专利名称：选择性替代中枢神经系统中雌激素缺乏的药物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及所选择的甾体在制备用于有目的地替代中枢神经系统中雌激素缺乏但不影响其他器官或系统的药物制剂中的应用。
与全身作用的天然或合成雌激素、包括17a-雌二醇相反，所述甾体的特征在于具有类似于选择性向神经性雌激素的转录作用。
该甾体是以下通式Ⅰ的化合物 其中R1代表氢原子、羟基或1-5个碳原子的烷氧基，R2代表氢原子、1-5个碳原子的烷基、1-5个碳原子的酰基、通式SO2NR10R11的基团(其中R10和R11相互独立地分别是氢原子、1-5个碳原子的烷基、或者与氮原子一起形成吡咯烷酮基、哌啶子基或吗啉基)，R3代表氢原子或羟基，R4代表氢原子、羟基或1-5个碳原子的烷基，R5和R6相互独立地代表氢原子或卤原子，R7代表氢原子或甲基，R8代表氢原子、羟基、氧基、或通式CR12R13的基团(其中R12和R13相互独立地分别代表氢原子或卤原子)，R9代表甲基或乙基，Z代表C-C双键或者经取代或未经取代的环丙烷环，而基团＞CR5R6设置成α-或β-固定的，其中如果基团＞CR5R6是α-固定且未反转的，则R7是β-固定的。
生物中雌激素浓度的突然或者逐步下降可在生理(逐渐衰老、停经)和病理条件(性腺切除、添加GnRH类似物作为补充性癌症治疗剂)下发生在女性和男性中。雌激素下降的最明显的临床症状是以热主动性充血的更高素因为形式的热调节紊乱、骨质疏松症以及心脏和循环疾病(Netter A，The menopause．InThibault C，Levasseur MC，Hunter RHF(编辑)，哺乳动物和人中的生殖(Reproduction in Mammals and Man)，Ellipses，Paris，627-642(1993))。最新的临床研究(van den Beld AW等人，雌激素在老年男性的生理和社会心理良好状态中的作用(The role ofestrogens in physical and psychosocial well-being in elderly men)，TheAging Male 1(Suppl．1)，54，1998)明确证实男性中血清雌激素浓度随年龄增加而下降。由此强调了老年男性中“雌激素缺乏症”的现有报道和病理重要性。
大脑是雌激素作用的一个非常重要目标器官。雌激素对许多神经生理过程有决定性的生理影响。其效果通常分为两个大的组别-器质化和活化(McEwen BS等人，作为神经可塑性之介导剂的甾体激素(Steroidhormones as mediators of neural plasticity)，J Steroid Biochem Mol Biol 39223-232，1991)。
第一组主要是在新的个体发育期间涉及神经物质的性别特异性器官化。第二组包括特异性改变受雌激素浓度影响的神经规则循环周期的作用，该作用导致性成熟后性腺的生理性分泌。雌激素在中枢神经系统中的活化作用例如在以下生理过程中表现为性别特异性调节促性腺激素分泌(Fink G，促性腺激素分泌及其控制(Gonadotropin secretion and ist control)．在Knobil E，Neil(编辑)的“生殖生理学(The Physiology of Reproduction)”一书中，Raven Press，NewYork，1349-1376，1988)；调节性行为(Baum MJ等人，雌性灵长类动物proceptivity和接受性的激素基础(Hormonal basis of proceptivity and receptivity in femaleprimates)，Arch Sex Behav 6173-192，1977)；调节对于压力的神经内分泌性反应(Viau，Meaney MJ，在鼠的雌激素周期中下丘脑-垂体-肾上腺对压力的反应变化(Variations in thehypothalamic-pituitary-adrenal response to stress during the estrous cycle inthe rat)，Endocrinology 1292503-2511，1991)；带有适应性重要意义的行为模式的学习和保留(O＇Neal MF等人，雌激素对卵巢切除鼠在两种选择的水逃逸工作记忆任务中性能的作用(Estrogen affects performance of ovariectomized rats in a two-choice water-escape working memory task)，Psychoneuro-endocrinology 2151-65，1996)；维持神经化学机理的反应预备性，其对于保障警觉性和足够的信息处理是必须的(Fink G等人，中枢神经传递的雌激素控制对情绪、智力状态以及记忆的作用(Estrogen control of central neurotransmissioneffects on mood，mental state and memory)，Cell Mol Neurobiol 16325-344，1996)；
脑结构中神经间接触密度的动态改变，其对识别能力和情感状态具有重要的作用(Wooley CS，McEwen BS，雌二醇介导成年鼠的雌激素周期中海马突触密度的波动(Estradiol mediates fluctuations in hippocampalsynapse density during the estrous cycle in the adult rat)．J Neurosci 122549-2554，1992)。
雌激素之令人惊奇的向神经性作用表现在以下作用方面诱导中枢神经系统特异性基因序列的表达，其产物对于神经细胞的存活具有关键性的意义(Miranda RC，Sohrabji F，Toran-Allerand CD，推测性雌激素靶向神经元表达neurotrophins和neurotrophin受体的mRNA雌激素与neurotrophins潜在发展相互作用的基础(Presumptiveestrogen target neurons express mRNA for both the neurotrophins andneurotrophin receptorsa basis for potential development interactions ofestrogen with the neurotrophins)，Mol Cell Neurosci 4510-525，1993)；保障中枢神经系统中信号传递的多样性和质量(Luine VN，雌二醇增加雌鼠之特异性基底前脑核和反射区域中的胆碱乙酰基转移酶的活性(Estradiol increases choline acetyltransferase activity in specific basalforebrain nuclei and projection areas of female rats)，Exp Neurol 89489-490，1985)；(Weiland N，在海马中雌二醇和孕酮调节谷氨酸脱羧酶信使核苷酸(Glutamic acid decarboxylase messenger ribonucleic acid is regulated byestradiol and progesterone in the hippocampus)，Endocrinology 1312697-2702，1992)；(Bosse R，Di Paolo T，雌二醇调节脑多巴胺和GABAA受体停经后中枢神经系统变化的一个线索(The modulation of braindopamine and GABAAreceptors by estradiola clue for CNS changesoccurring at menopause)，Cell Mol Neurobiol 16199-212，1996)；以及提高神经细胞对病理作用的耐受性(Goodman Y等人，雌激素减弱而皮质酮恶化海马神经元中的兴奋毒性、氧化性损伤、和淀粉状b-肽毒性(Estrogens attenuate and corticosterone exacerbates excitotoxicity，oxidative injury，and amyloid b-peptide toxicity in hippocampal neurons)，JNeurochem 661836-1844，1996)。
临床发现表明雌激素缺乏是阿尔茨海默病的致病机理中的因果性因素，并表明雌激素替代疗法的可能性，该替代治疗可阻止该疾病的临床症状或发展(Henderson VW等人，老年妇女中的雌激素替代疗法阿尔茨海默病和对照组之间的对比(Estrogen replacement therapy in olderwomencomparisons between Alzheimer′s disease cases and Controls)，ArchNeurol 51896-900，1994)；(Paganini-Hill A，Henderson VW，雌激素缺乏和阿尔茨海默病的危险(Estrogen deficiency and risk of Alzheimer′sdisease)，Am J Epidemiol，140256-261，1994)。其逆转录受生理雌激素量影响的神经肽序列(如催产素和精氨酸-血管紧张素)在情绪行为组分的调节中扮演重要的作用(Adan RA，Burbach JP，雌激素和甲状腺激素对血管紧张素和催产素基因表达的调节(Regulation of vasopressin andoxytocin gene expression by estrogen and thyroid hormone)，Progr Brain Res92127-136，1992)。
专业文献中的报告表明，雌激素缺乏的出现会伴随生物体消除活性氧物质和自由基的能力显著下降(Niki E，Nakano M，作为抗氧剂的雌激素(Estrogens as antioxidants)．Methods Enzymol 186330-333，1990)；(Lacort M等人，雌激素和儿茶酚雌激素在体外对抗过氧化性膜损伤的保护作用(Protective effects of estrogens and catecholestrogens againstperoxidative membrane damage in vitro)，Lipids 30141-146，1995)。过量的自由基在许多器官和系统中产生细胞损害，而且与神经变性疾病的发病机理形成关联(Smith CD等人，在正常衰老和阿尔茨海默病中的过量脑蛋白氧化和酶失活(Excess brain protein oxidation and enzymedysfunction in normal aging and in Alzmeimer′s disease)．Proc Natl Acad SciUSA 8810540-10543，1991)；(Hastings TG，Zigmond MJ，神经变性疾病和氧化压力由Parkinsonism之动物模型中观察到的(Neurodegenerativedisease and oxidative stressinsights from an animal model of Parkinsonism)．在Fiskum G编辑的“神经变性疾病(Neurodegenerative Diseases)”一书中，Plenum Press，New York，37-46，1996)。因此，雌激素替代在维持和提高内源性抗氧化能力方面也可发挥作用(Behl C等人，体外17b-雌二醇保护神经元免受氧化压力诱导的细胞死亡(17b-Estradiol protectsneurons from oxidative stress-induced cell death in vitro)，Biochem BiophysRes Commun 216473-482，1995)。
到目前为止，雌激素替代是用天然及合成的雌激素进行，这些雌激素的作用可发生在所有包含雌激素受体的器官和系统上，也就是说实际上在整个身体中。因为该雌激素在小的药理学剂量时就已经可以在女性生殖器官切除的组织(子宫内膜)和乳腺上皮中引起强烈的细胞增殖作用，其最后造成致癌性的分化作用，所以其在治疗中枢神经系统的雌激素缺乏症状中的应用由于许多禁忌病症而受到限制(Bernstein BA，RossRK，Henderson BE，激素的使用与癌症危险之间的关系(Relationship ofhormone use to cancer risk)．J Natl Cancer Inst Monograph 12137-147，1992)。
雌激素的增殖性作用对于男性中良性前列腺增生和／或男子乳房发育症的发生是一个直接的危险因素(Knabbe C，前列腺疾病的激素治疗(Endokrine Therapie von Prostataerkrankungen)．在Allolio B Schulte HM编辑的“实用内分泌学(Praktische Endokrinologie)”一书中，Urban ＆Schwarzenberg，Muechen，645-651，1996)。由此，尽管有可证实的适应症，但雌激素替代疗法在男性中仍未被认真考虑过。
以下专利已经公开了全身作用--即在身体的所有器官和系统都作用的天然及合成雌激素可用于治疗神经变性疾病US4，897，389、US5，554，601和WO95／12402、WO97／03361、DE4338314C1。
-US4，897，389保护雌二醇、雌酮和雌三醇在单独或者与促性腺激素、雄性激素、合成代谢的雄性激素或人生长激素复合使用时在治疗老年性痴呆、帕金森病、大脑萎缩、阿尔茨海默病、小脑萎缩、老年性或者原发性震颤中的应用。
-US5，554，601和WO95／12402保护雌激素物质在预防神经细胞免受进行性损害以及治疗神经变性疾病中的应用，其还具有微小的“性活性”。例如，17a-雌二醇可作为具有微小“性活性”以及神经保护作用的物质。
-WO97／03361保护非雌激素物质在保障神经保护作用中的应用，该物质的结构中有至少两个环结构，其中至少一个是端部苯酚环，而且其分子量小于1000道尔顿。
-DE4338314C1描述了具有苯酚A环结构的甾体，其俘获自由基和抗氧化作用不同于雌激素样作用。该化合物可用于预防和治疗自由基介导的细胞损害作用。
在所有上述专利文献中，所述物质的治疗和神经保护作用都是基于一种或多种以下最终作用-刺激天然神经元生长因子的生物合成；-刺激乙酰胆碱合成酶的活性或者乙酰胆碱合成物质的吸收；-通过提高神经细胞对营养物质或生长因子释放的耐受性而直接保护细胞；-消除神经细胞对自由基和反应性氧物质的敏感性，这些物质最后会产生创伤性或者神经毒性作用。
但是在所有上述专利文献中都没有描述具有选择性、雌激素样的向神经性转录作用的甾体，也就是说在以类似于雌激素的方式影响中枢神经系统的雌激素依赖性基因的转录的剂量下，所述甾体在体内对生殖系统没有显著的生物作用。特别需要强调的是，在US5，554，601和WO95／12402的专利文献中描述了17a-雌二醇--一种在生殖器官切除中具有还原雌激素活性的物质的作用(Clark JH等人，17a-雌二醇对雌激素受体的核占有、刺激Ⅱ型核部位以及子宫生长的作用(Effects of estradiol17a on nuclear occupancy of the estrogen receptor，stimulation of nucleartype Ⅱ sites and uterine growth)，J Steroid Biochem 16323-328，1982)，其仅在通过除去营养剂而导致细胞死亡之前对经培养的细胞表现出保护作用，其没有说明17a-雌二醇与17b-雌二醇的相对效力。由此我们可以得出以下结论由目前已经公开的报告和专利文献中找不到对于17a-雌二醇或其衍生物具有选择性向神经性作用的提示，而17b-雌二醇则明显没有中枢神经系统选择性，并因此将其归为具有全身作用的雌激素。WO97／03661和DE4338314C1的专利公开阐明了由于其端部苯酚A环的自由基捕获作用而具有雌激素的细胞保护作用。17a-雌二醇的单独向神经性作用是以影响雌激素敏感性基因的转录为基础的，该作用既没有在所述专利文献中讨论，也没有在文献中对其加以描述。
本发明的目的在于提供药物制剂，以在中枢神经系统中进行有目的的雌激素缺乏替换但不影响其他的器官或系统。
根据本发明，上述目的是如下实现的使用所选择的甾体制备药物制剂，该制剂可确保替代中枢神经系统中的雌激素缺乏，但不影响其他器官或系统。
所述甾体的特征在于，与全身作用的天然或合成雌激素、包括17a-雌二醇相反，其具有类似于选择性向神经性雌激素的转录作用。
非常令人惊奇的是，在本发明应用中所选择的甾体-选择性地影响中枢神经系统中雌激素依赖性基因的转录，并导致相应生理参数的变化；-在对生殖系统的组织没有生物作用的剂量下具有中枢神经系统特异性的转录作用；-在17b-雌二醇或17a-雌二醇都没有作用的剂量下具有中枢神经系统特异性的转录作用；-以及对中枢神经系统中雌激素依赖性基因的转录的影响不超过辅助性17b-雌二醇的作用。
所述甾体是具有通式Ⅰ的化合物 其中R1代表氢原子、羟基或1-5个碳原子的烷氧基，R2代表氢原子、1-5个碳原子的烷基、1-5个碳原子的酰基、通式SO2NR10R11的基团(其中R10和R11相互独立地分别是氢原子、1-5个碳原子的烷基、或者与氮原子一起形成吡咯烷酮基、哌啶子基或吗啉基)，R3代表氢原子或羟基，R4代表氢原子、羟基或1-5个碳原子的烷基，R5和R6相互独立地代表氢原子或卤原子，R7代表氢原子或甲基，R8代表氢原子、羟基、氧基、或通式CR12R13的基团(其中R12和R13相互独立地分别代表氢原子或卤原子)，R9代表甲基或乙基，Z代表C-C双键或者经取代或未经取代的环丙烷环，而基团＞CR5R6设置成α-或β-固定的，其中如果基团＞CR5R6是α-固定且未反转的，则R7是β-固定的。
优选的化合物是15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇；15βH，3′H-环丙[14，15]-18a-同-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇；17α-羟基-15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3-基-戊酸酯；17-亚甲基-15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3-醇；15βH，3′H-3′，3′-二氟-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇；17-亚甲基-15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3-基-氨基磺酸酯；17-二氟亚甲基-15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3-醇；3-甲氧基-15β-甲基-3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3-醇；15α-甲基-3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇；17-二氟亚甲基-15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3-基-(1，4-亚丁基亚氨基)磺酸酯；17-亚甲基-3′H-环丙[8，9]-15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)-三烯-3-醇。
本发明的优点是，使用根据本发明的化合物制备的药物制剂可用于预防和治疗识别能力与年龄有关的衰退、年龄条件和绝经周围的焦虑、经前综合症、神经官能症和神经衰弱、惊恐和惊恐性神经官能症、雌激素衰竭(绝经、性腺切除、用GnRH类似物治疗)后的热主动性充血、以及性行为的心理阻碍。而且还表明，由此可排除由于非受控的增殖作用以及致癌性而导致的对生殖系统中激素敏感性组织(子宫内膜、子宫肌层、前列腺、乳腺)的损害的危险。
本发明的主题是经口和非胃肠道给药的药物制剂，所述非胃肠道给药包括经局部、直肠、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻腔内、阴道内、颊内或舌下给药。除常规的载体和稀释剂外，所述药物制剂还包括如权利要求1所述的化合物作为活性物质。
可如下使用药物制剂-每日口服0．1-2mg的片剂或糖衣片，-每日皮下注射0．1-2mg的安瓿，-每日使用可释放0．05-2mg的透皮药贴，-每日释放量为0．05-2mg的皮下植入物，-每日经皮释放0．05-2mg的凝胶和软膏剂，-每日释放0．1-1mg的颊部给药系统。
本发明的药物可用合适量的常规固体或液体载体或稀释剂、以及相应于所希望的给药方式在常规制药技术中所用的佐剂，用已知的方法制得。
在以15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇(通式Ⅰ的化合物R1=R2=R3=R4=R5=R6=R7=H；R8=α-OH，β-H；R9=CH3；Z=C-C双键)为原型物质的实施例中，并参考附图，用实验比较了根据本发明的选择性雌激素样作用和17b-雌二醇和17a-雌二醇。
实施例1长期皮下给药对子宫重量的体内影响性成熟的(3月龄，重量为250±30g)雌性Wistar鼠(TierzuchtSchoenwalde GmbH，德国)在氯胺酮麻醉下切除卵巢。14天后，向所述动物皮下植入等渗微型泵(Alzett，USA)，该微型泵能够在7天中释放待测试的物质(15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇、17b-雌二醇以及17a-雌二醇)，其每日剂量为0．01、0．1、0．3、1、3、30和100μg。而对照组为相应体积的载体(丙二醇)。在处理到第7天时，将动物杀死，并测量子宫湿重(以100g体重计)。
图1显示了不同剂量的17b-雌二醇(正方形)、17a-雌二醇(圆形)以及15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇(三角形)在卵巢切除鼠中的向子宫性作用。每个点代表7-10个测定值的平均值±标准偏差(X±SEM)；阴影部分表示在安慰剂治疗的动物(OXV)中参数的调节范围。
可以看出，在0．03-0．1μg的每日剂量时，17b-雌二醇可使子宫明显增大。而对于可相比较的向子宫性作用，17a-雌二醇的每日剂量就必须是100μg，15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇为30μg。该结果说明，15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇的作用在生殖器官切除的雌性动物中比17b-雌二醇低1000倍，但可与17a-雌二醇相媲美。
实施例2体外对a-雌激素受体依赖性报道基因转录的活化乳腺癌细胞MCF-7／2A释放雌激素受体(Era)的α-同工型。该细胞用报道基因-质粒EREwtcLUC稳定转化。该报道基因包含卵黄生产素的雌激素效应元件(ERE)、胸苷激酶启动子以及Photinus pyralis的荧光素酶编码基因。在实验开始之前，在无甾体的培养基中培养细胞7天，然后与不同浓度(10-11、10-10、10-9和10-8M)的17b-雌二醇、17a-雌二醇或15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇温育48小时。使细胞裂解，然后用特异性的测试物质(Serva／Promega，德国)测定荧光素酶活性，由此计算荧光素酶报道基因的转录。
图2显示了用不同剂量的17b-雌二醇(正方形)、17a-雌二醇(圆形)和15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇(三角形)处理48小时后，在释放雌激素受体的乳腺癌细胞MCF-7中诱导经稳定转化的雌激素依赖性报道基因(荧光素酶)的转录。该图代表两个独立实验的平均值。
可以看出，测试物质剂量依赖性地刺激报道基因的转录。15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇和17a-雌二醇的作用比17b-雌二醇的小一个数量级(10倍)。该结果表明，15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇在乳腺癌组织中的雌激素作用比上述物质弱许多倍。
实施例3长期在体内用对子宫没有作用的剂量治疗后刺激脑中催产素基因的转录性成熟的(3月龄，重量为250±30g)雌性Wistar鼠(TierzuchtSchoenwalde GmbH，德国)在氯胺酮麻醉下切除卵巢。14天后，向所述动物皮下植入等渗微型泵(Alzett，USA)，该微型泵能够在7天中释放待测试的物质(15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇)，其每日剂量为0．01、0．1、和1μg。而对照组为相应体积的载体(丙二醇)。将动物杀死后，立即测量子宫湿重(以100g体重计)。根据已知的方法(Fischer D等人，作为天然可逆性肾上腺皮质功能亢进模型的乳汁分泌控制鼠中下丘脑-垂体-肾上腺活性的机理的可塑性(Lactation as a model of naturally reversiblehypercorticalismplasticity in the mechanism governing hypothalamo-pituitary-adrenal activity in the rat)，J Clin Invest 961208-1215，1995)与特异性放射活性标记的寡脱氧核苷酸探针进行原位杂交，由此在下丘脑旁室核(PVN)中产生编码催产素合成的信使核糖核酸(mRNA)。用光密度计测量限定解剖结构中的特异性杂交信号，由此定量处理后引起的催产素基因转录的变化。
图3显示了长期皮下给药三种不同剂量的17b-雌二醇(圆形)、17a-雌二醇(正方形)以及15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇(三角形)后在卵巢切除鼠的下丘脑旁室核中诱导催产素编码的转录。下面的图代表测试物质对子宫湿重的作用。每个点代表5-7个测定值的X±SEM。阴影部分表示在载体治疗的动物中相应参数的调节范围。星号表示与对照组(OXV)相比有显著性的差异(p＜0．05)。
结果表明，15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇剂量依赖性地刺激PVN中催产素基因的表达，而且其作用与17b-雌二醇的非常接近。然而，与17b-雌二醇不同，15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇的向神经性转录作用没有伴随子宫增大作用。在所用的剂量中，17a-雌二醇对下丘脑PVN中催产素-mRNA的浓度没有影响。该结果还证实了15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇在雌鼠脑中选择性的雌激素样作用。
实施例4长期在体内用没有对子宫向性作用的剂量治疗后刺激海马中抗凋亡(anfiapoptotischen)基因bcl-2的转录测试物质来自于在如实施例3所述的实验中处理的动物。基因bcl-2编码一种蛋白的合成，该蛋白参与细胞增殖的级联过程，并抵抗编程细胞死亡(凋亡)(Merry DE，Korsmeyer Sj，神经系统中的bcl-2基因族(Bcl-2 gene family in the nervous system)，Ann Rev Neurosci 20245-267，1997)。该基因的转录是由雌激素刺激的(Kandouz M等人，雌二醇和孕激素之间对乳腺癌细胞中bcl-2表达的拮抗作用(Antagonism betweenestradiol and progestin on Bcl-2 expression in breast cancer cells)，Int JCancer 68120-125，1996)。齿状回是海马形成的组成部分，其中鼠中的神经元也持久地处于成熟老化(Gould E等人，压力减少成年猴的齿状回中粒细胞前体的增殖作用(Proliferation of granule cell precursors in thetentate gyrus of adult monkeys is diminished by stress)，Proc Natl Acad SciUSA 963168-317，1998)，并释放bcl-2。通过与特异性寡核苷酸探针的原位杂交(Clark RSB等人，鼠中创伤性脑损伤后凋亡抑制剂基因bcl-2的表达(Apoptosis-suppressor gene bcl-2 expression after traumatic braininjury in rats)，J Neurosci 179172-9182，1997)，在脑切片中产生bcl-2转录物，然后如实施例3所述的方法用光密度计进行定量。
图4显示了长期皮下给药三种不同剂量的17b-雌二醇(圆形)、17a-雌二醇(正方形)以及15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇(三角形)对在卵巢切除鼠的齿状回中bcl-2表达的影响。图及缩写如图3。
用15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇处理可导致剂量依赖性地刺激齿状回中bcl-2的表达。该作用与给药相同剂量的17b-雌二醇时产生的作用-样。如图4所示，17a-雌二醇在所用剂量时对于bcl-2的转录没有影响。
该结果表明，在所用的剂量时，15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇以雌激素样模式影响中枢神经系统中抗凋亡基因bcl-2的转录，但对于子宫没有影响。
实施例5脑和子宫肌层中催产素受体的分离诱导在子宫肌层和中枢神经系统中已存在肽激素-催产素之具有相同生化特性的结合部位。在这两种器官中，急性或慢性雌激素治疗造成催产素受体的数值(密度)增加。脑结构中其参数对雌激素反应特别敏感的是间隙条纹端核(Nucleus interstitialis striae terminalis)、腹侧正中核(Nucleus ventromedialis)和扁桃样核复合物。在这些结构中雌激素造成的催产素受体诱导作用与一系列prosozialen行为模式、包括性行为有因果关系(Insel TR，催产素-亲和神经肽行为、受体自体放射照相、和对比研究中的占据(Oxytocin-a neuropeptide for affiliationevidencefrom behavioral，receptor autoradiographic，and comparative studies)，Psychoneuroendocrinology 173-35，1992)。
为测量限定解剖结构中催产素受体的密度，根据Wahl的方法(Kremarik P等人，组织自体放射照相检测鼠端脑中的催产素和血管紧张素结合部位(Histoautoradiographic detection of oxytocin-andvasopressin-binding sites in the telencephalon of the rat)，J Comp Neurol 333343-359，1993)结合放射活性标记的催产素受体拮抗剂d(CH2)5-Tyr(Me)2、Thr4、Orn8-[125I]Tyr9-精氨酸催产素(125I-OVTA)，由此制备自体放射照片。以每日1μg的剂量向卵巢切除鼠皮下给药15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇、17b-雌二醇、或17a-雌二醇(如图3所示)共7天，该鼠大脑和子宫的冷冻切片然后与50pM浓度的125I-OVTA(NEN DuPont，德国)一起温育。紧接着制得自体放射照片，可用其根据已知的方法(Patchev VK等人，鼠肢和下丘脑结构中的催产素结合部位肾上腺和性腺甾体的部位特异性介导作用(Oxytocin binding sites in rat limbic and hypothalamicstructuressite-specific modulation by adrenal and gonadal steroids)．Neuroscience 57537-543，1993)用光密度计测量催产素的结合部位。
图5显示了在用17b-雌二醇(黑色柱)、17a-雌二醇(阴影柱)以及15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇(灰色柱)以每日1μg的剂量治疗7天后，125I-标记的催产素受体配体(125I-OVT)在子宫肌层和两种雌激素敏感性的脑结构--腹侧正中核(VMN)和间隙条纹端核(BNST)中的特异性结合。星号表示与安慰剂治疗的卵巢切除鼠相比(OVX)具有显著差异(p＜0．05)。右侧图表示测试物质对子宫内膜增殖的作用。每个柱代表4-5个测量值的X±SEM。
该检查结果见图5所示。用17b-雌二醇和15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇治疗使所有测试的脑组织中的催产素受体密度增加，但在VMN中15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇的作用比17b-雌二醇弱。在所用剂量时，17a-雌二醇在脑组织中都没有作用。在子宫肌层中，17b-雌二醇产生强的催产素结合部位的诱导，而17a-雌二醇和15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇具有非常低的作用。计算机辅助测量子宫制剂中子宫内膜强度表明，每日1μg剂量的17b-雌二醇产生子宫内膜增殖作用，而15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇和17a-雌二醇在相应的剂量时对子宫内膜的强度没有影响。
总之，实施例5的结果表明，15βH，3＇H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇优先影响中枢神经系统中的生物化学参数-催产素受体，该受体不仅对生殖系统(子宫肌层)而且对中枢神经系统都是特征性的，而且该物质通过其选择性的向神经性作用而与天然雌激素17b-雌二醇和17a-雌二醇在本质上不同。
实施例6长期治疗后对识别功能的影响已知的是，降低雌激素浓度与学习和记忆能力有关(Kopera H，雌激素和心理功能(Estrogens and psychic functions)．Aging and estrogens，Front Hormone Res．2118-133，1973)。
还在动物模型中证实了雌激素血清浓度和识别能力之间的相关关系(Kondo Y，Suzuki K，Sakuma Y，雌激素缓解卵巢切除的沙土鼠中瞬时脑缺血后的识别功能障碍(Estrogen aleviates cognitive dysfunctionfollowing transient brain ischemia in ovariectomized gerbils)，Neurosci Lett23845-48，1997)。以下实验对比性地测试了15βH，3＇H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇、17b-雌二醇和17a-雌二醇对识别能力的影响。
在氯胺酮麻醉下将性成熟的雌性Wistar鼠(重量240±20g)切除卵巢。手术后一周时，每日皮下给药以下日剂量的物质17b-雌二醇，1μg；17a-雌二醇，100μg；15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇，30μg。总的治疗时间为14天。在治疗第5和6天时，根据已知的方法(Diaz-Veliz G等人，雌激素周期、卵巢切除和雌二醇替代对鼠获得条件性逃避反应的影响(Influence of theestrous cycle，ovariectomy and estradiol replacement upon the acquisition ofconditioned avoidance responses in rats)，Physiol Behav 46397-401，1989)进行训练，以学会条件性的逃逸行为。在该训练中，每只动物进行50次组合性刺激，该组合性刺激包括一次无条件的(电刺激)和二次条件性的刺激(光和声信号)。在治疗的第7天时，测试已掌握的条件性行为的保留。在中断学习训练6天后，在治疗的第14天时，确定到已掌握的条件性行为都已消失。用50次连续暴露中正确行为反应(在出现条件性信号后在3秒种内由装置的“安全”隔断逃逸)的数量作为评估已掌握行为保留或消失的标准。
图6显示了17b-雌二醇(黑色柱)、17a-雌二醇(阴影柱)以及15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇(灰色柱)对卵巢切除鼠(开口柱，OVX)获得和保留一种新的行为模式的影响。星号表示与安慰剂治疗的动物相比(OVX)具有显著差异(p＜0．05)。以下子宫重量(X±SEM，n=8-10每治疗组，给药mg／100g KG)是在治疗的第14天时测量的OVX，53±2；17b-雌二醇，187±9；17a-雌二醇，100±5；以及15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇，108±4。
可以看出，在所用剂量时，15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇对已掌握行为模式具有类似于雌激素的刺激作用，而其向子宫性作用明显小于日剂量为1μg的17b-雌二醇。该结果表明，15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇如雌激素一样对认识能力产生影响，但在生殖器官中表现出较低的增殖性作用。
实施例717α-羟基-14，15a-亚甲基-雌-，3，5(10)，8-四烯-3-醇和17a-雌二醇生物转化为17b-雌二醇卵巢切除鼠每日皮下给药100μg的17a-雌二醇、30μg的15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇、或者1μg的17b-雌二醇，共进行7天(如实施例6)。在最后治疗那天，测量三个实验组中的17b-雌二醇血清浓度，并使它们与载体治疗的对照组进行比较。
图7显示了用17b-雌二醇(黑色柱)、17a-雌二醇(阴影柱)以及15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇(灰色柱)按所述剂量皮下给药7天进行治疗后的17b-雌二醇血清值。星号表示与在安慰剂治疗的动物中测定的值相比具有显著差异。后者在本发明方法所示的范围之下，而每个治疗组包括7只动物。
可以看出，在以所希望的剂量给药17b-雌二醇和17a-雌二醇后记录到可检测浓度的17b-雌二醇。长期用15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇皮下治疗没有导致内源性17b-雌二醇的升高。该结果表明，在给药15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇后，所观察到的药物动力学作用没有将该物质生物转化为17b-雌二醇。
权利要求
1.具有通式Ⅰ的甾体化合物在制备用于有目的地替代中枢神经系统中的雌激素缺乏但不影响其他器官或系统的药物制剂中的应用 其中R1代表氢原子、羟基或1-5个碳原子的烷氧基，R2代表氢原子、1-5个碳原子的烷基、1-5个碳原子的酰基、通式SO2NR10R11的基团，其中R10和R11相互独立地分别是氢原子、1-5个碳原子的烷基、或者与氮原子一起形成吡咯烷酮基、哌啶子基或吗啉基，R3代表氢原子或羟基，R4代表氢原子、羟基或1-5个碳原子的烷基，R5和R6相互独立地代表氢原子或卤原子，R7代表氢原子或甲基，R8代表氢原子、羟基、氧基、或通式CR12R13的基团，其中R12和R13相互独立地分别代表氢原子或卤原子，R9代表甲基或乙基，Z代表C-C双键或者经取代或未经取代的环丙烷环，而基团＞CR5R6设置成α-或β-固定的，其中如果基团＞CR5R6是α-固定且未反转的，则R7是β-固定的。
2.如权利要求1所述的甾体化合物，其中所述甾体是15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇；15βH，3′H-环丙[14，15]-18a-同-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇；17α-羟基-15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3-基-戊酸酯；17-亚甲基-15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3-醇；15βH，3′H-3′，3′-二氟-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇；17-亚甲基-15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3-基-氨基磺酸酯；17-二氟亚甲基-15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3-醇；3-甲氧基-15β-甲基-3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3-醇；15α-甲基-3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3，17α-二醇；17-二氟亚甲基-15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)，8-四烯-3-基-(1，4-亚丁基亚氨基)磺酸酯；17-亚甲基-3′H-环丙[8，9]-15βH，3′H-环丙[14，15]-雌-1，3，5(10)-三烯-3-醇。
3.如权利要求1或2所述的应用，其中，所述药物制剂是用于预防和治疗识别能力与年龄有关的衰退、年龄条件和绝经周围期的焦虑、经前综合症、神经官能症和神经衰弱、惊恐和惊恐性神经官能症、雌激素衰竭(绝经、性腺切除、用GnRH类似物治疗)后的热主动性充血、以及性行为的心理阻碍。
全文摘要
所述甾体的特征在于,与全身作用的天然或合成雌激素、包括17a一雌二醇相反,其具有类似于选择性向神经性雌激素的转录作用。非常令人惊奇的是,在本发明应用中所选择的甾体可选择性地影响中枢神经系统中雌激素依赖性基因的转录,并导致相应生理参数的变化;在以对生殖系统的组织没有生物作用的剂量下具有中枢神经系统特异性的转录作用;在17b－雌二醇或17a－雌二醇都没有作用的剂量下具有中枢神经系统特异性的转录作用;以及对中枢神经系统中雌激素依赖性基因的转录的影响不超过辅助性17b－雌二醇的作用。
文档编号A61P43/00GK1291102SQ99803170
公开日2001年4月11日 申请日期1999年2月10日 优先权日1998年2月20日
发明者伏拉基米尔·帕切夫, 迈克尔·厄特尔, 伊娜·蒂姆, 西格弗里德·施瓦茨, 沃尔夫冈·勒默尔 申请人:耶拿制药两合公司