专利名称：大黄素－8－O－β－D－葡萄糖苷的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷在医药技术领域地新用途。
大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(Emodin-8-O-β-D-glucopyranoside)，结构式为
分子式为C21H20O5，为黄色针状结晶(MeOH)，分子量为432，能溶于乙酸乙酯、乙醇、甲醇。
该化合物可由蓼科蓼属植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)、大黄(Polygonum palmatum L.)、虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)等及酸模属植物羊蹄(Rumex japonica Houtt.)、巴天酸模(Rumex patientiaL.)等中提取制得。据报道，具有抑菌及抗肿瘤活性。
本发明的目的在于扩展大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的用途，将其用于制备防治老年性痴呆症或提高智力的药物和食品。
本发明的依据为首先，老年性痴呆病人的记忆功能失调已证明为胆碱能神经元退行性病变的结果，提高中枢的乙酰胆碱(Ach)含量治疗老年性痴呆具有较好的效果，近年来从石杉中分离得到的高活性早老性痴呆症(AD)治疗药物石杉碱甲(Hup A)就是一种高效的胆碱酯酶抑制剂；其次，现代医学认为老年性痴呆等疾病的发生和发展与海马神经元的损伤密切相关，一般认为对海马神经元损伤的保护具有重要的临床意义。经研究表明，大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对脑中真性乙酰胆碱酯酶活力具有可逆性抑制作用，其可提高中枢的乙酰胆碱(Ach)含量，而且，大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对海马神经元损伤具有一定保护作用，因而大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷既是一种真性乙酰胆碱酯酶可逆性抑制剂，又是海马神经元损伤保护剂，对老年性痴呆等疾病的发生和发展的多个环节有改善作用。动物行为学研究表明，大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷能显著改善由东莨菪碱导致的小鼠学习记忆功能障碍并能显著提高正常小鼠学习记忆获得能力，因此，大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷可用于制备防治老年性痴呆症或提高智力的药物和食品。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的药理试验及结果来说明其新用途。
一、对真性乙酰胆碱酯酶活力影响
1材料与方法
1．1动物ICR小鼠，雌雄各半，体重23±3g，由第二军医大学实验动物中心提供。在室温20±2℃实验室适应3天后开始实验。
1．2药品与试剂大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(PMEG，自提)；羟胺(分析纯)；三氯化铁(分析纯)，溴化乙酰胆碱(Sigma公司)。
2给药方法
2．1离体试验 直接作用于提取的大脑皮层乙酰胆碱酯酶酶原。
2．2整体试验a．急性给药小鼠口服PMEG 30分钟后，取大脑皮层提取酶原；b．慢性给药小鼠口服PMEG 15小时后，取大脑皮层提取酶原。
3测定方法 将适量的胆碱酯酶样品与14pM溴化乙酰胆碱50μl混合，反应液总体积100μl，37℃水浴中孵育30分钟，而后加入羟胺200μl终止反应，再加2M盐酸200μl混匀，最后加0.197M三氯化铁300μl，呈色后用高速离心机离心1～2分钟，吸取上清液300μl于微量酶标板内，用酶标仪在492纳米处记录吸光度。非酶水解管加缓冲液及乙酰胆碱同步孵育，在加入碱羟胺1分钟后再加酶样品，乙酰胆碱标准管加缓冲液及乙酰胆碱，置水浴中，试剂空白只加缓冲液。
酶活力计算已知标准管乙酰胆碱含量为0.7M，酶含量计算公式为
胆碱酯酶活性(30min)=(非酶水解管吸光度-样品管吸光度)/ 标准对照管吸光度×0.7
4结果4．1体外给药以微量羟胺比色法测定酶活力，对乙酰胆碱酯酶活力影响结果见表1表1．PMEG体外给药对乙酰胆碱酯酶活力的影响(X±s,n=3)*P＜0.05,**P＜0.01与空白组比较
IC50=54μM(95％可信限50μM～57μM)，酶活力恢复50％所需时间t1/2=115分钟，235分钟后酶活力完全恢复正常，表明PMEG在体外对乙酰胆碱酯酶活力抑制作用是可逆性的。
4．2整体试验
4．2．1急性给药 以微量羟胺比色法测定酶活力，对酶活力的影响结果见表2。表2．PMEG急性给药对乙酰胆碱酯酶活力的影响(X±s,n=3)**P＜0.01与空白组比较
以20mg/kg口服小鼠，在给药后0.5,1,1.5,2,2.5,3,4,5,6,8小时处死小鼠，取脑皮层匀浆，制备酶原，测定乙酰胆碱酯酶活力，观察计算酶的恢复时间。
酶活力恢复50％所需时间t1/2=165分钟，312分钟后酶活力完全恢复正常，表明PMEG在体内对乙酰胆碱酯酶活力抑制作用也是可逆性的。
4．2．2慢性给药 以微量羟胺比色法测定酶活力，对酶活力影响的结果见表3。
表3．PMEG慢性给药对乙酰胆碱酯酶活力的影响(X±s,n=3)
*P＜0.05与空白组比较
5结论离体实验和整体实验中对酶活力具可逆性抑制作用，体内外酶活力恢复50％所需时间分别为t1/2=115分钟，t1/2=165小时，全部恢复所需时间分别是t=235分钟，t=312小时，为可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂。
二、对神经元细胞损伤的保护作用
1材料和方法
1．1动物与材料 SD胎鼠购自第二军医大学动物中心；DMEM培养基，马血清，胎牛血清，β淀粉样蛋白1-43(Aβ1-43)购自Sigma公司。
1．2方法
1．2．1制备胎鼠海马细胞取受孕后14～16天的SD胎鼠，无菌条件下分离取出海马，经机械分散、胰酶消化成细胞悬液后，以1×106细胞/ml铺板，孵育，每周换液两次。接种后3～4天加入阿糖胞苷抑制非神经细胞的增殖。
1．2．2Aβ1-43对海马细胞的损伤及PMEG的保护作用取培养第7天的海马细胞，加入Aβ1-43(100nM)，同时加入不同浓度的PMEG，共同孵育，24小时后，测定细胞上清乳酸脱氢酶活性及细胞四唑盐染色
1．2．3乳酸脱氢酶(LDH)活性测定细胞损伤时，细胞膜通透性增高，细胞中LDH释放到细胞上清中，因此常以细胞培养上清中LDH活性的增加来反映细胞的损伤。LDH活性的测定采用连续监测法进行。
1．2．4四唑盐染色测定(MTT法测定)MTT是一种水溶性黄色四唑盐，它能被活细胞的线粒体脱氢酶转化为一种不溶性的紫色结晶，此结晶能溶于异丙醇等溶剂并在570纳米处有吸收峰；死细胞没有这种能力。因此该方法被用来取代同位素掺入法用于细胞增殖的测定。
2结果
淀粉样蛋白(Aβ)对培养的胎鼠海马细胞有明显损伤作用，使细胞膜通透性增加，使细胞上清中LDH活性明显升高(从30.10±4.80增加到78.64±5.87,P＜0.01)，并使MTT吸收度值显著降低(从0.469±0.075降低到0.171±0.043,P＜0.01)；PMEG对Aβ损伤有不同程度的保护作用，PMEG10-8、10-7、10-6M使升高的LDH降低24.89％、31.31％、24.5％，使MTT值显著升高44.44％、52.63％、41.52％(见表4)。
表4．PMEG对Aβ所致海马细胞损伤的保护作用(X±s)
*P＜0.05，**P＜0.01与Aβ(100nM)组比较
3结论 现代医学认为老年性痴呆等疾病的发生和发展与海马神经元的损伤密切相关，一般认为对海马神经元损伤的保护具有重要的临床意义，本实验考察了PMEG对海马神经元损伤的保护作用，结果表明PMEG对Aβ造成的损伤具有一定的保护作用，表明对海马神经元损伤的保护是PMEG防治老年性痴呆的又一作用途径。
三、对整体动物学习记忆功能的影响
1材料与方法
1．1动物与试药昆明种小白鼠120只，雌雄各半，体重21±2g，由第二军医大学实验动物中心提供。在室温20±2℃实验室适应3天后开始实验。大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(PMEG)自提，用时以生理盐水配成100mg/L；石杉碱甲(HupA)由军事医学科学院毒物药物研究所提供，用时以生理盐水配成20mg/l；氢溴酸东莨菪碱注射液，无色透明，1ml/支，0.3mg/ml，由上海禾丰制药厂有限公司生产，批号9511010。
1．2实验方法
1．2．1给药方法取60只小鼠，随机分为3组，每组20只，各组分别灌胃给予生理盐水(2毫升/只)、PMEG(10mg/kg体重)及HupA(2mg/kg体重)，每日两次，连续七天后测试学习记忆功能。另取60只小鼠，随机分为3组，同样方法给药七天后，于训练前10分钟静脉注射东莨菪碱(2mg/kg)制造损伤模型，测试学习记忆功能。
1．2．2采用外形为一长方形反射箱，大小10×10×60厘米，用黑色塑料板分隔成5间。底面铺以铜栅，间距为0.5厘米，用以通电，电压强度由变压器控制。每间左后角置一高和直径均为4.5厘米的平台。将动物放入反应箱内适应环境3分钟，然后通以36伏的交流电。动物受到电击，其正常反应是跳到平台上以逃避伤害性刺激。多数动物可能再次或多次跳至铜栅上，受到电击后又跳回平台。如此训练5分钟，并记录受到电击的次数，即错误次数。记录受电击的动物数及3分钟内的错误总数。对实验结果进行t检验。
2实验结果
2．1对正常学习记忆获得的作用
HupA、PMEG分别给药7天，测试结果见表5。HupA、PMEG皆能显著提高正常小鼠学习记忆获得能力，在此剂量条件下，两者无显著差异。
表5．PMEG对正常小鼠学习记忆获得的影响(X±s)
*p＜0.05与生理盐水组比较
2．2对东莨菪碱所致学习记忆障碍的拮抗作用
HupA、PMEG分别给药7天后，用东莨菪碱造模，测试结果见表6。HupA、PMEG皆能显著提高东莨菪碱所致小鼠学习记忆获得能力，在此剂量条件下，两者无显著差异。
表6．PMEG对东莨菪碱所致小鼠学习记忆获得障碍的影响(X±s)
**p＜0.01与生理盐水组比较
3结论PMEG能显著改善由东莨菪碱导致的小鼠学习记忆功能障碍并能显著提高正常小鼠学习记忆获得能力，与HupA(2mg/kg)无显著差异。
四、急性毒性试验
昆明种小鼠30只，雌雄各半，体重18～20g，由第二军医大学实验动物中心提供。在室温20±2℃实验室适应3天后开始实验。随机分成3组，分别灌胃给予大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷1.0、2.0、4.0g/kg体重，立即观察各剂量组小鼠的反应情况及在7天内的死亡的数目，并对存活和死亡的小鼠进行解剖病理检查，结果表明，各剂量组小鼠无死亡，病检未见异常变化，表明大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷口服具有较高的安全性。
以上试验结果说明大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对脑中的真性乙酰胆碱酯酶具有良好的可逆性抑制作用，对Aβ造成的海马神经元损伤具有一定的保护作用，能显著改善由东莨菪碱导致的小鼠学习记忆功能障碍，这些作用都有利于预防和治疗老年性痴呆症，能显著提高正常小鼠学习记忆获得能力，从而可用于制备防治老年性痴呆症或提高智力的药物及食品。
PMEG制备方法何首乌、大黄、虎杖、羊蹄、巴天酸模等植物的干燥根或根茎粉碎，制成粗粉，按常规用80％乙醇渗漉提取，浸出液减压浓缩得浸膏，以3倍量水混悬，按常规依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取。乙酸乙酯浸膏经反复硅胶柱层析，氯仿/甲醇(15∶1、10∶1)洗脱；正丁醇萃取物过大孔树脂柱，以水及10％、30％、50％、70％、95％乙醇洗脱；收集50％、70％洗脱组份，进行硅胶柱层析，依次以氯仿/甲醇(15∶1、10∶1)溶剂系统洗脱，收集氯仿/甲醇(10∶1)洗脱部位，再反复柱层析，得大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(PMEG)黄色结晶，按常规制备成胶囊或片剂，作为药物用于防治老年性痴呆症，也可作为食品添加剂用于制备提高智力的功能性食品。
本发明的优点在于
本发明对已知化合物大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷安全低毒，药理作用较强，其原料来源丰富、价廉，制备工艺简单，可用于制备防治老年性痴呆症或提高智力的药物及食品。
权利要求
1、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷用于制备防治老年性痴呆症和提高智力的药物或食品的用途。
全文摘要
本发明涉及大黄素－8－O－β－D－葡萄糖苷在医药技术领域的新用途,其对脑中的真性乙酰胆碱酯酶具有良好的可逆性抑制作用,对β一淀粉样蛋白造成的海马神经元损伤具有一定的保护作用,能显著改善由东莨菪碱导致的小鼠学习记忆功能障碍,能显著提高正常小鼠学习记忆获得能力,因而大黄素－8－O－β－D－葡萄糖苷可用于制备防治老年性痴呆症和提高智力的药物或食品。
文档编号A61P25/28GK1302610SQ99119950
公开日2001年7月11日 申请日期1999年11月2日 优先权日1999年11月2日
发明者陈万生, 徐江平, 殷学平, 柴逸峰, 周斌, 乔传卓, 张卫东 申请人:中国人民解放军第二军医大学