专利名称：胆红素及其衍生物作为抗甲1型流感病毒剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于胆红素及其衍生物在医药领域中的应用，特别是涉及胆红素及其衍生物作为抗甲1型流感病毒剂的用途。
胆红素是哺乳动物体内血红素代谢的产物，血红素在血红素氧化酶的作用下，形成胆绿素IXα，它经胆绿素还原酶作用，还原为胆红素IXα(BilirubinIXα，俗称胆红素)。胆红素在人体内的作用，现已明确，它具有抗氧化作用。胆红素存在于胆汁中，经过血液循环、代谢，可以排出体外。当代谢不正常时，会和其他组分一起形成胆结石。牛胆结石称为牛黄，牛黄作为中药成分在中国已有2000多年的历史，用牛黄(包括人工牛黄)的中成药有200余种，如牛黄清心丸、安宫牛黄丸、犀黄丸、六神丸、片仔癀，速效感冒胶囊、感冒通等。这些药是治疗中风、脑炎、扁桃体炎、感冒等病的常用药。牛黄中的胆红素的含量在50％以上，而我国配制的人工牛黄中仅含胆红素0.7％，一方面是由于胆红素的价格太贵，另一方面是由于怀疑胆红素的药理作用(张能荣，《胆红素》，中国医药科技出版社，北京，1994)，所以没有将胆红素作为有效成分，而单独用于配药的。牛黄具有清热解毒、开窍豁痰、安神定惊的作用。胆红素的药理作用过去也曾有过一些研究，如可以促进红血球新生，增强血管的收缩作用；解热作用；抗乙脑病毒；抗癌；消炎作用等(张能荣，《胆红素》中国医药科技出版社，北京，1994)。国外近年来大量文献报道了胆色素的抗氧化作用(A.F.McDonagh，临床围产学(Clinics in perinatology)，17(2)359-3691990)、抗HIV(人免疫性缺乏病毒)作用(H.Mari et.al.，日本癌症研究(Jpn.J.Cancer Res.)，82，755-757，1991)、抗HHV-6(人疱疹病毒-6)作用(T.Nakagami et.al.，微生物免疫学(Microbiol.Immunal.)，36，381-390，1992)。也有专利报道胆色素可以作为抗补体剂(日本，公开特许公报(A)，特开平6-183969)和抗疟疾剂(日本，公开特许公报(A)，特开平6-157308)，但至今尚未有用胆红素及其衍生物作为抗甲1型流感病毒剂。
人体每天可产生、排泄大约300mg的胆红素，在肝功能实验和为了减轻关节炎的治疗应用时，给成人和新生儿静脉注射剂量达到20mg/kg，未出现有害的影响。胆红素具有潜在的毒性，也只有在代谢不正常的特殊情况下才会发生(张能荣，《胆红素》中国医药科技出版社，北京，1994)。所以对胆红素的药用研究，目前正处于方兴未艾。
本发明的目的旨在表明胆红素及其衍生物中胆红素XIII α可以抑制甲1型流感病毒，并可被用来制备预防和治疗由甲1型流感病毒引起的流行性感冒的药物。
本发明的技术方案中所用胆红素及其衍生物结构为
R1-R8为烷基、乙烯基、脂肪酸取代基。
R1R2R3R4R5R6R7R8胆红素(胆红素IXα) M V M P P M M V中胆红素XIIIα M E M P P M E MM＝CH3，E＝CH2CH3，V＝CH＝CH2，P＝CH2CH2COOHR1、R2、R3、R6、R7、R8还可以为其他烷基、烯基、烷基羰基，R4、R5还可以为脂肪酸基、脂肪酸的盐、脂肪酸的酰胺、脂肪酸的酯。
胆红素及其衍生物物理化学性质胆红素(胆红素IXα)；分子量584.7，红色固体粉末，可溶于氯仿、二甲基亚砜，易溶于0.1M的氢氧化钠水溶液，不溶于水、甲醇、石油醚、正己烷等溶剂，固态及碱性溶液中稳定，溶液中酸性条件下易氧化。
中胆红素XIIIα分子量588.7，亮黄色固体粉末，其溶解性、稳定性与胆红素相同，310℃开始分解。
胆红素及其衍生物的制备1.胆红素(胆红素IXα)胆红素来自市场购买的，因纯度太低，必须经过提纯、重结晶。提纯方法参考文献(A.F.McDonagh and F.Assisi，生物化学杂志(Biochem.J.)，129797-800，1972)并做改进。具体方法如下将市场购得的胆红素500mg加入500mL脱去稳定剂的氯仿中，在氮气流下加热回流半小时，然后冷却至室温。过滤溶液，用0.1M NaHCO3洗氯仿溶液(3×100mL)。然后通过双层滤纸过滤，以除去氯仿中水。在30℃下真空旋转蒸发浓缩氯仿溶液。然后往浓缩的氯仿溶液中加甲醇，至出现混浊，放入冰箱，至出现结晶，过滤。用含少量氯仿的甲醇洗，然后在真空下干燥。根据原料来源不同，回收率为50-90％，纯度为98％以上(以克分子消光系数为65000计)，整个操作要在暗处进行。所有溶剂预先通氩气半小时。
2.胆红素衍生物中胆红素XIIIα的合成乙酰乙酸乙酯的肟与戊二酮在醋酸-锌粉还原下缩合成4-乙酰基-3，5-二甲基-1氢吡咯-2-羧酸乙酯，进一步经还原、水解、脱羧、氧化、溴化得到5-溴甲叉基-4-乙基-3-甲基-2-氧代-2，5-二氢吡咯，该吡咯与2，4-二甲基-5-羧基-1氢吡咯-3-丙酸在甲醇中酸催化回流缩合成黄胆红酸甲酯，再经DDQ(2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-对苯二醌)氧化缩合成中胆绿素XIIIα二甲酯，最后经硼氢化钠还原、水解成最终产物，纯度为99％以上。参考文献(D.A.lightner，J.S.Ma et.al.，杂环化学杂志(J.Heterocyclic Chem.)，21 139-144，1984.R.T.Trull，R.W.Franklin and D.A.Lightner，杂环化学杂志(J.Heterocyclic Chem.)，24 1573-1579 1987)。
结构参数IR(液膜)ν 3420，3260，2966，1704，1689，1629cm-1。1HNMR(氘代氯仿)δ 1.12(t，6H，J＝7Hz)，1.85(s，6H，2、18位CH3)，1，85(s，6H，7、13位CH3)，2.48(q，4H，J＝7Hz)，2.78(m，8H，-CH2CH2COOH)，4.06(s，2H，10位-CH2-)，6.04(s，2H，5、10位＝CH)，9.15(s，2H，吡咯NH)，10.52(s，2H，内酰胺NH)，13.31(s，2H，COOH)ppm；MSM+587.7。UV-Vis(氯仿)λmax431nm，ε，60,000。13CNMR(氘代氯仿)8.54(q)，9.62(q)，15.29(q)，17.64(t)，19.74(t)，23.96(t)，34.81(t)，98.19(d)，119.72(s)，122.43(s)，123.00(s)，123.39(s)，128.28(s)，130.81(s)，147.67(s)，172.42(s)，174.46(s)。
胆红素及其衍生物抗甲1型流感病毒试剂的配制胆红素水溶液的配制准确称取上述纯的2.790mg胆红素IXα于一25mL的容量瓶中，用微量注射器加入250μL的分析纯二甲基亚砜(DMSO)，接着用移液管准确移取5mL 0.2M的磷酸二氢钾(KH2PO4)标准水溶液并加入容量瓶中，振荡使胆红素充分溶解；再准确移取4.28mL 0.2M的氢氧化钠(NaOH)标准水溶液，用滴管逐滴加入容量瓶中，再用去离子水洗滴管和中转容器一并加入容量瓶中，最后用去离子水定容。最终浓度胆红素为111.6μg/mL相当于190.87μM，DMSO为1％(v/v)。缓冲体系(KH2PO4-NaOH)pH值7.6，浓度0.05M。
中胆红素XIIIα水溶液的配制样品量为3.146mg配置成25mL的水溶液(125.8μg/mL相当于214μM)，其操作同上，DMSO为0.5％(v/v)，缓冲体系浓度及pH值同上。
胆红素及其衍生物水溶液的配置还有以下几种方法1.引入水溶性集团，直接溶于水溶液中；a在胆红素的两个羧基上引入两个牛磺酸钠盐，制成二牛磺酸胆红素钠(DTBR)；b在胆红素的两个羧基上引入季铵盐阳离子(如四乙基铵)，制成胆红素的季铵盐。
2.采用药物载体增加其水溶性a血清白蛋白；b β-环糊精包结。
本发明胆红素及其衍生物中胆红素XIIIα的制剂对甲1型流感病毒的抑制作用是明显的，因此可以作为抑制甲1型流感病毒的药物使用。胆红素及衍生物中胆红素XIIIα的合成简单，成本较低。这类药物能够抑制甲1型流感病毒，而其对生物体及人体低的毒副作用则是经过长期的医学临床观察证明了的。综上所述，胆红素及其衍生物作为一类抗甲1型流感病毒药物具有极大的进一步开发、研究的价值。
图1.胆红素微摩尔浓度的对数对甲1型流感病毒的平均抑制率作图；图2.衍生物微摩尔浓度的对数对甲1型流感病毒的平均抑制率作图。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
胆红素及其衍生物体外抗病毒实验方法及实验结果实验材料1.鸡胚10-12日龄鸡胚(购自中国农业大学)2.病毒唑(购自江苏新沂制药厂，批号960330)3.菌株甲1型流感病毒株(中国预防科学院病毒学研究所提供)(一)胆红素实验试剂配制
胆红素水溶液的配制准确称取纯度为98％以上的2.790mg的胆红素IXα于一25mL容量瓶中，用微量注射器加入250μL的分析纯二甲基亚砜(DMSO)，接着用移液管准确移取5mL 0.2M的磷酸二氢钾(KH2PO4)标准水溶液并加入容量瓶中，振荡使胆红素充分溶解；再准确移取4.28mL 0.2M的氢氧化钠(NaOH)标准水溶液，用滴管逐滴加入容量瓶中，再用去离子水洗滴管和中转容器一并加入容量瓶中，最后用去离子水定容。最终浓度胆红素为111.6μg/mL相当于190.87μM，DMSO为1％(v/v)。缓冲体系(KH2PO4-NaOH)pH值7.6，浓度0.05M。
实验方法用无菌生理盐水将胆红素原液稀释为1∶2、1∶4、1∶8、-----1∶64的溶液，分别取不同稀释度的药液1mL与100EID50的病毒液1mL与试管内混合，室温作用1小时；病毒唑按5mg/mL浓度与病毒液等量混合。分别取上述混合物0.2mL接种鸡胚尿囊腔，生理盐水对照组接种生理盐水0.2mL，病毒对照组接种100EID50病毒液0.1mL。用蜡封好接种孔，置37℃卵育箱培养48小时。收获鸡胚尿囊液，做血凝实验。
实验结果胆红素对甲1型流感病毒繁殖抑制作用结果组别 病毒 实验次数1 2 3 4原液 甲1- - - -1∶2 甲1- - - +1∶4 甲1- - ++-胆红素1∶8 甲1++ ++ - -1∶16甲1+ ++ ++-1∶32甲1+ ++ +++++1∶64甲1+++ +++ +++ ++++NS对照组- - - - -病毒对照组 甲1++++++++++++ ++++病毒唑组 甲1- - - -注+代表有病毒繁殖；-代表无病毒繁殖；NS代表正常生理盐水。(二)胆红素衍生物中胆红素XIIIα实验试剂的配制
中胆红素XIIIα水溶液的配制准确称取纯度为99％以上3.146mg的中胆红素XIIIα于一25mL的容量瓶中，用微量注射器加入分析纯125μL的二甲基亚砜(DMSO)，接着用移液管准确移取5mL 0.2M的磷酸二氢钾(KH2PO4)标准水溶液并加入容量瓶中，振荡使中胆红素XIIIα充分溶解；再准确移取4.28mL 0.2M的氢氧化钠(NaOH)标准水溶液，用滴管逐滴加入容量瓶中，再用去离子水洗滴管和中转容器一并加入容量瓶中，最后用去离子水定容。最终浓度中胆红素XIIIα为125.8μg/mL相当于214μM，DMSO为0.5％(v/v)。缓冲体系(KH2PO4-NaOH)pH值7.6，浓度0.05M。
实验方法用无菌生理盐水将胆红素衍生物中胆红素XIIIα原液稀释为1∶2、1∶4、1∶8、-----1∶64的溶液，分别取不同稀释度的药液1mL与100EID50的病毒液1mL与试管内混合，室温作用1小时；病毒唑按5mg/mL浓度与病毒液等量混合。分别取上述混合物0.2mL接种鸡胚尿囊腔，生理盐水对照组接种生理盐水0.2mL，病毒对照组接种100ElD50病毒液0.1mL。用蜡封好接种孔，置37℃卵育箱培养48小时。收获鸡胚尿囊液，做血凝实验。
实验结果中胆红素XIIIα对流感病毒体外繁殖抑制作用结果组别病毒实验次数1 2 3 4原液 甲1- - - -1∶2 甲1- - - +1∶4 甲1- - - ++中胆红素 1∶8 甲1- ++++-XIII α 1∶16甲1+++ +++ ++++ ++++1∶32甲1++++ ++++ ++++ ++++1∶64甲1++++ ++++ ++++ ++++NS对照组 - - - - -病毒对照组 甲1++++ ++++ ++++ ++++病毒唑组甲1- - - -注+代表有病毒繁殖；-代表无病毒繁殖；NS代表正常生理盐水。
实验证明胆红素及其衍生物中胆红素XIIIα在实验浓度下不影响鸡胚的正常生长发育；保温培养48小时后进行血凝实验排除了非特异性抑制的机制。分析上表数据可以看出，原液对甲1型流感病毒有完全的抑制作用；胆红素及中胆红素XIIIα具有对甲1型流感病毒50％抑制浓度(IC50)分别为13.95μg/mL(23.86μM)和15.73μg/mL(26.75μM)，均为1/8稀释的原液浓度。通过附图也可看出，在实验浓度范围内，当越过某阀值浓度时，随着色素浓度的增加，色素对病毒的抑制作用显著提高，直至完全抑制。所有这些都说明，胆红素及其衍生物中胆红素XIIIα在其25μM左右以上浓度的缓冲水溶液中具有明显的抑制甲1型流感病毒的作用，且无毒副作用。
权利要求
1.一种胆红素及其衍生物作为抗甲1型流感病毒剂的用途，其特征在于下述结构的胆红素及其衍生物用于制备抑制甲1型流感病毒剂
R1R2R3R4R5R6R7R8胆红素IXα M V M P P M M V中胆红素XIIIαM E M P P M E MM＝CH3，E＝CH2CH3，V＝CH＝CH2，P＝CH2CH2COOH。
全文摘要
本发明属于胆红素及其衍生物在医药领域中的应用,特别是涉及胆红素及其衍生物作为抗甲1型流感病毒剂的用途。其特征在于下述结构的胆红素及其衍生物用于制备抑制甲1型流感病毒剂。
文档编号A61P31/00GK1262928SQ9910066
公开日2000年8月16日 申请日期1999年2月12日 优先权日1999年2月12日
发明者马金石, 王鹏, 阎芳 申请人:中国科学院感光化学研究所