具有活性的刺猬状蛋白偶联物及其生产方法和用途的制作方法

专利名称：具有活性的刺猬状蛋白偶联物及其生产方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种活性增强的刺猬状(hedgehog)蛋白偶联物(conjugate)及其生产方法和医疗用途。
刺猬状(hh)蛋白可以理解为是一族分泌出的信号蛋白，在胚胎发生中它们对许多结构的形成都起作用(J.C.Smith，《细胞》76(1994)193-196,N.Perrimon，《细胞》80(1995)517-520,C.Chiang等，《自然》83(1996)407,M.J.Bitgood等，《当代生物学》，6(1996)296,A.Vortkamp等，《科学》273(1996)61 3,C.J.Lai等，《发育》121(1995)2349)。在其生物合成过程中，对信号序列的裂解和自身催化的裂解后，可得到20kD的N-末端结构域和25kD的C-末端结构域。在天然蛋白质中，裂解C-末端结构域后，N-末端结构域在它的C-末端受到胆固醇修饰(J.A.Porter等，《科学》274(1996)255-259)。在高等的生命形式中，hh家族至少由三个成员组成即sonic、indian和desert hh(shh、Ihh、Dhh；M.Fietz等，《发育》(增刊)(1994)43-51)组成。在原核细胞和真核细胞中重组产生后可以观察到生成的刺猬状蛋白活性的差异(M.Hynes等，《神经元》15(1995)35-44和T.Nakamura等，《生物化学与生物物理学研究通讯》237(1997)465-469)。
Hynes等比较了在转化的人胚肾293细胞的上清液中hh(真核细胞hh)与大肠杆菌中生成的hh的活性，发现从肾细胞系上清液中得到的hh的活性高四倍。这种hh活性增长的原因经讨论认为是由于存在只能在真核细胞中表达的潜在的额外辅助因子、翻译后的修饰、不同的N-末端(因为从大肠杆菌细胞分离的hh 50％都携带两个附加N-末端氨基酸(Gly-Ser)或缩短了5-6个氨基酸)，或者是由于较高聚集状态(如通过与镍琼脂糖珠结合)。
Nakamura等比较了在转化的鸡胚胎成纤维细胞上清液中的shh与从大肠杆菌中分离的仍具有N-末端多组氨酸部分的shh融合蛋白的活性。在C3H10T1/2细胞中刺激碱性磷酸酶(AP)方面，该成纤维细胞上清液中的shh比纯化的该大肠杆菌蛋白有高7倍的活性。现已假定这种增强的活性是由于hh与诸如骨形态发生蛋白(BMPs)之类分子的协同作用的缘故，所述骨形态发生蛋白仅存在于真核细胞的上清液中，与hh组合时能够更强地诱导AP。
Kinto等，FEBS Letters,404(1997)319-323中描述了在胶原上肌内植入分泌hh的成纤维细胞能够诱导异位骨形成。但是，分离出的hh蛋白尚未知有这一活性。
本发明的目的是提供比已知形式具有显著提高的活性的hh蛋白(多肽类)。
该目的是通过重组生成已人工使其亲脂化的刺猬状蛋白而得以实现的。优选这种亲脂化是采用化学修饰方法实现的。这类刺猬状蛋白偶联物最好包括一个附加多肽，所述多肽是共价结合的(优选在C-末端和/或N-末端)，并且由10-30个优选的疏水氨基酸和/或那些形成跨膜螺旋结构的氨基酸组成。这种附加多肽特别优选包含2-12个赖氨酸和/或精氨酸但是不含多组氨酸部分，所述多组氨酸部分适合于在Ni螯合物柱上纯化该偶联物。也优选共价结合(优选在C-末端和/或N-末端)1-4个链长为8-24个碳原子的饱和或不饱和烃基或有亲脂性(疏水)作用的类固醇。而且，优选通过氧化所形成的二硫桥将疏水性巯基化合物，如特别是巯基胆固醇和巯基链烷烃、巯基链烯烃与hh蛋白共价偶联(优选在C-末端和/或N-末端半胱氨酸，此处是在N-末端半胱氨酸)。
所述蛋白质可以用这类亲脂基团疏水化，这样能够改善该蛋白质与真核细胞(特别是哺乳动物细胞)的脂膜的相互作用。
所以，应当将本发明亲脂化蛋白理解为是疏水化蛋白，它相对于未修饰的蛋白具有增强的表面疏水性，这样增加了它对非极性分子或两亲物的亲合力。该蛋白亲脂性程度的增加可以通过如Haque,Z.等，农业与食品化学杂志(J.Agric.Food Chem.)30(1982),481所述的在脂质层聚集的程度来测定。蛋白质的疏水化(亲脂化)修饰方法例如在Haque,Z.等，农业与食品化学杂志31(1983)1225-1230；Webb,R.J.等，《生物化学》37(1998)673-679；Hancock,J.F.，《细胞》63(1990)133-139；《膜蛋白纯化的实践指南》，G.v.Jagow,Hermann Schagger(1994)编辑，(第16章，第535-554页)中进行了描述。
令人惊奇的结果是在药剂和体外试验中这种亲脂化刺猬状蛋白(在下文中也指刺猬状蛋白偶联物(hh偶联物))比未修饰的刺猬状蛋白(如在大肠杆菌中细胞质表达后)活性显著提高，优选提高至少10倍，特别优选提高103-105倍。另外，还令人惊奇的是本发明这种刺猬状蛋白偶联物可特别有利地用于对骨、软骨、神经细胞(在神经损伤或神经变性疾病中)或肌肉组织的局部治疗中。
从Yang等在《发育》124(1997)4393-4404中得知，对体内药物有效活性来说，刺猬状蛋白的局部高浓度必须在身体内作用部位保持至少16小时。由于Yang等就此所述的载体系统(即装载有刺猬状蛋白的色谱基质affigel CM),Marti等在《自然》375(1995)322-325中所述的Ni琼脂糖或者Lopez-Martinez等在《当代生物学》5(1995)791-796中所用的Affigel兰或者他们所用的肝素琼脂糖颗粒具有免疫原性，并且能够引起炎症反应，所以它们都不太适合用于药物应用中。
本发明的偶联物是新的活性物质，可用于生产施用的药物剂型。总的说来，偶联导致刺猬状蛋白的药物动力学曲线有所改良。疏水性烃基能使刺猬状蛋白定位于靶细胞的细胞膜上，这样，除了容易使刺猬状蛋白整合到细胞内以外，总的说来还使刺猬状蛋白在细胞表面的存在时间显著延长，这对药理作用来说是最好不过了。
本发明偶联物不一定需要另外偶联到载体上以便缓慢释放。本发明刺猬状蛋白偶联物在未从载体中形成长期持续释放(几天)的情况下也能在体内作用部位具有较高活性。不过，对局部使用本发明刺猬状蛋白偶联物来说，使用包含本发明偶联物和载体基质的这样一种药物组合物是有利的。该载体基质具体来说是通过为这种药物组合物提供局部使用的合适最小粘度而基本上起到利于局部应用的作用。该药物组合物优选缓冲于pH4-9之间，并且包括一种或几种非离子型去污剂如聚氧山梨酸酯或聚氧乙烯型去污剂(如Tween20,Tween80,TritonX-100)、辛基葡糖苷，或离子型去污剂如脱氧胆酸钠、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠。
在一个优选的实施方案中，表达了在N-末端和/或C-末端包含附加的10-30个主要是疏水氨基酸的hh蛋白，因为这些氨基酸也掺入到细胞膜中[Webb等，《生物化学》37(1998)673-679,Skolnick等，生物膜(1996)536-554；ed.:Merz和Roux]。在本发明情况中，应当将疏水性氨基酸理解为在从水相到疏水/有机相的转换中具有负自由能的氨基酸。而且，已知能形成跨膜螺旋结构的N-末端和/或C-末端序列(如M28肽)，或者能够作为螺旋结构而与膜表面作用的N-末端和/或C-末端序列(如maginin2)(Skolnick等，1996)也适合用于增加hh蛋白的活性。
在进一步优选的实施方案中，通过含有2-12个赖氨酸和/或精氨酸的多肽基团对刺猬状蛋白的N-末端和/或C-末端进行修饰。在这种情况下，有可能省略用烃基进行的修饰。
具有疏水作用并且链长为8-24，优选10-24，最优选12-18个碳原子的一种饱和或不饱和脂族烃基优选是任意用氧或硫原子或羰基打断的饱和的/或单一不饱和到多不饱和的脂肪酸或烷基醇基团。特别优选的饱和脂肪酸是癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸和山萮酸。优选的单一不饱和脂肪酸是肉豆蔻酸、棕榈油酸和油酸。特别优选的多不饱和脂肪酸是亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸。这类脂肪酸基团优选通过酯键、酰胺键、二硫键或硫酯键而与该蛋白的反应性基团偶联。
每个蛋白质分子的疏水性烃链数能够通过反应条件(如稀释)或者通过选择被修饰的氨基酸来适当地控制。例如，shh包含三个半胱氨酸，其中N-末端半胱氨酸特别活泼。这样，反应步骤能够使得N-末端半胱氨酸被一个或者多个疏水性烃链所修饰。从统计学上讲，修饰两个或几乎所有三个半胱氨酸也是可能的。尽管当修饰其他氨基酸时优选修饰所指定的氨基酸，但也有可能在药物组合物中使用衍生的刺猬状蛋白，所述衍生的刺猬状蛋白存在每个分子大约1到4条链的烃链修饰这种统计学分布。尽管每个分子中烃链数较高是适合的，但由此使得药物组合物的溶解度下降，这会破坏活性三维蛋白结构。当与长链烷基(C14-C24，优选C16-C24)偶联时，优选只偶联1-2条碳链，然而，当偶联短碳链时，优选偶联2-3个烷基。
在优选的实施方案中，所述衍生作用也包括将两个疏水烃链偶联于一个氨基酸上。这可通过例如将脂肪酸的甘油二酯与所述氨基酸偶联来实现。
由于刺猬状蛋白十分不稳定，在一个优选的实施方案中，将N-末端半胱氨酸的SH基团受到保护的刺猬状蛋白用于偶联。通过在偶联步骤之前或偶联过程中迅速还原受保护的SH基团即可以得到一种SH偶联产物。优选通过形成同源刺猬状二硫键或混合的二硫键(如用GSH或β-巯基乙醇)来保护该半胱氨酸的SH基团。
巯基保护基在本领域是已知的，包括但不限于三苯甲基(三苯甲游基)和s-叔丁基、s-对硝基苄基和s-对甲氧基苄基(参见如Greene和Wuts，《有机合成中的保护性基团》，第二版，John Wiley&Sons，纽约(1991)，和Atherton等，《肽》，Gross和Meienhofer编辑，Academic Press，纽约(1983)，第19卷，1-38)。对生产巯基受到修饰的刺猬状蛋白来说，这种巯基受到保护的或同型二聚体化的刺猬状蛋白是有价值的中间体，它们是本发明的主题。
本发明还涉及刺猬状蛋白的用途，其中N-末端半胱氨酸的SH基团受到保护或被同型二聚体化，可作为稳定的中间体来生产SH受到修饰的刺猬状蛋白。在该工艺中，裂解保护性基团或者裂解同型二聚体，并且与激活的衍生剂反应。
优选下列方法来偶联SH受到保护的刺猬状蛋白Ⅰ．当用咪唑化物(imidazolides)或辅酶A衍生物进行偶联时，优选在偶联混合物中还原二硫化物或裂解保护基团。
Ⅱ．还原二硫化物，在酸性基质中分离未被保护的单体，立即在中性范围使用激活的二硫化物(如吡啶基-SS)作偶联剂进行偶联。
现已清楚N-末端半胱氨酸上的双酰化主要出现在用咪唑化物或辅酶A衍生物(约60-70％)的偶联中，其中，被偶联的疏水化合物一方面以酰胺结合，另一方面以硫酯形式结合。选择性裂解以硫酯形式结合的疏水性化合物能够合成单一疏水化的刺猬状蛋白。这种选择性裂解可用还原剂如DTE或羟胺进行。
通过激活的二硫化物如吡啶基-SS衍生物的偶联会导致单烷基化。本发明所述的工艺能够使许多疏水物质如类固醇、含有巯基的碳链(如脂肪酸)偶联到刺猬状蛋白质上。
所以，本发明的另一个主要目的是生产巯基被修饰的刺猬状蛋白或其N-末端片段(优选主要含有N-末端结构域的片段)的工艺，其特征在于保护刺猬状蛋白的N-末端半胱氨酸的巯基，分离以这种方式修饰的蛋白质，在裂解了保护基团后，优选通过一种疏水化合物如脂肪酸或类固醇而与SH基团共价偶联，从而在N-末端半胱氨酸处将该刺猬状蛋白衍生化。这种偶联优选是可逆的，能够在哺乳动物细胞中和体内存在的生理还原条件下逆转，从而形成未疏水化的刺猬状蛋白。
本发明的又一个主要目的是将疏水化合物通过N-末端半胱氨酸的SH基而偶联到刺猬状蛋白或其片段上的工艺，其特征在于保护刺猬状蛋白的N-末端半胱氨酸的巯基，将所述受到保护的SH基还原，并且使该刺猬状蛋白与疏水化合物的一种激活的衍生物反应从而在该刺猬状蛋白和疏水化合物之间形成一个硫醇键。在一个优选的实施方案中，可以通过一个酰胺键将疏水化合物的另一分子偶联到刺猬状蛋白上。
例如，疏水化合物的咪唑化物和辅酶A衍生物适合作为激活的疏水化合物。这种激活的化合物优选用于方法Ⅰ中(参见上述)。
疏水化合物的吡啶基二硫化物衍生物也适合于作为激活的疏水化合物。这种激活的化合物优选用于方法Ⅱ中(参见上述)。
优选使用天然或非天然的饱和和单一不饱和或多不饱和脂肪酸，特别是链长为4-18、优选8-18个碳原子的饱和脂肪酸或者类固醇通过咪唑化物工艺来酰化刺猬状蛋白，由此得到其内烃基具有8-24个碳原子的偶联物。
为了通过吡啶基二硫化物工艺连接疏水化合物和刺猬状蛋白，优选使用天然或非天然的饱和和单一不饱和或多不饱和巯基烷烃，特别是含巯基、链长为8-24个碳原子的饱和碳链，巯基类固醇，特别是巯基胆固醇。
在本发明的工艺中，优选刺猬状蛋白的使用浓度为0.01-10mg/ml，特别优选为3mg/ml。盐浓度优选为0-2mol/1。优选使用氯化钠。偶联剂与蛋白质的摩尔比在1∶2到20∶1比较好。优选的缓冲液是Hepes缓冲液、磷酸盐缓冲液和MES缓冲液。该偶联反应优选在pH4.5-8.5，更优选在pH6.5-7.5之间进行。反应时间取决于所用的条件，对制备二棕榈酰基化的shh来说最好是5分钟到5天。该反应优选在0-40℃之间的温度范围进行。低温下(优选在10℃以下，如4℃)副产物的比例较低。
去污剂的加入对本发明的工艺特别有益。这种试剂可以是诸如离子型或非离子型去污剂。优选两性离子去污剂。优选的浓度大约是0.5-3％(v/v)。
烃链或类固醇可有利地通过酰胺键、酯键、二硫键或硫酯键与该蛋白质的反应性基团如游离的羟基、巯基、羧基或氨基偶联。这种工艺对本领域普通技术人员是已知的，在例如Wong,S.S.,Chemistry of Protein Conjugation and CrossLinking,CRC Press,Boca Raton,FL.,美国，1993中进行了描述。例如，脂肪酸能够通过琥珀酰亚胺酯或N-顺丁烯二酰亚胺偶联剂(如棕榈酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)或通过脂肪酸酐、脂肪酸咪唑酯或酸性氯化物与辅酶A(例如棕榈酰基辅酶A)偶联成硫酯。
棕榈酰基辅酶A、硬脂酰基辅酶A或肉豆蔻酰基辅酶A的偶联工艺例如在Ross等，《神经科学研究杂志》21(1988)35-44,Bizzozero等，《生物化学杂志》262(1987)2138-2145中进行了描述，对于微管蛋白的偶联工艺在0zols,J.等，《细胞的分子生物学》8(1997)637-645中进行了描述。对于卵清蛋白(Segawa,A.,等，Int.Archs Allergy appl.Immun.66(1981)189-199)或肽类(Yadav,S.P.等，《生物化学与生物物理学研究通讯》205(1994)1688-1695)的脂肪酸酐的衍生作用也进行了描述。还有许多用脂肪酸琥珀酰亚胺酯乙酰化的例子，例如对酪蛋白的乙酰化(Haque,Z.等，《农业食品化学杂志》31(1983)1225-1230)，(Haque,Z.等，《农业生物化学》46(1982)597-599)。也可以通过融合对象(例如棕榈酰基-Cys-CHO)上的醛基偶联到N-末端半胱氨酸上(Liu等，《美国国家科学院院报》91(1994)6584-6588)。实现丝氨酸的N-末端偶联的方法是将它转化成醛基、与酰肼(例如，棕榈酰基-Cys酰肼)反应并稳定所形成的腙(如通过用NaBH3CN还原)(Gaertner等，Bioconjugate Chem.3(1992)262-268)。
根据偶联化学，以例如醚、硫醚、酯、硫酯、二硫化物或酰胺的形式将疏水烃链结合到活性氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、精氨酸或赖氨酸的侧基上。Wong,S.S.在《蛋白质共轭和交联化学》，CRC Press Inc.,Boca Raton,FL，美国(1993)和Lundblad(1995)在《蛋白质修饰技术》中描述了对特定氨基酸进行特殊偶联的方法。
在本发明的一个优选实施方案中，将疏水化合物溶于有机溶剂或有机溶剂和水的混合物(优选含有10％(v/v)以上的有机溶剂)中。这类有机溶剂优选是二噁烷、四氢呋喃或异丙醇。为了偶联疏水化合物和刺猬状蛋白，将该疏水化合物的这种溶液与含有去污剂的刺猬状蛋白(优选以它的受保护形式)溶液混合，使得该混合物包括10％或更少的有机溶剂。现已发现含有高于10％的有机溶剂的刺猬状蛋白溶液会使刺猬状蛋白沉淀和/或变性。
在另外优选的实施方案中，在有增溶性去污剂如具体是脱氧胆酸钠、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、辛基葡糖苷或TritonX-100的存在下，通过氧化形成二硫桥而将巯基胆固醇与巯基，特别是N-末端半胱氨酸的巯基偶联。与用胆固醇在C-末端天然修饰的hhN-末端片段相比，在此工艺中生成了在N-末端含有巯基胆固醇的hh形式。这种形式具有与天然形式相似的增强活性，但是能够更简单更大量地生成。由于二硫桥的细胞质不稳定性，所以，这种hh形式没有或只有轻微的免疫原性潜力。
为了增加经亲脂性修饰的hh蛋白的溶解度，另外优选在有可溶性阴离子多糖如苏拉明和肝素存在下进行衍生作用和/或随后的纯化或药物配制。
本发明所述的活性应当理解为在哺乳动物细胞中该多肽能够诱导的碱性磷酸酶的活性(在碱性磷酸酶试验中的活性)。在该方法中，用含有胎牛血清的培养基培养小鼠成纤维细胞系。接着，加入过滤除菌的样品，大约5天后裂解细胞，并通过生色底物(pNP，对硝基苯酚)的裂解来测定细胞裂解物中的碱性磷酸酶(J.Asahina,《实验细胞学研究》222(1996)38-47和T.Nakamura(1997))。
本发明的刺猬状蛋白应当理解为是一种分泌的信号蛋白(19kD的N-末端的信号结构域)，这种信号蛋白对胚胎发生中许多结构的形成起作用。特别优选使用sonic、indian或desert hh(Fietz M.等，《发育》(增刊)(1994)43-51)。优选使用具有EMBL数据库中No.L38518所述序列的hh蛋白。刺猬状蛋白家族的蛋白质在它们的氨基酸序列中具有明显的同源性，这就是为什么也优选表达编码与上述sonic刺猬状蛋白(shh)序列有80％或更大同源性的刺猬状蛋白的那些核酸的原因。蛋白质同源性能够在计算机程序Gap或BestFit帮助下测定(Wisconsin大学；Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》48(1970)443-453；Smith和Waterman，《高等应用数学》2(1981)482-489)。
人sonic hh前体蛋白是由EMBL数据库中No.L38518所述序列的第1-462位氨基酸组成。氨基酸1-23表示信号肽，氨基酸24-197表示成熟的信号结构域，氨基酸32-197表示缩短了八个氨基酸的信号结构域，氨基酸198-462表示在自身蛋白水解裂解后自动加工的C-末端结构域。所以，按照本发明，hh蛋白中优选发生偶联的N-末端或C-末端应当理解为是N-末端信号结构域24-197的第一个氨基酸(N-末端)或最后一个氨基酸(C-末端)。优选偶联于最初10个或最后10个氨基酸中的一个或几个氨基酸处。特别优选偶联于N-末端结构域N-末端的第一个或第二个氨基酸(AA24或25)或者N-末端结构域C-末端的最后一个或倒数第二个氨基酸(AA196或197)。在本发明刺猬状蛋白偶联物中，优选将亲脂基团或烃链偶联于hh蛋白的N-末端结构域，偶联产物具体是在24位的N-末端半胱氨酸与月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸或油酸或者类固醇形成的硫酯或酰胺，或者是通过二硫桥结合了巯基胆固醇或巯基链烷烃/链烯烃的hh蛋白。优选在原核表达系统(如大肠杆菌)中，使用本领域普通技术人员所熟悉的方法重组生产未修饰的hh蛋白。该刺猬状蛋白优选以可溶解的方式作为融合蛋白而重组产生，从细胞培养物的上清液中分离出来，或者在溶解宿主细胞后，用一种序列特异性蛋白酶如肠激酶裂解(优选N-末端)融合部分(如多组氨酸、链霉抗生物素蛋白等)，并且通过与巯基保护试剂反应或者通过在该半胱氨酸处由二硫桥将该刺猬状蛋白二聚体化来保护N-末端半胱氨酸的游离巯基。
本发明药物组合物含有药理上有效剂量的hh偶联物，并且优选能够局部给药。优选将本发明的偶联物与刺猬状蛋白家族的其它蛋白或者骨生长因子如骨形态发生蛋白(BMP)(Wozney等，《骨的细胞分子生物学》，骨形态发生蛋白及其基因表达(1993)学术出版公司，131-167)或甲状旁腺素(Karablis等，《基因和发育》8(1994)277-289)或者胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ或Ⅱ)或者转化生长因子(TGF-β)一起结合使用。
在另一个优选的实施方案中，优选含有苏拉明的本发明刺猬状蛋白偶联物的药物组合物，这能有利于使用。
在一个优选的实施方案中，该药物组合物含有浓度为0.01-10mg/ml、尤其是0.01-1mg/ml的刺猬状蛋白偶联物。
在一个优选的实施方案中，该药物组合物还含有一种药学上可接受的缓冲液，该缓冲液在pH4-10，特别优选pH6-9，最好在pH7左右是生物相容性的。为了防止折叠结构的变性和络合在刺猬状蛋白上的Zn的脱落，该药物组合物的pH值最好是高于pH4。该缓冲液的浓度优选是1-500mmol/1，更优选10-100mmol/l。所以在一个适当的实施方案中，将20mmol/l磷酸钾缓冲液(pH7.2)用作缓冲液。
而且，生产该药物组合物时，最好加入辅助物质，如糖(甘露糖醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖，优选20-100mg/ml)或者氨基酸如甘氨酸或精氨酸，以及抗氧化剂如EDTA、柠檬酸盐、聚乙二醇(1-10重量％)、抗坏血酸、生育酚、去污剂(优选非离子型去污剂)(优选0.005-1重量％)如聚山梨酸酯类或聚氧乙烯型去污剂(如Tween20、Tween80)或聚氧乙烯类，或者离子型去污剂如胆酸钠、脱氧胆酸钠或牛磺脱氧胆酸钠，抗炎剂，局部麻醉剂，抗生素和/或稳定剂如脂类、脂肪酸或甘油。
本发明的偶联物在骨诱导药物组合物中可有利地用于诱导或刺激软骨细胞和骨细胞，或者也能诱导肌肉和神经细胞。例如从US5,364,839、WO97/35607和WO95/16035中可获知一些骨诱导药物组合物。
可以按照Glansbeek,H.L.等，《实验室研究》78(1998)133-142；US专利No.5,270,300；Toriumi,D.M.，等，Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.117(1991)1101-1112；Cook,S.D.,等，《骨和关节外科杂志》(J.Bone and Joint Surgery)76-A(1994)827-837；以及Riley,E.H.等，Clin.Orthopaed.and RelatedResearch324(1996)39-46所述体内评估本发明刺猬状蛋白偶联物的活性。
当将本发明偶联物局部给药时，优选将它与作为载体的适当基质和/或与螯合剂一起使用。这类基质适合于体内特别是在骨或软骨组织的周围以活性形式缓慢释放该蛋白质。该多价螯合剂是一种易于通过例如注射给药和/或可防止或者至少是延迟本发明蛋白质从给药部位迁移的物质。
本发明药物组合物优选含有具有细胞粘附功能的聚合物(结构物质)。这类结构物质例如是胶原。
生物相容性的、可降解的物质例如基于胶原的物质或者基于聚乳酸、聚乙醇酸或者乳酸和乙醇酸共聚物的其它聚合物特别适合于用作基质物。这类聚合物基质在例如W093/00050中进行了描述。
多价螯合剂例如是纤维素和纤维素样物质，例如烷基纤维素、羧甲基纤维素、透明质酸、藻酸钠、聚乙二醇和聚乙烯醇，其中特别优选透明质酸，特别是当在没有载体基质的药物组合物中时。
下面的实施例、说明书、序列表和附图进一步解释本发明和专利权利要求所描述的保护范围。所描述的方法应当理解为仅是举例，即使在改进后也能描述本发明的主题。
附图描述

图1表示用棕榈酰基辅酶A衍生后的重组人shh的活性。
图2表示用巯基胆固醇衍生后的重组人shh的活性。
实施例1a)克隆连有His-6锚以及肠激酶裂解位点的人sonic hh；在大肠杆菌中表达使用下列步骤从任何理想质粒或含有sonic hh的相应cDNA中扩增人sonic hh的成熟N-末端部分(aa24-Cys到197-Gly)借助于两个引物(344和345)，扩增从内部RsrⅡ裂解位点直到氨基酸198编码序列的一段shh基因，同时可以在C末端连上几个终止密码子和一个PstⅠ裂解位点。SEQ ID NO:1引物344:5′-ca gaattc ttg cggaccg ggc agg gg 26-merEcoRⅠ RsrⅡSEQ ID NO:2引物345:5′-ga ctgcag tta a tca tta gcc tcc cga ttt ggc cgc 36-merPstⅠ终止 终止 终止密码子密码子密码子可用RsrⅡ和PstⅠ再裂解以这种方式扩增的DNA片段，这在下述步骤中是必需的(片段344/345)。
通过将另外两个引物(346/347)退火来构建接头，借助于该接头，在N-末端掺入6个组氨酸残基和一个肠激酶裂解位点(EK):SEQ ID NO:3引物346:5′-aattc atg cat cat cac cac cac cac gat gac gac gac aaa tg cg| His6 EkEcoRⅠ突出SEQ ID NO:4引物347:5′-gtc cgc att cgt cgt cgt cat cgt ggt ggt ggt gat gat gca tg|RsrⅡ突出346和347退火后的衔接头aattc atg cat cat cac cac cac cac gat gac gac gac aaa tgc gg tac gta gta gtg gtg gtg gtg cta ctg ctg ctg ttt acg c ctg为了进行表达，将PCR片段344/345与衔接头346/347一起克隆到已用EcoRⅠ/PstⅠ裂解的载体中。这一步骤可以直接进行或者在间接将片段344/345克隆至其它载体后进行。为了在大肠杆菌中进行表达，已用EcoRⅠ/PstⅠ裂解的载体必需在EcoRⅠ末端含有一个适当的启动子，优选T5、tac、lac等。为了进行该表达，将shh表达质粒转染到一个适当的大肠杆菌菌株中。该表达系统还含有编码原核细胞中的精氨酸tRNAAGA/AGG的核酸(Brinkmann等，《基因》85(1989)109-114)。
b)发酵101 hedgehog的大肠杆菌表达克隆的发酵从典型培养物(存放在-20℃下的平板涂片或安瓿中)制备前培养物，并将其在30-37℃振摇培养。在每种情况下，接下来的大体积培养中，接种体积为1-10体积％。将氨苄青霉素(50-100mg/1)加入前培养物和主要培养物中以便对质粒的丢失进行负筛选。
可以使用的营养物是酶解的蛋白质和/或酵母提取物作N-和C-源，以及甘油和/或葡萄糖作额外的C-源。将该培养基缓冲于pH7，并且加入生理可耐受浓度的金属盐来稳定发酵过程。发酵温度为25-37℃。通过测定528nm处的光密度来确定生长情况。用IPTG诱导该表达。在经过约30小时的发酵期后，在OD稳定时通过离心收集生物量。实施例2a)重组人shh二聚物的制备用高压压滤器将实施例1b中制备的55g生物量溶解、离心分离，并且将上清液上样到50ml螯合琼脂糖柱(Pharmacia Biotech)中，该柱已事先装载了Zn。用在50mM Hepes；250mM NaCl；pH7.4中0到200mM的咪唑梯度洗脱shh融合蛋白。通过SDS-PAGE鉴别出含有shh的洗脱级分，将它们合并，并用一体积的50mM Hepes；pH7.4稀释。离心分离在稀释过程中产生的沉淀，在4℃对50mMHepes(pH7.4)透析该上清液。向500mg以这种方式得到的shh融合蛋白中加入肠激酶(1∶500；ww；Boehringer Mannheim GmbH)和β-ME(终浓度10mM)，并且在35℃的水浴中温育16小时。接着加入固体DTT到10mM的浓度。将样品上样到166ml的SP-琼脂糖(Pharmacia Biotech)柱上，用在20mM HEPES,pH7.4中的0-800mM NaCl梯度洗脱。经SDS-PAGE分析峰级分后，合并主要级分，等分并且在-80℃下存放直到下一次使用。在非还原性条件下这些主要级分含有的shh是二聚物，它是通过可还原的二硫桥而交联的，具有大约38kDa的表观分子量。
b)通过还原条件下的保温来修饰用10mM DTE还原二聚物形式的shh(浓度为1mg/ml)(30分钟，25℃)，并且对含有0.5mM DTT的PBS透析过夜。通过RP-HPLC脱盐后，该透析液的质谱显示大多数单体化shh是32±4道尔顿(N-末端半胱氨酸的双氧化)和47±4道尔顿的加合物(即除了导致质谱峰拓宽的没有特殊说明的其他修饰之外)。以这种方式修饰的shh形式不能通过再氧化重新二聚化。这表明N-末端半胱氨酸的SH基团已经修饰为稳定的形式。所以该SH基团不再能够进行进一步的反应，例如形成硫酯，从而大大降低了用疏水化合物进行衍生作用的产率。所以，为了体外酰化N-末端半胱氨酸，已还原的shh存在于溶液中的时间应当尽可能地短，在适当的偶联化学中，该反应应当在Tris(2-羧基乙基)膦盐酸化物(TCEP·HCl)的存在下进行，因为这将只攻击二硫化合物而不攻击(激活的)硫酯。
c)与溶剂pH值有关的shh再氧化形成二聚物的动力学通过加入2mM TCEP(Tris(2-羧基乙基)膦盐酸化物)在25℃还原分子间二硫桥15分钟而使0.5ml shh二聚物(浓度为2.7mg/ml)单体化。接着用在PBS pH7.0或PBS pH5.0中的PD-10-柱(Pharmacia)将样品重新缓冲，在通过RP-HPLC除去还原剂后，分析自发二聚化(于25℃)相对于保温时间的情况。
结果总结在表2中表2
可以看出shh单体可自发发生二聚化。这种二聚体化作用在pH7.0时非常迅速，但在pH5.0是以更缓慢的动力学进行的。实施例3a)制备偶联剂以用于选择性酰化半胱氨酸中的SH基团(Ⅰ)咪唑化物工艺采用与文献(Leksyszyn,J.等，《合成》(1978)478-479；StaabH.A.,Angew.Chem.74(1962)407-423；Fahrenholtz,K.E.等，《医学化学杂志》17(1974)337-342)相似的方法，通过一般工艺A、B或C来制备起始物质(咪唑化物)。
Ⅰa)一般工艺A将10mmol相应的羧酸和10mmol的1,1’-羰基二咪唑溶于无水四氢呋喃中，在室温下搅拌30分钟到24小时。将混合物真空蒸干，使用前不作进一步纯化。
Ⅰb)一般工艺B在没有湿气的无水甲苯中，将10mmol相应的酸性氯化物和20mmol咪唑回流加热1-24小时。过滤所形成的咪唑氢氯化物，将滤液真空蒸干。用乙酸乙酯/庚烷通过硅胶层析法或通过重结晶法纯化该残余物。
Ⅰc)一般工艺C在二氯甲烷中将10mmol相应羧酸与10mmol二环己基碳二亚胺和10mmol咪唑于室温下一起搅拌1-48小时。冷却到0℃后，滤除所形成的脲，用水萃取该滤液，在硫酸钠上干燥，真空蒸发并重结晶。
得到脂肪酸的下列咪唑化物衍生物1-咪唑-1-基-己-1-酮(无色油状；产率66％)1-咪唑-1-基-辛-1-酮(无色晶体；产率59％)1-咪唑-1-基-癸-1-酮(无色晶体；产率79％)1-咪唑-1-基-十二烷-1-酮(无色晶体；产率86％)1-咪唑-1-基-十四烷-1-酮(无色晶体；产率52％)1-咪唑-1-基-十六烷-1-酮(无色晶体；产率70％)l7-(4-咪唑-1-基-1-甲基-4-氧代-丁基)-10,13-二甲基-十二氢化-环戊二烯并[a]菲-3,7,12-三酮) (无色晶体；产率56％)4-(10,13-二甲基-十六氢化-环戊二烯并[a]菲-17-基)-1-咪唑-1-基-戊-1-酮(无色晶体；产率71％)(Ⅱ)吡啶基二硫化物工艺按照文献(Lee,S.等，Bull.Chem.Soc.Jpn.64(1991)2019-2021)，采用一般工艺A制备起始物质(吡啶基二硫化物)。将10mmol的相应硫醇和10mmol的2,2’-二硫代联吡啶溶于30ml的无水二氯甲烷中，并且在室温下搅拌6-24小时。真空除去溶剂，向该残余物中加入乙醚并且过滤。将该滤液真空蒸干，用乙酸乙酯/庚烷通过硅胶层析法纯化。
得到下列物质2-癸基二硫基-吡啶 (无色油状物，产率76％)(2-decyldisulfanyl pyridine)2-十六烷基二硫基-吡啶 (无色晶体；产率64％)2-{17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢化-1H-环戊二烯并[a]-菲-3-基二硫基}-吡啶 (无色晶体；产率56％)
b)用棕榈酰基咪唑化物制备棕榈酰化的重组人shh用实施例2的二聚化的未修饰重组人shh作离析物。该蛋白质以3mg/ml的浓度存在于PBS缓冲液(10mM磷酸钠缓冲液，150mMNaCl,pH7.4)中。将去污剂(优选200μl的10％Zwittergent 3-14溶液)加入2ml的该样品中。接着将三(2-羧乙基)膦(TCEP)加入至浓度为2mM。在室温保温15分钟后，加入于二噁烷中的60mM棕榈酰基咪唑化物(1-咪唑-1-基-十六烷-1-酮)溶液50μl。优选在4℃振摇下将该溶液保温1-3天。
在这些条件下形成的主要产物是二棕榈酰化shh(70-75％)，按照实施例6中所述用RP-HPLC和质谱法对其进行了鉴定。在实施例7中所述的活性试验中，以这种方法修饰的shh比没有被修饰的shh具有高得多的生物活性。在70ng/ml达到最大活性的一半。
所用去污剂的类型对二棕榈酰化shh的产率和其生物活性水平具有较大的影响(表1)。表1所用去污剂对反应混合物中二棕榈酰化shh的比率的影响(在室温下进行)。定量方法如实施例6中所述。
c)用2-十六烷二硫基吡啶制备烷基化的重组人shh使用实施例2a的二聚化的未修饰重组人shh作离析物。该蛋白质以3mg/ml的浓度存在于PBS缓冲液(10mM磷酸钠缓冲液，150mMNaCl,pH7.4)中。加入2mM TCEP后，保温15分钟以形成单体。接着，用平衡于5mM磷酸钾缓冲液，150mM NaCl,pH5.0的PD-10柱除去TCEP。使用以这种方式制备的shh单体的200μl等分液，通过两种不同方法与2-十六烷基二硫基-吡啶反应。A)向该shh单体中加入20μl的10％Zwittergent 3-14溶液；20μl的0.5M HEPES pH7.0和1倍至20倍摩尔过量的偶联剂(溶于二噁烷溶液，60mM)。B)向该shh单体中加入2μl的10％脱氧胆酸钠、20μl的1M磷酸钾缓冲液，pH7.6和2倍到20倍摩尔过量的偶联剂(溶于甲醇中，60mM)。
在上述两种方法中15分钟后完成反应。
10倍摩尔过量的偶联剂在方法A)中得到的单烷基化shh占反应混合物中的43％，在方法B)中得到的单烷基化shh占反应混合物的47％。在方法A)中，生物活性比未修饰的shh有巨大的增长，并且半最大活性为200ng/ml shh。单倍摩尔过量的2-十六烷基二硫基吡啶只得到稍微降低的产率。在方法B中，活性也比未修饰的shh要提高一些，但程度较小相同量的蛋白质只能达到30％的生物活性。所以，优选使用方法A。
d)烷基化shh衍生物的纯化用50mM HEPES,0.1％Tween80,pH7.4将偶联产物按1∶4稀释，接着用SP-Sepharose HP(Pharmacia)纯化。
平衡缓冲液50mM HEPES,0.1％Tween80,pH7.4，洗脱缓冲液含有0.8M NaCl的50mM HEPES,0.2％Tween80,pH7.4梯度洗脱(2×6柱体积)和不连续洗脱。
在二棕榈酰化shh中，有可能分离出多余的棕榈酰基咪唑化物，并部分分离出未修饰的shh。在用2-十六烷基二硫基吡啶修饰时，单棕榈酰化shh显著富集，为76％。修饰的shh能够用例如肝素Sepharose进一步纯化。实施例4a)用棕榈酰基-CoA制备棕榈酰化的重组人shh将2ml的shh浓度为0.35mg/ml的已纯化二聚体shh样品与DTE混合至最终浓度为20mM，在37℃保温2小时，接着在下列溶液中透析a)50mM Tris/HCl,1mM DTE,0.1mM ZnCl2,0.5％TritonX-100,pH8.5,b)100mM MOPS,1mM DTE,0.1％TritonX-100,0.1mg/ml苏拉明，pH7.4,c)100mM MOPS,1mM DTE,0.1％TritonX-100,pH7.4。
接着将不同体积的棕榈酰基-CoA(于100mM MOPS,1mM DTT,0.2％TritonX-100,pH7.6中，10mg/ml)加入到0.5ml等分的样品中，使得混合物中棕榈酰基-CoA的浓度为1)0μM2)50μM3)500μM然后在37℃将它们保温1小时。在过滤并1/200稀释以用于细胞试验之前，将样品与BSA(1mg/ml最终浓度)和苏拉明(0.1mg/ml最终浓度)混合。用上述样品，如实施例7所述进行shh活性测试，结果表明在含有500μM棕榈酰基-CoA的缓冲液b)和c)中保温的shh样品比没有棕榈酰基-CoA的混合物具有显著增长的生物学活性(参见图1)。以这种方式棕榈酰化的shh能够用已经就膜蛋白描述过的方法纯化，这些方法例如在“膜蛋白的实践指导”(1994；Jagow&Schlagger编辑，Academic Press)或者在欧洲专利申请No.98102095.1中进行了描述。
b)酰化对shh浓度和shh与棕榈酰基-CoA(Pal-CoA)之间摩尔比的依赖性用PBS稀释二聚化shh(在PBS中)到浓度为150μM或37.5μM，加入Tween80(最终浓度为0.05％)、DTE(最终浓度为3mM)和TCEP(最终浓度为1mM)。然后以所述的量加入Pal-CoA(在水中，20mM)，在25℃将混合物保温过夜。用RP-HPLC分析诸样品，或者在用PBS,1mg/ml BSA,0.05％Tween80 pH7.3稀释并且无菌过滤后，以不同的稀释度用于细胞测试中。结果总结在表3中表3
>*EC50是用于细胞试验中达到碱性磷酸酶最大诱导结果一半所需的shh浓度。由于细胞传代次数的差异和由此导致的细胞生理学改变，在不同时间进行的测定之间这一数值会稍微变化。
偶联剂中度过量(＜50倍)主要导致形成在N-末端半胱氨酸酰化两次的shh衍生物。随着提高Pal-CoA与shh的比率，棕榈酰化两次以上的shh的形成量增加。用两个以上脂肪酸残基进行棕榈酰化也使活性增加。当shh浓度为37.5μM时，就活性而言，大约10倍过量的Pal-CoA是理想的。在shh的浓度为150μM时，Pal-CoA过量3倍就已经达到了两次棕榈酰化shh的高产率和高活性。
c)酰化对去污剂的类型和浓度的依赖性用pH7.4的PBS将二聚化shh调节到0.75mg/ml的浓度，并按所述量与相应去污剂混合，所有情况下都混合入500μM Pal-CoA和3mM DTE或3mM TCEP(最终浓度)。在25℃将偶联混合物保温过夜，接着用RP-HPLC分析，或者在用PBS,1mg/ml BSA,0.05％Tween80 pH7.3稀释并过滤除菌后，以不同稀释度用于细胞测试中。结果总结在表4中表4
pal.=棕榈酰化*用3mM的TCEP替代3mM的DTE还原。
结果表明使用0.05％Tween80或0.5％辛基糖苷能够得到高棕榈酰化率；用0.05％Zwittergent进行棕榈酰化也导致活性大大增加。同时用TCEP还原得到与用DTE还原的相似结果。
d)还原的单体shh的酰化与偶联混合物pH值的关系用10mM的DTE还原二聚化shh(浓度为0.7mg/ml)，并对PBS,0.05％Tween80,0.5mM DTE透析过夜。用PBS,0.05％Tween80,0.5mM DTE将透析液调整到最终浓度为0.25mg/ml和各种pH值，加入125μM Pal-CoA。将混合物在37℃保温2小时，接着以1∶500稀释度在细胞试验中进行分析。在表5中总结了该样品的活性，该活性是作为AP活性相对于未刺激的C3H10T1/2细胞(=100％)的基本活性的刺激表5
这样最大激活出现在中性到微碱性的pH。
e)含有不同碳链长度之酰基的酰基CoA衍生物的偶联用PBS,0.05％Tween80 pH7.4将二聚化shh调节成浓度为0.75mg/ml，加入3mM DTE和0.5mM的相应酰基-CoA衍生物并且将它在25℃保温过夜。将样品用RP-HPLC分析，或者在用PBS,1mg/mlBSA,0.05％Tween80 pH7.3稀释并无菌过滤后将该样品的不同稀释度用于细胞试验中。在RP-HPLC上保留值的偏移以及二酰化shh的产率和细胞试验中的活性总结在表6中。表6
这表明通过利用Pal-CoA衍生物的方法能够有效地转移具有不同链长的酰基。所用去污剂的浓度以及去污剂的类型需要根据被转移的酰基的链长进行最优化。酰基链长的缩短或不饱和碳键数目的增加均导致酰化shh衍生物的比活性下降。实施例5a)用巯基胆固醇衍生重组人shh为了通过二硫桥将巯基胆固醇连接到氨基末端半胱氨酸上而修饰shh，用下列的反应缓冲液以1∶3的比率稀释在0.5mM DTT pH7.0中的0.66mg/ml已还原单体shh100mM乙醇胺100mM NaCl
50μM CuCl2pH9.50.8％(w/v)脱氧胆酸钠或0.4％(w/v)胆酸钠或1.3％(w/v)正辛基糖苷或0.3％TritonX-100。
通过加入(最终浓度)5％(v/v)丙酮或100μM巯基胆固醇(于丙酮中的10mM溶液)或500μM巯基胆固醇(于丙酮中的10mM溶液)而起始反应，混合物在室温下振摇30分钟。
在无菌过滤前，已经将样品用9体积的20mM磷酸钠，0.9％NaCl,0.05％Tween80,1mg/mlBSA、0.1mg/ml苏拉明，pH7.2稀释，再以1/20稀释后用于细胞试验中进行分析。
如图2所示，活性有一个增长，这种增长取决于巯基胆固醇的浓度，其在含有阴离子去污剂的样品中最有效地产生或稳定下来。
b)用巯基胆固醇吡啶基二硫化物衍生重组人shh为了通过二硫桥将巯基胆固醇连接到氨基末端半胱氨酸上而修饰shh，在室温下用2mM TCEP还原在N-末端半胱氨酸之间通过二硫键共价交联的shh二聚物15分钟，接着重缓冲于PBS缓冲液pH5中以通过PD10柱(Pharmacia)分离还原剂。为了进行偶联，用PBSpH5将shh浓度调节到1mg/ml。通过加入浓缩的缓冲液(如40体积百分比的0.4M磷酸钠，pH9.2)将pH调节到中性到微碱性pH值(如pH7.6)，然后立即先加入去污剂，再加入溶于有机溶剂(如甲醇，40℃)的偶联剂(5mM巯基胆固醇吡啶基二硫化物)。在室温下将反应混合物保温几小时，接着用HPLC和质谱术进行分析，或者在用PBS,1mg/ml BSA,0.05％Tween80 pH7.3稀释并无菌过滤后将其不同稀释液用于细胞试验中。偶联混合物的一些例子的结果总结在表7中。表7
如表7所示，shh的二硫化物偶联的巯基胆固醇衍生物能够在适当条件下以50％以上的产率生产，并且在细胞试验中具有二棕榈酰化shh的比活性的至少10％。实施例6由RP-HPLC和质谱术鉴定具有巯基胆固醇吡啶基二硫化物的shh偶联制剂将已在PBS,0.05％Tween80中透析过的、含有0.7mg/ml shh,1％胆酸钠，250μM巯基胆固醇吡啶基二硫化物，pH7.6的100μl偶联制剂上样到1×150mm Butyl柱(VydacTM214TP5115)中，该柱已在18％乙腈和0.1％三氟乙酸(TFA)中平衡过。在25℃，用0.1％TFA中的18-90％乙腈的梯度洗脱。分离洗脱液，一方面通过测定在220nm处的吸收值来在线分析，另一方面通过电喷雾质谱仪(API100,Sciex；参数设置起始质量(m/z)900原子量单位(amu)，终止质量(m/z)1500amu，步长0.3amu，停留时间0.5ms，锐孔电压(orifice voltage)30V)在线分析。在第18分钟(42-44％乙腈)洗脱出分别具有19560道尔顿和39120道尔顿的还原的shh单体和再氧化的shh二聚体，在第24.5分钟(48.5％乙腈)洗脱出具有19962.7道尔顿的含有巯基胆固醇的二硫化交联的shh。实施例7在细胞试验中对碱性磷酸酶的诱导(测定碱性磷酸酶的活性)在96孔微量滴定板上的每个孔中接种鼠间充质多潜能性细胞系C3H10T1/2(ATCC CC1-226)5000个细胞。将细胞在100μl DMEM,2mM谷氨酰胺，100IU/ml青霉素，100μg/ml链霉素和10％胎牛血清(FCS)中培养。第二天，将待检测的活性物质用培养基稀释后，以100μl的体积按适当浓度加入其中。5天后停止试验。为了进行测试，去掉上清液，并且用PBS将细胞洗涤一次。将细胞在50μl0.1％TritonX-100中裂解并冻于-20℃。融化后，将25μl用于蛋白质测定，另25μl用于测定碱性磷酸酶的活性。按照生产商Pierce的操作指示进行蛋白质测定向混合物中加入75μl重蒸馏水，然后加入100μl BCA蛋白试剂(Pierce Micro BCA,No.23225)。60分钟后，测定550nm处的光密度(0D)。按照生产商Sigma的操作指示测定碱性磷酸酶的活性向该制剂中加入100μl反应缓冲液(Sigma221)。将一个底物胶囊(Sigma 104-40)溶于10ml重蒸馏水中，然后用取液器将100μl加入到试验混合物中。在颜色变黄后，测定405nm处的OD值。在该反应中，碱性磷酸酶将对硝基苯基磷酸酯转化成了对硝基苯酚。
用标准曲线将OD值分别转化成nmol或μg。按照下列公式进行评估nmol的pNP/(测定的)分钟/mg(细胞)蛋白质参考文献《膜蛋白纯化实用指南》G.v.Jagow,Hermann Schgger编(1994)，第16章，pp.535-554Asahina,J.，实验细胞研究，222(1996)38-47Atherton et al.，《肽》，Gross和Meienhofer编，Academic Press,New York(1983),Vol.19,1-38Bitgood,M.J.et al.，当代物生学，6(1996)296Bizzozero et al.，生物化学杂志，262(1987)2138-2145Brinkmann et al.，基因，85(1989)109-114Chiang,C.et al.，自然，83(1996)407Cook,S.D.,et al.，骨和关节外科杂志，76-A(1994)827-837欧洲专利申请No.98102095.1Fahrenholtz,K.E.et al.，医学化学杂志，17(1974)337-342Fietz,M.et al.，发育(增刊)(1994)43-51Gaertner et al.，生物偶联物化学，3(1992)262-268Glansbeek,H.L.,et al.，实验室研究，78(1998)133-142Greene and Wuts，《有机合成中的保护基》，第二版，John Wiley&Sons,New York(1991)Hancock,J.F.，细胞，63(1990)133-139Haque,Z.et al.，农业生物化学，46(1982)597-599Haque,Z.et al.，农业食品化学杂志，30(1982)481Haque,Z.et al.，农业食品化学杂志，31(1983)1225-1230Hyness,M.et al.，神经元15(1995)35-44Karablis et al.，基因与发育，8(1994)277-289Kinto et al.,FEBS Letters,404(1997)319-323Lai,C.J.et al.，发育121(1995)2349Lee,S.et al.,Bull.Chem.Soc.Jpn.64 1991)2019-2021Leksyszyn,J.et al.，合成，(1978)478-479Liu et al.，美国国家科学院院报，91(1994)6584-6588Lopez-Martinez et al.当代生物学，5(1995)791-796Lundblad，《蛋白质修饰技术》，CRC Press,Boca Raton,FL,USA(1995)Marti et al.，自然，375(1995)322-325Nakamura,T.et al.，生物化学与生物物理学研究通讯，237(1997)465-469Needleman and Wunsch，分子生物学杂志，48(1970)443-453Ozols,J.et al.，细胞的分子生物学，8(1997)637-645Perrimon,N.，细胞，80(1995)517-520Porter,J.A.et al.，科学，274(1996)255-259Riley,E.H.,et al.,Clin.Orthopaed.and Related Research324(1996)39-46Ross et al.，神经科学研究杂志，21(1988)35-44Segawa,A.et al.,Int.Archs Allergy appl.Immun.66(1981)189-199Skolnick et al.,《生物膜》(1996)536-554；Merz和Roux编Smith,J.C.，细胞，76(1994)193-196Smith and Waterman，高等应用数学，2(1981)482-489Staab H.A.,Angew.Chem.74(1962)407-423Toriumi,D.M.,et al.,Arch.Otolaryngol. Head Neck Surg.117(1991)1101-1112美国专利No.5,270,300美国专5,364,839Vortkamp,A.et al.，科学273(1996)613Webb,R.J.et al.，生物化学，37(1998)673-679WO93/00050WO95/16035WO97/35607Wong,S.S.，《蛋白质结合和关联化学》，CRC Press,Boca Raton,USA,1993Wozney et al.，《骨、骨形态发生蛋白及其基因表达的分子生物学》，(1993),Academic Press Inc.,131-167Yadav,S.P.et al.，生物化学与生物物理学研究通讯，205(1994)1688-1695Yang et al.，发育，124(1997)4393-4404序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人(A)姓名ROCHE DIAGNOSTICS GMBH(B)街区Sandhofer大街116号(C)城市曼海姆(E)国家德国(F)邮政编码(ZIP):D-68305(G)电话08856/60-3446(H)传真08856/60-3451(ⅱ)发明名称具有活性的刺猬状蛋白偶联物及其生产方法和用途(ⅲ)序列数4(ⅳ)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patentin Release #1.0，版本#1.30B(EPO)(2)SEQ ID NO:1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其他核酸(A)描述/desc=“引物344”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:CAGAATTCTT GCGGACCGGG CAGGGG 26(2)SEQ ID NO:2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其他核酸(A)描述/desc=“引物345”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:GACTGCAGTT AATCATTAGC CTCCCGATTT GGCCGC36(2)SEQ ID NO:3的资料(ⅰ)序列特征(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其他核酸(A)描述/desc=“引物346”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:AATTCATGCA TCATCACCAC CACCACGATG ACGACGACAA ATGCG 45(2)SEQ ID NO:4的资料(ⅰ)序列特征(A)长度44个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型其他核酸(A)描述/desc=“引物347”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GTCCGCATTT GTCGTCGTCA TCGTGGTGGT GGTGATGATG CATG 4权利要求
1．一种刺猬状蛋白偶联物，它包含共价连接到刺猬状蛋白上的a)由10到30个疏水氨基酸和/或能够形成跨膜螺旋结构并且带正电荷的氨基酸组成的多肽，b)链长为8-24个碳原子并且具有疏水作用的1到4个饱和或不饱和的脂族烃基，或者c)一种疏水性巯基化合物。
2．按照权利要求1所述的刺猬状蛋白偶联物，其中的多肽含有2到12个赖氨酸和/或精氨酸。
3．按照权利要求1所述的刺猬状蛋白偶联物，其中的烃基是作为酯、硫酯、酰胺或二硫化物而连接的脂肪酸或烷基醇残基。
4．按照权利要求3所述的刺猬状蛋白偶联物，其中的脂肪酸是月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸或花生四烯酸。
5．按照权利要求1所述的刺猬状蛋白偶联物，其中的疏水性巯基化合物是巯基胆固醇。
6．按照权利要求1到5中任一项所述的刺猬状蛋白偶联物，其中的烃基、多肽或巯基化合物连接于刺猬状蛋白的C-末端和/或N-末端。
7．一种生产如权利要求3或4或6所述的刺猬状蛋白偶联物的方法，其中所述烃基与刺猬状蛋白的游离羟基、巯基、羧基或氨基共价偶联。
8．一种通过将烃基或疏水性巯基化合物与刺猬状蛋白共价偶联来生产权利要求1到6中任一项所述刺猬状蛋白偶联物的方法，其中所述烃基、多肽或疏水性巯基化合物的共价偶联和/或分离步骤是在苏拉明、肝素、阴离子多糖或去污剂存在下进行的。
9．一种通过将脂肪酸残基或疏水性巯基化合物与刺猬状蛋白共价偶联来生产权利要求1到6中任一项所述刺猬状蛋白偶联物的方法，其中将棕榈酰辅酶A或棕榈酰基咪唑化物(palmitoylimidazolide)用作脂肪酸偶联剂，将巯基胆固醇或含巯基的碳链用作疏水性巯基化合物。
10．一种药物组合物，它含有药理有效量的权利要求1到6中任一项所述的刺猬状蛋白偶联物以及药学辅助物质、去污剂、稳定剂、基质材料、苏拉明、肝素、阴离子多糖和/或螯合剂。
11．一种生产药物组合物的方法，其中将权利要求1到6中任一项所述的刺猬状蛋白偶联物用作该组合物的主要成分。
12．一种刺猬状蛋白，其中N-末端半胱氨酸的巯基偶联了一个巯基保护基，或者该刺猬状蛋白是其中N-末端半胱氨酸通过二硫键而连接的同型二聚体。
13．权利要求12所述的刺猬状蛋白在生产刺猬状蛋白偶联物中的用途，其中所述刺猬状蛋白偶联物包含共价连接到刺猬状蛋白上的a)由10到30个疏水氨基酸和/或能够形成跨膜螺旋结构并且带正电荷的氨基酸组成的多肽，b)链长为8-24个碳原子并且具有疏水作用的1到4个饱和或不饱和的脂族烃基，或者c)一种疏水性巯基化合物。
全文摘要
一种刺猬状(hedgehog)偶联物,其特征在于包含共价连接到刺猬状蛋白上的:a)由10到30个疏水氨基酸和/或能够形成跨膜螺旋结构并且带正电荷的氨基酸组成的多肽,b)链长为8—24个碳原子并且具有疏水作用的1到4个饱和或不饱和的脂族烃基,或者c)一种疏水性巯基化合物。该刺猬状蛋白偶联物活性提高了数倍,适于用作药剂。
文档编号A61P25/00GK1233616SQ9910630
公开日1999年11月3日 申请日期1999年4月29日 优先权日1998年4月30日
发明者A·艾斯威恩, K·朗, P·卢格, T·塞特 申请人:罗切诊断学有限公司