专利名称：硅导电玻璃介质生物芯片及其制备方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域，是一种将DNA或蛋白质或多肽定点固定在导电玻璃介质生物芯片的方法。
现行的生物芯片导电介质一般为铝和铂金，但铝和铂金在通电均存在不同程度电解或电泳介质脱落现象，而且工艺复杂，DNA，蛋白质，多肽固定难度较大，成本昂贵。
目前美国Nanogen公司采用Pt为介质，法国CIS Bio international实验室采用金为介质，不但制作工艺复杂，可想而知其价格也是十分昂贵的。
本发明的目的是提供大规模集成化，工艺简单，准确定位，快速反应，且价格低廉的生物芯片。
本发明的硅导电玻璃介质生物芯片是一种集成电路生物芯片，是导电玻璃即掺锡的氧化铟(Tin-doped indium oxide,ITO)和SiO2钝化层组成，在玻璃基板上形成导电玻璃膜电极陈列图形。SiO2钝化层可以用等离子体增强化学汽相淀积(PECVD)方法在ITO导电膜上形成，厚度为1um，引出电极和测试孔。
本发明的芯片也可以是在导电膜，如掺锡氧化铟上陈列电极图形，其余同上。
本发明的电路也可以设计为Al/ITO复合电极电子束蒸发在ITO导电玻璃上淀积一层1um厚的Al膜，从而形成Al/ITO复合电极图形。测试孔从导电玻璃膜中引出，从而提高测试速度。
本发明的硅导电玻璃介质生物芯片包括采用ITO导电玻璃或ITO膜制备的生物芯片本发明的导电玻璃介质是掺锡的氧化铟，其主要化学成分为In2O3，它是一种透明的导电氧化膜层，薄膜电阻率在10-3～10-4Ω.cm，对ITO导电膜进行化学处理与DNA共价结合并采用点定位，结果表明ITO导电膜电极与其他金属电极相比具有较强的抗电解腐蚀能力，是一种较为理想的电极材料。
本发明的硅导电玻璃介质生物芯片，其特征是该芯片用于疾病诊断，基因测序，基因表达研究或微实验室集成电路芯片。
本发明的硅导电玻璃介质生物芯片制备包括导电玻璃电路设计，导电玻璃介质处理，寡核苷酸，蛋白质和多肽的修饰，电引导探针芯片定点固定。
导电玻璃介质选择例如采用ITO(Tin-dopedindium oxide)玻璃，其主要化学成分为In2O3。
导电玻璃电路设计采用两种方案纯ITO导电膜电极在ITO导电玻璃上先进行光刻和腐蚀以形成ITO电极陈列图形。通过等离子体增强化学汽相淀积(PECVD)方法在ITO导电膜上覆盖一层钝化层SiO2，厚度为1um。再用光刻和反应离子刻蚀法(RIE)开出电极引出孔和DNA测试孔。
Al/ITO复合电极电子束蒸发在ITO导电玻璃上淀积一层1um厚的Al膜，然后进行光刻和Al膜，并在ITO膜上形成Al/ITO复合电极图形。再将测试孔中的Al腐蚀，露出基底ITO层，而电极表面的Al层可以减少测试过程中的电极的电阻。PECVD方法在电极上淀积约1um厚的SiO2钝化层，用光刻和反应离子刻蚀法(RIE)开出电极引出孔和DNA测试孔。
导电玻璃介质处理化学方法处理可采用APS,PDC,Pyrrole等化学物质处理，例如氧化铟(In2O3)+3-氨丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropyltrimethoxysilane；APS)In2O3+APS+1.4-苯二异硫氰酸盐(1.4-phenylene diisothiocyanate；PDC)生物亲和方法采用链霉亲和素或亲和素包被固定。
APS-PDC具体处理导电玻璃介质方法A．洗净导电玻璃浸入0.5％APS中2分钟后用丙酮10×5分钟，B．烤箱干烤110℃45分钟C．0.05％PDC浸泡45分钟D．甲醇浸泡5分钟E．丙酮浸泡5分钟F．室温干燥即可。
寡核苷酸酸链的修饰在寡核苷酸酸链的5’端或3’末端修饰氨基，醛基，吡咯基团，有的需要在末端修饰生物素基团。
蛋白质或多肽的修饰在其末端修饰生物素基团或吡咯基团等。
附
图1是APS-PDC Microarray与5’-amino-Oligos交联示意图。附图2是纯ITO导电膜电极。附图3是Al/ITO复合电极。
例1材料与方法a．乙肝(HBV)24669:5′-Amino-TTTTTTTTTTTACGAACCACTGAACAAATGGCACTAG23296:5′-FAM-ATGCTTGGTGACTTGTTTACCGTGATC-3′b．丙肝(HCV):
25420:5′-Amino-TTTTTTTTTTTTTTCTGTGAGGAACTACTGTCTTC-3′YING:5′-Rho-GGGATAGTCGAAGACAGTAGTTCCTCACAG-3′c．对照Probe 1A:5＇-Amino-TTTTTTTTTTTTCTTTTGTCGCATCA-3′其中5＇-amino group试剂为N-trifluoroacetyl-6-aminohexyl-2-cyanoethylN’,N’-diisopropyl-phosphoroamidite(ABI)，临床标本的预处理与荧光标记所有标本应预处理为DNA或cDNA，采用随机引物标记，Nick末端荧光标记，PCR掺入荧光标记等等。
电泳定点引导探针并固定2mMOligo24669,Oligo254200.5ul于APS-PDC硅导电玻璃介质生物芯片，通电5uA 2分钟，0.5uL ProbelA作为阴性对照。再洗涤用1％氨水洗涤5分钟，再用双蒸水洗涤干燥。
电泳趋向杂交或快速静电杂交。5uL,10-100pmol/ul荧光标记Oligo23296,37℃杂交6h，再次洗涤用洗涤液(2×SSPE,0.1％SDS)50ul,3×5分钟，水洗干燥，再次杂交5uL,10-100pmol/ul荧光标记Oligoying,37℃杂交6h，最后洗涤用洗涤液(2×SSPE,0.1％SDS)50ul,3×5分钟，水洗干燥。
荧光扫描或CCD荧光成像，并采用软件分析图像结果。FAM:EX=494 EM=520；Rhodamine:EX=578 EM=604HBV阳性显微镜下呈现黄绿色荧光点HCV阳性显微镜下呈现红色荧光点例2采用链霉亲和素(SA)或吡咯(Pyrrole)处理硅导电玻璃介质生物芯片，蛋白质或多肽采用生物素或吡咯修饰。
20mM pyrrole,0.1M LiClO4,luM吡咯修饰的多肽在-0.35～+0.85V的电场强度下电定位与芯片进行固定，再与处理的血清进行反应，最后与荧光标记的二抗进行反应，阳性结果出现荧光亮点。
权利要求
1．硅导电玻璃介质生物芯片，是一种集成电路生物芯片，主要是导电玻璃和SiO2钝化层，其特征是玻璃基板上的导电玻璃膜陈列有电极图形，导电玻璃膜上有SiO2钝化层，从中引出电极和测试孔。
2．根据权利要求1所述的硅导电玻璃介质生物芯片，包括导电膜(ITO膜)制备的生物芯片，其特征是导电膜陈列有电极图形，导电膜上有SiO2钝化层，从中引出电极和测试孔。
3．根据权利要求1所述的硅导电玻璃介质生物芯片，其特征是玻璃基板的导电膜上有Al膜，电极是Al和导电玻璃复合电极图形，测试孔是导电玻璃膜中引出。
4．根据权利要求1所述的硅导电玻璃介质生物芯片，其特征是导电玻璃是掺锡氧化铟。
5．根据权利要求1所述的硅导电玻璃介质生物芯片，其特征是该芯片用于疾病诊断，基因测序，基因表达研究或微实验室集成电路芯片。
6．一种硅导电玻璃介质生物芯片的制备方法包括导电玻璃电路设计，导电玻璃介质的处理，寡核苷酸链，蛋白质和多肽的修饰和连接，其特征是1)化学方法处理，可采用APS,PDC,Pyrrole(吡咯)等化学物质处理氧化铟(In2O3)+3-氨丙基三甲氧基硅烷(3-aminopropyltrimethoxysilane；APS)In2O3+APS+1.4-苯二异硫氰酸盐(1.4-phenylene diisothiocyanate；PDC)2)生物亲和方法采用链霉亲和素或亲和素包被固定硅导电玻璃介质生物芯片，与末端带生物素的寡核苷酸链，蛋白质或多肽进行反应。
全文摘要
本发明是一种能检测疾病,基因测序和基因表达的导电玻璃介质生物芯片。现行的生物芯片导电介质是铝和铂金,它们存在电解或电泳介质脱落现象。本发明用导电玻璃作为导电介质,经化学,生物方法处理,用集成电路制作工艺在导电膜上覆盖SiO
文档编号A61N1/08GK1226446SQ9911348
公开日1999年8月25日 申请日期1999年2月12日 优先权日1999年2月12日
发明者汪进, 毛裕民, 周鲁卫, 黄维宁, 王世平 申请人:复旦大学