA抗原)并与其一起提呈的肿瘤抗原肽。各种大小的片段首先通过PCR、外切核酸酶或限制酶等从肿瘤抗原蛋白编码基因制备，并与MHCⅠ类抗原基因共转染入不表达肿瘤抗原蛋白的细胞(例如COS细胞)以瞬时表达。然后根据其与CTL的反应性鉴定包括肿瘤抗原肽的区域。随后，根据所鉴定的区域合成肽。然后用所合成的肽对表达MHCⅠ类抗原但是不表达肿瘤抗原蛋白的细胞施以脉冲，以便例如通过检测与CTL的反应鉴定肿瘤抗原肽(J.Exp.Med.，1761453，1992；J.Exp.Med.，17924，759，1994)。已知某些类型的MHC如HLA-A1、-A0201、-A0205、-A11、-A24、-A31、-A6801、-B7、-B8、-B2705、-B37、-Cw0401和-Cw0602结合并提呈的肽的序列规律(基元)(Immunogenetics，41178-228，1995)，由此，肿瘤抗原肽的候选物也可以通过参照这类基元设计、合成并用与上述相同的方法检测(Eur.J.Immunol.，24759，1994；J.Exp.Med.，180347，1994)。按照上述方法，迄今已经鉴定了各种肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽。然而，如上所述，一些已知的肿瘤抗原蛋白仅在有限的肿瘤中表达，而其它肿瘤抗原蛋白即使在各种肿瘤中有表达，但也仅在特定肿瘤患者中的少部分人中表达，因此它们不能广泛用于各种肿瘤的治疗或诊断。为此，本发明人已经建立了一种衍生自食管癌的鳞状细胞癌细胞系KE-4(此后称为食管癌细胞系KE-4或简称为KE-4)，而且还建立了识别由所述KE-4表达、HLA抗原如HLA-A2601、HLA-A2402等限制性的肿瘤抗原肽的CTL(此后称为KE-4CTL)(CancerRes.，554248-4253，1995)。用由KE-4制备的cDNA文库的重组质粒和含有HLA-A2601cDNA的重组质粒共转染成纤维细胞系VA-13。通过用KE-4CTL处理产生的转化体并检测所产生的IFN-γ量以确定KE-4-CTL是否已被活化，进行新的肿瘤抗原蛋白编码基因的筛选。从而，本发明人首次从非黑素瘤的肿瘤细胞成功克隆了编码新的肿瘤抗原蛋白的新基因。所克隆基因的核苷酸序列示于SEQIDNO2，而推断的氨基酸序列示于SEOIDNO1。随后，本发明人尝试鉴定上述肿瘤抗原蛋白的氨基酸序列中真正起肿瘤抗原肽作用的部分，并鉴定了HLA-A26、HLA-A24等限制性的不同肿瘤抗原肽部分。其中，具有示于SEQIDNO1氨基酸序列中的690-698位的氨基酸序列(SEQIDNO3)的肽被鉴定为HLA-A24限制性肿瘤抗原肽。之后，本发明人通过改变示于SEQIDNO3的HLA-A24限制性肿瘤抗原肽中的氨基酸残基从而制备了各种肽衍生物，并检测了其活性，表明所述衍生物也具有肿瘤抗原肽的活性。基于这些发现完成了本发明。因此，本发明的要点是提供肿瘤抗原肽衍生物，所述抗原肽衍生物包含其中示于SEQIDNO3的氨基酸序列中一个至数个氨基酸残基改变的氨基酸序列的全部或部分，所述衍生物能够结合于HLA-A24抗原并由此可被细胞毒性T细胞识别。附图简述图1图示电泳图谱，该图谱显示通过采用在重组质粒6DI中编码克隆自食管癌细胞系KE-4的肿瘤抗原蛋白的插入序列部分作为DNA探针进行RNA印迹杂交而获得的在各种细胞系(a)和各种组织(b)以及外周血白细胞中肿瘤抗原蛋白mRNA表达分布的分析结果，所述组织包括心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睾丸、子宫、小肠和结肠(粘膜衬里)。在图1中，a)KE-4、KE-3、TE-8和TE-9表示食管癌细胞系；Kuma-1表示头颈部癌细胞系；HSC-4表示口腔癌细胞系；Bec-1表示B细胞系；KMG-A表示胆囊癌细胞系；R-27表示乳腺癌细胞系；KIM-1、KYN-1和HAK-3表示肝癌细胞系；以及M36和M37表示黑素瘤细胞系。从图1可见，在克隆6DI中编码的肿瘤抗原蛋白mRNA广泛表达于各种癌细胞系和正常组织。图2图示显示具有示于SEQIDNO5、6和7的氨基酸序列的肽的体外IFN-γ诱导活性的条线图。准确地说，用上述肽衍生物刺激得自HLA-A24阳性健康个体的外周血淋巴细胞，并在表达所述肿瘤抗原的HLA-A24阳性KE-4细胞存在下检测所述已刺激的淋巴细胞产生的IFN-γ量。由图2可见，SEQIDNO5、6和7的每个肽衍生物均诱导CTL。因此，包含其中示于SEQIDNO3的肿瘤抗原肽氨基酸序列中的一个或一个以上氨基酸残基改变的衍生物的全部或部分并具有肿瘤抗原肽活性的所有肽即能够结合到HLA-A24抗原而因此被CTL识别的肽，均在本发明肿瘤抗原肽衍生物的范围内。在本发明中，“能够结合到HLA-A24抗原而因此被CTL识别”是指所述肿瘤抗原肽衍生物可以结合到HLA-A24形成复合物而且CTL可以识别这种复合物。在本发明中，氨基酸残基的“改变”是指氨基酸残基的置换、缺失和/或加入，而优选的实例为氨基酸残基的置换。以下描述主要涉及氨基酸残基的置换，但是相同的描述也适用于氨基酸残基的缺失或加入。可以鉴定本发明的肿瘤抗原肽衍生物，例如通过合成包含其中用其它氨基酸残基置换示于SEQIDNO3的氨基酸序列中的一个或一个以上、优选一个至数个氨基酸残基的氨基酸序列的全部或部分的候选肽，然后进行分析以确定CTL是否识别所述候选肽和HLA-A24抗原之间的复合物。尽管只要保有肿瘤抗原肽活性就可以随意确定待取代的氨基酸残基的数目和位置，但是最好是取代一个至数个残基，因为示于SEQIDNO3的肽片段由9个氨基酸残基组成。肽的合成用肽化学中通常使用的方法例如描述于以下文献中的方法，可以实现肽合成，所述文献为“肽合成”，Intersicence，NewYork，1966；“蛋白质”，第二卷，AcademicPressInc.，纽约，1976；“Pepuchido-Gosei”，Maruzen，1975；“Pepuchido-Gosei-no-Kiso-to-Jikkenn”，Maruzen，1985；和“Iyakuhin-no-Kamatu，Zoku，第14卷，Peputido-Gosei”，HirokawaShoten，1991。HLA-抗原限制性CTL的识别例如可以采用以下方法检测所合成的候选肽是否能够结合至HLA-A24抗原并由此被CTL识别，所述方法是(1)按照述于J.Immunol.，1542257(1995)的方法，从HLA-A24抗原阳性的人分离外周血淋巴细胞，并检测当加入候选肽体外刺激所述淋巴细胞时是否诱导特异性识别用所述候选肽施以脉冲的HLA-A24阳性细胞的CTL。可以检测CTL诱导的存在与否，例如采用酶联免疫吸附测定(ELISA)等检测CTL在应答抗原肽提呈细胞时产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量。或者，也可以使用其中检测CTL对51Cr标记的抗原肽提呈细胞的细胞毒性的方法(51Cr释放测定，Int.J.Cancer，58317，1994)。用于上述测定的HLA-A24阳性细胞是一般可获得的细胞如食管癌细胞系KE-4(FERMBP-5955)或SKG-Ⅲa细胞(JCRB0232)。(2)此外，也可以通过将HLA-A24cDNA表达质粒引入COS-7细胞(ATCC第CRL1651号)或VA-13细胞(RIKENCELLBANK，TheInstituteofPhysicalandChemicalResearch)，用上述候选肽对所获得的细胞施以脉冲，使其与HLA-A24限制性CTL细胞系KE-4CTL(保藏号FERMBP-5954)反应，然后检测KE-4CTL产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量(J.Exp.Med.，187277，1998)，从而进行所述检测。上述各种测定的范例表述于以下的参考实施例7和8以及实施例2中。另外，采用结合到所述衍生物与用放射性同位素标记的标准肽(SEQIDNO3)之间的HLA抗原的竞争性抑制测定(R.T.Kubo等，J.Immunol.，1523913，1994)，可以在无细胞体系中容易地检测肿瘤抗原肽衍生物与HLA-A24抗原的结合亲和力。只要本发明肿瘤抗原肽衍生物结合到HLA-A24抗原并由此被CTL识别，则其长度不特别限制。按照本发明的目的，本发明肿瘤抗原肽衍生物不仅包括在结合到HLA-A24抗原后由抗原提呈细胞表面上自身提呈的抗原肽衍生物，而且包括在靶细胞中适当片段化产生合适长度肽片段的抗原肽衍生物，所述片段含有其中SEQIDNO3氨基酸序列中的一个至数个氨基酸残基改变的氨基酸序列的全部或部分，并能够结合到HLA-A24抗原而由此被CTL识别。本身结合到HLA-A24抗原并因此提呈的肽片段最好是具有8-11个氨基酸的长度。因此，通过氨基酸取代可获得的肽衍生物的实例包括1)具有其中示于SEQIDNO3的氨基酸序列中的一个至数个氨基酸残基被其它氨基酸残基取代的氨基酸序列、由9个氨基酸组成的肽；或2)包括上述1)的完整肽的长度约10-11氨基酸的肽，或包括上述1)的肽的部分、由约8个氨基酸组成的肽，其中所述衍生物保留结合到HLA-A24抗原并由此被CTL识别的肿瘤抗原肽活性。通过合成各种其中SEQIDNO3氨基酸序列中任何位置的一个氨基酸或数个氨基酸改变的肽，并根据本发明说明书中所述对肿瘤抗原肽活性进行筛选，可以获得预定的肿瘤抗原肽衍生物。在结合并由HLA抗原提呈的抗原肽序列中具有一些规律(基元)。关于HLA-A24的基元，已知在8-11个氨基酸组成的所述肽序列中，N末端第二位的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而C末端氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸(Immunogenetics，41178-228，1995；J.Immunol.，1523913，1994；J.Immunol.，1554307，1994)。此外，用另一个相似性质的氨基酸取代与所述基元一致的氨基酸可获得的衍生物也可以潜在地认为是HLA-A24抗原结合肽。因此，本发明的肿瘤抗原肽衍生物的实例包括含有其中用其它氨基酸残基取代示于SEQIDNO3的氨基酸序列中第二位和/或第九位(C末端)的氨基酸残基的氨基酸序列的全部或部分并具有结合到HLA-A24抗原并由此被CTL识别的活性肽衍生物。因此，本发明提供包括其中用其它氨基酸残基取代示于SEQIDNO3的氨基酸序列中第二位和/或第九位的氨基酸残基的氨基酸序列的全部或部分、并能够结合到HLA-A24抗原而由此被CTL识别的肿瘤抗原肽衍生物。在优选的肽衍生物中，在示于SEQIDNO3的氨基酸序列中第二位和/或第九位的氨基酸残基被与上述基元一致的氨基酸残基取代。准确地说，优选的肿瘤抗原肽衍生物是这样的肽衍生物，它们包括其中示于SEQIDNO3的氨基酸序列中第二位的酪氨酸被苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸取代和/或第九位的苯丙氨酸被亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分并具有上述活性，其氨基酸序列示于SEQIDNO4。所以，在另一实施方案中，本发明提供包含示于SEQIDNO4的氨基酸序列的全部或部分并能够结合到HLA-A24抗原而由此被CTL识别的肿瘤抗原肽衍生物。而且，含有按照上述基元的氨基酸残基的取代的肿瘤抗原肽衍生物的优选实例是包括其中示于SEQIDNO3的氨基酸序列中的第九位的苯丙氨酸被色氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分的肿瘤抗原肽衍生物；包括其中示于SEQIDNO3的氨基酸序列中的第二位的酪氨酸被苯丙氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分的肿瘤抗原肽衍生物；和包含所述取代的组合的肿瘤抗原肽衍生物。因而，在优选的实施方案中，本发明提供包括其中示于SEQIDNO3的氨基酸序列中的第九位的苯丙氨酸被色氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分并能够结合到HLA-A24抗原而由此被CTL识别的肿瘤抗原肽衍生物。在再一优选的实施方案中，本发明提供包含其中示于SEQIDNO3的氨基酸序列中的第二位的酪氨酸被苯丙氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分、并能够结合到HLA-A24抗原而由此被CTL识别的肿瘤抗原肽衍生物。在又一优选的实施方案中，本发明提供包含其中示于SEQIDNO3的氨基酸序列中的第九位的苯丙氨酸被色氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代和在第二位的酪氨酸也被苯丙氨酸取代的氨基酸序列的全部或部分、并能够结合到HLA-A24抗原而由此被CTL识别的肿瘤抗原肽衍生物。特别优选的肿瘤抗原肽衍生物包含全部或部分示于SEQIDNO5的氨基酸序列。本发明的肿瘤抗原肽衍生物结合到于大部分人类对象(例如在约60％日本人中)发现的HLA抗原即HLA-A24并由此提呈。所以，预期本发明衍生物可用作新的抗肿瘤剂，因为它们一般可用于大多数肿瘤患者并且也可广泛用于高发病率的肿瘤如鳞状细胞癌。关于此，鳞状细胞癌是最常见的人类癌症之一，特别是食管癌和肺癌，已知它们对现有化疗或放疗相对抗性。如以下详述，本发明的肿瘤抗原肽衍生物可体内和体外用于各种目的，包括肿瘤的治疗、预防或诊断。所以，本发明还提供包含作为活性成分的至少一种上述本发明肿瘤抗原肽衍生物的用于肿瘤的治疗或预防剂。当使用目的是治疗或预防肿瘤时，给予患者至少一种本发明肿瘤抗原肽衍生物或其两种或多种的组合物，必要时，结合例如其它肿瘤抗原肽给予。当给予本发明的肿瘤治疗剂或预防剂的患者是HLA-A24阳性而且衍生本发明肿瘤抗原肽衍生物的肿瘤抗原蛋白也是阳性时，所述肽衍生物与抗原提呈细胞的HLA-A24抗原一起以高密度提呈，然后对提呈的HLA-A24抗原复合物特异性的CTL增殖并破坏肿瘤细胞。从而，可以治疗患者的肿瘤，或者阻止肿瘤增殖或转移。如上所述，衍生本发明肿瘤抗原肽衍生物的肿瘤抗原蛋白广泛表达于例如鳞状细胞癌如食管癌、肺癌等。所以，本发明的肿瘤治疗或预防剂具有用途广泛的优点。此外，尽管上述鳞状细胞癌常常表现出化疗和放疗抗性，但是本发明的肿瘤治疗剂的组合应用使其可以达到需要的治疗效应。另外，不需要使所述癌症发生的部位特化就可以给予治疗也是一个突出的优势。含有本发明肿瘤抗原肽衍生物的肿瘤治疗剂或预防剂可以与佐剂一起给予以有效建立细胞免疫，或者可以以颗粒剂型给予。为此，可使用文献中(Clin.Microbiol.Rev.，7277-289，1994)描述的佐剂。另外，也可以使用使得外源性抗原肽衍生物可以有效地在HLA抗原上提呈的剂型，例如脂质体制剂、其中所述衍生物结合到直径为数个μm的珠粒的颗粒剂或其中所述衍生物结合到脂质的制剂。可以例如皮内、皮下、静脉内注射等给药。尽管所给予的本发明肿瘤抗原肽衍生物的剂量可以根据例如所治疗的疾病、特定患者的年龄和体重调适，但是通常每几天到几月为0.0001mg-1000mg所述衍生物，优选0.001mg-1000mg，更优选O.1mg-10mg。此外，本发明肿瘤抗原肽衍生物可用于体外诱导抗原提呈细胞而所述细胞可用于例如治疗肿瘤。因此，本发明提供包含HLA-A24抗原和本发明肿瘤抗原肽衍生物之间的复合物的抗原提呈细胞，所述复合物存在于具有抗原提呈能力并得自于肿瘤患者的分离的细胞表面。本发明还提供包含作为活性成分的上述抗原提呈细胞的肿瘤治疗剂。尽管“具有抗原提呈能力的细胞”没有特异性限定于任何细胞，只要它在其表面表达能够提呈本发明肿瘤抗原肽衍生物的HLA-A24抗原，但是优选据报道抗原提呈能力特别高的树突细胞。为了制备这类抗原提呈细胞，从肿瘤患者分离具有抗原提呈能力的细胞，并用本发明肿瘤抗原肽衍生物离体施以脉冲，以形成HLA-A24抗原和所述肽衍生物之间的复合物(CancerImmunol.Immunother.，4682，1998)。含有作为活性成分的上述抗原提呈细胞的肿瘤治疗剂优选包含生理盐水、磷酸缓冲盐水(PBS)、培养基等，以便稳定地保持所述抗原提呈细胞。可以例如静脉内、皮下或皮内给药。通过将上述肿瘤治疗剂回输到所述患者体内，在HLA-A24阳性并且衍生本发明肿瘤抗原肽衍生物的肿瘤抗原蛋白也是阳性的患者中有效诱导特异性CTL。因此可以治疗所述肿瘤，而且还可以防止肿瘤转移。另外，本发明肿瘤抗原肽衍生物的另一个体外应用实例可能属于以下的过继性免疫治疗。在黑素瘤的情况下，已经观察到，其中取自所述患者自身的肿瘤内T细胞浸润物在体外大量培养，然后回输到所述患者的过继性免疫治疗达到了治疗增益(J.Natl.Cancer.Inst.，861159，1994)。此外，在小鼠黑素瘤中，通过用肿瘤抗原肽TRP-2体外刺激脾细胞，由此使所述肿瘤抗原肽特异性CTL增殖，然后将所述CTL给予携带移植的黑素瘤的小鼠体内，观察到对转移的抑制(J.Exp.Med.，185453，1997)。这是因为特异性识别抗原提呈细胞的HLA抗原和所述肿瘤抗原肽之间的复合物的CTL体外增殖的结果。据认为，包括用本发明肿瘤抗原肽衍生物体外刺激得自患者的外周血淋巴细胞以使肿瘤特异性CTL增殖，并将所述CTL回输到所述患者的治疗肿瘤的方法是有用的。因此，本发明还提供特异性识别HLA-A24抗原和上述肿瘤抗原肽衍生物之间的复合物的细胞毒性T细胞。此外，本发明提供包含作为活性成分的上述细胞毒性T细胞的肿瘤治疗剂。最好是所述治疗剂包含生理盐水、磷酸缓冲盐水(PBS)、培养基等，以便稳定地保持CTL。可以例如静脉内、皮下或皮内给予。通过将上述治疗剂回输到所述患者体内，在HLA-A24阳性并且衍生本发明肿瘤抗原肽衍生物的肿瘤抗原蛋白也是阳性的患者中增强CTL对肿瘤细胞的毒性效应。肿瘤细胞的破坏使得可以治疗肿瘤和防止转移。为了在肿瘤诊断中应用本发明肿瘤抗原肽衍生物，例如以常规方法制备抗所述肿瘤抗原肽衍生物的抗体，必要时进行适当标记。该抗体用来检测取自怀疑患有肿瘤的患者的样品(例如血液、肿瘤组织等)中抗原的存在，由此诊断是否存在肿瘤。本发明肿瘤抗原肽衍生物本身也可以用作检测在上述样品如血液或肿瘤组织中抗体存在的诊断试剂，以便诊断是否存在肿瘤。本发明还提供采用上述肿瘤抗原肽衍生物、提呈所述肿瘤抗原肽衍生物的抗原提呈细胞、特异性识别所述肿瘤抗原肽衍生物和HLA-A24抗原之间复合物的细胞毒性T细胞来治疗、预防或诊断肿瘤的方法。此外，本发明肿瘤抗原肽衍生物也可以用作研究试剂。提供以下实施例以进一步说明本发明，但不能解释为限制其范围。参考实施例肿瘤抗原蛋白cDNA的克隆以及HLA-A2限制性肿瘤抗原肽的鉴定(1)建立抗食管癌细胞系的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系按照Nakao等(CancerRes.，554248-4252(1995))公开的方法，从一个患者的外周血单核细胞建立抗组织类型分类属于鳞状细胞癌的食管癌细胞系KE-4的CTL，命名为KE-4CTL，并用于实验。食管癌细胞系KE-4和KE-4CTL分别以国际保藏号FERMBP-5955和FERMBP-5954已于1997年5月23日保藏于国立生命科学和人体技术研究所(TheNationalInstituteofBioscienceandHumanTechnology，1-1-3Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。此外，按照Nakao等的上述公开的方法对KE-4的HLAⅠ分子进行分类，证实它们是HLA-A2402、-A2601、B54、-B60、-Cw1和-Cw3。(2)HLA-A2601cDNA和HLA-A2402cDNA的制备采用KE-4按照Nakao等(CancerRes.，554248-4252(1995))公开的方法，将HLA-A2601cDNA导入表达载体pCR3(INVTROGEN)从而制备重组质粒。此外以同样方式制备另一个HLA-A2402的重组质粒。(3)衍生自KE-4的cDNA文库的制备通过分离总RNA部分并按照生产商的方案用mRNA纯化系统(PharmaciaBiotech生产)在寡聚(dT)柱上进行纯化，由KE-4制备Poly(A)+mRNA。采用SuperScriptTM质粒系统(GibcoBRL)按照生产商的方案，由mRNA制备具有连接到每个末端的NotⅠ接头和ScaⅠ接头的cDNA，然后将其连接至用限制酶NotⅠ和SalⅠ消化的表达载体即质粒pSV-SPORT1(GibcoBRL)，以产生重组质粒。在25μF和2.5kV的条件下，采用基因脉冲仪(Bio-Rad)电脉冲将所述重组质粒导入大肠杆菌ElectroMAXDH10B／p3TM细胞(GibcoBRL)中。在含氨苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基(1％细菌用胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl，pH7.3)上选择所述重组质粒已经导入的转化体。(4)肿瘤抗原蛋白基因的筛选从述于上述(3)中的约100个转化体的库中如下回收重组质粒DNA。将100个转化体加入并在含有LB培养基加氨苄青霉素(50μg/ml)的96孔U型底微量培养板的每个孔中培养。然后将部分培养物转移到另一个每孔含有0.25mlTYGPN培养基的96孔U型底微量培养板中(F.M.Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，Inc.)，于37℃培养48小时。将所述微量培养板LB培养基中的余下培养物冷冻保藏。在所述微量培养板中用碱裂解法实现从培养于TYGPN培养基中的转化体制备重组质粒DNA(FM.Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，Inc.)。将经异丙醇沉淀回收的重组质粒DNA悬浮于含有20ng／mlRNA酶的50μl的10mMTris，1mMEDTA，pH7.4中。采用如下的脂质转染法，用KE-4cDNA的重组质粒和HLA-A2601cDNA的重组质粒双重转染成纤维细胞系VA-13细胞(RIKENCELLBANK，TheInstituteofPhysicalandChemicalResearch；Ann.Med.Exp.Biol.Fenn.，44242-254，1966)。将7000个VA-13细胞置入96孔平底微量培养板的每个孔中，并在含有10％FCS的100μlRPMI1640培养基中培养2天。采用脂质转染试剂(GibcoBRL)，从70μl混合物中取30μl加入到待双重转染的VA-13细胞中，所述混合物组成为25μl对应于约100个转化体的KE-4cDNA重组质粒、10μl(200ng)参考实施例(2)中所述HLA-A2601cDNA重组质粒和35μl约35倍稀释的脂质转染试剂。复份制备转染体。5小时后，将200μl含有10％FCS的培养基加入到所述转染体中，再于37℃培养72小时。去除所述培养基后，每孔加入10，000个KE-4CTL细胞，在100μl含有10％FCS和25U／mlIL-2的培养基中于37℃培养24小时。回收所述培养基，用ELISA检测K3-4CTL产生于所述培养物上清液中的IFN-γ量。准确地说，使抗人IFN-γ小鼠单克隆抗体作为固相抗体吸附于96孔微量培养板的每个孔上，用牛血清白蛋白阻断非特异性结合后，使其与上述培养物上清液中的IFN-γ结合。然后结合作为检测抗体的抗人IFN-γ兔多克隆抗体，在与碱性磷酸酶标记的抗兔免疫球蛋白羊抗体结合后，与作为显色底物的对硝基苯磷酸反应。在加入等体积1NNaOH猝灭该反应后，于405nm检测吸光度。该吸光度与用标准IFN-γ获得的吸光度比较，以确定所述上清液中的IFN-γ量。关于其中观察到高产量IFN-γ的四个组，将相应的约100个含有KE-4cDNA重组质粒的转化体的冷冻保藏库用于以下筛选。将所述转化体库平板接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂培养基上以获得菌落。如上所述，培养每组的200个菌落(总共800个菌落)使得每个孔中包含单一种类的转化体，由此制备KE-4cDNA的重组质粒DNA。然后，用KE-4cDNA的重组质粒和HLA-A2601cDNA的重组质粒双重转染VA-13细胞，然后与KE-4CTL共培养，如上所述定量检测因KE-4CTL反应产生的IFN-γ，以便选择阳性质粒。这样，选择了单个KE-4cDNA重组质粒克隆并命名为6DI。此外，用6DI重复相似的方法以按照上述相同方法检测KE-4CTL产生的IFN-γ量。结果示于以下表1。表1<tablesid="table1"num="001"><table>靶细胞KE-4CTL产生的IFN-γ量(pg/ml)VA-13细胞VA-13细胞+HLA-A2601VA-13细胞+6DIVA-13细胞+HLA-A2601+6DIVA-13细胞+HLA-A02011)VA-13细胞+HLA-A0201+6DI1)01.84.324.00.93.0</table></tables>1)为了比较，转染不同类型的HLA。(这些数据是通过转染以下DNA量获得的200ngHLA-A2601或HLA-A0201，100ng6DI)(5)用RNA杂交进行肿瘤抗原蛋白基因的表达分析采用RNAzolB(TEL-TEST，Inc.)从各种细胞系制备RNA。使5μgRNA在甲酰胺和甲醛存在下变性，在琼脂糖上电泳，然后转移并固定在Hybond-N+尼龙膜上(Amersham)。与正常组织RNA一样，使用其上已经预印迹mRNA的市售膜(Clontech)。采用MultiprimeDNA标记系统(Amersham)，用32P标记在参考实施例(4)中克隆的重组质粒6DI的插入序列区以制备DNA探针。按照已知的方法(Nakayama等，Bio-Jikken-Illustrated，第二卷，“Idenshi-Kaiseki-No-Kiso(ABasisforGeneAnalysis)”，第148-151页，Shujunsha，1995)，使该探针杂交到膜上的RNA，并进行放射性自显影以检测本发明肿瘤抗原蛋白基因的mRNA。用于检测所述基因mRNA的膜在0.5％十二烷基硫酸钠水溶液中煮沸以去除所述探针，用在细胞组成型表达的β-肌动蛋白作探针以相似的方式进行RNA杂交，以便检测用作内标的mRNA。结果示于图1。从这些结果明显看出，本发明肿瘤抗原蛋白基因的mRNA广泛表达于各种肿瘤细胞和正常组织中，其全长约2.5kb(图1)。(6)编码肿瘤抗原蛋白的全长cDNA克隆的克隆和碱基测序分析将上述参考实施例(3)中所述的KE-4衍生的cDNA文库平板接种于含有氨苄青霉素(50μg／ml)的LB琼脂培养基上，然后按照生产商的方案将由此获得的菌落转移并固定于Hybond-N+尼龙膜(Amersham)上。与用于参考实施例(5)相同的6DI探针用来在与参考实施例(5)使用的相同条件下进行杂交和放射性自显影，以便选择含有掺入肿瘤抗原蛋白基因cDNA的重组质粒的菌落。而且，从选定菌落回收重组质粒，用限制酶NotⅠ和SalⅠ处理，然后在琼脂糖上电泳以确定掺入cDNA的长度。选择掺入约2.5kbcDNA的重组质粒并命名为K3。用DyeDeoxy终止子循环测序试剂盒(Perkin-Elmer)检测在质粒K3中的所述cDNA区的碱基序列。由此确定的碱基序列示于SEQIDNO2。该cDNA全长为2527个碱基对。由SEQIDNO2碱基序列碥码的氨基酸序列(800个氨基酸)示于SEQIDNO1。分析表明，示于SEQIDNO2的碱基序列与衍生自黑素瘤的已知肿瘤抗原蛋白基因不具有同源序列，从而证实它是不同的基因。采用WWWEntrez数据库对SEQIDNO2的碱基序列进行检索表明，所述碱基序列的部分对三个基因序列显示高于90％的高度同源性，所述三个基因序列的功能不清楚，由WashU-MerckESTProjet解码并且以登记号第R89163、R62890和R00027号注册于GENBANK。R89163、R62890和R00027分别对应于SEQIDNO2的1893-2267、2081-2389和2024-2510位的序列。然而，这三个序列是位于示于SEQIDNO2碱基序列起始密码子3’的序列，因此不能确定其相应的氨基酸序列。在如上所述确定碱基序列后，将质粒K3导入大肠杆菌JM109中获得大肠杆菌JM109(K3)，该大肠杆菌是含有新的肿瘤抗原蛋白cDNA的贮藏用转化体。已于1997年5月22日将大肠杆菌JM109(K3)以国际保藏号FERMBP-5951保藏于国立生命科学和人体技术研究所(TheNationalInstituteofBioscienceandHumanTechnology，1-1-3Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)。此外，以上述相同方式还筛选了得自正常人组织(外周血淋巴细胞)的cDNA文库(GIBCOBRL，Inc.)。所述筛选导致已经掺入约2.5kb的cDNA的重组质粒的克隆。当测定所述碱基序列时，由此克隆的所述cDNA除了812位的碱基(正常人组织的812位为T)外，与示于SEQIDNO2的碱基序列相同。表明，在包括示于SEQIDNO2的肿瘤抗原蛋白编码基因的全长基因方面，在癌细胞和正常人组织中表达几乎相同的基因。然后，VA-13细胞用含有新的肿瘤抗原蛋白基因cDNA的重组质粒和另一个含有HLA-A2601cDNA的重组质粒双重转染，并用作上述(4)中的靶细胞。按照上述(4)中所述的方法，检测由KE-4CTL反应产生的IFN-γ量。结果示于以下的表2。表2<tablesid="table2"num="002"><table>靶细胞KE-4CTL产生的IFN-γ量1)(pg/ml)VA-13细胞+HLA-A2601+K3VA-13细胞+HLA-A02012)+K3143910</table></tables>1)减去KE-4CTL应答每种HLA转染的VA-13细胞而产生的IFN-γ量(本底)后获得的数值。2)为了比较，转染不同类型的HLA。(这些数据是通过转染以下DNA量获得的200ngHLA-A2601或HLA-A0201，100ngK3)基于以上结果，证实所获得的cDNA编码肿瘤抗原蛋白。(7)肿瘤抗原肽的鉴定从在上述(4)中克隆、已经掺入新的肿瘤抗原蛋白基因的部分cDNA的重组质粒6DI获得含有不同长度的部分cDNA的质粒，该质粒采用Kilo-Sequence的缺失试剂盒(TakaraShuzoCo.)按照生产商的方案通过缺失制得。将这些质粒导入大肠杆菌ElectroMaxDH10B／p3TM细胞(GibcoBRL)。将所述细胞平板接种于琼脂培养基上，并随机选择50个菌落。从所述菌落制备质粒DNA，进行电泳，并选择含有具有合适长度的质粒的5个菌落。按照上述(4)中所述方法，VA-13细胞用HLA-A2601cDNA和上述的质粒DNA双重转染，与KE-4CTL共培养，并按照(4)中所述方法定量检测所述培养液中的IFN-γ。结果发现，具有缺乏SEQIDNO2的2253位以后的碱基序列的质粒的转染体，对KE4CTL没有IFN-γ诱导活性。因此，这提示SEQIDNO1氨基酸序列约739位以后的序列的肽对KE-4CTL可能具有IFN-γ诱导活性。所以，合成了一系列每个由SEQIDNO1730位以后的氨基酸序列中的10个连续氨基酸残基组成的21个不同的肽，从而使得它们每个具有连续位移三个氨基酸残基的氨基酸序列。采用这些肽，如上所述检测培养液中的IFN-γ，不同的是通过用所述肽对HLA-A2601cDNA转染的VA-13细胞施以脉冲达到抗原提呈。结果在具有SEQIDNO1的736位至745位(736-745)、748位至757位(748-757)和784位至793位(784-793)的氨基酸序列的肽中观察到IFN-γ诱导活性。对于这三种肽中的每一种，通过截去N-或C-末端残基合成9个氨基酸残基组成的另外的肽，并用于以相似方式检测IFN-γ诱导活性。在具有SEQIDNO1的736位至744位(736-744)、749位至757位(749-757)和785位至793位(785-793)的氨基酸序列的肽，观察到较强的IFN-γ诱导活性。结果示于表3。表31)用HLA-A2601cDNA转染的VA-13细胞2)用不同HLA-A0201cDNA转染的VA-13细胞作对照表3中的结果表明，这些肽以HLLA-A24限制性肿瘤抗原肽起作用。然后如下鉴定HLA-A24限制性肿瘤抗原肽。在由HLA抗原结合并提呈的抗原肽序列中具有一些规律(基元)。关于HLA-A24的基元，已知在8-11个氨基酸组成的肽序列中，N末端第二位的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而C末端氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸(Immunogenetics，41178-228，1995；J.Immunol.，1523931，1994；J.Immunol.，1554307，1994)。因此，又合成了另一种由对应于上述基元的SEQIDNO1的690位至698位(690-698；SEQIDNO3)的区段组成的肽。然后用所述肽对用HLA-A2402cDNA转染的VA-13细胞施以脉冲，并如上所述检测对KE-4CTL的IFN-γ诱导活性。结果示于表4。表41)用HLA-A2402cDNA转染的VA-13细胞2)用不同HLA-A0201cDNA转染的VA-13细胞作对照表4中的结果提示，肽“690-698(SEQIDNO3)”以肿瘤抗原肽起作用。(8)用肿瘤抗原肽从外周血淋巴细胞诱导CTL本发明人已经研究了，通过用上述(7)中所述肿瘤抗原肽体外刺激是否可以由获得KE-4的癌症患者的外周血淋巴细胞诱导抗原特异性CTL。所用的肿瘤抗原肽是上述在参考实施例(7)中获得的具有序列“736-744”、“749-757”和“690-698”的肿瘤抗原肽。使采用Ficoll法从上述癌症患者分离的冷冻外周血淋巴细胞复苏，以约2x106细胞/孔转移到24孔培养板，在含有10％FCS和IL-2(100U/ml)的RPMI1640培养基中培养。为了刺激外周血淋巴细胞，以10μg/ml将上述肿瘤抗原肽加入到所述培养基中。一周后，将10μg/ml上述肿瘤抗原肽与约1x105细胞的X线照射(50Gy)的外周血淋巴细胞一起加入以进行第二次刺激。再一周后，以相似方式进行第三次刺激。至于具有“736-744”和“749-757”序列的肽，在第三次刺激后一周回收外周血淋巴细胞，并采用51C标记的KE-4和另一种其HLA-A基因座为A2402和A2的食管癌细胞系KE-3作为靶细胞，按照D.D.Kharkevitch等(Int.J.Cancer，58317(1994))所述方法检测其细胞毒性活性(特异性裂解)。结果示于表5。表5当用具有“736-744”序列的肽刺激时，KE-4严重受损，而阴性对照KE-3未受损害。因而证实诱导了KE-4特异性的CTL。同样，当用具有“749-757”序列的肽刺激时，尽管也观察到对KE-3的非特异性细胞毒性活性，但是观察到对KE-4的较强细胞毒性活性，表明诱导了KE-4特异性的CTL。对于具有“690-698(SEQIDNO3)”序列的肽，在第三次刺激后回收外周血淋巴细胞，进一步在含有10％FCS、50％AIM-V(GibcoBRL)和IL-2(100U/ml)的RPMI-1640培养基中培养。然后，如上所述采用51C标记的KE-4和VA-13细胞作靶细胞检测细胞毒性活性。另外，从HLA-A基因座为纯合型A24的正常个体的外周血分离淋巴细胞，如上所述采用51C标记的KE-4和HLA-A基因座为纯合型A2601的肺癌细胞系QG-56作为靶细胞，以相似的方式检测其细胞毒性活性(特异性裂解)。结果示于表6。表6当用具有“690-698(SEQIDNO3)”序列的肽刺激癌症患者和正常个体的外周血淋巴细胞时，尽管也观察到对阴性对照VA-13和OG-56细胞的非特异性细胞毒性活性，但是观察到对KE-4的较强的细胞毒性活性。上述结果表明诱导了KE-4特异性的CTL。实施例1合成肿瘤抗原肽衍生物如上所述，在由HLA抗原结合并提呈的抗原肽序列中具有一些规律(基元)。关于HLA-A24的基元，已知在8-11个氨基酸组成的肽序列中，N末端第二位的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而C末端氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸(Immunogenetics，41178-228，1995；J.Immunol.，1523913，1994；J.Immunol.，1554307，1994)。关于在上述参考实施例(7)和(8)中鉴定为HLA-A24限制性肿瘤抗原肽的肽“690-698(SEQIDNO3)”，含有按照上述基元的氨基酸取代的肽衍生物的氨基酸序列示于SEQIDNO4。制备各种其中示于SEQIDNO3的氨基酸序列组成的HLA-A24限制性肿瘤抗原肽的第二个和/第九个氨基酸残基根据上述规则改变的这类肿瘤抗原肽衍生物。以下为几个具体实例a)Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp，b)Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Leu，c)Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Ile，d)Glu-Phe-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Phe，e)Glu-Phe-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp。采用AdvancedChemtechMPS350，通过Fmoc方法合成这些肽，然后采用YMC-PackODS-ASH-363-5柱经HPLC进行纯化。所纯化的产物的纯度均为95％或者高于95％。下面根据以下典型肽更详细地描述合成肽衍生物的方法(1)Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Ile(SEQIDNO5)；(2)Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Leu(SEQIDNO6)；和(3)Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp(SEQIDNO7)；(1)Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Ile(SEQIDNO5)的合成使用Fmoc-Ile-Alko树脂(0.62mmol/g，100-200目)作树脂。采用100mg该树脂，按照下表7中所述流程1开始合成，以便依次偶联以下残基Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Gln-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pmc)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH。完成偶联后，将该方法进行到流程1的步骤3以获得所述肽树脂。于该肽树脂中加入2ml试剂K(5％苯酚、5％苯硫基甲烷、5％H2O和2.5％乙二硫醇的TFA)，并让其在室温下反应2.5小时。用冰冷却于该树脂中加入10ml乙醚，搅拌该混合物10分钟，过滤，然后用10ml乙醚洗涤。向所述滤饼中加入10ml乙酸水溶液，搅拌该混合物30分钟。过滤除去树脂，并用4ml乙酸水溶液洗涤。在冻干过滤液并洗涤后，将生成的粗品肽溶解于乙酸水溶液中，上样于用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填充材料YMC-PackODS-ASH-363-5柱(30φx250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，在200分钟内以7ml/min流速在增加乙腈浓度高至24％的同时进行洗脱。以220nm的吸光度A监测洗出液。将含有所需产物的流分合并在一起，并冻干获得47.8mg的Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Ile。所获得的肽Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Ile当通过用含有0.1％TFA的0-60％线性梯度的乙腈洗脱的反相填充材料YMC-PACKODS-AMAM-303柱(4.6φx250mm)分析时，其保留时间为19.3分钟。所述肽的氨基酸分析和质谱与理论值一致。氨基酸分析水解1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃，24小时；分析方法茚三酮法；*参比氨基酸；理论值标示于括号内。Asx0.94(1)Thr0.91(1)Glx1.94(2)Gly0.99(1)*Ile1.00(1)Tyr0.93(1)Phe0.98(1)Arg0.95(1)质谱(FAB)[M+H]+1128表7*处理时间(min)x处理次数(2)Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Leu(SEQIDNO6)的合成以上述(1)小节的相同方式，采用100mgFmoc-Leu-Alko树脂(0.54mmol/g，100-200目)，依次偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Gln-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg-(Pmc)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH，然后将产物去保护。将生成的粗品肽溶解于乙酸水溶液中，上样于用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填充材料YMC-PackODS-ASH-363-5柱(30φx250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，在200分钟内以7ml/min流速在增加乙腈浓度高至25％的同时进行洗脱。以220nm的吸光度A监测洗出液。将含有所需产物的流分合并，并冻干获得52.5mg的Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Leu。所获得的肽Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Leu当通过用含有0.1％TFA的0-60％线性梯度的乙腈洗脱的反相填充材料YMC-PACKODS-AMAM-303柱(4.6φx250mm)分析时，其保留时间为19.6分钟。所述肽的氨基酸分析和质谱与理论值一致。氨基酸分析水解1％苯酚/6N盐酸水溶液，110℃，24小时；分析方法茚三酮法；*参比氨基酸；理论值标示于括号内。Asx0.97(1)Thr0.94(1)Glx1.98(2)Glv1.02(1)*Leu1.00(1)Tyr0.94(1)Phe1.00(1)Arg0.97(1)质谱(FAB)[M+H]+1128(3)Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp(SEQIDNO7)的合成以上述(1)小节的相同方式，采用100mgFmoc-Trp(Boc)-Alko树脂(0.65mmol/g，100-200目)，依次偶联Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH，然后将产物去保护。将生成的粗品肽溶解于乙酸水溶液中，上样于用0.1％TFA水溶液预平衡的反相填充材料YMC-PackODS-ASH-363-5柱(30φx250mm)。用0.1％TFA水溶液洗涤该柱，在200分钟内以7ml/min流速在增加乙腈浓度高至26％的同时进行洗脱。以220nm的吸光度A监测洗出液。将含有所需产物的流分合并，并冻干获得14.0mg的Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp。所获得的肽Glu-Tyr-Arg-Gly-Phe-Thr-Gln-Asp-Trp当通过用含有0.1％TFA的0-60％线性梯度的乙腈洗脱的反相填充材料YMC-PACKODS-AMAM-303柱(4.6φx250mm)分析时，其保留时间为20.7分钟。所述肽的氨基酸分析(Trp不能保护)和质谱与理论值一致。氨基酸分析水解1％苯酚/6N盐酸水溶液，11O℃，24小时；分析方法茚三酮法；*参比氨基酸；理论值标示于括号内。Asx0.67(1)Thr0.96(1)Glx2.00(2)Gly1.02(1)Tyr0.96(1)*Phe1.00(1)Arg1.01(1)质谱(FAB)[M+H]+1202实施例2肿瘤抗原肽衍生物的活性检测在实施例1中制备的肽可以按照参考实施例(7)中所述检查其诱导IFN-γ活性或者按照参考实施例(8)中所述检查其诱导CTL的能力，以便证实这些肽具有肿瘤抗原肽的功能。以下表述一个实例。以参考实施例(8)相同方式，采用上述实施例1中合成的三种肿瘤抗原肽衍生物(SEQDNO5-7)，对从HLA-A24阳性健康人获得的外周血淋巴细胞进行体外肽刺激，以检测这些肽是否能够诱导CTL。在用所述肽第三次刺激后一周回收所述外周血淋巴细胞，并用表达所述肿瘤抗原的HLA-A24阳性KE-4细胞作为靶细胞，检测所述外周血淋巴细胞在应答所述刺激中产生的IFN-γ量。另外，以相似的方式，采用HLA-A24阴性VA-13细胞作为靶细胞，检测所述外周血淋巴细胞在应答所述刺激中产生的IFN-γ量并用作本底值。通过由对KE-4细胞产生的IFN-γ量减去对VA-13细胞产生的IFN-γ本底量，计算抗原特异性的CTL活性。结果示于图2。证实示于SEQIDNO5、6和7的每种肽衍生物均诱导CTL。尤其是示于SEQIDNO5的肿瘤抗原肽衍生物表现出诱导IFN-γ产生的强活性。另一方面，采用市售SKG-Ⅲa细胞(JCRB0232)取代KE-4细胞作为肿瘤抗原阳性和HLA-A24阳性靶细胞，也可以进行与上述相同的活性检测。工业适用性本发明提供的新的肿瘤抗原肽衍生物可用于范围广泛的肿瘤的预防、治疗或诊断。序列表的独立文本在示于SEQIDNO4的氨基酸序列中，第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸或色氨酸，而第九个氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或蛋氨酸。序列表&#60110&#62ITOH，Kyogo&#60120&#62肿瘤抗原肽衍生物70&#60130&#62661092&#60160&#627&#60210&#621&#60211&#62800&#60212&#62蛋白质&#60213&#62Homosapiens&#60400&#621MetGlySerSerLysLysHisArgGlyGluLysGluAlsAlaGlyThr51015ThrAlaAlaAlaGlyThrGlyGlyAlaThrGluGlnProProArgHis202530ArgGluHisLysLysHisLysHisArgSerGlyGlySerGlyGlySer354045GlyGlyGluArgArgLysArgSerArgGluArgGlyGlyGluArgGly505560SerGlyArgArgGlyAlaGluAlaGluAlaArgSerSerThrHisGly65707580ArgGluArgSerGlnAlaGluProSerGluArgArgValLysArgGlu859095100105110GlyAspAlaSerSerLeuSerIleGluGluThrAsnLysLeuArgAla115120125LysLeuGlyLeuLysProLeuGluValAsnAlaIleLysLysGluAla130135140GlyThrLysGluGluProValThrAlaAspValIleAsnProMetAla145150155160LeuArgGlnArgGluGluLeuArgGluLysLeuAlaAlaAlaLysGlu165170175LysArgLeuLeuAshGlnLysLeuGlyLysIleLysThrLeuGlyGlu180185190AspAspProTrpLeuAspAspThrAlaAlaTrpIleGluArgSerArg195200205GlnLeuGlnLysGluLysAspLeuAlaGluLysArgAlaLysLeuLeu210215220GluGluMetAspGlnGluPheGlyValSerThrLeuValGluGluGlu225230235240PheGlyGlnArgArgGlnAspLeuTyrSerAlaArgAspLeuGlnGly245250255LeuThrValGluHisAlaIleAspSerPheArgGluGlyGluThrMet260265270IleLeuThrLeuLysAspLysGlyValLeuGlnGluGluGluAspVal275280285LeuValAsnValAsnLeuValAspLysGluArgAlaGluLysAsnVal290295300GluLeuArgLysLysLysProAspTyrLeuProTyrAlaGluAspGlu305310315320SerValAspAspLeuAlaGlnGlnLysProArgSerlleLeuSerLys325330335TyrAspGluGluLeuGluGlyGluArgProHisSerPheArgLeuGlu340345350GlnGlyGlyThrAlaAspGlyLeuArgGluArgGluLeuGluGluIle355360365ArgAlaLysLeuArgLeuGlnAlaGlnSerLeuSerThrValGlyPro370375380ArgLeuAlaSarGluTyrLeuThrProGluGluMetValThrPheLys385390395400LysThrLysArgArgValLysLysIleArgLysLysGluLysGluVal405410415ValValArgAlaAspAspLeuLeuProLeuGlyAspGlnThrGlnAsp420425430GlyAspPheGlySerArgLeuArgGlyArgGlyArgArgArgValSer435440445GluValGluGluGluLysGluProValProGlnProLeuProSerAsp450455460AspThrArgValGluAsnMetAspIleSerAspGluGluGluGlyGly465470475480AlaProProProGlySerProGlnValLeuGluGluAspGluAlaGlu485490495LeuGluLeuGlnLysGlnLeuGluLysGlyArgArgLeuArgGlnLeu500505510GlnGlnLeuGlnGlnLeuArgAspSerGlyGluLysValValGluIle515520525ValLysLysLeuGluSerArgGlnArgGlyTrpGluGluAspGluAsp530535540ProGluArgLysGlyAlaIleValPheAsnAlaThrSerGluPheCys545550555560ArgThrLeuGlyGluIleProThrTyrGlyLeuAlaGlyAsnArgGlu565570575GluGlnGluGluLeuMetAspPheGluArgAspGluGluArgSerAla580585590AsnGlyGlySerGluSerAspGlyGluGluAsnIleGlyTrpSerThr595600605ValAsnLeuAspGluGluLysGlnGlnGlnAspPheSerAlaSerSer610615620ThrThrIleLeuAspGluGluProIleValAsnArgGlyLeuAlaAla625630635640AlaLeuLeuLeuCysGlnAsnLysGlyLeuLeuGluThrThrValGln645650655LysValAlaArgValLysAlaProAsnLysSerLeuProSerAlaVal660665670TyrCysIleGluAspLysMetAlaIleAspAspLysTyrSerArgArg675680685GluGluTyrArgGlyPheThrGlnAspPheLysGluLysAspGlyTyr690695700LysProAspValLysIleGluTyrValAspGluThrGlyArgLysLeu705710715720ThrProLysGluAlaPheArgGlnLeuSerHisArgPheHisGlyLys725730735GlySerGlyLysMetLysThrGluArgArgMetLysLysLeuAspGlu740745750GluAlaLeuLeuLysLysMetSerSerSerAspThrProLeuGlyThr755760765ValAlaLeuLeuGlnGluLysGlnLysAlaGlnLysThrProTyrIle770775780ValLeuSerGlySerGlyLysSerMetAsnAlaAsnThrIleThrLys785790795800&#60210&#622&#60211&#622527&#60212&#62DNA&#60213&#62Homosapiens&#60220&#62&#60221&#625’UTR&#60222&#62(1)…(38)&#60220&#62&#60221&#62CDS&#60222&#62(39)…(2438)&#60220&#62&#60221&#623’UTR&#60222&#62(2439)…(2506)&#60400&#622ggttcggcggcagccgggctcggagtggacgtgccactatggggtcgtccaagaagcatc60gcggagagaaggaggcggccgggacgacggcggcggccggcaccgggggtgccaccgagc120agccgccgcggcaccgggaacacaaaaaacacaagcaccggagtggcggcagtggcggta180gcggtggcgaacgacggaagcggagccgggaacgtgggggcgagcgcgggagcgggcggc240gcggggccgaagctgaggcccggagcagcacgcacgggcgggagcgcagccaggcagagc300cctccgagcggcgcgtgaagcgggagaagcgcgatgacggctacgaggccgctgccagct360ccaaaactagctcaggcgatgcctcctcactcagcatcgaggagactaacaaactccggg420caaagttggggctgaaacccttggaggttaatgccatcaagaaggaggcgggcaccaagg480aggagcccgtgacagctgatgtcatcaaccctatggccttgcgacagcgagaggagctgc540gggagaagctggcggctgccaaggagaagcgcctgctgaaccaaaagctggggaagataa600agaccctaggagaggatgacccctggctggacgacactgcagcctggatcgagaggagcc660ggcagctgcagaaggagaaggacctggcagagaagagggccaagttactggaggagatgg720accaagagtttggtgtcagcactctggtggaggaggagttcgggcagaggcggcaggacc780tgtacagtgcccgggacctgcagggcctcaccgtggagcatgccattgattccttccgag840aaggggagacaatgattcttaccctcaaggacaaaggcgtgctgcaggaggaggaggacg900tgctggtgaacgtgaacctggtggataaggagcgggcagagaaaaatgtggagctgcgga960agaagaagcctgactacctgccctatgccgaggacgagagcgtggacgacctggcgcagc1020aaaaacctcgctctatcctgtccaagtatgacgaagagcttgaaggggagcggccacatt1080ccttccgcttggagcagggcggcacggctgatggcctgcgggagcgggagctggaggaga1140tccgggccaagctgcggctgcaggctcagtccctgagcacagtggggccccggctggcct1200ccgaatacctcacgcctgaggagatggtgacctttaaaaagaccaagcggagggtgaaga1260aaatccgcaagaaggagaaggaggtagtagtgcgggcagatgacttgctgcctctcgggg1320accagactcaggatggggactttggttccagactgcggggacggggtcgccgccgagtgt1380ccgaagtggaggaggagaaggagcctgtgcctcagcccctgccgtcggacgacacccgag1440tggagaacatggacatcagtgatgaggaggaaggtggagctccaccgccggggtccccgc1500aggtgctggaggaggacgaggcggagctggagctgcagaagcagctggagaagggacgcc1560ggctgcgacagttacagcagctacagcagctgcgagacagtggcgagaaggtggtggaga1620ttgtgaagaagctggagtctcgccagcggggctgggaggaggatgaggatcccgagcgga1680agggggccatcgtgttcaacgccacgtccgagttctgccgcaccttgggggagatcccca1740cctacgggctggctggcaatcgcgaggagcaggaggagctcatggactttgaacgggatg1800aggagcgctcagccaacggtggctccgaatctgacggggaggagaacatcggctggagca1860cggtgaacctggacgaggagaagcagcagcaggatttctctgcttcctccaccaccatcc1920tggacgaggaaccgatcgtgaatagggggctggcagctgccctgctcctgtgtcagaaca1980aagggctgctggagaccacagtgcagaaggtggcccgggtgaaggcccccaacaagtcgc2040tgccctcagccgtgtactgcatcgaggataagatggccatcgatgacaagtacagccgga2100gggaggaataccgaggcttcacacaggacttcaaggagaaggacggctacaaacccgacg2160ttaagatcgaatacgtggatgagacgggccggaaactcacacccaaggaggctttccggc2220agctgtcgcaccgcttccatggcaagggctcaggcaagatgaagacagagcggcggatga2280agaagctggacgaggaggcgctcctgaagaagatgagctccagcgacacgcccctgggca2340ccgtggccctgctccaggagaagcagaaggctcagaagaccccctacatcgtgctcagcg2400gcagcggcaagagcatgaacgcgaacaccatcaccaagtgacagcgccctcccgtagtcg2460gccctgcctcaaccttcatattaaataaagctccctccttatttttaaaaaaaaaaaaaa2520aaaaaaa2527&#60210&#623&#60211&#629&#60212&#62蛋白质&#60213&#62Homosapiens&#60400&#623GluTyrArgGlyPheThrGlnAspPhe5&#60210&#624&#60211&#629&#60212&#62蛋白质&#60213&#62人工序列&#60211&#629&#60212&#62蛋白质&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60221&#62变异体&#60222&#622&#60223&#62Xaa是Phe、Tyr、Met或Trp。&#60220&#62&#60221&#62变异体&#60222&#629&#60223&#62Xaa是Phe、Leu、Ile、Trp或Met。&#60400&#624GluXaaArgGlyPheThrGlnAspXaa5&#60210&#625&#60211&#629&#60212&#62蛋白质&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60221&#62变异体&#60400&#625GluTyrArgGlyPheThrGlnAspIle5&#60210&#626&#60211&#629&#60212&#62蛋白质&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60221&#62变异体&#60400&#626GluTyrArgGlyPheThrGlnAspLeu5&#60210&#627&#60211&#629&#60212&#62蛋白质&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60221&#62变异体&#60400&#627GluTyrArgGlyPheThrGlnAspTrp权利要求1．一种肿瘤抗原肽衍生物，它包括其中示于SEQIDNO3的氨基酸序列中一个至数个氨基酸残基改变的氨基酸序列的全部或部分，并且该衍生物能够结合到HLA-A24抗原而由此被细胞毒性T细胞识别。2．权利要求1的肿瘤抗原肽衍生物，它包括其中用另一种氨基酸残基取代示于SEQIDNO3的氨基酸序列的第二位和/或第九位的氨基酸的氨基酸序列的全部或部分。3．权利要求2的肿瘤抗原肽衍生物，它包括示于SEQIDNO4的氨基酸序列的全部或部分。4．权利要求3的肿瘤抗原肽衍生物，它包括其中用色氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代示于SEQIDNO3的氨基酸序列的第九位的苯丙氨酸的氨基酸序列的全部或部分。5．权利要求3的肿瘤抗原肽衍生物，它包括其中用苯丙氨酸取代示于SEQIDNO3的氨基酸序列的第二位的酪氨酸的氨基酸序列的全部或部分。6．权利要求3的肿瘤抗原肽衍生物，它包括其中在示于SEQIDNO3的氨基酸序列中，用色氨酸、亮氨酸或异亮氨酸取代第九位的苯丙氨酸以及用苯丙氨酸取代第二位的酪氨酸的氨基酸序列的全部或部分。7．权利要求4的肿瘤抗原肽衍生物，它包括示于SEQIDNO5的氨基酸序列的全部或部分。8．用于肿瘤的治疗剂或预防剂，它包括至少一种选自权利要求1-7中所述衍生物的肿瘤抗原肽衍生物。9．一种抗原提呈细胞，它包括HLA-A24抗原和按照权利要求1-7中任一项的肿瘤抗原肽衍生物之间的复合物，该复合物存在于具有抗原提呈能力、得自肿瘤病人的分离细胞的表面。10．一种肿瘤治疗剂，它包括作为活性成分的权利要求9的抗原提呈细胞。11．一种细胞毒性T细胞，它特异性识别HLA-A24抗原和按照权利要求1-7中任一项的肿瘤抗原肽衍生物之间的复合物。12．一种肿瘤治疗剂，它包括作为活性成分的权利要求11的细胞毒性T细胞。全文摘要肿瘤抗原肽衍生物含有通过改变氨基酸序列GluTyrArgGlyPheThrGlnAspPhe(SEQIDNO:3)的一个或数个氨基酸残基而衍生的完整氨基酸序列或其一部分,并能够结合到HLA－A24抗原而由此被细胞毒性T细胞识别;这些肿瘤抗原肽衍生物在治疗、预防和诊断肿瘤中的用途;以及含有这些作为活性成分的肽衍生物的肿瘤治疗药或预防药。文档编号A61K38/00GK1284083SQ98813407公开日2001年2月14日申请日期1998年12月2日优先权日1997年12月5日发明者伊东恭悟,七条茂树,今井康久申请人:伊东恭悟