专利名称：应用蛋白酶抑制剂治疗皮肤伤口的制作方法
技术领域：
本发明的背景皮肤充当人体抵御感染的第一道防线。因此，为了防止感染，必须将损伤的皮肤或皮肤伤口迅速闭合就显得重要。但是，某些类型的伤口在正常生理情况下难以愈合。例如慢性溃疡可以定义为不可愈合的伤口。这类溃疡是某些疾病，如糖尿病或出现慢性静脉供血不足的其它病变的共同合并症。近来治愈这类溃疡的方法受到很大重视。例如，见美国专利号5,693,332〖角化细胞的应用〗，美国专利号5,646,117(单核细胞趋化活化因子的应用，MCAF)，美国专利号5,202,118(IL-1的应用)和美国专利号5,599,788(H3蛋白的应用)，其各自的公开内容在此全面地引入，作为参考。
所以显而易见，治疗象慢性溃疡这类慢性伤口的改良方法是所迫切希望的。加快慢性伤口愈合的新方法尤其需要。
以往的研究已证明慢性伤口中蛋白酶活性增高。见Palolahti等，《实验皮肤病学》(Exp.Derm.)2:29(1993)和Wysocki等，《皮肤病学研究杂志》(J.Invest.Dermatol.)101:64(1993)。本发明人已经发现，这种蛋白酶活性的抑制可用于这类慢性伤口的治疗。
本发明的概括所以本发明的目的之一是提供治疗伤口的改良方法。
本发明的另一个目的是提供在这些伤口愈合方法中使用的药物组合物。
为了达到这些目的，根据本发明的一个方面，提供一种治疗伤口的方法，该法包括按病人需要给其施用一种有效量的含丝氨酸蛋白酶抑制剂的治疗剂的步骤，其中将该丝氨酸蛋白酶抑制剂局部施用于伤口。在一个实施方案中，该治疗剂包括一种尿激酶抑制剂。在另一个实施方案中，该治疗剂选自下列一组药物纤溶酶原激活物抑制剂2(PAI-2)，一种具有纤溶酶原激活抑制性质的PAI-2变体，一种PAI-2衍生物，以及一种PAI-2衍生物的变体。在还有一个实施方案中，该丝氨酸蛋白酶抑制剂以凝胶制剂形式施用。该凝胶制剂可以是一种含表面活性剂的纤维素凝胶。该表面活性剂可以是吐温-80。
根据本发明的另一个方面，提供一种治疗伤口的方法，该法包括按病人需要给其施用一种有效量的含PAI-2、PAI-2变体、PAI-2衍生物、PAI-2衍生物的变体以及至少另外一种丝氨酸蛋白酶抑制剂的治疗剂的步骤。其中将该治疗药剂局部施用于伤口。在一个实施方案中，该另一种丝氨酸蛋白酶抑制剂指的是一种uPA抑制剂。在另一个实施方案中，该治疗剂还进一步含有一种蛋白酶抑制剂，后者选自下列一组抑制剂巯基蛋白酶抑制剂，酸性蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。在还有一个实施方案中，该蛋白酶抑制剂与PAI-2、PAI-2变体、PAI-2衍生物、PAI-2衍生物的变体一起施用。在更进一步的实施方案中，该PAI-2或PAI-2变体、PAI-2衍生物，或PAI-2衍生物的变体的施用剂量范围为0.1-2000μg/cm2伤口。在另一个实施方案中，该PAI-2或PAI-2变体、PAI-2衍生物，或PAI-2衍生物的变体以每天至少一次持续至少5天的方式施用。
在进一步的实施方案中，通过将PAI-2作生化修饰，制取PAI-2衍生物，其中这种生化修饰选自下列一组修饰方法用聚乙二醇化学连接，磷酸基连接，硫酸基连接，肽酶处理，用修饰糖链的酶处理，以及用糖连接酶处理。在另一些实施方案中，通过删除或增加PAI-2氨基末端的氨基酸残基，制取PAI-2的变体。这种变体也可以通过删除或增加PAI-2羧基末端的氨基酸残基而制得。
根据本发明的另一个方面，提供一种在含表面活性剂的凝胶制剂中含有PAI-2或PAI-2衍生物、PAI-2变体或PAI-2衍生物的变体的药物组合物。在一个实施方案中，该表面活性剂为吐温-80，该凝胶为纤维素凝胶。
根据本发明的另一个方面，提供一种含PAI-2和至少另外一种丝氨酸蛋白酶抑制剂的药物组合物。该药物组合物还可以进一步包含一种蛋白酶抑制剂，后者选自下列一组抑制剂巯基蛋白酶抑制剂，酸性蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。在另一个实施方案中，该药物组合物是以含表面活性剂的纤维素凝胶制剂的形式出现。从下面的详述中，本发明的其他目的、特征和优点会是显而易见的。但是，应当考虑到，仅仅以说明的方式作这种详述和专门的实施例，同时指出了本发明的特定的实施方案，因为本领域的技术人员从这种详述就会理解在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。
附图的简要说明附
图1表示PAI-2在伤口液中3小时内的稳定性。将人氧化PAI-2在伤口液中以200 IU/ml浓度(1/10稀释)培养。在所指出的时间内，用特异酶试验检测PAI-2的残存活性。
附图2表示接受安慰剂(菱形)或PAI-2(正方形)的病人在不同时间间隔的溃疡面积(cm2)。
附图3表示施用PAI-2后第一天病人伤口液中的特异性uPA活性。
附图4表示在吐温-80存在下PAI-2从纤维素凝胶中的释放增加。
优选实施方案的详细说明本发明基于局部应用丝氨酸蛋白酶抑制剂即应用于伤口或溃疡而提供有助于慢性腿部溃疡和其它伤口愈合的方法和组合物。本领域的技术人员会认识到，这里所介绍的治疗溃疡的方法也可以应用于其它皮肤伤口。在一个优选的实施方案中，提供一种尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)抑制剂作为局部应用药物。
本发明也包括含有一种蛋白酶抑制剂与另一种蛋白酶抑制剂的治疗腿部溃疡的组合物以及治疗这种溃疡的方法。这样，本发明提供了治疗溃疡和其它伤口的方法和组合物，其中，将一种蛋白酶抑制剂以与一种或多种其它类型的蛋白酶抑制剂伍用的方式使用，为的是改善伤口愈合。
在一个优选的实施方案中，纤溶酶原激活物抑制剂2(PAI-2)是一种局部应用药物。PAI-2的性质在Kruithof等的论文“纤溶酶原激活物Ⅱ型的生物学和临床方面”(见《血液》(Blood)86:4007,1995)中作了详细阐述，将该文献的内容引入本文作为参考。简言之，PAI-2是纤溶酶原激活物(PA)糸统的一种成份。PA糸统具有多种功能，包括在诸如组织重建、细胞迁移、伤口愈合和血管生成等各种生理过程中胞外蛋白水解的调节。
纤溶酶原激活物(PA)属丝氨酸蛋白酶，它把纤溶酶原转化为纤溶酶(一种胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶)，后者不仅司纤维蛋白的降解，而且促进胞外基质的降解和周转。纤溶酶可以在炎症部位局部地形成，并可以通过循环于血浆和组织液中的其无活性前体纤溶酶原的有限制的蛋白水解得到补充。纤溶酶原由尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)激活。这些催化反应通常在浆膜(u-PA)或纤维蛋白表面(t-PA)发生。这些具有激活作用的酶由大范围的间充质细胞、上皮细胞和内皮细胞产生，作为对各种细胞因子和生长因子的应答。活化后的纤溶酶能降解各种基质，包括胞外基质大分子(胶原除外)和纤维蛋白。纤溶酶和其具有激活作用的蛋白酶的活性受包括PAI-2和纤溶酶激活物抑制剂1(PAI-1)在内的多种蛋白酶抑制剂的胞外调节。
本发明的发明者发现，从丝氨酸蛋白酶抑制剂一类抑制剂中筛选出来的化合物(例如PAI-2)的局部施用可使腿部溃疡的面积与对照相比明显减少。本领域的技术人员会考虑到，PAI-2和其它丝氨酸蛋白酶抑制剂在这一方面的应用并不只限于治疗腿部溃疡，而可以扩大应用到一般的伤口愈合，尤其是慢性皮肤伤口或损伤的愈合。这类伤口的举例包括外科伤口或创伤伤口、擦伤、皮肤撕裂伤、水泡、压迫性溃疡、糖尿病性溃疡、静脉曲张性溃疡、动脉性溃疡、混合型溃疡和烧伤。
在本发明的一个方面，采用丝氨酸蛋白酶抑制剂PAI-2。根据本发明，基本上具有PAI-2的氨基酸序列并能抑制纤溶酶激活物的PAI-2变体也可以用作伤口愈合制剂中的一个有效成分。即，“PAI-2变体”是一种基本上具有PAI-2的氨基酸序列的蛋白，该PAI-2的氨基酸序列的残基被天然地或人工地删除、增加、或替代到一定程度，但PAI-2的特征性抑制活性没有丧失。在这一点上，本领域的技术人员将所熟知的PAI-2活性测定很容易地应用到被公认的PAI-2变体的筛选。
因此，本发明关注保守，半保守和其它氨基酸替代，只要它们不降低活性以至该受影响的多肽在此上下文中在治疗上是无效的。天然出现的PAI-2和重组PAI-2的N-末端和C-末端区域的氨基酸序列可以不同-引起氨基酸残基数的增加或减少-依赖于其生成条件。这些变体按特性属于本发明的范围内。本领域的技术人员会理解，PAI-2的其它活性变体也可应用于本发明，只要它们保持PAI-2特征性的蛋白酶抑制剂性质。
按照本发明，能通过化学或生化修饰PAI-2或PAI-2变体所生成的衍生物也适合作为活性组分。这类衍生物的典型例子有通过以下方法所得到的化合物(A)化学连接聚乙二醇或其类似物；(B)连接磷酸基或硫酸基；(C)用肽酶(例如内肽酶)处理；和(D)用修饰糖链的酶处理，或用连接糖链的酶(例如唾液酸酶)处理。用本领域的技术人员所熟知的方法检测以这种方式制备的衍生物的蛋白酶抑制剂活性。例如可参见Fersht主编，《酶结构和机理》(ENZYME STRUCTURE ANDMECHANISM)，第二版，W.H.Freeman和CO.，1985以及该书中的参考文献。
蛋白酶抑制剂，例如本文所述的PAI-2或PAI-2变体和PAI-2衍生物(本文统称为PAI-2)可以以任何适宜的生理上可接受的载体，例如配制在磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)溶液中，给病人局部施用。其它载体为本领域的技术人员所熟知，例如在《REMINTON氏药剂学》(REMINTON SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，Mack PublishingCompany,Easton,PA,1990)一书中就述及。
该蛋白酶抑制剂可每天施用于伤口，根据需要增加或减少施用频率。本领域的技术人员会理解，特殊应用的最适剂量范围为本领域的技术人员所熟知，如前述REMINTON氏的书中所述。抑制剂的标准日剂量为20μg/cm2伤口或溃疡，尽管认为这一剂量是可以改变的，以及可以使用的有效浓度范围为0.1-2000μg/cm2。例如，长期(如一年或更长)溃疡可能需要500μg/cm2的浓度每天施用多次，例如每天2次、3次，或4次。对时间较短的溃疡，或对较高剂量反应好的溃疡，可以降低剂量。例如，该蛋白酶抑制剂剂量可以依次降低到例如100,10,1，或0.1μg/cm2。此外，可以减少该抑制剂的施用频率，例如从每天4次减少到每天1次。PAI-2不会出现全身毒性，故如有必要，甚至可施用更高的剂量。如有必要，可用ELISA试验测定PAI-2的全身浓度，并据此调整PAI-2的剂量。其它合适的抑制剂的毒性和全身浓度可用本领域的技术人员所熟知的方法测定。
应用于病人的载体中的有效的抑制剂浓度约为1mg/ml，尽管必要时可使用更高或更低的浓度。例如，可使用低至约0.1mg的浓度，也可使用达到载体中抑制剂溶解度限值的高浓度。
该抑制剂可短期或长期使用。像PBS这样的载体适合于该抑制剂的短期使用。对于长期使用，优先使用释放慢的载体。例如凝胶制剂可用作该抑制剂的有效转运。以往已报告凝胶制剂中纤维素衍生物与EGF、TGF-α、PDGF和FGF这样的蛋白相兼容。在这些制剂中的蛋白超过规定时间有凝集的倾向，这一点在目前的应用中是不利的。这种凝集表现为凝胶呈乳白色或混浊，并导致该活性蛋白组分的活性降低，由于这种凝集颗粒的体积增大，蛋白从凝胶中的释放减缓。
本发明的发明者通过在抑制剂/纤维素聚合物凝胶中添加少量表面活性剂(少于或等于0.05％)解决了这一凝集问题。其结果是凝胶的澄明度有很大改善。这种凝胶的优点详见后面的实施例3。可使用吐温-80或Genapol PF10这样的表面活性剂。本领域的技术人员会理解其它表面活性剂也可成功地使用。
出乎预料，本发明的发明者发现，0.02％吐温-80的添加，除减少凝胶中的凝集外，还可使该抑制剂从含抑制剂/羟乙基纤维素的凝胶中的释放增多。这些实验在下面的实施例3中较详细地叙述。
研究了各种蛋白酶抑制剂对伤口液中蛋白酶活性的影响。这些数据在下面的实施例3中较详细地叙述。
本发明的发明者发现，只有丝氨酸蛋白酶抑制剂，尤其uPA抑制剂，能高度抑制伤口液中蛋白酶活性。因此，为了达到这样的抑制水平，至少存在一种丝氨酸蛋白酶抑制剂是必要的。
伤口液中抑制剂必须是稳定的，以便在帮助伤口愈合中起作用，这一点的重要性也是显而易见的。在本发明的范围内，伤口液中抑制剂是相当稳定的，其在伤口液中滞留3小时后仍可保留至少50％抑制活性。所以在这一方面，尤其希望使用一种能抑制uPA并在伤口液中保持稳定的抑制剂。例如据观察，PAI-2加到伤口液中引起uPA活性抑制，而且PAI-2在伤口液中相当稳定，见下面的附图1。
相反，单独应用金属蛋白酶、酸性蛋白酶和巯基蛋白酶的抑制剂产生的抑制作用程度很低，参见例如后面的实施例2。但是，本发明的发明者发现，单一抑制剂的抑制作用可借助使用另一种抑制剂而增强。这些抑制剂的联合应用可使抑制作用达到很高水平，例如，可使蛋白酶活性的抑制达到97％。例如，本发明的发明者发现，在与PAI-2的联合应用中，PAI-2的功效可由于使用另一种蛋白酶抑制剂而增强。
在一个实施方案中，PAI-2以与至少一种别的蛋白酶抑制剂伍用的方式使用。例如，PAI-2可以与另一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如阿米洛利)及其衍生物伍用的方式使用。
在另一个实施方案中，PAI-2以与至少一种金属蛋白酶、酸性蛋白酶和巯基蛋白酶的抑制剂伍用的方式使用。例如，PAI-2可以与乙二胺四乙酸(EDTA〕、抑胃酶肽和N-乙基马来酰亚胺(NEM)中的一种或多种伍用的方式使用。
还是在另一个实施方案中，PAI-2以与至少一种别的蛋白酶抑制剂和至少一种别的金属蛋白酶、酸性蛋白酶和/或巯基蛋白酶的抑制剂伍用的方式使用。
丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的抑制剂，以及酸性蛋白酶和金属蛋白酶的抑制剂是本领域的技术人员所熟知的，其中不少可从市场上买到，例如，可从Boehringer Mannheim(Indianapolis,IN)、Promega(Madison,WI)、Calbiochem(LaJolla,CA)和Life Technologies(Rockville,MD)公司购买。其它抑制剂在著名的酶学书-例如，Fersht主编，《酶结构和机理》(ENZYME STRUCTURE AND MECHANISM)，第二版，W.H.Freeman和CO.，1985以及该书中的参考文献-中有叙述。
这些蛋白酶抑制剂可以在PAI-2治疗前或治疗后施用，或与PAI-2治疗一起施用。这些蛋白酶抑制剂也可以多于或少于PAI-2的施用频率施用。特别是降解较快的抑制剂可以多于稳定抑制剂的施用频率施用。相反，较稳定的抑制剂可以较少的施用频率施用。本领域的技术人员会理解，简易的抑制剂稳定性试验可用于估计抑制剂的施用频率。
较可取的是，这些蛋白酶抑制剂可以与PAI-2相同的载体应用，尽管对疗效而言，这并不是必须的。特别是这些蛋白酶抑制剂可以与前述PAI-2所用一样的凝胶载体应用。如果这些抑制剂不使用与PAI-2相同的载体，那么它们可以在任何药剂学上可接受的载体中应用，如前述REMINGTON氏的书中所述的那样。
上面一般介绍了本发明，通过参考下面的实施例会更容易了解本发明，这些实施例以说明的方式提供，意图并不是以这些实施例限制本发明。
实施例1PAI-2用于治疗腿部慢性静脉曲张性溃疡设计本研究是一种以安慰剂作对照的随机双盲试验。根据溃疡大小采用分层随机方法。将溃疡面积小于和大于20cm2的病人分开作随机处理。对病人目前的溃疡状况不设最小或最大倍数。最小和最大的溃疡面积为2cm2和50cm2，检查病人(溃疡)包涵物的静止踝臂的多普勒动脉压指数等于或大于0.80。
所有病人都接受压迫绷带包扎。用描绘法(tracing)测量溃疡面积。试验溶液，即PAI-2浓度为1.0mg/ml的磷酸盐缓冲的生理盐水(pH7.0)或磷酸盐缓冲液，以20μl(含PAI-2 20μg)/cm2的用量施用于伤口。在试验溶液施用于伤口表面时，要求病人躺在检查椅上，在上绷带前15分钟保持此体位。
试验溶液以这种方式连续施用5天。然后在15,22和29天就诊。在1,5,15,22和29天作溃疡面积测量。在1,5和29天用结构光评定法作溃疡体积测量且在第1、5和29天对溃疡拍照。，并与相伴随的药疗法一样，每次就诊都评定不良反应。
此外，在第一天试验溶液施用前和施用后2小时、4小时、6小时，分别收集伤口液。在第2、3、4和5天(试验溶液施用前)以及29天也收集伤口液。在第一天试验溶液施用前(0小时)和施用后0.5小时、1小时、2小时，以及第5天分别取血样。在第5天作活体穿剌，供溃疡边缘组织学检查用。
所有供uPA活性测定的伤口液样品都用Chromolise试验分析，供总蛋白测定的伤口液样品都用Bradford试验分析。如果伤口液样品充足，还可以按优先次序作下列试验(1)用ELISA法测定PAI-2抗原水平；(2)用Western印迹试验检查PAI-2分子是完整的，复合的还是以片段存在；(3)以偶氮酪蛋白为底物，用显色试验测定总蛋白酶活性；和(4)在EDTA(阻断金属蛋白酶)或抑酶肽(阻断纤溶酶)存在下的总蛋白酶活性。此外，用PAI-2ELISA试验分析血样(第一天0小时、0.5小时、1小时、2小时)，第1天(0小时)和第5天的血液样品还作FBC和临床化学分析。
将Chromolise uPA试验(BioPool诊断试剂盒，DadeInternational)用于总uPA活性测定。它包括有活性的双链uPA和无活性的单链uPA，因为在本试验中纤溶酶的添加，后者转化为前者。用于PAI-2测定的ELISA试验检测的是糖基化和非糖基化PAI-2二者以及复合的(与uPA或tPA)和非复合的PAI-2二者。收集到的不充足伤口液样品用于在抑酶肽或EDTA存在下的总蛋白酶试验。用结构光评定法测得的溃疡体积变异很大重复测定的变异为20.4％，故那些数据不能用于判断溃疡体积的细小变化。
结果20例病人完成了全部试验方案，1例病人完成了该试验计划的前半部分。总的耒说，将12例病人随机划入PAI-2组，9例病人随机划入安慰剂组。没有完成全部试验计划的那例病人划入PAI-2组，在试验的1-5天其数据并入uPA分析，但将这些数据从完成了全部试验方案的所有其它参数中剔除出来。在本研究过程中，共观察到23宗不良反应，其中3宗认为属严重反应。但认为没有一种与PAI-2治疗有关。因此，PAI-2供腿部慢性溃疡局部应用看耒是安全的。
两组病人在年龄、性别、溃疡持续时间和溃疡体积方面是可比较的，但安慰剂组试验开始时的溃疡面积较大。用重复测量方差分析比较了本研究29天过程中两个组的溃疡面积，观察到PAI-2组中的溃疡面积减少，而安慰剂组未显示变化。数据列于下面的表中安慰剂病人编号DayI Day5 Day15Day22 Day29001 7.30 7.50 7.60 6.20 5.70007 14.40 11.30 12.2012.50 13.60009 7.40 6.60 7.70 6.80 8.20013 7.30 8.30 8.00 10.00 11.30015 10.50 8.80 9.60 8.10 5.20016 3.50 2.80 3.00 2.00 2.20032 34.80 32.80 39.2043.40 39.60033 44.70 43.50 43.8044.80 44.80034 22.40 17.60 18.9016.70 24.60中位数 10.50 8.80 9.60 10.00 11.30(IQR)(7.30,28.60) (7.05,25.20) (7,65,29.05) (6.50,30.05) (5.45,32.10)PAI-2病人编号DayI Day5Day15 Day22 Day290024.50 3.804.104.10 3.700037.10 5.206.005.30 5.000041.80 1.101.100.90 1.200052.60 1.100.600.30 0.3000619.80 20.10 19.50 20.90 21.500084.90 5.204.803.90 3.8001013.30 13.20 12.60 11.50 3.300116.60 6.406.907.70 6.800125.10 5.606.400142.50 1.401.100.10 0.000173.20 3.202.402.70 3.9003138.00 36.50 25.60 26.30 24.50中位数 5.00 5.205.404.10 3.80IQR (2.75,11.75)(1.85,11.50)(1.43,11.18)(0.90,11.50)(1.20,6.80)(IQR-分位数的间距)附图2表示两组病人溃疡面积的中位数。
对大多数病人首次就诊取自0、2、4、和6小时的伤口液样品中的PAI-2作了测定。接受该药的那些病人用药后2小时PAI-2水平激剧升高，到4小时几乎下降至基线水平。这些样品的蛋白质印迹分析证明，用药后2小时样品中存在显著量的完整PAI-2，这表明此时PAI-2尚未降解。因此，可以认为，用药后2小时，大部分PAI-2未吸收，此后可能已被吸收入溃疡。尚未发现PAI-2局部应用有全身分布的证据。
治疗第一天施用PAI-2后6小时期间，与安慰剂组(见附图3)相比，uPA特异性活性(伤口液样品中ng/mg总蛋白)降低。但是在该研究时间过程的后面的天数里，这两个组之间的uPA活性无显著差异，表明在被PAI-2抑制后uPA合成的恢复。
这两个组之间的uPA活性，用单位/ml伤口液而不是用单位/mg蛋白表示时，无显著差异，表明伤口液中水份含量的差别。这并不是添加PAI-2蛋白的结果，对总蛋白水平没有显著影响。5cm2见方的溃疡中平均添加100μg PAI-2蛋白，而伤口液样品中蛋白浓度约为30mg/ml。不管是以ng/ml伤口液还是ng/mg蛋白表示，总蛋白酶活性看来并不是由于PAI-2的添加而改变的，虽然更大研究人群的统计学评价可能有助于证实这一事实。
第5次就诊所取的活检标本用苏木素和伊红染色后作组织学检查。没有观察到由于PAI-2局部应用而引起组织损害的证据，这两个组之间的组织病理学图谱几乎没有差异。在取自经PAI-2治疗的病人的活检标本中观察到血管中纤维蛋白样坏死的发生率呈某种程度减少。这种影响可能对溃疡是有益的。
实施例2伤口液中蛋白酶活性的抑制从患腿部慢性静脉曲张性溃疡的病人收集伤口液，并在每种抑制剂存在或不存在的条件下，将伤口液与蛋白酶基质ZGGRAMC一起在体外培养。该基质的裂解指示蛋白酶活性，后者用荧光法在460nm处加以检测。缺乏荧光表示蛋白酶活性的抑制。伤口液中蛋白酶活性的抑制单一抑制剂抑制剂作用方式 抑制百分比EGRCK uPA(非竞争性) 94阿米洛利 uPA(竞争性) 96抑胃酶肽 酸性蛋白酶 0EDTA金属蛋白酶 0NEM 巯基蛋白酶 21AEBSF 丝氨酸蛋白酶(如uPA,tPA)0关键词EGRGK 谷氨酸-甘氨酸-精氨酸氯甲酮EDTA乙二胺四乙酸NEM N-乙基马来酰亚胺AEBSF 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟ZGGRAMC 羧苯氧基-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸-氨甲基香豆素多种抑制剂抑制剂抑制百分率抑胃酶肽+EDTA19抑胃酶肽+NEM 71抑胃酶肽+AFBSF 98EDTA+NEM 65EDTA+AEBSF 97NEM+AEBS 94抑胃酶肽+EDTA+NEM60抑胃酶肽+EDTA+AEBSF 98抑胃酶肽+NEM+AFBSF 93EDTA+NEM+AFBSF 90抑胃酶肽+EDTA+NEM+AEBSF 95试验条件同上面单一抑制剂所述。
实施例3含PAI-2凝胶的制备和PAI-2释放的测定在这些试验中，将含PAI-2凝胶置于一个二分隔容器的上部室中。底室含缓冲液，两个室用微孔膜分隔开。下室中PAI-2的出现指示PAI-2从凝胶中释放出来，并借助PAI-2活性测定加以监测。
下表反映一种新的PAI-2凝胶制剂性能的改善。附图4描绘PAI-2从凝胶中释放增加。
PAI-2凝胶制剂的澄明度赋形剂聚合物 浓度(％〕 安慰剂不加Genapol PFIO 吐温80聚羧乙烯971P 0.5清澈 s.o. 清澈 清澈1.0清澈 s.o. 清澈 清澈聚羧乙烯974P 0.5清澈 乳白色 s.o. s.o.1.0清澈 混浊 乳白色 s.o.聚羧乙烯9810.5清澈 s.o. 清澈 清澈1.0清澈 s.o. 清澈 清澈Blanose 7LF 2.0 清澈混浊d非常混浊d乳白色d羟乙基纤维素250HHX 1.5 清澈s.o. 清澈 清澈黄原胶RD3.0 乳白色 混浊 非常混浊 混浊关键词opal.=乳白色s.o.=轻度乳白色v.o.=非常混浊d=可能有微生物污染方法将聚合物溶解至所希望的浓度，然后滴定至pH7.4-7.7。添加表面活性剂至0.05％，添加PAI-2至1mg/ml。叠氮钠(0.05％)作为防腐剂。
本发明已概括地公开，并通过参考上述有代表性的实施方案加以说明。本领域的技术人员会理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可对其作各种修改。
权利要求
1．一种治疗伤口的方法，该方法包括按病人需要给其施用一种有效量的丝氨酸蛋白酶抑制剂的步骤，其中将所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂局部施用于所述的伤口。
2．根据权利要求1中的方法，其中所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂是一种尿激酶抑制剂。
3．根据权利要求2中的方法，其中所述的尿激酶抑制剂选自下列一组抑制剂PAI-2，具有纤溶酶激活抑制性质的PAI-2变体，PAI-2衍生物，以及所述衍生物的变体。
4．根据权利要求1中的方法，其中所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂以凝胶制剂形式施用。
5．根据权利要求4中的方法，其中所述的凝胶是一种含表面活性剂的纤维素凝胶。
6．根据权利要求5中的方法，其中所述的表面活性剂是吐温80。
7．一种治疗伤口的方法，该方法包括按病人需要给其施用一种含PAI-2和至少一种其它丝氨酸蛋白酶抑制剂的有效量的治疗剂的步骤，其中将所述的治疗剂局部施用于所述伤口。
8．根据权利要求7中的方法，其中所述的其它丝氨酸蛋白酶抑制剂是一种uPA抑制剂。
9．根据权利要求7中的方法，其中所述的治疗剂进一步包含一种蛋白酶抑制剂，后者选自下列一组抑制剂巯基蛋白酶抑制剂，酸性蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。
10．根据权利要求9中的方法，其中所述的蛋白酶抑制剂与PAI-2一起施用。
11．一种在含表面活性剂的凝胶中含有PAI-2的药物组合物。
12．根据权利要求11中的药物组合物，其中所述的表面活性剂是吐温-80，且所述的凝胶是一种纤维素凝胶。
13．一种含有PAI-2和至少一种其它丝氨酸蛋白酶抑制剂的药物组合物。
14．根据权利要求13中的药物组合物，进一步包含一种蛋白酶抑制剂，后者选自下列一组抑制剂巯基蛋白酶抑制剂，酸性蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。
15．根据权利要求13中的药物组合物，其中所述的组合物是以含表面活性剂的纤维素凝胶的形式存在。
16．根据权利要求3中的方法，其中将所述的PAI-2在0.1-2000μg/cm2伤口的范围内施用。
17．根据权利要求16中的方法，其中所述的PAI-2以至少每天一次持续至少五天的疗程施用。
18．根据权利要求3中的方法，其中所述的PAI-2衍生物由生化修饰PAI-2制得，其中所述的修饰法选自下列一组修饰法聚乙二醇化学连接；磷酸基连接；硫酸基连接；用肽酶处理；用修饰糖链的酶处理；和用糖连接酶处理。
19．根据权利要求3中的方法，其中所述的变体通过PAI-2的氨基末端氨基酸残基的删除或添加而制得。
20．根据权利要求3中的方法，其中所述的变体通过PAI-2的羧基末端氨基酸残基的删除或添加而制得。
全文摘要
通过采用丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如PAI－2)局部治疗法可以加快慢性伤口(例如腿部溃疡)的愈合。采用蛋白酶抑制剂例如PAI－2与其它丝氨酸蛋白酶抑制剂的组合物和/或分别与金属蛋白酶、酸性蛋白酶和巯基蛋白酶的抑制剂这样一类蛋白酶抑制剂的组合物,也可以加快促进伤口愈合。
文档编号A61K38/06GK1299286SQ98813949
公开日2001年6月13日 申请日期1998年11月13日 优先权日1998年4月1日
发明者C·L·布恩, J·安德鲁斯, P·夏普 申请人:澳洲生物科技公司