专利名称：人白细胞介素11的改造和制备的制作方法
已经证明和发现在免疫系统和造血系统中起调节作用的蛋白质有数十种，它们统称为细胞因子，如集落刺激因子、白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子等。这些细胞因子具有广泛的生物功能和广泛的靶细胞，包括骨髓细胞、外周血细胞、胎肝细胞、淋巴细胞等。由于细胞因子的自然来源十分有限，应用基因工程手段进行基因克隆、重组表达和高效的纯化，是目前众多细胞因子在基础研究和临床应用上重要手段。
人白细胞介素11(interleukin 11，IL-11)是具有多种生物功能的蛋白。主要证实的作用有刺激巨核细胞增生，促进B细胞的发育和功能，保护粘膜细胞受损，增加血小板数量。天然成熟人白介素11由178个氨基酸组成，分子量为20kD，是强碱性蛋白(pI11.7)，疏水性较强。人IL-11基因全长1100对碱基，其中5’端有72个碱基非编码区，3’端有431个碱基非编码区。阅读框架为597个碱基，翻译表达为199个氨基酸组成的人白介素11蛋白，其中N末端1-21个氨基酸是信号肽序列，故天然活性的人白介素11N末端为Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Ala Ser ProAsp等。猿和鼠的白介素11基因已被克隆和重组表达成功。人和猿的白介素11在氨基酸和碱基序列方面有极高的同序性，其中氨基酸序列同源性93.7％，碱基序列同源性99.5％。
重组人白细胞介素11已经在原核细胞(大肠杆菌)和真核细胞(COS细胞)表达成功。由于IL-11的特殊性，在大肠杆菌中表达十分困难。美国Genetics Institute公司采用融合蛋白表达系统pTRXFUS来表达人IL-11获得成功，其融合蛋白为还原型硫氧蛋白(Thioredoxin)。此系统有几个特点十分有利于人IL-11的表达(1)Thioredoxin的pI为4.5，中间接头区有四个天冬氨酸，可以中和IL-11的强碱性；(2)Thioredoxin是一种伴侣蛋白，可以帮助IL-11的复性；(3)酶切下的重组IL-11与天然成熟的IL-11仅在N-末端缺失一个脯氨酸；(4)缺失脯氨酸的人白介素11在体内外证明与天然IL-11有相同的生物功能。用本方法的最大缺点是蛋白酶切位点是肠激酶(enterokinase)，此酶的成本高，酶切效率不如凝血酶。本专利为了引进凝血酶作为融合表达蛋白的蛋白酶切点，构建了新型的人白介素11。凝血酶特异蛋白识别位点是Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser，切点在Arg和Gly之间。分析人和猿的IL-11的N末端35个氨基酸序列中仅有三个差异(
图1)，其中6-10位氨基酸序列的差异猿为Gly Ser Pro ArgAla，人为Gly Pro Pro Arg Val。
猿的白介素11在N末端第6和7位氨基酸序列正好是Gly Ser，这样就可以用具有含凝血酶酶切位点的融合表达系统来制备。主要的设计方案是首先缺失人白介素11的N末端5个氨基酸即Pro Gly Pro Pro Pro，然后将人的第7位和第10位氨基酸替换成猿的氨基酸即分别为Ser和Ala，其它的序列与人的IL-11氨基酸序列完全一致。这种改进的新型人白细胞介素11可用含凝血酶切点的融合表达系统来制备。本专利所述方法制备的新型重组人白介素11与设计的完全一致，不会出现多余的氨基酸。应用本专利制备的新型人白介素11与天然人白介素11相比在体内外的活性一致。由于N末端缺失脯氨酸的重组人白介素11已正式应用于临床治疗肿瘤病人因化疗引起的血小板减少症，本专利发明的新型改进型白介素11可望具有临床应用价值。
实例说明一、新型人白介素11融合表达系统的构建选用含谷胱甘肽转硫酶(GST)的融合表达质粒pGEX-4T-1(Pharmacia)作为构建的载体，此载体含有凝血酶切位点。根据人和猿的白介素11的cDNA序列，以及新型改进型人白介素11即N末端缺失5个氨基酸，N末端第7位和10位氨基酸改为猿的Ser和Ala的要求，设计两对PCR扩增引物，即正链5’-CT GGA TCC CCT CGA GCT TCCCCA GAC CCT CGG-3’，反链5’-TTA TCA CAG CCG AGT CTT CAG CAGCAG TAG CCC-3’。以人的白细胞介素11全基因cDNA为模板，扩增出的改进型人白介素11基因片段与酶切后的pGEX-4T-1大片段相连，转化大肠杆菌JM105，筛选出含插入片段的重组子命名为pGEX-FK-11(图2)。经序列分析后可进行融合表达研究。二、新型人白介素11的基因测序从pGEX-FK-11中用BamHI和Sal I双酶切下新型改进型人白介素11基因片段，与pUC-19经BamHI和Sal I双酶切后的大片段相连，用蓝白斑法筛选出重组子，命名为pUC-FK-11。经AB I全自动基因测序后得到插入的新型人白细胞介素11的基因序列(图3)以及相对应的氨基酸序列，结果分析与设计的完全一致。三、新型人白介素11的重组表达含新型改进型人白介素11基因的pGEX-FK-11转化大肠杆菌JM105，在含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中摇瓶过夜(37℃，200rpm)，再按1∶30接种含有100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养3小时后，加入0.5mM IPTG诱导4小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现含新型人白介素11的融合蛋白GST-FK-11(44.6kD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的28％。四、重组新型人白介素11的纯化用1000ml发酵液，离心收集菌体约15克，用50mM磷酸盐缓冲液(PH7.8)含1％Triton溶液悬液菌体，在室温下破菌20分钟，破菌液经超声波处理至无粘稠后离心去沉淀。上清经Glutathion-Sepharose(Pharmacia)进行亲和层析纯化，吸附在柱上的含新型人白介素11的融合蛋白，用人血浆凝血酶(每毫克融合蛋白用5NIH单位凝血酶)室温下在位酶切。酶切下的重组新型人白介素11，再经CM-SepharoseCL-4B纯化，最终产物的纯度超过98％，热原含量每mg蛋白低于10EU内毒素。五、重组新型人白介素11的理化性质本方法制备的重组新型人白介素11分子量为18.6KD，等电点大于10.0，紫外最大吸收峰为281nm，溴化氰肽图分析含有二个甲硫氨酸。氨基酸组成分析与理论设计值一致，其中无半胱氨酸。N末端测序证实是Gly Ser Pro Arg Ala Ser Pro Asp Pro Arg Ala Gln Leu Asp SerThr，与设计的新型人白介素11的N末端序列完全一致。六、重组新型人白介素11的体外生物活性用依赖于白介素6的细胞株7TD1和T1165的MTT方法测活，参照品是美国Genetics Institute的缺失脯氨酸的重组人白介素11和天然的人白介素11。测得本方法制备的重组新型改进型人白介素11的比活性分别是2.5×106(7TD1细胞)和8.0×106(T1165细胞)，与天然和缺失脯氨酸的人白介素11的比活性完全一致。七、重组新型人白介素11体内增加血小板数目实验用5-FU化疗的小鼠模型和Carboplatin化疗的绒猴模型，血小板数目均显著减少，皮下给予本方法制备的重组新型人白介素11，阳性对照药物是美国Genetics Institute的缺失脯氨酸的重组人白介素11。结果提示，重组新型人白介素11具有显著增加血小板数目的功能，其增加效率与阳性对照完全一致(表1和图4)。
权利要求
1.改进的新型人白细胞介素11是指在N末端比天然成熟的人白细胞介素11少5个氨基酸即Pro Gly Pro Pro Pro，同时将天然人白介素11的N末端第7位和第10位氨基酸替换成猿白介素11相对应位置的氨基酸分别为Ser和Ala。
2.条款1中的第10位氨基酸可以不替换，仍用人的白介素11氨基酸Valine。
3.条款1中的第7位氨基酸可以不替换，仍用人的白介素11氨基酸proline。
4.条款1、2、3中的新型人白细胞介素11可以用基因工程或多肽合成手段获得。基因工程方法制备包括原核表达系统，酵母表达系统以及真核表达系统。
5.条款1和2中新型人白细胞介素11在融合表达系统中最大优势是用凝血酶作为蛋白酶切位点，酶切后制备的重组新型人白介素11在N末端不会含新的氨基酸，与设计的新型人白介素11序列完全一致。
6.条款5中的融合蛋白切开方法可以是化学法或其它方法，如Hydroxylamine和Intein。本条款同样适合条款3中所述新型人白介素11。
7.条款1和5的重组新型人白介素11用融合表达系统进行表达，亲和层析纯化融合蛋白，酶解下目的蛋白。
8.条款7中的融合表达系统指任何融合表达系统和相对应的亲和层析纯化。
9.条款1、2、3、4、6获得的新型人白介素11具有药用价值，可以开发出各种剂型的药品。
10.条款9中的药用价值指医学和非医学的治疗和预防作用。
11.条款9中的剂型指粉针、水针、喷雾、含片、胶囊、栓剂等药物剂型。
全文摘要
人白细胞介素11具有刺激巨核细胞增生、增加血小板数量、调节免疫功能和粘膜保护等功能,其重组产品已应用于临床治疗肿瘤病人化疗后引起的血小板减少症。本发明采用基因工程手段制备出改进的新型改进型重组人白介素11,经证明与天然人白介素11有相同的体内外生物功能,可望成为治疗血小板减少症的药物。
文档编号A61K9/00GK1264710SQ9911146
公开日2000年8月30日 申请日期1999年8月16日 优先权日1999年8月16日
发明者范开, 聂李亚, 肖建国, 马素永, 田峰, 王建, 王立兵, 黄洪涛, 黄秀东 申请人:重庆多泰制药有限公司