专利名称：亚单位抗原微乳剂疫苗的制造方法
技术领域：
本发明涉及生物制品一疫苗制造领域，一种用于亚单位抗原的微乳剂疫苗制造技术。
亚单位抗原是指由病原微生物提取或通过生物工程技术制备的一种有效保护性抗原成份。由于在制备过程中除去了对保护性免疫无效的成份，用其制备的疫苗能够产生更为特异的免疫反应，是目前疫苗研究的方向之一。但是，由于亚单位抗原一般是分子量较小的纯化抗原成份，虽然能够产生更为特异的免疫反应，但由于抗原性较弱，必须与有效的佐剂配合使用，才能获得理想的免疫效果。目前对亚单位蛋白抗原效果较好的佐剂是用Qui/A制备的免疫刺激复合物。这种佐剂虽然有良好的佐剂效果，但由于其原材料Qui/A来源于南美的一种树皮，产量有限，而且价格昂贵。另外在制备免疫刺激复合物疫苗时，必须加入去污剂，而且要经超速离心进行纯化，工艺过程繁杂，不适于大批量工业化生产。
本发明的目的是为了研制更为有效、而且来源方便、制造工艺简便的亚单位疫苗佐剂用于生产疫苗。
本发明的实施方案是采用由中国的一种植物提取的植物糖苷作为主要成份与胆固醇经超声处理制备成功一种微乳剂佐剂。将该微乳剂与提取的病原微生物亚单位抗原按一定比例混合，制成亚单位微乳剂疫苗，并通过对新城疫病毒外膜蛋白及禽巴氏杆菌亚单位抗原的试验，来验证其免疫增强和佐剂作用。
本发明的具体实施步骤为，由中国草药皂角用水浸法提取皂角苷，经澄清后，经喷雾干燥(出口温度为80～120℃)为皂角苷粉。在制备微乳剂基质时，将皂角苷粉用蒸镏水配成5mg/ml的皂角苷溶液；将胆固醇用氯仿配成100mg/ml的胆固醇溶液。在超声过程下，按照1∶100(V/V)将以上胆固醇溶液缓慢加到皂角苷溶液中，继续超声至混合液呈白色乳状液。再于减压条件下抽除氯仿，并以5000r/min离心20min，除去沉淀物后的上部液体再经20000r/min离心1h，去其上清液，用pH7.2 PBS溶液将沉淀稀释至原溶液体积而成微乳剂，按终浓度1/万加入硫柳汞防腐。
在制备亚单位微乳剂疫苗时，将提取的亚单位抗原按2mg/ml的浓度加入微乳剂中，即成为亚单位微乳剂疫苗。
在对新城疫病毒外膜蛋白制备的新城疫亚单位微乳剂疫苗的试验中，将新城疫病毒外膜蛋白加入制备的微乳剂中，使蛋白(即亚单位抗原)浓度为2mg/ml，免疫小白鼠，免疫后90天，亚单位微乳剂疫苗组，HI抗体效价仍可达到1∶128。而仅注射同样剂量外膜蛋白组，在免疫后20天HI抗体效价只有1∶8，30天后即转为阴性。
在3批禽霍乱亚单位微乳剂疫苗的安全实验中注射10日龄无特定病原(SPF)鸡，每只胸部肌肉注射1ml禽霍乱亚单位微乳剂疫苗，未见任何不良反应。在效力试验中，用该禽霍乱亚单位微乳剂疫苗免疫1月龄SPF鸡，每只肌肉注射1ml，并于10天后再用相同剂量和方法进行第二次免疫接种。经第二次免疫后30天，用禽源多杀性巴氏杆菌强毒进行攻击，保护率可达到100％，而同样剂量的油佐剂灭活疫苗免疫组只有60％。在免疫期试验中，经两次免疫的鸡，于第二次免疫后60天用禽源多杀性巴氏杆菌强毒攻击，保护率为80％～100％，免疫后6个月，保护率仍可达到60％。
在对禽源大肠杆菌的试验中，将禽源大肠菌菌毛抗原与制备的微乳剂基质制成亚单位微乳剂疫苗。用此疫苗免疫SPF鸡后15天采血测定凝集抗体，免疫组100％转为阳性，而油佐剂免疫组只有66％转为阳性。
微乳状液是一种具有高度稳定性的溶液，其物理性状介于乳状液与胶团溶液之间，其质点直径小于0.1μm，除稳定性高外，由于表面积的增加，对溶液中的溶质有更高的分散能力和吸附性。采用的皂角苷本身具有免疫增强作用，将其与胆固醇经超声处理制成微乳剂后，对于蛋白抗原具有很强的吸附性能，从而使蛋白抗原分子聚集成具有多个抗原决定簇的颗粒、增加对免疫细胞的有效刺激。在本发明的有关验证试验中将新城疫病毒外膜蛋白抗原、禽源多杀性巴氏杆菌裂解后的可溶性蛋白抗原及禽源大肠杆菌菌毛抗原分别加入该微乳剂溶液中制备成的各自亚单位微乳剂疫苗均取得安全有效的结果即形成的新城疫病毒外膜蛋白微乳剂免疫小白鼠后，直至90天，HI抗体价仍可达到1∶128，而蛋白抗原单独免疫鼠在免疫后30天HI抗体即转为阴性。禽源多杀性巴氏杆菌是一种免疫原性较弱的致病菌，目前使用的氢氧化铝胶灭活疫苗和油佐剂灭活疫苗的免疫效果均不理想，免疫保护率仅为50％～80％。将禽霍乱微乳剂疫苗免疫鸡，二次免疫攻毒保护率可达到80％以上。免疫期已测到2个月。大肠杆菌微乳剂疫苗免疫SPF鸡后15天采血测定凝集抗体，免疫组100％转为阳性。而油佐剂免疫组只有66％转为阳性。根据以上对不同亚单位抗原的试验，可以认为发明的微乳剂佐剂对于亚单位抗原有良好的免疫增强作用，是一种完全新型的佐剂。
实施例及实验实施例1 微乳剂基质的制备将皂角苷粉用蒸镏水配成5mg/ml的皂角苷溶液；将胆固醇用氯仿配成100mg/ml的胆固醇溶液。将1ml 100mg/ml胆固醇氯仿溶液在超声过程中(250W)逐滴加到100ml 5mg/ml皂角苷溶液中，继续超声(约10min)至混合液呈白色乳状液。再于减压条件下抽除氯仿，并以5000r/min离心20min，除去沉淀物后的上部液体再经20000r/min离心1h，去其上清液，用pH7.2 PBS溶液将沉淀稀释至100ml而成为半透明的微乳剂，按终浓度1/万加入硫柳汞防腐。实施例2 新城疫(ND)微乳剂疫苗的制备将新城疫病毒(NDV)以40000r/min离心3h，弃上清，将沉淀病毒用1/400原病毒液体积的pH7.2 PBS溶解成浓缩400倍的病毒液，加入2％Triton X100室温作用30min，将裂解病毒液置于40％蔗糖溶液上以40000r/min超速离心10h。收取上层蛋白带，即为NDV外膜蛋白，紫外法测定蛋白浓度为60mg/ml。
取100ml微乳剂基质，分别加入提取的蛋白抗原，使终浓度为2mg/ml，即为新城疫微乳剂疫苗。实施例3 禽霍乱微乳剂疫苗的制备将禽巴氏杆菌C48-1株强毒菌马丁琼脂培养菌膜用pH7.2 PBS洗下，配制成100亿/ml菌液，经超声处理30min破碎菌体后，再反复冻融2次，使菌体充分裂解；以5000r/min离心30min，收取上清蛋白溶液，即为禽源多杀性巴氏杆菌裂解亚单位抗原。蛋白浓度为20mg/ml。
取100ml微乳剂基质，分别加入提取的禽源多杀性巴氏杆菌裂解亚单位抗原，使终浓度为2mg/ml，即为微乳剂疫苗。实验1 新城疫微乳剂疫苗免疫试验将新城疫微乳剂疫苗免疫10只小白鼠，每只肌肉注射0.5ml，同时将NDV外膜蛋白溶液配制成2mg/ml，也注射10只小白鼠作为对照组。免疫后20天、30天、60天采血测定其血凝(HI)抗体价。
新城疫病毒外膜蛋白微乳剂苗免疫小白鼠后20天、30天、90天，HI抗体价均达到1∶128，而同批外膜蛋白抗原免疫组，免疫后20天HI抗体价仅为1∶8，免疫后30天以后一直为阴性，结果见表1。
表1新城疫病毒外膜蛋白微乳剂苗对小鼠的免疫
禽巴氏杆菌微乳剂苗的安全试验将3批禽霍乱微乳剂疫苗各肌肉注射5只小白鼠，每只0.5ml；各注射10只10日龄SPF鸡，每只1ml，观察10天进行安检。试验结果表明以上3批禽霍乱微乳剂疫苗接种10日龄SPF鸡和小白鼠后，均未见任何不良反应，说明该疫苗安全性好。实验3 禽巴氏杆菌微乳剂苗效力试验将3批禽巴氏杆菌微乳剂苗与9801批同批抗原的油佐剂苗分别免疫1月龄SPF鸡，每只肌肉注射疫苗1ml。10天后第二次免疫，每只肌肉注射1ml，第二次免疫后30天每组取5只鸡，用C48-1强毒菌进行攻击。
经3批微乳剂苗二次免疫的免疫组鸡，在免疫后30天，攻毒保护率均达到100％，而同批抗原的油佐剂苗免疫组为60％，对照组100％发病死亡，结果见表2。
表2三批禽巴氏杆菌微乳剂苗的效力试
实验4 禽巴氏杆菌微乳剂苗免疫剂量测定将9803批微乳剂苗按2ml/只、0.5ml/只、0.2ml/只免疫1月令SPF鸡，进行免疫剂量测定，免疫后30天用禽源多杀性巴氏杆菌C48-1强毒菌株进行攻击。其试验攻毒保护率分别为100％、100％、50％，说明最小有效免疫剂量为0.5ml/只，使用剂量采用1ml/只比较合理，结果见表3。
表3禽巴氏杆菌微乳剂苗免疫剂量测定
实验5 禽霍乱微乳剂苗的免疫程序及免疫期试验将3批禽霍乱微乳剂苗分别免疫20日龄未经任何禽霍乱疫苗免疫过的鸡(以下称非免疫鸡)，每只胸肌注射1ml，第一次免疫(以下或称首免)后30天每组取5只进行强毒攻击，剩余鸡每只胸肌注射1ml同批微乳剂苗进行第二次免疫(以下可称二免)。二免后60天，每组取5只用禽源多杀性巴氏杆菌强毒菌进行攻击试验。结果为首免后30天，攻毒保护率9801、9802、9803批苗分别为80％、80％、100％，二免后60天攻毒保护率分别为100％、80％、100％，结果见表4。
表4禽巴氏杆菌微乳剂苗免疫程序及免疫期试验
权利要求
1.一种亚单位抗原微乳剂疫苗制造方法，其特征在于用由中国皂角提取皂角苷作为主要成份与胆固醇经超声处理制备成一种微乳剂。将该微乳剂作为佐剂与制备疫苗用微生物亚单位抗原按一定比例混合，制成免疫用亚单位微乳剂疫苗。
2.权利要求1所述的亚单位抗原微乳剂疫苗制造方法，其特征在于微乳剂是由中国草药皂角提取制成的皂角苷粉为其主要成分之一。
3.权利要求1所述的亚单位抗原微乳剂疫苗制造方法，其特征在于制备疫苗用微生物亚单位抗原是复制后的疫苗病毒经处理制成的具有免疫活性的成分——即亚单位抗原。
4.权利要求1所述的亚单位抗原微乳剂疫苗制造方法，其特征在于制备疫苗用微生物亚单位抗原是繁殖后的制苗用细菌经处理制成的具有免疫活性的成分——即亚单位抗原。
全文摘要
本发明涉及的是一种亚单位抗原微乳剂疫苗制备技术,用提取的皂角苷和胆固醇制成微乳剂,经分别与提取的新城疫病毒外膜蛋白、禽源多杀性巴氏杆菌裂解产物和禽源大肠杆菌菌毛抗原制成亚单位微乳剂疫苗,免疫鼠和鸡。新城疫病毒外膜蛋白微乳剂疫苗免疫鼠HI抗体可达到1∶128。显著高于外膜蛋白单独免疫鼠的1∶8。禽霍乱微乳剂疫苗免疫鸡,经两次免疫接种,免疫后30天和60天,攻毒保护率可达到80%以上。用大肠杆菌亚单位微乳剂疫苗免疫SPF鸡后15天采血测定凝集抗体,免疫组100%转为阳性,而油佐剂免疫组只有66%转为阳性。
文档编号A61K47/46GK1265327SQ99126278
公开日2000年9月6日 申请日期1999年12月23日 优先权日1999年12月23日
发明者支海兵, 刘倩, 宋立 申请人:中国兽药监察所