专利名称：在喷雾过程中脂类:dna制剂的稳定化的制作方法
发明的背景本发明总的涉及脂类/脂质体技术和DNA输送领域。更具体地，本发明涉及在喷雾过程中脂类DNA制剂的稳定化。
相关技术的描述与气溶胶递药相适应的脂质体制剂的开发，已使喷射式喷雾器能应用于输送核酸制剂，而该核酸制剂的生物活性足以维持用于治疗用途。利用脂质体作气溶胶递药有很多优点，包括与水的相容性；在肺部持续缓释以维持治疗药物的水平；而且，脂质体有助于细胞内递药(特别是对呼吸上皮细胞)。
气溶胶定位、局部治疗的功效，决定于在肺内疾病部位所释放的药物量；有一些不同的关键参数决定着释放的量，它们相互作用从而决定气溶胶制剂的治疗效果。例如，喷雾器设计、流速、流量、颗粒大小、吸湿性、以及是否存在辅助设备(如管子、连接器、管头、面罩等)是重要的变数。因此，可通过合适的喷雾器设备的适当操作，来提高合适颗粒大小的气溶胶输出效率。设备的不适当操作和/或不佳参数可影响吸入剂量、递药部位，并影响治疗结果。
药物制剂也是调节气溶胶输出效率和药物-脂质体的气体动力学性质的关键因素。现己发现，利用低的相转变温度所制备的脂质体，可提高药物-脂质体输出效率(见Waldrep et al.,J.Of Aerosol Med.7:1994(1994)和Waldrep et al.,Int′l J.Of Pharmaceutics 97:205-12(1993))。提高气溶胶药物-脂质体输出效率的其它方法是提高药物和磷脂储液槽的浓度。一些药物-脂质体制剂以高于50mg/ml的浓度喷雾时，会导致喷雾器喷嘴的堵塞；但空脂质体制剂在高达150mg/ml时也能成功喷雾(见Thomas,et al.,Chest 99:168-70(1991))。另外，气溶胶性能(输出量和颗粒大小)受理化性质(如粘度和表面张力)的部分影响。这些变量影响了与经喷射式喷雾器的气溶胶递药相适应的最大药物-脂质体浓度。
对于定向的肺基因疗法目的，一个与阳离子型脂类质粒DNA制剂的气雾递药有关的问题是，喷雾过程导致制剂的转染效率显著下降。这是气雾制剂的活体基因转移效率较低的一个主要原因。活性的快速丧失与各种不同喷射式喷雾器和脂类DNA制剂有关。
现有技术的缺陷还在于，缺乏改善喷雾过程中脂类DNA制剂稳定性的有效手段。本发明满足了本领域的这种长期需求和期望。
发明概述在本发明的一个实施例中，提供了一种脂质体气雾剂组合物，它包括(1)药物化合物，(2)阳离子型脂类，(3)中性的辅助脂类(co-lipid)和(4)胰蛋白胨。
在本发明的另一实施例中，提供了一种脂质体气雾剂组合物，它包括(1)药物化合物，(2)阳离子型脂类，(3)中性的辅助脂类(co-lipid)和(4)谷氨酸。
在本发明的另一实施例中，提供了一种用于脂类DNA转染的、阳离子型脂类辅助脂类DNA的喷雾悬浮液，其中所述阳离子型脂类是双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇(bis(guanidinium)-tren-cholesterol,BGTC)。
在本发明的另一实施例中，通过将小鼠置于一密闭室中然后暴露于气雾剂(该气雾剂每隔10分钟喷雾1分钟)，从而使气雾剂暴露更为有效。在这种设计中，使用含5％二氧化碳的压缩空气代替大气，以提高动物的深呼吸，从而提高转染制剂的肺沉积量。
从下面出于说明目的而给出的本发明较佳实施例的描述中，将会明白本发明的其它的和更进一步的内容、特征和优点。
附图的简单说明通过附图所示的某些实施例，可对上面简单总结的本发明作更具体的描述，从而获得和更详细地理解本发明的上述特征、优点和目的，以及其他显而易见的方面。这些附图构成说明书的一部分。但是，要提及的是，附图阐述的是本发明的较佳实施例，因而不应认为用于限制本发明范围。
图1显示了向喷雾(器)溶液中加入1.3％胰蛋白胨产生了类似的、中等水平的对抗喷雾器诱导型损失的保护作用。
图2显示了在不同脂类中遇到的，胰蛋白胨对喷雾器诱导型损失的作用。
图3显示了当谷氨酸的存在浓度与胰蛋白胨浓度相当时，谷氨酸也提供了抗喷雾器诱导型细胞转染活力下降的明显的保护作用。
图4显示了对Balb/C小鼠的活体气雾处理结果。在该试验中，让动物间歇地暴露于所示的脂类DNA(氯霉素乙酰基转移酶基因)制剂，或不被暴露于气雾中(noaerosol exposure,NEG)。暴露是这样实现的将动物置于连接有一PuritanBennett 1600单喷射式喷雾器的密闭室中，提供1分钟的气雾剂随后提供9分钟延迟以便动物呼吸气雾剂，然后再开始下一循环。喷雾器是用含5％二氧化碳的压缩空气驱动的以提高深呼吸程度。重复该过程，直至所有的喷雾器液体被耗尽(约16小时)。在气雾剂处理结束后48小时，杀死动物，取出肺，抽提组织，用ELISA法分析CAT活性的表达情况。
图5显示了在喷雾过程中阳离子型脂类对转染稳定性的影响。如下详细所示，将脂类DNA制剂在所示的期间内进行喷雾，然后将脂类DNA制剂从喷雾器储液槽取出并用培养的A549细胞(人肺癌细胞)在体外转染分析中定量地加以监测。鈲胆甾醇/DOPE的活性代表了2个试验的平均值，并且在喷雾过程中其稳定性明显高于DC-胆甾醇/DOPE(所示的)和大量其他在该图中未示出的常用脂类。
发明的详细描述本发明涉及一种脂质体气雾剂组合物，它包括(1)药物化合物，(2)阳离子型脂类，(3)中性的辅助脂类(co-lipid)和(4)胰蛋白胨。在一种脂质体气雾剂组合物中，药物化合物是质粒DNA形式的基因。有用磷脂的代表性例子包括蛋黄磷脂酰胆碱、氢化的大豆磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰基-二棕榈油酰基磷脂酰胆碱、双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇和二棕榈酰磷脂酰胆碱。辅助脂类通常是中性磷脂。合适的辅助脂类的代表性例子包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺类似物和胆甾醇。典型地，胰蛋白胨在组合物中的数量足以增强DNA脂类悬浮液在喷雾后的转染。通常，该浓度约为0.1-5％。
本发明还涉及一种脂质体气雾剂组合物，它包括(1)药物化合物，(2)阳离子型脂类，(3)中性的辅助脂类(co-lipid)和(4)谷氨酸。在一种脂质体气雾剂组合物中，药物化合物是基因。有用磷脂的代表性例子包括蛋黄磷脂酰胆碱、氢化的大豆磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰基-二棕榈油酰基磷脂酰胆碱、双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇和二棕榈酰磷脂酰胆碱。典型地，谷氨酸在组合物中的数量足以增强DNA脂类悬浮液在喷雾后的转染。通常，该浓度约为0.1-5％。
本发明还涉及一种用于脂类DNA转染的、阳离子型脂类DNA的喷雾悬浮液，其中所述阳离子型脂类是双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇，而且中性辅助脂类是DOPE。较佳地，双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇在该悬浮液中的所含浓度，与测定为最佳转染的质粒DNA浓度相关。稳定制剂的浓度取决于这三种组份(即质粒DNA，阳离子型脂类双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇和中性的辅助脂类DOPE)的相对浓度。质粒DNA的优选范围是约40-400微克/毫升。质粒DNA与合并脂类(脂类制剂含比例1∶1的阳离子型脂类和中性辅助脂类)的最佳比例约为1∶3。然而，对于不同的应用或不同的质粒而言，稍有不同的比例通常证明是最佳的，例如较大的质粒有更大的净电荷因而需要更多的脂类来中和电荷。因此，对于400微克/毫升DNA而言，人们可以使用约600微克/毫升双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇和600微克/毫升DOPE。在约1.5毫克/毫升之内的双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇的浓度(当与DOPE以1∶1比例存在)，在含质粒DNA的制剂中应是稳定的。在本发明的一种喷雾型阳离子型脂类DNA悬浮液中，DNA浓度与合并的阳离子型脂类和中性辅助脂类的浓度之比约为1∶1至1∶4。
下面的实施例用于阐述本发明的各种实施方案，而并不用于以任何方式限制本发明。
实施例1质粒巨细胞病毒(CMV)启动子和大肠杆菌β-半乳糖苷酶报道基因(pCMVβ-gal)被用于评估哺乳动物细胞表达。pCMVβ-gal(Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA)是以细菌糊剂形式从Genzyme,Inc．获得，然后在Qiagen柱(Qiagen,Inc.,Chat sworth,CA)上纯化。
实施例2阳离子型脂类通过混合DL-EPC(5毫克/毫升氯仿)和DOPE(5毫克/毫升氯仿)，然后在氮气下干燥，制得DL-EPC/DOPE，即1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine,DL-EPC)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE，得自Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)的1∶1混合物。然后将该脂类溶解在37℃叔丁醇中，在-80℃冷冻，然后冻干至少24小时。
通过将DC-CHOL溶解于氯仿，再与DOPE混合，从而制得DC-CHOL/DOPE，即3β-[N-[(N′,N′-二甲基氨基)乙烷]氨基甲酰基]胆甾醇(DL-CHOL)和DOPE的1∶1混合物。然后按与DL-EPC/DOPE相同方式制备该脂类。脂类贮存于-20℃以备使用。然后将脂类升温至室温，用灌溉用水(Water For Irrigation,WFI)膨胀至少30分钟，然后与DNA复合。
实施例3DNA与脂类比例的优化DNA与脂类比例的优化通过凝胶电泳加以确定。当负的DNA电荷被阳离子型脂类完全中和时，组织培养的转染就最大化。通过将DNA与脂类之比在1∶1至1∶10之间变化，然后将复合物在1％琼脂糖-TAE凝胶上电泳，可以观察到最佳比例，因为中性的脂类DNA复合物是不迁移的。
实施例4组织培养A549细胞(具有上皮样形态的人肺癌)，在补充了10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和50微克/毫升庆大霉素的Dulbecco氏改进的必需培养基(D-MEM)中培养。
实施例5转染在转染前一天，将A549细胞以1.5×105细胞/35厘米培养皿进行接种。在转染时，细胞的汇合度约为80％。将等体积的2×Opti-memⅠ型减少血清培养基(Opti-mem；Gibco-BRL,Grand Island,NY)从喷雾器储液槽加至各175微升等分样品中，然后用Opti-mem(1×)培养液加至终体积3.5毫升。Opti-mem是一种改良的Eagle′s极限必需培养基，其中有加入的生长因子，适用于阳离子型质粒-DNA转染。刚好在转染之前，细胞用Opti-mem漂洗2次，然后用1毫升转染液/每孔覆盖(对于每个时间点转染3个孔)。在24小时后，去除溶液，细胞用Opti-mem漂洗2次，然后加入1毫升A549培养液。再孵育细胞24小时，用PBS漂洗2次，然后裂解。
实施例6对β-半乳糖苷酶转染效率的定量分析用含0.5％Triton X-100的0.1M Tris-HCl裂解A549细胞。细胞碎片被离心去除。裂解液的蛋白质浓度通过二辛可酸(bicinchronic acid)(BCA Protein Assay；Pierce,Rockford,IL)蛋白分析加以确定。β-半乳糖苷酶活性，用氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG；Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)溶液(其中含氯化镁和β-巯基乙醇的磷酸缓冲液(PBS))进行测量。将100微升的裂解液等分样品加至96孔板的孔中，然后加入等体积的CPRG溶液。样品和标准物在37℃孵育，然后在Dynatech MR5000微量滴定板读数仪(Dynatech Laboratories,Inc.,Chantilly,VA)上读取数据。
实施例7结果某些在喷雾前加至脂类DNA悬浮液的成分，可明显地稳定这些制剂的转染力。这导致被输送的生物活性基因治疗剂的数量增加了数倍。
在数次试验中，将0.13％胰蛋白胨(酪蛋白的酶(胰酶)消化产物)加至喷雾器溶液中，在用A549人肺癌细胞进行的体外测试中，当等分的喷雾器循环材料分别在雾化的3、6、和9分钟时从喷雾器储液槽中(以15L/分流速和5毫升起始体积)取出，结果分别保留了对照(未喷雾的)材料的105％、100％和93％转染活性。这与未加入胰蛋白胨的对照形成了对比，该对照仅保留了51％、13％和6％转染活性。加入1.3％胰蛋白胨产生了类似的但中等程度的抗喷雾器诱导型下降的保护作用。
这些结果是由与pCMVα-GAL质粒DNA复合的DL-EPC/DOPE所构成的制剂获得的。当该试验再重复2次时，实现了类似的转染活性的稳定化作用。所用的喷雾器是改良的Puritan Bennett 1600喷雾器(Carlsbad,CA)一双喷嘴的一个管子被去除-该喷雾器被称为Puritan Bennett 1600单喷射式喷雾器(PB sj)。对照喷雾(器)溶液由在灌溉水(WFI,Baxter)中复合的200微克pCMVβ-GAL和700微克DL-EPC/DOPE构成，总体积为5毫升。含0.13％胰蛋白胨的喷雾溶液含有相同数量的质粒DNA和脂类。在DNA和脂类已复合15分钟后，将50微升一份的13％胰蛋白胨原液(13％w/v，在WFI中)加至喷雾溶液中(终体积仍保持5毫升)。含1.3％胰蛋白胨的喷雾溶液也含有相同数量的质粒DNA和脂类。在DNA和脂类已复合15分钟后，将0.5毫升一份的13％胰蛋白胨原液(13％w/v，在WFI中)加至喷雾溶液中(在加入胰蛋白胨后，终体积仍为5毫升)。
此外，当使用由DC-CHOL/DOPE和pCMVβ-GAL构成的制剂时，获得了类似的稳定化。这表明，该效果显然并不取决于脂类制剂中具体的阳离子型脂类。对照喷雾溶液由在灌溉水(WFI)中复合的200微克pCMVβ-GAL和800微克DC-CHOL/DOPE构成，总体积为5毫升。含0.13％胰蛋白胨的喷雾溶液含有相同数量的质粒DNA和脂类。在DNA和脂类已复合15分钟后，将50微升一份的13％胰蛋白胨原液(13％w/v，在WFI中)加至喷雾溶液中(终体积仍保持5毫升)。含1.3％胰蛋白胨的喷雾溶液也含有相同数量的质粒DNA和脂类。在DNA和脂类已复合15分钟后，将0.5毫升一份的13％胰蛋白胨原液(13％w/v，在WFI中)加至喷雾溶液中(在加入胰蛋白胨后，终体积仍为5毫升)。胰蛋白胨对两种脂类所遇到的喷雾器诱导型下降的效应的比较，示于图2。
因为胰蛋白胨是由多种组份构成的，因此检验导致所观察到的气雾剂稳定化的是否是一种或多种具体组份。谷氨酸是胰蛋白胨的一种主要氨基酸，当其存在浓度与在上述试验中有效胰蛋白胨浓度中所存在浓度相当时，也能明显地起保护作用以免受喷雾器诱导型细胞转染活性的下降(见图3)。该试验按与前面所述试验相同的方式进行，其中使用DC-胆甾醇DOPE:pCMVβ-GAL以及0.221毫克/毫升和0.975毫克/毫升浓度谷氨酸，并且也重复试验。对照喷雾溶液由在灌溉水(WFI)中复合的200微克pCMVβ-GAL和800微克DC-CHOL/DOPE构成，总体积为5毫升。含0.221毫克/毫升谷氨酸的喷雾溶液也含有相同数量的质粒DNA和脂类。
在DNA和脂类已复合15分钟后，将0.227毫升一份的4.875毫克/毫升谷氨酸原液(在WFI中)加至喷雾溶液中(在加入谷氨酸后，终体积仍为5毫升)。含0.975毫克/毫升谷氨酸的喷雾溶液也含有相同数量的质粒DNA和脂类。在DNA和脂类已复合15分钟后，将1毫升一份的4.875毫克/毫升谷氨酸原液(在WFI中)加至喷雾溶液中(在加入谷氨酸后，终体积仍为5毫升)。
实施例7质粒巨细胞病毒(CMV)启动子和大肠杆菌β-半乳糖苷酶报道基因(pCMVβ-gal)被用于评估哺乳动物细胞表达。pCMVβ-gal(Clontech Laboratories,Inc.,Palo Alto,CA)是以细菌糊剂形式从Genzyme,Inc.获得，然后在Qiagen柱(Qiagen,Inc.,Chatsworth,CA)上纯化。
实施例8阳离子型脂类通过混合DL-EPC(5毫克/毫升氯仿)和DOPE(5毫克/毫升氯仿)，然后在氮气下干燥，制得BGTC/DOPE，即双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇(bis(guanidinium)-tren-cholesterol,BGTC)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE，得自Avanti PolarLipids,Alabaster,AL)的1∶1混合物。然后将该脂类溶解在37℃叔丁醇中，在-80℃冷冻，然后在冻干至少24小时。通过将DC-CHOL溶解于氯仿，再与DOPE混合，从而制得DC-CHOL/DOPE，即3β-[N-[(N′,N′-二甲基氨基)乙烷]氨基甲酰基]胆甾醇(DL-CHOL)和DOPE的1∶1混合物。然后按与BGTC/DOPE相同方式制备该脂类。脂类贮存于-20℃以备使用。然后将脂类升温至室温，用灌溉用水(Water ForIrrigation,WFI)膨胀至少30分钟，然后与DNA复合。
实施例9DNA与脂类比例的优化DNA与脂类比例的优化通过凝胶电泳加以确定。当负的DNA电荷被阳离子型脂类完全中和时，组织培养的转染就最大化。通过将DNA与脂类之比在1∶1至1∶10之间变化，然后将复合物在1％琼脂糖-TAE凝胶上电泳，可以观察到最佳比例，因为中性的脂类DNA复合物是不迁移的。
实施例10组织培养A549细胞(具有上皮样形态的人肺癌)，在补充了10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和50微克/毫升庆大霉素的Dulbecco氏改进的必需培养基(D-MEM)中培养。
实施例11转染在转染前一天，将A549细胞以1.5×105细胞/35厘米培养皿进行接种。在转染时，细胞的汇合度约为80％。将等体积的2×Opti-memⅠ型减少血清培养基(Opti-mem；Gibco-BRL,Grand Island,NY)从喷雾器储液槽加至各175微升等分样品中，然后用Opti-mem(1×)培养液加至终体积3.5毫升。Opti-mem是一种改良的Eagle′s极限必需培养基，其中有加入的生长因子，适用于阳离子型质粒-DNA转染。刚好在转染之前，细胞用Opti-mem漂洗2次，然后用1毫升转染液/每孔覆盖(对于每个时间点转染3个孔)。在24小时后，去除溶液，细胞用Opti-mem漂洗2次，然后加入1毫升A549培养液。再孵育细胞24小时，用PBS漂洗2次，然后裂解。
实施例12对β-半乳糖苷酶转染效率的定量分析用含0.5％Triton X-100的0.1M Tris-HCl裂解A549细胞。细胞碎片被离心去除。裂解液的蛋白质浓度通过二辛可酸(bicinchronic acid)(BCA Protein Assay；Pierce,Rockford,IL)蛋白分析加以确定。β-半乳糖苷酶活性，用氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG；Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)溶液(其中含氯化镁和β-巯基乙醇的磷酸缓冲液(PBS))进行测量。将100微升的裂解液等分样品加至96孔板的孔中，然后加入等体积的CPRG溶液。样品和标准物在37℃孵育，然后在Dynatech MR5000微量滴定板读数仪(Dynatech Laboratories,Inc.,Chantilly,VA)上读取数据。
实施例13双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇对转染的稳定作用本发明表明，某些成分，在喷雾前加至脂类DNA悬浮液时，可明显地稳定这些制剂的转染力。更具体地，含有一种特定阳离子型脂类的制剂，在喷雾过程中表现得比以前测试的脂类明显更稳定。这种脂类，即双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇(BGTC)已被报道(Oudrhiri等人，1997)，是一种潜在的基因治疗候选物。然而，Oudrhiri等人仅使用气管内滴注法来施用脂类DNA制剂，而没有检查气雾剂递药方式。当这些制剂被喷雾时，它们作为基因治疗剂在活体(在小鼠肺中)是有效的。这些结果示于图4。
在2个试验中，使用双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇时，导致在用A549人肺癌细胞进行的体外测试中，当等分的喷雾器循环材料分别在雾化3、6、和9分钟时从喷雾器储液槽中(以15L/分钟的流速和5毫升的起始体积)取出，结果分别保留了对照(未喷雾的)材料的98％、95％和84％的转染活性。这与另一种常用的阳离子型脂类(DC-CHOL/DOPE)形成了对比，后者仅保留了40％、15.7％和13.5％转染活性。
在DC-CHOL/DOPE中所观察到的转染活性下降程度，在用于基因治疗用途以及目前用于临床试验的许多阳离子型脂类中所观察的情况中是非常典型的。该数据总结于图5。所用的喷雾器是改良的Puritan Bennett 1600喷雾器(Carlsbad,CA)一双喷嘴的一个管子被去除-该喷雾器被称为Puritan Bennett 1600单喷射式喷雾器(PB sj)。对照喷雾(器)溶液由在灌溉水(WFI,Baxter)中复合的200微克pCMVβ-GAL和700微克阳离子型脂类/辅助脂类构成，总体积为5毫升。
本说明书中提到的任何专利或出版物均代表了本发明所属领域技术人员的水平。这些专利或出版物都同等地在此引为参考，就好象每一出版物被具体地、单独地引为参考。
熟悉本领域的技术人员将容易地认识到，本发明非常适合于实现本发明所提到的目的、结果和优点，以及所揭示内容中固有的那些内容。说明书所描述的实施例及方法、步骤、处理方法、分子和具体化合物是目前最佳实施方案的代表，是例示性的，并不意味着对本发明的范围的限制。对于本领域技术人员来说可以想到的变化形式以及其他用途，被包括在权利要求范围所限定的本发明精神实质之中。
权利要求
1．一种脂质体气雾剂组合物，其特征在于，它包括(a)药物化合物；(b)阳离子型脂类；(c)中性的辅助脂类；和(d)胰蛋白胨。
2．如权利要求1所述的脂质体气雾剂组合物，其特征在于，该药物化合物是含有基因的质粒DNA。
3．如权利要求1所述的脂质体气雾剂组合物，其特征在于，该阳离子型脂类和中性辅助脂类选自下组蛋黄磷脂酰胆碱、氢化的大豆磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰基-二棕榈油酰基磷脂酰胆碱、双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二油酰基磷脂酰乙醇胺。
4．如权利要求1所述的脂质体气雾剂组合物，其特征在于，胰蛋白胨在组合物中的浓度约为0.01-5％。
5．一种脂质体气雾剂组合物，其特征在于，它包括(a)药物化合物；(b)阳离子型脂类；(c)中性的辅助脂类；和(d)谷氨酸。
6．如权利要求5所述的脂质体气雾剂组合物，其特征在于，该药物化合物是含有基因的质粒DNA。
7．如权利要求5所述的脂质体气雾剂组合物，其特征在于，该阳离子型脂类和中性辅助脂类选自下组蛋黄磷脂酰胆碱、氢化的大豆磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰基-二棕榈油酰基磷脂酰胆碱、双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二油酰基磷脂酰乙醇胺。
8．如权利要求5所述的脂质体气雾剂组合物，其特征在于，该谷氨酸在组合物中的浓度约为0.01-5％。
9．一种用于脂类DNA转染的、阳离子型脂类中性辅助脂类DNA的喷雾悬浮液，其特征在于，该阳离子型脂类是双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇，而且中性辅助脂类是二油酰基磷脂酰乙醇胺或其类似物。
10．如权利要求9所述的阳离子型脂类DNA喷雾悬浮液，其特征在于，所述双(鈲)-三[氨乙基]胺胆甾醇在该悬浮液中的浓度约为50微克/毫升-1500微克/毫升。
11．如权利要求9所述的阳离子型脂类DNA喷雾悬浮液，其特征在于，所述DNA在该悬浮液中的浓度约为40微克/毫升-400微克/毫升。
12．如权利要求9所述的阳离子型脂类DNA喷雾悬浮液，其特征在于，该阳离子型脂类与中性辅助脂类以1∶1比例存在。
13．如权利要求9所述的阳离子型脂类DNA喷雾悬浮液，其特征在于，DNA浓度与阳离子型脂类和中性辅助脂类的合并浓度之比约为1∶1至1∶4。
全文摘要
本发明提供了一种脂质体气雾剂组合物,它包括:(a)药物化合物;(b)阳离子型脂类;(c)中性的辅助脂类;和(d)胰蛋白胨。还提供了一种用于脂类:DNA转染的、阳离子型脂类:DNA的喷雾悬浮液,其中阳离子型脂类是双(鈲)－三[氨乙基]胺胆甾醇。
文档编号A61K48/00GK1288388SQ99802056
公开日2001年3月21日 申请日期1999年1月8日 优先权日1998年1月8日
发明者C·L·登莫尔, J·V·萘特, J·C·沃尔德珀, B·M·金西 申请人:研究发展基金会