专利名称：促进伤口组织修复的伤口覆盖材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于促进伤口组织修复的伤口复盖材料，特别是涉及包括胶原蛋白海绵层和含有一种或多种生长因子及其稳定剂的纤维素衍生物凝胶层的促进伤口组织修复的伤口复盖材料，其制备方法及在促进和/或改善外科手术伤口或各种物理创伤伤口的组织修复中的应用。本发明的伤口复盖材料特别适用于促进涉及脑组织或脊髓组织的伤口的组织修复和伤口愈合。
当人或动物身体遭受包括拔牙在内的各种外科手术，或包括灼伤在内的各种物理创伤时，常常造成软组织和/或骨组织及神经组织的破坏和断裂及缺损，并可造成出血和感染的机会。正常情况下，伤口可以自然愈合和修复。伤口自然愈合和修复的过程包括封闭伤口以限制血液流失并阻止感染；然后去除受损的组织并通过细胞吞噬作用消灭病原微生物；继之周围组织中各种类型的细胞侵入伤口部位并形成肉芽和瘢痕；最后重建瘢痕组织并改变细胞群体，以导致伤口的完全愈合。
在大多数下，自然愈合过程是很有效的。但由于组织发生学上的原因，某些组织，特别是脊髓和/或外周神经组织，则很难修复和愈合。另外，有些伤口往往因受病人身体素质、创伤大小和严重程度及并发感染等因素的影响，大多数情况下的伤口愈合需要医疗干预。例如，某些带有实质性组织损伤的严重烧伤往往难于完全愈合而需要进行植皮修复，另外多数涉及脊髓神经组织和大的外周神经组织的损伤如不投用某些促进神经组织修复的药物则很难修复。需要医疗干预的其他创伤包括软骨、韧带和肌腱等的难以自然愈合和修复的伤口。
促进伤口愈合和组织修复的一种方法是在局部投用包括各种生长因子的伤口愈合促进剂。然而，这种方法不能保证药物在伤口部位以有效量长时间缓慢释放并发挥作用，而且单纯使用生长因子也往往不能真正有效地促进整个损伤组织的全面修复。某些具有良好组织修复活性的药物，例如多种生长因子，如果不借助适当的局部投药载体，使药物从固体或半固体载体材料中以长时间持续投用的有效量释放到伤口部位，则将不能发挥其治疗价值。因此，特别希望建立并不断改进有效地局部投用这些治疗剂的配方和材料。本发明提供了这样一种可生物降解和可吸收的药物释放系统。
本发明的一个目的是提供一种用于促进伤口组织修复的伤口复盖材料，该材料包括一个含有促进伤口组织修复有效量的一种或多种生长因子及其稳定剂的凝胶层，和一个粘附在所说的凝胶层上的基于胶原蛋白和变性明胶混合物的海绵层。
根据本发明的一个实施方案，其中所说的海绵层是由胶原蛋白与变性明胶的1∶1混合物制成的；其中所说的含有一种或多种生长因子其稳定剂的凝胶层是羧烷基纤维素的含水凝胶，其中聚合物基质间隙内均匀地分散有选自表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)、结缔组织生长因子(CTGF)、肝细胞生长因子(HGF)、角质细胞生长因子(KGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)和睫状神经营养因子(CNTF)的一种或多种生长因子，以及选自纤维素衍生物钠盐、聚乙二醇、肝素或其衍生物、氨基酸及血清白蛋白的生长因子稳定剂。另外，所说的凝胶层中还可含有促进伤口愈合有效量的人血浆纤连蛋白。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的包含于凝胶层中的促进伤口组织修复有效量的生长因子是成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子和神经生长因子，并且所说的生长因子稳定剂是羧甲基纤维素钠、硫酸肝素和聚乙二醇；所说的海绵层则是由热变性的明胶与胶原蛋白的混合物制成的海绵。
根据本发明的一个优选实施方案，包含于凝胶层中的生长因子约为每平方厘米0.1-10μg，较好为每平方厘米1-5μg。纤连蛋白的含量为0.05-0.3％(W/W)。
本发明的另一个目的是提供制备如上文限定的伤口复盖材料的方法，该方法包括1)分别制备由变性明胶和胶原蛋白构成的海绵层，以及含有生长因子和其稳定剂及其他促进伤口愈合物质的羧烷基纤维素凝胶层；2)将粘度为50,000至300,000 cps的凝胶层与海绵层粘合在一起；3)在大约30至50℃的温度下风干或冷冻干燥步骤2)中得到的复合材料，以使其中的含水量降低到20％以下。
本发明的促进伤口组织修复的复合材料可在伤口部位长时间缓慢地释放包含于所说的材料中的各种生长因子及其他具有伤口组织修复和愈合促进活性的物质例如纤连蛋白。
本发明的复合材料具有极好的物理和化学结构特征，例如其具有适当的(20％以下)含水量，因而有利其保持相对干燥和一定的柔曲度，不会在局部造成额外刺激。因此，本发明的伤口组织修复和愈合促进材料特别适用于治疗涉及神经组织，例如脑组织和脊髓组织或外周神经的伤口、剖腹手术或口腔外科手术伤口，以及开放性骨折伤口等。可以将本发明的伤口组织修复促进材料埋入深部伤口内而不再取出，该材料一般可在大约2至3周时间内逐渐被完全降解和吸收。
本发明提供一种用于促进伤口组织修复和愈合的复合材料，该材料包括一个与伤口表面接触的凝胶层和一个粘着在凝胶层上的海绵层。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的海绵层是由明胶与胶原蛋白构成的海绵状材料；所说的凝胶层是含有一种或多种促进伤口组织修复有效量的生长因子和其稳定剂及其他活性物质的羧烷基纤维素含水凝胶。含水凝胶的粘度约为50,000至300,000cps根据本发明，所说的复合材料与伤口表面接触的海绵层是由重量比约为1∶1的热变性的明胶和胶原蛋白混合物制成的。胶原蛋白可以是选自Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅹ型的特殊类型的胶原蛋白。本发明优选的是从牛、马或羊的肌腱或软骨组织中提取的，或从人胎盘组织中提取的胶原蛋白。但特别优选的是从人胎盘中提取的人胶原蛋白和/或从哺乳动软骨中提取的Ⅱ型胶原蛋白。对于某些对异源蛋白质有排斥反应的高敏感个体，最好使用人胶原蛋白。已知胶原蛋白可促进伤口出血部位的血小板聚集，进而加速凝血级联反应，发挥凝血促进功能。另外，胶原蛋白还具有成纤维细胞生长促进活性，因而也具有伤口愈合促进作用。特别是已经发现，从哺乳动物和人软骨组织中提取的Ⅱ型软骨胶原蛋白具有明显地诱导血管生成作用(参见WO97/44059)。因此，本发明特别优选的海绵层材料是Ⅱ型胶原蛋白与变性明胶的1∶1(W/W)混合物。
本发明的伤口复盖材料中的凝胶层中还可含有重量比约为0.01％至0.3％的纤连蛋白，特别是从天然来源提取的人血浆纤连蛋白。纤连蛋白可促进炎性细胞向伤口部迁移及单核细胞的吞噬作用。在伤口愈合的血管生成和上皮化生阶段，纤连蛋白对内皮细胞发挥趋化活性，并促进上皮细胞和成纤维细胞在基底膜上的迁移。另外，在伤口愈合的修复期，纤连蛋白对胶原蛋白纤维的整合发挥重要作用。纤维状胶原蛋白最终在伤口部分形成大大提高了抗张强度的纤维束。
根据本发明，构成所说的伤口复盖材料的凝胶层是均匀地散布有一种或多种生长因子及其稳定剂的纤维素衍生物，特别是羧甲基纤维素(HMC)的含水凝胶。该凝胶层具有足以与所说的海绵层粘结在一起的粘度。一般说来，该凝胶层的粘度约为50,000至300,000cps。在本发明复合材料的含水凝胶层中，选自羧甲基或羧丙基纤维素或其碱金属盐的纤维素衍生物的含量约为1-8％，较好2-5％(W/W)。纤维素衍生物的粘度约为100,000～250,000cps。
在伤口愈合的过程中，神经血管生成是最重要的影响因素之一。神经血管生成程度和/或速率的增加可导致更迅速和更完全的伤口愈合。以前的大量研究已经证明，包括FGF-2、EGF、CTGF和NGF在内的许多生长因子在伤口局部被诱导和释放，发挥促进组织细胞有丝分裂和分化的功能。例如FGF-2和EGF可诱导成纤维细胞和内皮细胞的增殖与迁移；NGF和IGF可刺激神经细胞纤维(树突)的延伸与细胞突触间接触，有利于受损伤口部位神经细胞功能的恢复和细胞分化及形态重建。另外，CT-GF和HGF具有促进多种类型的组缔组织细胞生长和增殖，加速局部组织修复的活性。作为一种应激级联反应机制，尽管在机体组织遭受外科手术或其他机械创伤后，局部细胞或组织可释放出一定量的上述生长因子，但因机体反应能力的限制和受伤程度的不同，在许多情况下通过外源途径补充这些生长调节因子将是必要的。因此，本发明促进伤口组织修复的复合材料包括一个与伤口表面接触的羧烷基纤维素凝胶层，该凝胶层中均匀地分散有选自FGF-2、EGF、NGF、CTGF、HGF和IGF的一种或多种生长因子，其中优选的是FGF-2、IGF和NGF。这些生长因子可以是天然来源的，例如从人胎盘组织或小鼠颌下腺中提取并纯化的，也可以是以重组DNA技术产生的，但最好以重组技术由适当的宿主表达系统外源产生的。所说的生长因子FGF-2、IGF和NGF在所说的凝胶层中的含量一般为每平方厘米约0.1至10μg，较好为每平方厘米1-5μg。
本发明进一步提供制备用于促进伤口组织修复的复合材料的方法，该方法包括1)分别制备含有生长因子和其稳定剂及其他促进伤口愈合物质的羧烷基纤维素凝胶层，和由变性明胶与胶原蛋白的1∶1(W/W)混合物组成的海绵层；2)将粘度为50,000至300,000cps的凝胶层与所说的海绵层粘合在一起；3)在大约30至50℃的温度下风干或冷冻干躁步骤2)中得到的复合材料，以使其中的含水量低于20％。
或者，根据本发明的另一个实施方案，也可以首先制备所说的凝胶层并在30-50℃下风干或冷冻干燥之，然后将由变性明胶和胶原蛋白的1∶1(W/W)混合物制成的约3％含水海绵层基质倒入装预干燥凝胶层的浅盘内，铺敷后进一步按上述方法风干或冻干所得到的复合材料。
为了制备本发明的促进伤口组织修复的复合材料中的凝胶层，应首先制备羧烷基纤维素凝胶层。例如可首先将小量羟苯基甲酸甲酯溶解于0.1MPBS缓冲液中，然后将经干热灭菌的羧甲基纤维素粉末分散于该溶液内并持续搅拌2-4小时，得到无菌的凝胶基质。然后在搅拌下将适当量的FGF-2、IGF和NGF的冻干粉末和适当量的人血浆纤连蛋白以及硫酸肝素和聚乙二醇的混合物加水溶解，并将所得水溶液混入凝胶基质中。充分搅拌混匀后于大约30℃下将粘稠的凝胶倒入预冷的浅盘中，使之成为厚度约为2-6mm的凝胶片层。于大约30℃温度下风干该凝胶片层，当其中合水量的低于约40％时与另外无菌制备的海绵层粘结在一起。
为了制备本发明伤口复盖复合材料的海绵层，将于大约120℃下加热变性的明胶与干燥的胶原蛋白以大约1∶1重量比混合并溶解于0.01M柠檬酸水溶液中。将混合物振荡混匀后用1N NaOH溶液调pH至7.2，得到明胶与胶原蛋白的混合物凝胶。于缓慢搅拌下，将适当量(0.01-0.3％，W/W)过滤(0.22μm醋酸纤维滤膜)除菌的血浆纤连蛋白储备液(2mg/ml)加入上述明胶-胶原蛋白凝胶基质中。将所得到的均匀混合物倒入预冷的浅盘中，使之成为厚度为5-10mm的海绵片层。
为了保证本发明伤口组织修复材料的无菌性和贮存稳定性，可在所说的海绵层中加入适当量的选自苯酚或羟基苯甲酸化合物的防腐剂，以及适当的蛋白酶抑制剂。一般苯酚衍生物如氯甲酚含量为0.05-0.1％，对位羟基苯甲酸含量约为0.01-0.1％。蛋白酶抑制剂可以是约20单位的抑酶肽。
将如此制得的凝胶层与海绵层重迭，不加外力使两者粘结后，冷却至-4℃并置于-20℃下进行冻干循环，直到所得复合材料的总含水量低于20％(V/W)。
可根据使用部位和伤口面积，将本发明的复合材料无菌条件下切制成适当大小，并无菌封装在透明或半透明聚氨酯塑料袋内。包装后，可进一步用20-40 KGy的β或γ射线照射，以再次进行整体灭菌处理。
本发明进一步涉及本发明的复合材料在冶疗外科手术创伤和各种其他物理创伤，特别是涉及脑组织和脊髓组织的创伤及剖腹手术创伤中的应用。为此，可借助适当的器械将本发明的复合材料直接附盖在创伤部位，并确保足以附盖整个伤口表面。或者，也可在复合材料的上表面加盖一层或多层使用可吸收材料如酸甲基纤维素纤维制成的无纺纱布，以形成可置于伤口表面上的伤口愈合绷带或伤口复盖垫。
下列实施例旨在进一步举例说明本发明促进伤口组织修复的伤口复盖材料的制备方法，但这些实施例并不以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。实施例中使用的胶原蛋白、明胶、胶连蛋白和各种生长因子及其稳定剂均为市售的医药纯的产品。除特别指出者外，实施例中使用的所有百分比例均为重量百分比(W/W)。
实施例1凝胶层的制备将羟苯基甲酸甲酯(0.1g)溶解于96ml 0.1M磷酸盐缓冲盐水(95ml)中。以干热灭菌法对羧甲基纤维素(MMC)粉末进行灭菌处理。然后将HMC(5g)分散于上述溶液中并有搅拌棒电动搅拌2小时，得到灭菌的浓凝胶基质(5％)。通过0.22μm醋酸纤维素滤膜过滤50ml纤连蛋白的贮备溶液(2mg/ml)，然后向过滤的溶液内加入重组人FGF-2(500μg)、IGF(800μg)和NGFF(400μg)的冻干粉末，以及硫酸肝素(1mg)和聚乙二醇6，000(2mg)，并于4℃下彻底搅拌1小时。在低速搅拌(100rpm)下将该混合溶液(50ml)缓慢加入到50g上述浓缩凝胶基质中，得到粘度约140，000cps的贮存凝胶(100g)。
·实施例2海绵层的制备·强烈搅拌下将热变性的1.5g明胶溶解50℃蒸馏水(50ml)中。将1.5g干胶原蛋白(纤维状胶原蛋白)和200mg氯甲酚溶解于0.1M PBS(50ml)中。然后搅拌下将两溶液混合均匀，并在持续搅拌下用1N NaOH将所得含水凝胶的pH调到7.2。将所得含水凝胶倒入10×10cm大小的浅盘，30℃风干后得到厚度约为0.5cm的海绵片层。
实施例3复合伤口复盖材料的制备将实施例1中得到含生长因子及其稳定剂的羧甲基纤维素含水凝胶倒入4℃冷却的放置实施例2制得的2％变性明胶-胶原蛋白凝胶层的浅盘内。将浅盘移至冷冻干燥器的-4℃冻干室内。然后启动冻干器降温至-20℃，对本发明的复合材料进行冷冻干燥循环，直到产品的总含水量达到约17％为止。
根据使用需要，将冻干后得到的可柔曲的羊毛状产品无菌包装在半透明的聚氨酯薄膜袋内，并以30 KGy β射线批量照射10秒钟。然后4℃贮存备用。
权利要求
1．一种用于促进伤口组织修复的伤口复盖材料，该材料包括一个含有促进伤口组织修复有效量的一种或多种生长因子及其稳定剂的凝胶层，和一个粘附在所说的凝胶层上的基于胶原蛋白和变性明胶的混合物的海绵层。
2．根据权利要求1的伤口复盖材料，其中所说的凝胶层是含有一种或多种生长因子及其稳定剂的羧烷苯纤维素含水凝胶。
3．根据权利要求1的伤口复盖材料，其中所说的海绵层是重量比约为1∶1的变性明胶和Ⅱ型胶原蛋白的混合物。
4．根据权利要求1或2的伤口复盖材料，其中所说的包含于凝胶层中的一种或多种生长因子选自碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、神经生长因子、表皮生长因子、肝细胞生长因子、结缔组织生长因子、角质细胞生长因子和睫状神经营养因子。
5．根据权利要求4的伤口复盖材料，其中所说的包含于凝胶层中的一种或多种生长因子选自碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子和神经生长因子。
6．根据权利要求1的伤口复盖材料，其中所说的包含于凝胶层中的生长因子稳定剂选自羧烷基纤维素钠盐、聚乙二醇、肝素或其衍生物、氨基酸和血清白蛋白。
7．根据权利要求1或2的伤口复盖材料，其中所说的凝胶层还包含约为0.01％至0.3％(W/W)的纤连蛋白。
8．制备根据权利要求1至3中任一项的伤口复盖材料的方法，该方法包括1)分别制备含有一种或多种生长因子及其稳定剂的羧烷基纤维素凝胶层，和由变性明胶与胶原蛋白的1∶1(W/W)混合物构成的海绵层；2)将粘度为50,000至300,000cps的凝胶层与所说的海绵层粘结在一起；3)在大约30℃至50℃的温度下风干或冷冻干燥步骤2)中得到的复合材料，以使其中的含水量降低至20％以下。
9．根据权利要求8的方法，其中所说的步骤1)还包括在30℃至50℃的温度下风干或冷冻干燥所说的凝胶层，并且其中所说的步骤2)是将作为海绵层基质的变性明胶与胶原蛋白的混合物倒至所说的明胶层上，然后按步骤3)所述条件干燥如此得到的复合材料。
10．根据权利要求1至3中任一项的伤口复盖材料在治疗涉及脑组织或脊髓组织的创伤或剖腹手术伤口，以及开放性骨折伤口中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于促进伤口组织修复的伤口覆盖材料,特别是涉及包括胶原蛋白海绵层和含有一种或多种生长因子及其稳定剂的纤维素衍生物凝胶层的促进伤口组织修复的伤口覆盖材料,其制备方法及在促进和/或改善外科手术伤口或各种物理创伤伤口的组织修复中的应用。本发明的伤口覆盖材料特别适用于促进涉及脑组织或脊髓组织的伤口的组织修复和伤口愈合。
文档编号A61K47/38GK1228338SQ9910058
公开日1999年9月15日 申请日期1999年2月4日 优先权日1999年2月4日
发明者颜炜群, 张培因 申请人:马昭若