专利名称：水溶性紫杉醇衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类新型的水溶性紫杉醇衍生物-硫代硫酸或其盐的紫杉醇酯，所述衍生物可用于肿瘤和癌症的治疗。
紫杉醇(TAXOL)，是一种有效治疗多种癌症的天然植物药，现已广泛用于临床。但由于紫杉醇本身几乎不溶于水，在水中的溶解度小于0.004mg/ml，造成了对该药使用上的限制，因此紫杉醇只能借助于助溶剂制成针剂使用。而这类助溶剂均有不同程度上的毒副作用，如常用的助溶剂为cremophore EL(聚乙氧代蓖麻油)和乙醇以1∶1混合。而cremophore EL易于诱发过敏反应，临床症状为低血压、皮疹和呼吸困难，而乙醇会加重肝脏负担。因此，研究和发展水溶性好、毒性低、疗效高、使用方便的紫杉醇衍生物，具有重要意义。
本发明的目的在于提供一类含有硫代硫酸或其盐的紫杉醇衍生物。这种化合物在体外稳定，在体内由于代谢而释放出游离的紫杉醇，提高了其作为抗癌药的生物利用度，具有较好的抗癌效果。
本发明一类水溶性紫杉醇衍生物，是由取代的硫代硫酸或其盐在紫杉醇的2’位和7位上以酯基形式构成的，其结构式为 其中R=CO(CH2)mCONH(CH2)nS2O3M或H,R′=CO(CH2)mCONH(CH2)nS2O3M或H,m=2-6,n=2-6,M=氢、钠、钾、锂、铵，m最佳为2或3,n最佳为2或3,M最佳为钠R和R′均为CO(CH2)mCONH(CH2)nS2O3M时，可相同或不相同，R和R′中只能1个为H。
本发明含有硫代硫酸或其盐的水溶性紫杉醇衍生物-硫代硫酸或其盐的紫杉醇酯在25℃时水溶解度为5-15mg/ml。
本发明水溶性紫杉醇衍生物的制备方法本发明的硫代硫酸或其盐的紫杉醇酯是以紫杉醇(天然紫杉醇优选)为原料，经与相应的酸酐如琥珀酸酐或戊二酸酐，或者相应的二羧酸酰卤如丁二酰氯或戊二酰氯在有机碱存在下反应成羧酸酰紫杉醇，该形成的羧酸接着与氨基取代烷基硫代硫酸或其盐如β-氨基乙基硫代硫酸或其盐或3-氨基丙基硫代硫酸或其盐反应得到Y-3系列产物。本发明所述的合成方法简单，收率高，具有工业化生产的可能性。水溶性紫杉醇衍生物制备方法示意图参见图1。
本发明硫代硫酸或其盐的紫杉醇酯可用于配制治疗肿瘤和癌症的药物制剂，例如可以配制成用于静脉注射的水针剂或粉针剂。后述的实施例以2’-琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠紫杉醇(Y-3a)和2’,7-二琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠紫杉醇(Y-3b)对人体乳腺瘤异种移植模型(Bre-04)和小鼠黑色素瘤(B16)模型进行初步抗肿瘤疗效试验，结果表明相应剂量组均有较明显的抗肿瘤疗效。
本发明的衍生物与现有的紫杉醇相比具有下述的优点与效果，其水溶性由小于0.004mg/ml提高到大于5mg/ml，为单一紫杉醇水溶性的1250倍以上。这类新型的紫杉醇衍生物易溶于水，可以免除目前由于助溶剂cremophoer EL和乙醇的使用引发的毒副作用。这类化合物在体内经血液中的酶催化分解成不具药理活性，不影响紫杉醇的活性，对人体无不良反应的低级代谢产物和紫杉醇，后者由于在体内释出，具有生物利用度高的特点而增加了疗效。因此，应用本发明合成的衍生物配制的针剂，可用于肿瘤和癌症的治疗。与现有的紫杉醇比较，保持了原有的疗效，降低了毒副作用，减轻了患者的痛苦，具有发展成新一代抗癌药的潜力。
下面结合附图和实施例描述本发明的衍生物及其制备方法，但它并不限制本发明的范围。
图1水溶性紫杉醇衍生物制备方法示意图。
实施例1合成β-氨基乙基硫代硫酸2-氯乙胺盐酸盐18.6g和五水硫代硫酸钠39.6g溶于40ml水中加热至80℃，搅拌6-8小时。调整反应液的pH在6.0～6.5之间，通过偶尔滴加饱和碳酸氢钠水溶液实行。趁热过滤，剧烈搅拌滤液析出结晶。过滤收集结晶，用冷的无水乙醇洗涤，在干燥缸中干燥得20.6g产物，收率82％，熔点196℃。1H NMR(D2O)δ:3.5ppm(s,CH2CH2,4H)。
实施例2合成3-氨基丙基硫代硫酸3-氯丙胺盐酸盐20.85g和五水硫代硫酸钠39.6g溶于40ml水中加热至80℃，搅拌6-8小时。调整反应液的pH在6.0～6.5之间，通过偶尔滴加饱和碳酸氢钠水溶液实行。趁热过滤，剧烈搅拌滤液析出结晶。过滤收集结晶，用冷的无水乙醇洗涤，在干燥缸中干燥得21.9g产物，收率80％。
实施例3合成β-氨基乙基硫代硫酸钠(2a)将β-氨基乙基硫代硫酸15.7g，在0℃加入氢氧化钠水溶液40ml(浓度10％)，搅拌均匀后，冷冻干躁。得产物17g，收率95％，放入干燥器中待用。
实施例4合成3-氨基丙基硫代硫酸钠(2b)将3-氨基丙基硫代硫酸17.1g，在0℃加入氢氧化钠水溶液40ml(浓度10％)，搅拌均匀后，冷冻干躁。得产物19g，收率98％，放入干燥器中待用。
实施例5合成β-氨基乙基硫代硫酸四丁基胺盐将β-氨基乙基硫代硫酸2g，氢氧四丁基胺水溶液(10％)27ml混合，于室温下搅拌反应4小时，反应混合物用二氯甲烷15g萃取3次，将二氯甲烷全部合并，旋转蒸发得油状物，用油泵抽得淡黄色固体产品3.2g，收率77％，放入干燥器中待用。1H NMR(D2O)δ(ppm):0.8～1.2(m,12H),1.2～2.0(m,16H),3.0～3.5(m,12H)。
实施例6合成2’-琥珀酰紫杉醇(1a)方法1将紫杉醇0.5g，琥珀酸酐0.12g，DMAP 7mg，投入反应瓶中，真空干燥5小时，密封，用针筒加入无水吡啶4.8ml，搅拌，于室温反应3小时。向反应混合物中加入大量无水乙醚至浑浊，再加入正己烷至固体析出完全，过滤，得粗产品0.56g，将之溶于CHCl3后进行快速柱层析后可得单一纯产品(淋洗液为CHCl3∶CH3OH，比例为20∶1，然后10∶1)，收率为85％。
方法2将紫杉醇0.5g，丁二酸酰氯0.19g,DMAP 10mg，投入反应瓶中，真空干燥5小时，密封，用针筒加入无水吡啶8ml，搅拌，于室温反应3小时。向反应混合物中加入大量无水乙醚至浑浊，再加入正己烷至固体析出完全，过滤，得粗产品0.53g，将之溶于CHCl3后进行快速柱层析后可得单一纯产品(淋洗液为CHCl3∶CH3OH，比例为20∶1，然后10∶1)，收率为80％。
实施例7
合成2’-戊二酸酰紫杉醇(1b)方法1将紫杉醇0.5g，戊二酸酐0.15g,DMAP 7mg，投入反应瓶中，真空干燥5小时，密封，用针筒加入无水吡啶4.8ml，搅拌，于室温反应3小时。向反应混合物中加入大量无水乙醚至浑浊，再加入正己烷至固体析出完全，过滤，得粗产品0.61g，将之溶于CHCl3后进行快速柱层析后可得单一纯产品(淋洗液为CHCl3∶CH3OH，比例为20∶1，然后10∶1)，收率为90％。
方法2将紫杉醇0.5g，戊二酸酰氯0.22g,DMAP 10mg，投入反应瓶中，真空干燥5小时，密封，用针筒加入无水吡啶8ml，搅拌，于室温反应3小时。向反应混合物中加入大量无水乙醚至浑浊，再加入正己烷至固体析出完全，过滤，得粗产品0.59g，将之溶于CHCl3后进行快速柱层析后可得单一纯产品(淋洗液为CHCl3∶CH3OH，比例为20∶1，然后10∶1)，收率为80％。
实施例8合成2’,7-二(琥珀酰)紫杉醇(1c)将紫杉醇0.5g，琥珀酸酐0.25g,DMAP 7mg，投入反应瓶中，真空干燥5小时，密封，用针筒注入干燥重蒸的无水吡啶4.8ml，搅拌，于室温搅拌35-40小时。向反应混合物中加入大量无水乙醚至浑浊，再加入正己烷至固体析出完全，过滤，得粗产品0.76g将之溶于CHCl3后进行快速柱层析后可得单一纯产品(淋洗液为CHCl3∶CH3OH，比例为20∶1，然后8∶1)。
实施例9合成2’,7-二(戊二酸酰)紫杉醇(1d)将紫杉醇0.5g戊二酸酐0.3g,DMAP 7mg，投入反应瓶中，真空干燥5小时，密封，用针筒注入干燥重蒸的无水吡啶4.8ml，搅拌，于室温搅拌35-40小时。向反应混合物中加入大量无水乙醚至浑浊，再加入正己烷至固体析出完全，过滤，得粗产品0.71g，将之溶于CHCl3后进行快速柱层析后可得单一纯产品(淋洗液为CHCl3∶CH3OH，比例为20∶1，然后8∶1)。
实施例10合成2’-琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠紫杉醇(Y-3a)将2′-琥珀酰紫杉醇0.2g溶于无水四氢呋喃中，冰盐浴冷却至-10℃，滴加氯甲酸异丁酯0.093ml，然后滴入三乙胺0.17ml，维持此温度下反应五分钟，撤去冰盐浴，15分钟后升至室温，滴入β-氨基乙基硫代硫酸四丁基胺盐0.096g的四氢呋喃溶液，反应1小时，过滤除去Et3NHCl，用四氢呋喃洗涤，将滤液抽干，加压柱层析得到产品的四丁基铵盐，展开剂CHCl3-CH3OH(先为20∶1，然后为10∶1)。
将上述产品溶于水中加入4ml DOWEX-50离子交换树脂，剧烈搅拌5小时，然后进行离子交换柱装柱，用水淋洗得最终产物水溶液，此水溶液用甲醇和甲苯的混合溶液于25℃减压下带去水分，所得产品可经薄板层析进一步纯化，核磁检测无Bu4N+基团存在，薄板层析展开剂配比为CHCl3∶CH3OH=5∶1。还有少量未交换的前产物重复离子交换操作。得到产物0.19克。电喷雾质谱1116(M+1),1139(M+Na)；1H NMR(300MHz,CD3COCD3)与文献紫杉醇1H NMR比较，产物增加的峰δ(ppm)∶5.5(d,1H),3.48(t,2H),3.10(t,2H),2.70(t,2H),2.52(t,2H)。
实施例11合成2’,7-二(琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠)紫杉醇(Y-3b)将2′,7-二(琥珀酰)紫杉醇0.2g溶于无水DMF 5ml，冰盐浴冷却至-10℃，滴加氯甲酸异丁酯0.2ml，然后滴入三乙胺0.35 ml，维持此温度下反应五分钟，撤去冰盐浴，15分钟后升至室温，滴入β-氨基乙基硫代硫酸钠0.086g的无水DMF溶液，搅拌反应1小时，加入无水乙醚析出沉淀。过滤收集产物。加压柱层析得到产品0.21克，展开剂CHCl3-CH3OH(先为20∶1，然后为5∶1)。电喷雾质谱1377(M+1)；1HNMR(300MHz,CD3COCD3)与文献紫杉醇1H NMR比较，产物增加的峰1H NMR:δ(ppm,CD3COCD3)∶5.6(d,2H),3.5(t,4H),3.2(t,4H),2.8(t,4H),2.5(t,4H)。
实施例12合成2’,7-二(琥珀酰胺丙基硫代硫酸钠)紫杉醇(Y-3c)将2′,7-二(琥珀酰)紫杉醇0.2g溶于无水DMF 5ml，冰盐浴冷却至-10℃，滴加氯甲酸异丁酯0.2ml，然后滴入三乙胺0.35ml，维持此温度下反应五分钟，撤去冰盐浴，15分钟后升至室温，滴入3-氨基丙基硫代硫酸钠0.1g的无水DMF溶液，搅拌反应1小时，加入无水乙醚析出沉淀。过滤收集产物。加压柱层析得到产品0.23g。展开剂CHCl3-CH3OH(先为20∶1，然后为5∶1)。电喷雾质谱1405(M+1)；1H NMR(300MHz,CD3COCD3)与文献紫杉醇1H NMR比较，产物增加的峰1H NMR:δ(ppm,CD3COCD3):5.6(d,2H),3.5(t,4H),3.2(t,4H),2.8(t,4H),2.5(t,4H),1.3(m,4H)。
实施例13合成2’,7-二(戊二酸酰胺丙基硫代硫酸钠)紫杉醇(Y-3d)将2′,7-二(戊二酸酰)紫杉醇0.22g溶于无水DMF 5ml，冰盐浴冷却至-10℃，滴加氯甲酸异丁酯0.2ml，然后滴入三乙胺0.35ml，维持此温度下反应五分钟，撤去冰盐浴，15分钟后升至室温，滴入3-氨基丙基硫代硫酸钠0.1g的无水DMF溶液，搅拌反应1小时，加入无水乙醚析出沉淀。过滤收集产物。加压柱层析得到产品0.20g。展开剂CHCl3-CH3OH(先为20∶1，然后为5∶1)。电喷雾质谱1433(M+1)；1H NMR(300MHz,CD3COCD3)与文献紫杉醇1H NMR比较，产物增加的峰1H NMR:δ(ppm,CD3COCD3):5.6(d,2H),3.5(t,4H),3.2(t,4H),2.8(t,43H),2.5(t,4H),1.5(m,4H),1.1(m,4H)。
实施例14制备2’-琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠紫杉醇(Y-3a)水溶性粉针剂在反应瓶中投入2’-琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠紫杉醇40mg，大豆磷酯1.5克，脱氧胆酸纳1.85克，加入丙酮20毫升，搅拌至溶。在30℃真空蒸发至干，加入磷酸盐缓冲液(pH=7.5)40ml溶解残留物，微孔滤膜(0.2微米)过滤，滤液冷冻干燥得每瓶含40mg 2’-琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠紫杉醇的水溶性粉针剂。该粉针剂可直接加入5％葡萄糖或10％氯化纳注射剂溶解后静脉滴注。
实施例15制备2’,7-二(琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠)紫杉醇(Y-3b)水溶性粉针剂在反应瓶中投入2’,7-二(琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠)紫杉醇40mg，大豆磷酯1.5克，脱氧胆酸纳1.85克，加入丙酮20毫升，搅拌至溶。在30℃真空蒸发至干，加入磷酸盐缓冲液(pH=7.5)40ml溶解残留物，微孔滤膜(0.2微米)过滤，滤液冷冻干燥得每瓶含40mg 2’,7-二(琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠)紫杉醇的水溶性粉针剂。该粉针剂可直接加入5％葡萄糖或10％氯化纳注射剂溶解后静脉滴注。
实施例162’-(琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠)紫杉醇(Y-3a)对人体乳腺瘤及小鼠黑色素瘤疗效试验1．样品配制精确称取13mg样品，置研钵中研细，加入25ml生理盐水中溶解。按需再以生理盐水稀释成中、低浓度的溶液，试液需每天新鲜配制。
2．动物2.1．裸小鼠和C57BL/6小鼠，体重17-19克，6-8周龄，性别雌性2.2．动物数裸小鼠试验组和阳性对照组每组均为6只，阴性对照组为12只。C57BL/6小鼠实验组和阳性对照组均为10只，阴性对照组为20只。
3．瘤源人体乳腺瘤异种移植模型(Bre-04)及小鼠黑色素瘤(B16)。
4．剂量设置13、5.2及2.08mg/kg。
5．给药方案静脉给药，每天一次，连续七天。阴性对照组给以相应的溶剂，相同给药方案。阳性对照组环磷酰胺30mg/kg(以Cremophor52.7％加无水乙醇39.6％溶解成6mg/ml再以生理盐水稀释成所需浓度)静脉给药，每天一次，连续七天。
6．实验对照阴性对照给以相应的溶剂。阳性对照为环磷酰胺(CTX)，以生理盐水配制。
7．试验主要步骤取生长旺盛肿瘤，无菌条件下以匀浆法制备成约1×107/ml细胞悬液，以相应宿主每鼠腋皮下接种0.2ml，次日按实验设计方案给药。裸小鼠置于SPF条件饲养；C57BL/6小鼠置于清洁级条件饲养。实验结束后解剖各组动物，剖取肿瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率％=[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×1008．实验结果2’-(琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠)紫杉醇(Y-3a)以13、5.2及2.08mg/kg iv×7qd的治疗方案对人体乳腺瘤异种移植模型(Bre-04)及小鼠黑色素瘤(B16)的初步抗肿瘤疗效试验，结果表明三个剂量组均有较明显的抗肿瘤疗效，其肿瘤抑制率前者分别为75.64％、68.17％及45.55％，后者分别为55.95％、46.03％及31.35％。结果详见表1及2。
表1．2’-琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠紫杉醇(Y-3a)对人体乳腺瘤(Bre-04)异种移植模型的疗效
P**＜0.01与阴性对照组相比表2．Y-3a对小鼠黑色素瘤(B16)模型的疗效
P**＜0.01与阴性对照组相比9．试验小结本发明水溶性的紫杉醇衍生物Y-3a高剂量组采用与紫杉醇10mg/kg等摩尔13mg/kg iv×7qd的治疗方案，对人体乳腺瘤异种移植模型(Bre-04)及小鼠黑色素瘤(B16)的抗肿瘤疗效显示具有相当的抗肿瘤效果，并与紫杉醇疗效接近。由于剂量之间存在有一定的量效关系，所使用的剂量经调整可望进一步提高疗效。Y-3a的LD50数据正在测试中。
实施例172’,7-二(琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠)紫杉醇(Y-3b)对人体乳腺瘤及小鼠黑色素瘤的疗效试验1．样品配制精确称取16mg样品，置研钵中研细，加入25ml生理盐水中溶解。按需再以生理盐水稀释成中、低浓度的溶液，试液需每天新鲜配制。
2．动物2.1．裸小鼠和C57BL/6小鼠，体重17-19克，6-8周龄，性别雌性2.2．动物数裸小鼠试验组和阳性对照组每组均为8只，阴性对照组为12只。C57BL/6小鼠实验组和阳性对照组均为12只，阴性对照组为20只。
3．瘤源人体乳腺瘤异种移植模型(Bre-04)及小鼠黑色素瘤(B16)。
4．剂量设置16、6.4及2.57mg/kg5．给药方案静脉给药，每天一次，连续七天。阴性对照组给以相应的溶剂，相同给药方案。阳性对照组环磷酰胺30mg/kg(以Cremophor52.7％加无水乙醇39.6％溶解成6mg/ml再以生理盐水稀释成所需浓度)静脉给药，每天一次，连续七天。
6．实验对照阴性对照给以相应的溶剂。阳性对照为环磷酰胺(CTX)，以生理盐水配制。
7．试验主要步骤取生长旺盛肿瘤，无菌条件下以匀浆法制备成约1×107/ml细胞悬液，以相应宿主每鼠腋皮下接种0.2ml，次日按实验设计方案给药。裸小鼠置于SPF条件饲养；C57BL/6小鼠置于清洁级条件饲养。实验结束后解剖各组动物，剖取肿瘤称重，按下列公式计算肿瘤抑制率％=[(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×1008．实验结果2’,7-二(琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠)紫杉醇(Y-3b)以16、6.4及2.57mg/kg iv×7qd的治疗方案对人体乳腺瘤异种移植模型(Bre-04)及小鼠黑色素瘤(B16)的抗肿瘤疗效试验，结果表明三个剂量组均有较明显的抗肿瘤疗效，其肿瘤抑制率前者分别为76.84％、69.26％及44.47％，后者分别为52.38％,42.86％,27.78％。结果详见表3及4。
表3．2’,7-二(琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠)紫杉醇(Y-3b)对人体乳腺瘤(Bre-04)异种移植模型的疗效
P**＜0.01与阴性对照组相比表4．2’,7-二(琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠)紫杉醇(Y-3b)对小鼠黑色素瘤(B16)模型的疗效
P**＜0.01与阴性对照组相比9．试验小结水溶性的紫杉醇衍生物2’,7-二(琥珀酰胺乙基硫代硫酸钠)紫杉醇(Y-3b)高剂量组采用与紫杉醇10mg/kg等摩尔16mg/kg iv×7qd的治疗方案，对人体乳腺瘤异种移植模型(Bre-04)及小鼠黑色素瘤(B16)的抗肿瘤疗效显示具有相当的抗肿瘤效果，并与紫杉醇疗效接近。由于剂量之间存在一定的量效关系，所使用的剂量经调整，可望进一步提高疗效。Y-3b的LD50数据正在测试中。
权利要求
1.一类硫代硫酸或其盐的水溶性紫杉醇衍生物，其特征在于所述衍生物是由硫代硫酸或其盐在紫杉醇的2′位和7位上以酯基形式构成，其结构式如下 其中R=CO(CH2)mCONH(CH2)nS2O3M或H,R′=CO(CH2)mCONH(CH2)nS2O3M或H,m=2-6,n=2-6,M=氢、钠、钾、锂、铵，R和R′均为CO(CH2)mCONH(CH2)nS2O3M时，可相同或不相同，R和R′中只能1个为H。
2.如权利要求1所述的紫杉醇衍生物，其特征在于所述衍生物具有下列两种的取代基的结构(1)R和R′均为CO(CH2)mCONH(CH2)nS2O3M，两者相同；(2)R为CO(CH2)mCONH(CH2)nS2O3M时，R′为Hm=2或3,n=2或3,M=钠
3.如权利要求1所述的紫杉醇衍生物，其特征在于所述的紫杉醇是天然紫杉醇。
4.如权利要求1所述的紫杉醇衍生物的应用，其特征在于所述紫杉醇衍生物可用于配制治疗肿瘤和癌症的药物制剂。
5.如权利要求4所述的紫杉醇衍生物的应用，其特征在于所述紫杉醇衍生物可以配制成用于静脉注射的水针剂或粉针剂。
全文摘要
本发明涉及一类含有硫代硫酸或其盐的水溶性紫杉醇衍生物,该衍生物可用于肿瘤和癌症的治疗。与现有的药用单一紫杉醇比较,具有保持原有疗效,降低毒副作用,生物利用度高的优点。
文档编号A61P35/00GK1288890SQ9911688
公开日2001年3月28日 申请日期1999年9月17日 优先权日1999年9月17日
发明者漆又毛 申请人:漆又毛