专利名称：促肾上腺皮质素释放因子受体－1缺陷型小鼠的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及内分泌学和神经内分泌学领域。更具体地，本发明涉及促肾上腺皮质素释放因子受体-1和促肾上腺皮质素释放因子受体-1有缺陷的动物。
相关技术的描述生物体的存活依赖于在有压力的条件下(体内)稳态的维持。(体内)稳态的维持是通过调整适应性响应来抵销有害刺激作用而实现的(Chrousos等人，1992)。一般来说，这些适应性响应是通过刺激与自身保护相关的的神经途径(如注意、激发及侵袭)和抑制促进植物性机能(如生长，繁殖和摄食)的途径而造成的(Chrousos等人，1992)。在哺乳动物中，促肾上腺皮质素释放因子(CRF)是对应力作出内分泌、神经内分泌、自主性和行为响应的主要调节因素(Owens&Nemeroff,1991；Vale等人，1981)。应力响应的调节异常将导致很严重的心理和生理后果。事实上，促肾上腺皮质素释放因子系统的慢性功能亢进与许多情感性精神病有关，如忧郁、神经性厌食和抑郁症(Chrousos等人，1992；Orth,1992)。
除了在应力响应中的作用外，促肾上腺皮质素释放因子也与识别功能的控制有关。促肾上腺皮质素释放因子已知能够增强啮齿动物的学习和记忆(Behan等人，1995,Dimant&de Wied,1993,Koob&Bloom,1985,Liang&Lee,1988)，而且促肾上腺皮质素释放因子系统的变化与一些神经变性疾病有关，如阿尔茨海默病和帕金森病(De Souza,1995)。然而，在这些应力相关现象和认识功能中涉及的，依赖于促肾上腺皮质素释放因子的途径的发展和生理作用并不完全了解。
促肾上腺皮质素释放因子的多向性特性，最近随着尿皮质素(urocortin)(UCN)的发现扩大了，尿皮质素是哺乳动物促肾上腺皮质素释放因子家族中的第二个成员。尿皮质素是从大鼠的中脑中鉴定出的，与促肾上腺皮质素释放因子只有45％序列相同〔Vaughen等人，1995〕。虽然尿皮质素的确切功能未知，该肽却能够在体外和体内模仿促肾上腺皮质素释放因子的许多生物功能(Spina等人，1996；Turnbull等人，1996；Vaughan等人，1995)，尽管其效能曲线不同。
促肾上腺皮质素释放因子家族的生物作用是通过结合到特异性高亲合的膜受体上而加以介导的，该受体属于小配体的G-蛋白偶合受体亚家族，其中的配体包括肠促胰液素、血管活性肠多肽和生长激素释放因子(Segre&Goldring,1993)。从一些物种中已鉴别出两种截然不同的促肾上腺皮质素释放因子的亚类，即促肾上腺皮质素释放因子受体-1和促肾上腺皮质素释放因子受体-2(Grigoriadis等人，1996；Vale等人，1997)。促肾上腺皮质素释放因子受体-1与促肾上腺皮质素释放因子受体-2有约71％的氨基酸序列相似(Grigoriadis等人，1996；Vale等人，1997)，而且它们不但在药理学上不同，而且在脑和外周组织的表达模式都是独特的。在成人中，促肾上腺皮质素释放因子受体-1的表达主要限制在脑区域(包括脑干、小脑、大脑皮层、中层隔膜)和垂体(Chalmers等人，1995；Potter等人，1994)。
相反，促肾上腺皮质素释放因子受体-2在一些外周组织中表达，包括心脏、骨骼肌、胃肠道和附睾(Kishimoto等人，1995；Lovenberg等人，1995；Perrin等人，1995；Stenzel等人，1995)，而且在脑部的表达则以侧膜和下丘脑占最主要(Chalmers等人，1995；Perrin等人，1995)。每种受体亚类都能与促肾上腺皮质素释放因子和尿皮质素结合，然而尿皮质素与促肾上腺皮质素释放因子受体-2的亲合力比促肾上腺皮质素释放因子高约40倍(Vaughan等人，1995)。这些结果揭示，尿皮质素可能是促肾上腺皮质素释放因子受体-2假定的内源配体。然而，至今还没有确定触发对不利刺激作出的各种适应性响应的特异性促肾上腺皮质素释放因子的受体分子。
至今还未对促肾上腺皮质素释放因子系统的各种组份的发育作用作出全面的解释。促肾上腺皮质素释放因子的表达，在胚胎和新生儿发育时是受时间和空间调节的，而无促肾上腺皮质素释放因子基因的小鼠表现出内分泌和发育异常(Muglia等人，1995)。另外，早至胚胎期15天，促肾上腺皮质素释放因子受体就出现在小鼠脑的特定区域中，并且在早期的初生儿中这种表达由发育调节(Avishai-Eliner等人，1996；Insel等人，1988)。然而，多种的促肾上腺皮质素释放因子受体亚类和额外的与促肾上腺皮质素释放因子相关配体的存在，使得需要对由各种促肾上腺皮质素释放因子受体亚类调节的生物途径进行系统评估。
因此，现有技术在认识促肾上腺皮质素释放因子系统的作用、发育阶段的促肾上腺皮质素释放因子受体亚类和促肾上腺皮质素释放因子受体-1的缺陷型动物方面有所缺陷。本发明满足了本领域中这一长期存在的需要和愿望。
发明概要为了剖析促肾上腺皮质素释放因子受体介导途径的具体的发育和生物作用，通过在胚胎干细胞中的同源重组而产生了促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠。已发现，促肾上腺皮质素释放因子受体-1在肾上腺的发育和对应力作出正常的内分泌响应时是绝对必需的。另外，促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠表现出忧虑响应的减少和移动性生理节律的改变。促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠，提供了一种鉴定促肾上腺皮质素释放因子受体亚类的有用的模型系统，其中所述的亚类参与对应力作出各种适应性响应和认识功能。
对促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因的靶向破坏，清楚的证明了促肾上腺皮质素释放因子受体-1的发育作用使肾上腺为出生后的发育成熟分泌足够ACTH和使皮质类固醇产生区域发挥功能。促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因的突变也确立了这种受体在介导对应力作出内分泌和行为响应方面的重要作用，并显示了在调节运动活动节律中促肾上腺皮质素释放因子受体-1依赖性途径的新作用。对促肾上腺皮质素释放因子系统的其它成员确切贡献的描述(包括发育和维持体内稳态两方面)，要求产生在促肾上腺皮质素释放因子信号途径的其它组份中突变的动物，该动物可与本发明描述的小鼠品系杂交。
本发明的一个目的是提供一种促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型转基因小鼠。
在本发明的一个实施例中，提供了一种产生促肾上腺皮质素释放因子受体-1显著缺陷的转基因小鼠的方法。
在本发明的另一实施例中，提供了一种鉴别通过除促肾上腺皮质素释放因子受体-1以外的受体起作用的促肾上腺皮质素释放因子、尿皮质素或相关配体的促效剂或拮抗剂的方法。
本发明的其它和进一步方面、特征和优点，通过本发明目前最佳实施例的描述将变得显而易见。这些实施例是用来说明的。
附图的简要说明在本申请中包括附图是为了让本发明上述的特征，优点以及目的更清楚，在细节上更明白。这些图是说明书的一个组成部分。需要指出的是，附图是用来说明本发明的优选实施例的，不能视为对本发明范围的限制。
图1显示了促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠的产生。图1A(上方)促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因外显子4-13的基因组构造。(中间)用于同源重组的靶构建物。HindⅢ-XbaⅠ片段(外显子5-8)编码从第一胞外域最后12个氨基酸到第四跨膜结构域，该片段被缺失掉并用PGK-neo盒置换(下方)。同源重组后形成的突变基因座。图lB以BamHⅠ-HindⅢ外源探针，对破坏的促肾上腺皮质素释放因子受体-1等位基因作Southern分析鉴定，分别测得8.0kb野生型条带和6.3kb突变型条带J1(亲代ES细胞系)，J1-促肾上腺皮质素释放因子受体-1+/-(突变处杂合的的ES克隆)。图1C从野生型和促肾上腺皮质素释放因子受体突变的小鼠(促肾上腺皮质素释放因子受体-1-/-)中收集的全垂体的单层培养物导致促肾上腺皮质素释放因子刺激ACTH的分泌。
图2显示了促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠的肾上腺缺陷。图2A在促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠中血浆皮质酮浓度的显著减少。从雌性和雄性的野生型和促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变的(促肾上腺皮质素释放因子受体-1-/-)小鼠收集血样，采样于清晨(6AM)和下午(4PM)进行，并测得血浆皮质酮浓度(平均值±SEM；***P＜0.001)。图2B促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠的肾上腺体明显萎缩。野生型和促肾上腺皮质素释放因子受体-1-/-雌性小鼠的肾上腺体被切片并用苏木精和曙红染色。观察到产生皮质酮的束状(ZF)区域明显发育不良。而血管小球区(ZG)，网状区(Z受体-)和髓区(M)相对都没受影响。图2C促肾上腺皮质素释放因子受体突变型小鼠中促肾上腺皮质素发育。野生型和促肾上腺皮质素释放因子受体-1-/-小鼠的垂体被切片，并用抗ACTH抗体来定位促肾上腺皮质素。没有观察到促肾上腺皮质素数量的区别。(A)垂体前叶，(I)垂体小叶。
图3显示了促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠的下丘脑中，促肾上腺皮质素释放因子表达的增加但并精氨酸加压素的表达并不增加。对野生型和促肾上腺皮质素释放因子受体-1-/-小鼠下丘脑旁核(PVN)中促肾上腺皮质素释放因子(图3A)和精氨酸加压素(图3B)的免疫组织化学定位揭示，在突变动物中促肾上腺皮质素释放因子表达增加。在大脑的产生促肾上腺皮质素释放因子的其他区域如扁桃体，表达没有增加(没有显示数据)。
图4显示了促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠对应力作出的内分泌响应减少。野生型和突变型小鼠(两种性别)用物理方式约束10分钟，然后测定基础和应力后的ACTH水平(图4A)和皮质酮水平(图4B)(平均值±SEM；**P＜0.05，***P＜0.001)。
图5显示了促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠表现出的忧虑的减少。测定了促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠在黑暗-明亮变化实验中的行为，并与对照小鼠作比较。在5分钟期间的开始时，小鼠被置于小室中。图5A小鼠在小室外花费的时间(秒)(平均值±SEM；*P＜0.05)。还测定了野生型和突变型小鼠在新环境中运动灵敏度。图5B野生型和突变型小鼠在5分钟亮周期中的总区域进入次数(平均值±SEM)。促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠表现出改变了其运动节律。图5C在黑暗-明亮循环的暗和亮阶段，促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型和野生型小鼠运动的时间过程(区域进入次数/小时)。图5D在亮和暗阶段，野生型和突变型小鼠基础移动性(总区域进入次数/12小时)(平均值±SEM；*P＜0.05)。
图6显示了纯合的促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型雌性生物的后代表现出显著的肺发育不良，其可以通过在子宫内用皮质酮处理而获救。将产后1天的新生生物的肺固定，切片并用苏木精和曙红染色。图6A野生型肺显示了薄的肺泡隔膜和正常的空气空间扩展。图6B突变肺显示出肺泡的萎陷(*)和反应性气肿，并伴有肺泡内流血和含铁血黄素沉淀。透明膜不明显。图6C用母体的饮用水中的皮质酮在子宫处理的突变型新生小鼠的肺。
图7显示了用激素缓解促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠中的肾上腺缺陷。图7A从出生3天的野生型和促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠收集的肾上腺切片，用苏木精和曙红染色，证明在初生阶段肾上腺的形态没有区别。图7B促肾上腺皮质素释放因子受体-1-/-小鼠自出生10-21天起每天两次用ACTH或只用稀释液处理，然后从这种小鼠收集的肾上腺。观察到用ACTH处理的促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠肾上腺的束状区域大小和厚度都增加了。图7C从出生10天的促肾上腺皮质素释放因子受体-1-/-型或野生型小鼠收集的样本中血浆ACTH的浓度(平均值±SEM；**P＜0.02)。
本发明的详细描述根据本发明，可采用本领域技能中的常规分子生物学，微生物学，和DNA重组技术。这些技术在文献中有充分阐述，参见如，Sambrook,Fritsch&Maniatis,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；"DNA Cloning:A Practical Approach,"卷Ⅰ和Ⅱ(D.N.Glover ed.1985)；"OligonucleotideSynthesis"(M.J.Gait ed.1984)；"Nucleic Acid Hybridization"[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985)]；"Transcription and Translation"[B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1984)]；"Animal Cell Culture"[R.I.Freshney,ed.(1986)]；"Immobilized Cells And Enzymes"[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,"A Practical Guide To Molecular Cloning"(1984)。由此，如果在本文出现，下列术语的具有如下定义。
“DNA分子”指的是聚合形式的脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、或胞嘧啶)，无论是单链形式还是双链螺旋形式。这一术语只指分子的一级和二级结构，并不将它限制于任何特定的三级形式。所以，本术语其中包括在线性DNA分子(如限制片段)，病毒，质粒和染色体中发现的双链DNA。在论述时，结构按常例仅给出DNA非转录链的5‘到3’的序列(即，具有与mRNA同源序列的链)。
“载体”指的是一种复制子，如质粒，嗜菌体或粘粒，它们可以与另一DNA片段相连，从而导致所连接片段的复制。“复制子”是一种基因元件(如质粒，染色体，病毒)，其功能是作为体内DNA复制的自主单元，即能在其自身控制下复制。“复制起点”指的是参与DNA合成的DNA序列。“表达控制序列”指的是控制和调节另一DNA序列转录和翻译的DNA序列。是当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA时，然后mRNA被翻译成编码序列所编码的蛋白时，编码序列就是与转录和翻译控制序列操作性连接并在它们的控制下。
通常，含有启动子序列的表达载体是与宿主配合使用的，其中启动子序列能促进插入的DNA片段的有效转录和翻译。表达载体典型的包括复制起点，启动子，终止子，以及那些能在转化细胞中提供表型选择的特定基因，它们通常被称为“选择标记基因”或“可选择的标记”。被转化的宿主可以按本领域已知的方法发酵和培养，以达到最佳细胞生长。
DNA“编码序列”是指当置于适当的调节序列控制下，能在体内转录和翻译为多肽的DNA双链序列。编码序列的边界由5‘(氨基)端的起始密码子和3‘(羧基)端的翻译终止子界定。一个编码序列可以包括(但不限于)原核序列，源自真核mRNA的cDNA，真核(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列和甚至合成的DNA序列。聚腺苷酸化信号和转录终止子序列通常位于编码序列的3‘端。“cDNA”指的是复制一DNA或互补一DNA，它是mRNA转录物的反转录反应产物。“外显子”是转录自基因位点的被表达的序列，而“内显子”指的是来自基因位点的非表达的序列。
转录和翻译的控制序列是DNA调节序列，如启动子，增强子，聚腺苷酸化信号，终止子等，它们提供编码序列在宿主细胞中的表达。“顺式元件”是一种核苷酸序列，也被称为“共有序列”或“基序”，它可与那些能上调和下调特定基因位点表达的蛋白相互作用。“信号序列”也可以与编码序列一起被包括在内。这个序列编码编码位于多肽N-端的信号肽，该信号肽与宿主细胞联系并且将该多肽引向合适的细胞位置。已发现，信号序列可与许多原核和真核生物的天然蛋白相连。
“启动子序列”指的是一种DNA调节区域，它能在细胞内结合于RNA聚合酶并引发下游(3’方向)编码序列的转录。出于限定本发明的目的，启动子序列的边界在3’端是转录的起始位点，并向上游(5‘方向)延伸以包括引发高于背景的可检测水平的转录所必需的最少数目的碱基或元件。在启动子序列中，可找到转录起始位点和负责与RNA聚合酶结合的蛋白结合区域(共有序列)。真核的启动子经常，但并非总是，含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子除了-10和-35共有序列外，还含有SD(Shine-Dalgarno)序列。
术语“寡核苷酸”指的是一种包括两个或更多(最好在三个以上)脱氧核糖核苷酸的分子。它的确切大小由很多因素决定，而这些因素又取决于该寡核苷酸的最终功能和用处。如本文所用，术语“引物”指一种寡核苷酸，不论是天然存在的寡核苷酸(如以纯化的限制性酶消化片段)，还是合成的寡核苷酸，当其处于可引发合成引物延伸产物的条件下(即存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶和适当的温度及pH)，可以作为引发合成的位点，而引物延伸产物与核苷酸链是互补的。引物可以是单链的也可以是双链的，而且必须足够长使得能在诱导剂存在时引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，取决于靶序列的复杂性，寡聚核苷酸引物通常包含15-25或更多的核苷酸，虽然它也可以包含更少的核昔酸。
所选引物须与特定的靶DNA序列的不同链基本互补。这就是说，引物必须充分互补以便杂交于它们各自的链。因此，引物序列无需对应于模板的确切序列。例如，一段非互补核苷酸片段可连于引物的5’端，而引物序列的其余部分与此链互补。或者，只要引物序列具有与该序列的足够互补或与之杂交，从而形成用于合成延伸产物的模板，那么可将非互补的碱基或更长的序列散布插入在引物中。
本文所用的术语“限制性内切酶”和“限制性酶”指能在特定核苷酸序列处或附近切割双链DNA的酶。
“DNA重组技术”指合并两个异源DNA分子的技术，通常这是体外连接不同生物体DNA的结果。DNA重组分子通常用基因工程实验产生。同义的术语包括“基因拼接”，“分子克隆”和“基因工程”。这些操作的产物是“重组体”，“重组分子”或“转基因”。
当这种DNA被引入到细胞内时，细胞就被外来或异源DNA“转化”“转染”或“转导”了。转化DNA可整合或没有整合(共价连接)到细胞的基因组中。例如在原核生物，酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可在附加元件(如载体或质粒)上维持。对于真核细胞来说，稳定转化的细胞是转化DNA已螯合到染色体中的细胞，这样通过染色体的复制可遗传给子代细胞。这种稳定性表现为该真核细胞能够建立由含转化DNA的子代细胞群组成的细胞系和克隆。“克隆”是由单个细胞或祖先细胞通过有丝分裂而衍生出的一群细胞。“细胞系”是能在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。一种生物，如植物或动物，用外源DNA转化后称为是“转基因的”。
如本文所用，术语“宿主”不仅包括原核生物，也包括真核生物如酵母、植物和动物细胞。编码本发明的玉米淀粉合成酶的重组DNA分子或基因，可用本领域普通技术人员公知的任何一种技术来转化宿主。一种优选的例子是使用含基因编码序列的载体来转化原核生物。原核宿主可以包括大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(S.tymphimurium)、灵杆菌(Serratiamarcesens)、和枯草杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括酵母如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、哺乳动物细胞和昆虫细胞，更好的则是植物细胞如拟南芥(Arabidopsis thaliana)和烟草(Tobaccum nicotiana)。
当给定长度的DNA序列中的核苷酸有至少约75％(较好地约80％，最好地约90％或95％)是匹配的时，则这两个DNA序列是基本同源的。基本同源的序列可通过用序列数据库中已有的标准软件，或通过Southern杂交实验(如在为特殊系统定义的严谨条件下)进行序列比较来鉴定。确定适合的杂交条件，是在本领域技术人员的能力之内的，参见如Maniatis等人，同上；DNACloning,Vols.Ⅰ&Ⅱ，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上。
DNA构建物中的“异源”区域是在较大的DNA分子中的一段DNA，这段DNA在天然情况下不与该较大DNA分子相连。因此，当该异源区域编码哺乳动物基因时，该基因侧接的DNA往往是在来源生物基因组中并不侧接于哺乳动物基因组的DNA。另一例子中，编码序列是其自身在自然中是没有的的构建物(如，在基因组编码序列包括内含子情况下的cDNA，或包含了与自然基因不同密码子的合成序列)。等位(基因)变异或天然发生的突变事件并不产生这里所说DNA的异源区域。
按照本领域普通技术人员所公知的常规Northern杂交技术，可采用标准Nothern印迹试验来确定细胞或植物组织或其它转基因组织中的mRNA的相对量。或者，按照本领域普通技术人员所公知的常规Southern杂交技术，可采用标准Southern印迹试验来确定转基因系统中基因的存在与否和拷贝数。Northern印迹和Southern印迹都用到了杂交探针，如放射性标记的cDNA，或长度至少20(较好的是至少30，更好的是至少50，最好的是至少100)个连续核苷酸长度的DNA序列片段。DNA杂交的探针可以用按照本领域普通技术人员所公知的许多不同方法中的一种来标记。
这些研究中最常用的标记物是放射性元素、酶、暴露在紫外光下发荧光的化学剂等。已知有许多的荧光剂可用于标记。它们包括例如，荧光素、罗丹明、金胺、得克萨斯红(Texas Red)、AMCA蓝和荧光黄。一种具体的探测物质为山羊中制得的并通过异硫氰酸盐与荧光素偶连的抗一兔抗体。蛋白质可用放射性元素或酶标记。放射性标记可用目前已有的计数方法检测。较佳同位素可选自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、59Fe、90Y、l25I、131I和186Re。
酶标记也同样采用，可用目前使用的比色、分光光度计、荧光分光光度计、电流计或气体定量技术来测定。通过与桥连分子(如碳二亚胺、二异氰酸盐、戊二醛等)的反应，使酶与所选择的粒子偶连。许多用于这种方法的酶是已知的并可采用。较佳的是过氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶+过氧化酶及碱性磷酸酶。美国专利No.3,654,090、3,850,752和4,016,043被列举引用，它们还公开了其它的标记物质和方法。
本发明涉及一种促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型的转基因小鼠。与对照小鼠相比，这种缺陷导致小鼠忧虑的减少，对应力的内分泌响应减少和移动性节律的改变。这种小鼠随后可与另一品系的小鼠交配以产生后代。
本发明涉及一种识别通过除促肾上腺皮质素释放因子受体-1以外的受体起作用的促肾上腺皮质素释放因子、尿皮质素或相关配体的促效剂或拮抗剂的方法。该方法包括将测试化合物或空白对照剂施用于促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型转基因小鼠中，并测定测试化合物或空白对照剂对小鼠焦虑水平、对应力的内分泌响应和移动性节律的作用。焦虑水平、对应力的内分泌响应或移动性节律的改变，就表明是通过除促肾上腺皮质素释放因子受体-1以外受体起作用的促肾上腺皮质素释放因子、尿皮质素或相关配体的促效剂或拮抗剂。这些其它的受体可以包括促肾上腺皮质素释放因子受体-2或新的促肾上腺皮质素释放因子受体。
本发明还涉及了产生促肾上腺皮质素释放因子受体-1显著缺陷的转基因小鼠的方法。该方法包括通过将衍生自小鼠的促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因的促肾上腺皮质素释放因子受体-1转基因引入到胚胎干细胞中，而产生阳性ES细胞。该转基因包括一个编码选择标记的基因，该选择标记基因替换了促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因外显子5到外显子8。其中在选择标记的选择下存活并生长的ES细胞是阳性ES细胞，然后通过将阳性ES细胞引入C57BL/6胚泡中而产生转基因小鼠。这种转基因小鼠可以交配以产生转基因纯合的转基因小鼠。
本发明还涉及了一种筛选化合物的方法，该化合物是皮质酮或促肾上腺皮质素的类似物或拮抗剂。该方法包括在促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型的纯合雌小鼠和纯合雄小鼠之间进行交配，将化合物施用于到怀孕后的雌小鼠中，然后测定由雌小鼠所生后代中肺的组织学状况。不存在发育不良、肺泡的萎陷和反应性肺气肿并伴有肺泡内出血和含铁血黄素沉淀，就表明是皮质酮或促肾上腺皮质素类似物或拮抗剂。
本发明还涉及了一种减轻胎儿呼吸困难综合症的方法，它包括在子宫内，将药用可接受剂量的促肾上腺皮质素施用于被怀疑有胎儿呼吸困难综合症胎儿。
以下的实施例的给出是为了说明本发明的各种具体实施方案，并不用于以任何方式限定本发明。
实施例1靶载体的构建，ES细胞培养和无效突变的鉴定从129品系小鼠的基因组DNA库中，分离得到的对应于促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因座的克隆过的基因组DNA。用PGK-neo盒置换促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因的外显子5-8(编码从第一胞外域最后12个氨基酸到第四跨膜结构域)，由此产生靶构建物(图1)。按Lee等人，1992所述，所得的质粒DNA用NotⅠ线性化并电穿孔入J1胚胎干细胞(ES)中。在0.2mg/ml G418选择7-9天后，耐新霉素的克隆被各自选出，每个克隆的50％细胞在96孔板扩大培养以用于冷冻，剩下的50％在24孔板用于DNA分离。
用与靶构建物5’杂交的外部BamHⅠ/HindⅢ基因组片段，通过Southern分析，筛选出促肾上腺皮质素释放因子受体-1的等位基因受破坏的菌落(图1A)。得到含有6.3kb Eco受体-1片段(该片段表明是同源重组体)的ES细胞的频率为1/83。如Lee等人，1992所述，将阳性ES克隆细胞注射到C57BL/6胚泡中，从而产生嵌合小鼠。用表现出拉美刺鼠毛色的F1幼鼠收集的尾部DNA，通过Southern分析确定突变等位基因的种系传送情况(图1B)。对分离于纯合突变型小鼠和野生型小鼠的小脑受体-NA，用互补于外显子6和8的引物(缺失区域)进行受体-T-PC受体分析，证明了促肾上腺皮质素释放因子受体基因存在缺失。GAPDH mRNA被扩增，作为所有反应的阳性对照。
小鼠全垂体细胞的原代培养，被用来证明在无效突变中形成了促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因的缺失。简而言之，从8-10周大的雌性突变型和对照小鼠(约10只小鼠/组)中收集全垂体，并如Vale等人(1983)所述进行分散。用补充有2％FBS的完全培养基(bPJ)洗涤细胞，在48孔Costar平板上(用聚-d-赖氨酸20μg/ml预涂)铺成单细胞层(1.2×105细胞/孔/0.5ml)。回收3天后，用含有0.1％BSA的bPJ培养基平衡细胞2小时，用含0-100nM促肾上腺皮质素释放因子的新鲜培养基处理1小时。收集培养基，用放射免疫测定试剂盒(Diagnostic Products Corporation)测定ACTH的分泌。
实施例2组织学、免疫组织化学和原位杂交分析组织分析中，突变型和野生型小鼠(约8-10周年龄，除非另外说明)用4％聚甲醛灌流，解剖组织(肺，肾上腺等)，然后在4℃后固定24小时。随后，组织被包埋在石蜡中，切成7mm厚的切片，用苏木精和曙红染色，然后评价。在免疫组织化学确定促肾上腺皮质素释放因子、AVP和尿皮质素在脑中定位及ACTH在肾上腺的定位时，用4％聚甲醛灌流动物，组织被切成30mm厚的切片。进行了对促肾上腺皮质素释放因子和AVP(Chan等人，1993)，尿皮质素(Vaughan等人，1995)和ACTH(Potter等人，1994)的免疫组织化学定位。在原位杂交分析中，麻醉小鼠，然后陆续用盐水、含4％聚甲醛的0.1M硼酸盐缓冲液灌流。组织在4℃保存于含10％蔗糖的固定剂中。冷冻切片(30mm厚度)是在受体-eichert切片机上切片的，在抗冻溶液(30％聚乙二醇，20％甘油，0.05M NaPO4)中保存以备用。杂交和洗涤的条件见Potter等人(1994)所述。对于促肾上腺皮质素释放因子mRNA的原位定位，用小鼠的促肾上腺皮质素释放因子cDNA模板(由Dr.Kelly Mayo,Northwestern University提供)合成35S标记的反义和有义cRNA探针。对于促肾上腺皮质素释放因子受体-2的杂交，从含有80bp 5’非翻译区域和926bp编码序列的、约1kb小鼠促肾上腺皮质素释放因子受体-2 cDNA(Perrin等人，1995)合成33P标记的反义和有义cRNA探针。
实施例3采血样和激素分析在所有的激素分析中，将动物(约8-10周的年龄，除非另外说明)分别关在遮布的笼子里过夜，然后通过后眼眶放血收集血样。在对笼子初次干扰后的45秒内收集血样，然后迅速地将血样置于冰上的、含有EDTA的试管内。在分析前血样保存于-20℃。为了测定在未受干扰条件下促肾上腺皮质素的浓度，在6:00AM从突变型和野生型的雌雄小鼠收集血样(n=14每组)。同样在4PM从雌雄的突变型和对照小鼠收集血样(n分别为6,6,5和6)。为了评价对应力的内分泌响应，在8:00AM从雌雄促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型和野生型小鼠(n=6每组)收集血样。然后让动物立刻经历了一个短暂的物理约束应力(在移去底部的50ml锥形管内约束10分钟)。然后采集第二批血样，然后迅速将小鼠杀死。为了测定出生初期中ACTH循环浓度，从出生10天的促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型(n=5)和野生型(n=7)小鼠收集血样。以小鼠ACTH(1-39)为标准，用人ACTH双位点免疫放射测定法(Nichols Institute,San JuanCapistrano,CA)测定ACTH的血浆浓度。用大鼠/小鼠125I皮质酮放射免疫测定试剂盒(ICN Biomedicals,Costa Mesa,CA)测定血样中皮质酮的浓度。
实施例4行为分析用黑暗-明亮变化实验来测试促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠在焦虑环境下的行为响应，并与对照小鼠(n=6雄性小鼠/组)相比较。用于行为分析实验的小鼠都是单独关着的。测试在一个白色开放区域(50×50cm)中进行的，该开发区域带有深12cm和直径8cm的不透明箱盒(Takahashi等人，1989)。该箱盒位于开放区域的中央，敞开端对着角落。开放的区域用灯直接照射在区域的中心(地板上强度为120lux)。测试是在恒定的背景白噪音(80dB)的房间内进行的。小鼠在实验房间中习惯1小时，然后进行行为测试。行为测试就是通过将小鼠置于小箱盒中来而将它们引入不熟悉的测试环境。用电视摄影机记录下5分钟测试期间的行为情况。根据摄像记录，确定离开箱盒等待时间(“离开”被定义为四只爪子位于开放区域)、在箱盒内的总时间、离开的数量和每次离开后在开放区域的平均停留时间。
在置于带有光电管照射(San Diego Instruments,San Diego,CA)的框架内(25.5×47cm)的有机玻璃笼子(42×22×20cm)中，测定移动性。水平运动框架是由4×8排列的光束组成的。移动性测试是在恒定背景白噪音(80dB；Xu等人，1994)且光条件与上述类似的房间内进行的。小鼠在实验前1小时被引入实验房间。分析光束停顿方式，以确定在一段时间内进入区域的数量。进入区域被定义为指移动进入8个相同大小的方块(2×4矩阵，11×10.5cm/区)。这种测定方法被用来比重复中断单一光束更精确地反映水平移动。
在循环中明亮阶段测得的，在这种新环境下的移动响应，被用作焦虑测试中移动性的对照。记录移动响应180分钟，并且前5分钟与黑暗-明亮变化实验测试的5分钟作比较。两个月后，在有水和食物的条件下，记录移动性48小时。在测试笼子内习惯12小时后的24小时阶段的作为基础移动性。记录每个阶段的运动响应，并计算与循环中明亮阶段相比在暗条件下活力增加的百分比。
用Student氏t-测试来比较两组动物的移动性数据，以组(野生型和突变型动物)作为受实验对象间因子并以移动性时间-过程作为受实验对象内因子，对重复测量(ANOVA)的区别作因子分析。在黑暗-明亮变化实验中，用Mann-WhitneyU测试比较各组。
实施例5在子宫内用皮质类固醇来抢救肺发育不良纯合的促肾上腺皮质素释放因子受体-1雄性和雌性小鼠互交，并以交配管的出现证明交配(代表胚胎第0天)。胚胎第12天时，用25μg/ml皮质酮(Sigma,St.Louis,MO)加在饮用水中处理怀孕的雌鼠，直至出生后的14天来分析新生儿的存活。出生后1天，收集用皮质酮处理的突变型小鼠，没处理的突变型小鼠和没处理的对照小鼠的肺，并如上所述作组织分析。
实施例6激素抢救促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠的肾上腺缺陷如上所述用皮质酮抢救策略所产生的突变后代，被用于测定ACTH置换对成熟肾上腺的效果。简而言之，自出生后10-21天，每天皮下注射两次10ng/g体重的大鼠ACTH的稀释剂(0.1M磷酸盐缓冲液，0.1％牛血清白蛋白，0.01％抗坏血酸，pH7.3)，或仅注射稀释剂。然后，从ACTH处理的突变型小鼠(n=4)和仅用稀释剂处理的突变型小鼠收集肾上腺，并如上所述进行处理。
实施例7促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠的产生为了产生促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠，构建一个靶载体，其中用新霉素抗性基因盒置换促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因的一部分，该部分编码从第一胞外域最后12个氨基酸到第四跨膜结构域(图1A)。因此，形成的受破坏的促肾上腺皮质素释放因子受体-1 mRNA的翻译后，将形成无法结合到细胞膜的受体蛋白，这样就无功能。受筛选的500个耐新霉素菌落中有6个菌落，用外部探针作Southern分析时为阳性(图1B)。将两种靶ES细胞系的细胞注射到C57 BL/6肺泡中，以产生嵌合的起始小鼠，并获得被破坏受损的等位基因的种系传递。一般来说，由杂合体交配产生的纯合突变型小鼠正常发育，且能生育。然而，观察到促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型雄性小鼠有15％的死亡率。死亡主要发生在3-12周龄的动物，而这种情况没有发生在促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型的雌性小鼠和对照小鼠上。对从纯合的突变型小鼠小脑收集的mRNA所作的RT-PC受体分析证实，在促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因中存在缺失(没有显示数据)。
为了确定促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因的缺失是否导致无效突变，将培养的野生型和突变型小鼠垂体细胞用0-100nM促肾上腺皮质素释放因子受体处理1小时，并测定培养基中的ACTH水平。促肾上腺皮质素释放因子受体处理的野生型垂体细胞后，导致了剂量依赖型的ACTH分泌增加(图1C)。相反，用0-100nM促肾上腺皮质素释放因子处理的促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型的垂体细胞，却没有增加ACTH的分泌(图1C)。所以，靶突变将导致促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因的破坏，从而不产生有功能的受体蛋白。
实施例8缺乏促肾上腺皮质素释放因子受体-1的小鼠表现出明显的肾上腺缺陷促肾上腺皮质素释放因子依赖途径，已知在下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的调节和对应力的作出的许多中枢响应中起关键作用(Owents&Nemeroff,1991)。作为对突变动物HPA轴功能的初步评估，在6:00 AM和4:00PM从雌雄野生型和突变型小鼠采集血样。与野生型小鼠相比，促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型雌雄小鼠的血浆皮质酮浓度都非常低。具体地，在突变型小鼠中没有出现了应在下午出现的循环皮质酮的特征性白天增加(图2A)。对从促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠收集的肾上腺体进行组织分析，揭露了观察到的内分泌缺陷的解剖学基础。突变动物表现出显著的束状区域萎缩，该肾上腺区域负责产生皮质酮(图2B)。相反，突变型小鼠肾上腺的血管小球区域、网状区域和髓质都显得正常。另外，由突变型小鼠肾上腺血管小球区域产生的血浆醛固酮浓度与野生型小鼠近似(数据未示出)。所以，促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠的肾上腺缺陷，似乎特定于肾上腺中的皮质酮产生区域。
促肾上腺皮质素释放因子可以在体内刺激促皮质激素细胞(产生ACTH的垂体细胞；Gertz等人，1987)的增生，而且垂体ACTH对肾上腺中产生皮质酮的区域是向性的(tropic)(Idelman,1970)。所以，突变型小鼠垂体的总体形态学和细胞成份被测定，以确定促皮质激素细胞发育的缺陷是否明显。突变型小鼠垂体的组织学和免疫细胞化学分析揭示，没有可观察的解剖缺陷(没有显示数据)且促皮质激素补体正常(图2C)。分散的成熟突变型小鼠垂体细胞的体外基础ACTH分泌(图1C)和ACTH含量，与野生型小鼠近似。另外，成熟小鼠在上午(图4B)和下午时循环中的基础ACTH浓度与对照小鼠没有区别。虎斑小体(Nissl)染色的，促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠脑的各种部分(包括隔膜、海马和扁桃)切片进行检验，没有观察到任何明显的解剖学缺陷。
实施例9在促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠下丘脑旁核中，促肾上腺皮质素释放因子的表达增加促肾上腺皮质素释放因子受体-1，是表达于垂体并在参与调节介导促肾上腺皮质素释放因子各种生物作用的大脑功能区域中占主导的促肾上腺皮质素释放因子受体亚类(Grigoriadia等人，1996)。在突变动物中促肾上腺皮质素释放因子受体-1依赖途径的缺失，可能通过改变促肾上腺皮质素释放因子系统中其它组份的定位和/或表达水平来补偿。所以，进行了免疫细胞化学和原位杂交的分析，以鉴定促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠的脑和垂体中促肾上腺皮质素释放因子系统的其它关键组份表达的改变情况。免疫细胞化学分析揭示，在促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠下丘脑旁核(PVN)中，促肾上腺皮质素释放因子的表达与野生型相比明显增加(图3A)。与野生型小鼠相比，同样也测到突变型小鼠PVN中促肾上腺皮质素释放因子mRNA表达的增加。
精氨酸加压素(AVP)主要是由旁核中合成促肾上腺皮质素释放因子的相同神经元产生的，它是促皮质激素细胞功能的关键调节物。与促肾上腺皮质素释放因子相反，在突变型小鼠旁核中没有观察到AVP表达的可检测的改变(图3B)。在脑中其它产生促肾上腺皮质素释放因子的区域(如扁桃)，突变型小鼠中促肾上腺皮质素释放因子的表达与对照相比并无区别。所以，促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷特异地在突变型小鼠旁核中引起促肾上腺皮质素释放因子表达的增加。没有观察到突变型小鼠脑和垂体中促肾上腺皮质素释放因子受体-2表达的空间分布和水平的变化。同样，突变型小鼠中脑中尿皮质素的中枢表达与对照也近似。
实施例10促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠表现出受损的对应力的内分泌受体响应对应力的激素响应的触发，是通过下丘脑的侧脑神经元分泌更多的促肾上腺皮质素释放因子到下丘脑-垂体-人口系统，这导致增加垂体促皮质激素细胞分泌更多的ACTH同时伴随着肾上腺分泌皮质酮的增加(Owens&Nemeroff,1991)。为了测定在促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型动物中，垂体和肾上腺对应力的响应是否被破坏，在8:00AM对雌雄野生型和突变型小鼠作物理约束应力处理10分钟。在暴露于应力之前或之后立刻收集的样本，测定其皮质酮和ACTH的血浆浓度。对照动物(无论是雌或雄)，在物理约束后都作出了ACTH和皮质酮分泌的显著增加的响应(分别为图4A和图4B)。相反，在促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠中，约束应力并不导致产生循环ACTH的发生可检测的增加(图4A)，且与野生型相比所产生的皮质酮增加也是很迟钝的(图4B)。这些结果表明，促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠对应力的内分泌响应被严重损害了。
实施例11促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠表现出焦虑的减少焦虑的适应性改变指标是应力响应的主要组成部分，而且也已证明了促肾上腺皮质素释放因子在调节对应力的行为响应中起重要作用(Koob,1994)。所以，评价了促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠对应力的行为响应。用黑暗-明亮变化实验测试促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠对焦虑环境的行为响应，并与对照小鼠作比较。与对照小鼠相比，突变型小鼠倾向于等待更短时间就从小箱盒离开进入开放区域(相反环境)，且在开放区域消磨待的时间显著地的更长(P＜0.05；图5A)。与野生型小鼠相比，突变型小鼠的每次离开后在开放区域花费的平均时间也更多(19.9±7.53对3.8±3.2秒；P＜0.05)。
为了证明促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠对焦虑刺激的敏感性的减少并不是由于对新奇的移动性不同所造成的，测定了在黑暗-明亮变化实验的相同明亮条件下，在新环境下的移动性。对应于黑暗-明亮变化测试期间最初5分钟的总区域进入次数(图5B)以及整个3小时期间的总区域进入测试，在两组之间没有区别。所以，对新奇反应的区别，并不造成突变型小鼠在“黑暗-明亮变化任务”中更倾向于离开小箱盒。
实施例12促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠表现出移动性节律的改变促肾上腺皮质素释放因子表达(Moldow&Fischman,1984；Owens等人，1990)和包括移动性在内的数种行为响应方面的生理节律，已被清楚地确定。然而，还没有确定促肾上腺皮质素释放因子系统在调节行为的节律改变方面的潜在作用。所以，促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型和野生型小鼠的移动性节律被定性研究。在对测试器具熟悉后24小时(12小时亮和12小时暗)期间，评估基础移动性(图5C)。与明亮阶段相比，野生型和突变型小鼠在黑暗阶段的活力都表现出正常增加(野生型和突变型小鼠分别为P＜0.001和P＜0.01)。然而，在明亮阶段中突变型小鼠的移动性明显比野生型小鼠高(P＜0.05)，但在黑暗阶段则没有这种情况(图5D)。因此，与野生型小鼠(89.26±3.20)相比，突变型小鼠(56.70±4.37)在黑暗阶段的移动性较周期的明亮阶段所增加的百分比较小(P＜0.001)。在明亮阶段的最后几个小时内，促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠活力的增加特别明显(图5C)。所以，促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠表现出移动性节律的改变，这表现为在野生型小鼠正常活力较低时突变型小鼠活力的增加。
实施例13纯合的促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型雌性的后代新生儿死亡率和在子宫用皮质酮来解救如前所述，杂合的促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠的后代，在出生时能存活且有正常新生儿存活率。为了进一步鉴定促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变体的繁殖和发育能力，用纯合的突变型雌雄小鼠进行互交。尽管促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠的生育性没有明显的区别，但几乎所有纯合的促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型雌鼠的后代在出生后48小时内都死了。
由于在突变雌小鼠中观察到肾上腺的缺陷，以及已充分描述过的新生儿肺发育对皮质类固醇的需要(Ballard,1989)，因此这些动物在出生后最可能是由于呼吸困难而死亡。事实上，对出生后1天收集的肺进行组织分析发现，与对照小鼠的后代相比，纯合的突变雌鼠后代的肺发育明显异常(图6A和图6B)。突变体的肺表现出肺泡萎陷而且有反应性肺气肿(伴有肺泡内出血和含铁血黄素沉淀)(图6B)。随后，测定了用皮质酮处理是否可以防止纯合的突变型小鼠后代新生儿的肺发育不良和伴随的死亡率上升。
这些实验的结果表明，对纯合的突变雌鼠用皮质酮进行子宫处理，即在怀孕的12天到出生后的14天在饮用水中加入皮质酮，可以使它们的子代肺发育正常。对皮质酮子宫处理之后收集于出生1天的肺进行组织分析，发现正常的结构和薄的肺泡隔膜及正常的气体空间扩张(图6C)。在子宫内用皮质类固醇处理也导致了纯合突变雌鼠后代的产后存活率的正常(没有显示数据)。总之，这些结果和杂合促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠互交产生的后代新生儿存活率正常这一事实，得出了以下结论纯合的促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠后代的肺发育不良和新生儿存活率的降低，都是由于在怀孕后期和新生儿期母体皮质类固醇产生的不足引起的。
实施例14对促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠肾上腺的缺陷用激素来解救还进一步鉴定了促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠，以描绘了纯合动物中明显的肾上腺萎缩的发育和/或内分泌基础，以及肾上腺缺陷是否在产前和产后是第一表现。由于对维持肾上腺皮质类固醇的正常产生来说ACTH是绝对需要的(Colby等人，1974)，需要确定肾上腺的萎陷是否是缺少促肾上腺皮质素释放因子受体-1依赖型信号途径的直接结果，或是由于在肾上腺发育时促激素(ACTH)提供的不足引起的间接结果。
为了确定缺陷是否发生在产前对产后的发育过程中，在产后3天从对照和突变型小鼠收集肾上腺，并进行组织分析。没有观察到突变体肾上腺存在形态学上的明显区别(图7A)，这表明肾上腺的缺陷出现在产后。然后，用ACTH处理疗法来测定突变型小鼠的肾上腺是否保留了在萎缩的束状区域减少的情况下对外源ACTH的响应能力。在出生后10-21天，每天两次注射ACTH，与注射载体的突变型小鼠相比肾上腺大小和束状区域的范围都有增加(图7B)。所以，突变型小鼠的肾上腺保存了对外源促激素(ACTH)处理响应的能力。肾上腺的缺陷可能是突变型小鼠在正常出生后肾上腺发育阶段循环ACTH浓度减少的结果。
为了证明突变型小鼠在肾上腺发育时ACTH的缺乏，在出生后10天收集杂合突变型小鼠和野生型小鼠的血样。血浆ACTH浓度分析表明，与对照小鼠相比，突变型小鼠出生后10天的ACTH浓度显著降低〔图7C；P＜0.02〕。所以，导致突变动物肾上腺缺陷的机理可能是出生早期ACTH产生的不足引起的。这些结果揭示，促肾上腺皮质素释放因子受体-1介导的垂体腺的ACTH产生，对肾上腺的产后正常发育及成熟是绝对关键的。
本发明中，通过在胚胎干细胞中的基因靶向，以产生促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因座被靶向破坏的小鼠。培养的突变动物垂体细胞不能在促肾上腺皮质素释放因子处理下增加ACTH的分泌，这证实了突变可导致受体功能的丧失。促肾上腺皮质素释放因子受体-1在脑和垂体腺中分布广泛(Chalmers等人，1995；Potter等人，1994)，以及在产前和产后期间观察到的对促肾上腺皮质素释放因子受体的时空调节(Avishai-Eliner等人，1996；Insel等人，1988)，可以预测促肾上腺皮质素释放因子受体-1调节途径的缺失将导致突变动物明显的发育缺陷。事实上，促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠表现出肾上腺束状区域明显的萎缩。观察到的肾上腺缺陷，自身表现为成熟动物中循环皮质酮浓度的显著减少，这证明促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变体在结构和功能上有异常。这种在促肾上腺皮质素释放因子基因上被靶向破坏的小鼠同样也表现出类似的肾上腺缺陷(Muglia等人，1995)。
对于这些小鼠品系的肾上腺缺陷，提出了两种潜在的解释。突变型小鼠中的肾上腺萎缩可能是间接的，因为在发育阶段缺少促肾上腺皮质素释放因子刺激型垂体腺分泌的ACTH，或是在肾上腺中促肾上腺皮质素释放因子/促肾上腺皮质素释放因子受体-1依赖型发育途径的缺少所导致的直接结果。在肾上腺中测到了促肾上腺皮质素释放因子和促肾上腺皮质素释放因子结合位点，但配体和受体的表达则限制在髓区域(Hashimoto等人，1984；Suda等人，1984；Udelsman等人，1986)。对肾上腺(嗜铬细胞)髓区域的培养细胞，用促肾上腺皮质素释放因子处理，促进了儿茶酚胺和甲硫氨酸脑啡肽的分泌(Udelsman等人，1986)。虽然，这些因子据报道可以刺激体外肾上腺皮质的功能(Kapas等人，1995；Walker等人，1986)，但肾上腺中血液从皮质流到髓(Udelsman等人，1986)。所以，响应于促肾上腺皮质素释放因子由肾上腺髓释放的因子，不可能在肾上腺皮质成熟过程中提供向性作用。这些结果显然支持了另一假说，即促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型动物中的肾上腺缺陷是由ACTH分泌的不足介导的。促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠中观察到的肾上腺缺陷，与垂体切除后观察到的肾上腺缺陷在结构和功能上相似。被切除垂体的动物为了维持束状区域(Idelman,1970；Wyllie等人，1973)和正常的皮质类固醇产生(Colby等人，1974)，绝对需要ACTH置换。
当肾上腺完全成熟绝对需要促肾上腺皮质素释放因子受体-1依赖型ACTH分泌时，在产后的发育过程中似乎存在-关键的时间窗。在促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠的产前发育中，表现出肾上腺缺陷似乎是不可能的。在产前肾上腺皮层中的最初分化(Dailkoku等人，1976)和对产后3天收集的肾上腺进行的组织分析表明，在促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠和野生型小鼠间没有可探测的区别。所以，促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠的肾上腺缺陷可能是主要表现在产后。
在本研究中，收集于产后10天的突变动物的血浆ACTH浓度明显低于对照的，而且产后10-21天ACTH置换逆转了肾上腺萎缩。然而，成熟的突变动物中循环ACTH水平与对照小鼠的相似。突变动物并不受到皮质酮对ACTH合成和分泌的潜在抑制作用(Keller-Wood&Dallman,1984)，这-事实可能造成了缺乏促肾上腺皮质素释放因子受体-1动物中ACTH水平的近似。然而，成熟突变动物中表观正常的循环ACTH浓度并不足以恢复肾上腺发育成熟和正常功能。所以，肾上腺缺陷似乎是早期出生后促肾上腺皮质素释放因子受体-1介导型ACTH分泌缺乏所导致。
与肾上腺缺陷相反，在突变动物中没有观察到脑和垂体的解剖学缺陷。这种结果有点奇怪，因为据报道促肾上腺皮质素释放因子可促进体内垂体中ACTH产生细胞的分裂(Gertz等人，1987)，而且促肾上腺皮质素释放因子受体-1表达是在脑的特定区域在发育的特定时间内触发的(Avishai-Eliner等人，1996)。促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠的促肾上腺皮质素细胞的形态和发育成熟是正常的(Muglia等人，1995)。由此可见，对于正常促肾上腺皮质素细胞的发育而言，促肾上腺皮质素释放因子/促肾上腺皮质素释放因子受体-1不是关键需要的。然而，已确定在出生的早期促肾上腺皮质素释放因子受体-1介导的ACTH产生是需要的，因为促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠明显表现出在新生儿期间循环ACTH水平的减少。
促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因的突变，并没有伴有第二种促肾上腺皮质素释放因子受体亚类(促肾上腺皮质素释放因子受体-2)定位或表达水平的补偿性改变。然而，在促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠的PVN测到促肾上腺皮质素释放因子受体-1的主要配体表达有补偿性增加。这种在促肾上腺皮质素释放因子mRNA和蛋白的增加局限于PVN，且在脑的其它促肾上腺皮质素释放因子受体产生区域(如扁桃)中没有发现。PVN中促肾上腺皮质素释放因子受体-1表达的增加可能是由皮质类固醇的负反馈作用下降所介导的。在大鼠中，PVN中促肾上腺皮质素释放因子和精氨酸加压素的表达，受皮质类固醇抑制(Sawchenko,1987)且可通过肾上腺切除术得以提高(Sawchenko等人，1984)。然而，促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠的PVN中精氨酸加压素(ACTH分泌的另一关键调节物)的表达与对照动物相似。无论如何，成熟的突变型小鼠中正常循环的ACTH水平，不是精氨酸加压素对促肾上腺皮质素细胞(corticotrope)功能刺激加强所造成的。
促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变雌鼠有生育能力且没有明显的繁殖异常现象。杂合突变雌性的后代有正常的新生儿存活率，而纯合突变雌性的后代在出生后48小时就死于肺发育不良。对于促肾上腺皮质素释放因子缺陷型小鼠(Muglia等人，1995)和糖皮质激素受体基因被靶向破坏的小鼠(Cole等人，1995)，据报道具有相似的病因和新生儿死亡率。对于纯合的促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型雌鼠的后代，新生儿的死亡率是母体皮质酮缺乏导致胎儿/新生儿肺发育不充分所造成的。本发明中，通过由子宫开始补充皮质酮来恢复后代的存活。用相似的方法来拯救纯合的促肾上腺皮质素释放因子突变型小鼠的后代(Muglia等人，1995)，且皮质醇处理被广泛用于治疗早产儿的呼吸窘迫综合症(Ballard,1989)。
为了研究促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷的行为后果，野生型和促肾上腺皮质素释放因子受体突变型小鼠在黑暗-明亮变化实验中进行比较，该实验包括对充满应力的环境作出自由选择的响应。促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠较野生型小鼠对光照的开放区域的停留时间更长。由此，突变型小鼠显出对通常认为的啮齿类厌恶环境更加接近(Archer,1973；Crawley&Goodwin,1980；Denenbergh,1967；Misslin,1989)，且对焦虑刺激敏感性的减少。在新环境中测试时，促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠的灵敏移动性和对照小鼠没有区别，这表明突变型动物的焦虑下降并不是对新事物的反应性不同所造成的。先前的研究证明，大鼠中促肾上腺皮质素释放因子的焦虑作用是与垂体-肾上腺轴线的激活无关的(Britton等人，1986)。以前在大鼠中枢注射促肾上腺皮质素释放因子拮抗剂和反义寡核苷酸的数据也显示，对应力的行为和生理响应依赖于促肾上腺皮质素释放因子在脑系统中的作用(Martinez等人，1997；Skutella等人，1994；Swiergiel等人，1993,Takahashi等人，1989)。另外，用非肽的促肾上腺皮质素释放因子受体拮抗剂CP-154,526(对促肾上腺皮质素释放因子受体-1有高选择性)处理大鼠，据报道同样抑制了中枢施用的促肾上腺皮质素释放因子的焦虑作用(Schulz等人，1996)。所以，促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠焦虑响应的减少，可能不是由于它们皮质酮特性改变引起的。综合起来考虑，这些结果显示了促肾上腺皮质素释放因子活力的衰减便有利于在应力条件下的研究。这些结果与目前文献相一致，这些文献描述中枢施用促肾上腺皮质素释放因子可引发对应力的行为响应(Berridge&Dunn,1986；Koob,1994；Morimoto等人，1993；Takahashi等人，1989,Liang等人,1992)，并清晰的证明了，参与对应力的行为响应的促肾上腺皮质素释放因子依赖途径，是由促肾上腺皮质素释放因子受体-1介导的。
虽然，下丘脑促肾上腺皮质素释放因子浓度(Moldow&Fishman,1984；Owens等人，1990)和行为响应如移动性的昼夜变化都很好地确立了，但至今没有显示出促肾上腺皮质素释放因子依赖途径在调节移动性节律上的功能性作用。促肾上腺皮质素释放因子受体-1缺陷型小鼠的突变影响了移动性节律周期。与野生型动物相比，这些动物在黑暗和明亮之间活动节律较不明显，这显然是由于在明亮-黑暗循环中明亮阶段活力增加所致。从这一角度说，慢性缺乏皮质酮对促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型小鼠移动性节律周期的影响是不能排除的，需要进一步的研究。然而，这似乎是不可能的，因为先前对大鼠的研究表明肾上腺切除术对明亮阶段的移动性没有影响(Iuvone&Van Hartesveldt,1977)。
尽管目前已描述了两个具体的促肾上腺皮质素释放因子受体亚类时，然而还没有完全阐明这些受体在未受干扰和有应力条件下，介导对促肾上腺皮质素释放因子或促肾上腺皮质素释放因子相关配体作出的生物响应中所起的确切作用。促肾上腺皮质素释放因子受体-1在脑和垂体中的表达，很清楚受应力(Rabadan-Diehl等人，1996；Rivest等人，1995)和促肾上腺皮质素释放因子及其它调节剂(Mansi等人，1996；Pozzoli等人，1996)调节。而在相似的条件下，促肾上腺皮质素释放因子受体-2的表达是组成型的(Rivest等人，1995)。这些结果提出了一种可能性促肾上腺皮质素释放因子受体-1对于促肾上腺皮质素释放因子来说是脑中主要的应力受体。
本实验中，已清楚表明了促肾上腺皮质素释放因子受体-1介导对应力的经典内分泌和行为响应。然而，在促肾上腺皮质素释放因子受体-1突变型雄鼠中，没有减少由应力导致的血清中睾丸酮的还原，这表明动物对应力的适应性响应并非只由促肾上腺皮质素释放因子受体-1介导。额外的研究可以精确确定对应力的其他响应中哪些是由促肾上腺皮质素释放因子受体-1介导的，并确定促肾上腺皮质素释放因子受体-1介导途径在认识功能上的作用。对每种促肾上腺皮质素释放因子受体亚类精确作用的进一步阐明，可导致发展和应用促肾上腺皮质素释放因子受体的特异性拮抗剂于治疗上，和/或各种神经精神紊乱鉴别的诊断方法，及用于改善痴呆者的学习和记忆。
以下参考文献在本文中引用Archer,J.(1973).Anim.Behav.21,205-235Avishai-Eliner，等人(1996).Brain Res.Dev.Brain Res.91:159-163Ballard,P.L.(1989).Endocr.Rev.10,165-181Behan,D.P.，等人(1995).Nature 378,284-287Berridge,C.W.，等人(1986).Regul.Pept.16,83-93Britton,K.T.，等人(1986).Life Sci.39,1281-1286
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本领域技术人员将轻易领会，本发明适合执行目的，获得所述结果和优点。本文中所述的本发明实施例和所附带的方法、程序、处理、分子和具体化合物仅是优选实施例的代表，是示范性的，对本发明的范围不起任何的限制作用。本领域技术人员可作出改变和其它用途，这些都包括在权利要求范围所限定的本发明范围中。
权利要求
1．一种体细胞和生殖细胞都具有促肾上腺皮质素释放因子受体-1显著缺陷的转基因小鼠，其特征在于，这种小鼠的促肾上腺皮质素释放因子受体-1的一个或两个等位基因被破坏，导致该小鼠与对照小鼠相比焦虑减少，对应力的内分泌响应减少及移动性节律的改变。
2．一种鉴定通过除促肾上腺皮质素释放因子受体-1以外受体起作用的促肾上腺皮质素释放因子受体、尿皮质素或相关配体的促效剂的方法，其特征在于，包括如下步骤a)给如权利要求1所述的转基因小鼠施用测试化合物或空白对照化合物；b)测定所述测试化合物和所述空白对照化合物对所述小鼠的焦虑水平、对应力的内分泌响应和移动性节律的作用；和c)比较测试化合物和对照空白化合物对焦虑水平、对应力的内分泌响应和移动性节律的作用，其中所述的焦虑水平的变化、对应力的内分泌响应的变化和移动性节律的改变，就表明是通过除促肾上腺皮质素释放因子受体-1以外受体起作用的促肾上腺皮质素释放因子受体、尿皮质素或相关配体的促效剂。
3．如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的除促肾上腺皮质素释放因子受体-1以外的受体选自促肾上腺皮质素释放因子受体-2和新的促肾上腺皮质素释放因子受体。
4．一种鉴定通过除促肾上腺皮质素释放因子受体-1以外受体起作用的促肾上腺皮质素释放因子受体、尿皮质素或相关配体的拮抗剂的方法，其特征在于，包括如下步骤a)给如权利要求1所述的转基因小鼠中施用测试化合物或空白对照化合物；b)测定所述测试化合物和所述空白对照化合物对所述小鼠的焦虑水平、对应力的内分泌响应和移动性节律的作用；和c)比较测试化合物和对照空白化合物对焦虑水平、对应力的内分泌响应和移动性节律的作用，其中所述的焦虑水平的变化、对应力的内分泌响应的变化和移动性节律的改变，就表明是通过除促肾上腺皮质素释放因子受体-1以外受体起作用的促肾上腺皮质素释放因子受体、尿皮质素或相关配体的拮抗剂。
5．如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的除促肾上腺皮质素释放因子受体-1以外的受体选自促肾上腺皮质素释放因子受体-2和新的促肾上腺皮质素释放因子受体。
6．一种筛选皮质酮或促肾上腺皮质素的类似物或促效剂化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤a)将如权利要求1所述的纯合雌小鼠和权利要求1所述的纯合雄小鼠交配；b)将药学上可接受剂量的所述化合物施用于所述的怀孕后的雌鼠；和c)测定所述雌鼠后代的肺组织状况，其中发育不良、肺泡的萎陷和反应性肺气肿并伴有肺泡内出血和含铁血黄素沉淀的缺乏，就表明是皮质酮或促肾上腺皮质素的类似物或促效剂。
7．如权利要求1所述的小鼠与另一品系小鼠交配的后代。
8．一种产生促肾上腺皮质素释放因子受体-1显著缺陷的小鼠的方法，其特征在于，包括如下步骤a)通过将从小鼠促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因衍生出的促肾上腺皮质素释放因子受体-1转基因，引入到胚胎干细胞而产生阳性ES细胞，所述的转基因包括编码选择标记的基因，该标记基因替换了所述促肾上腺皮质素释放因子受体-1基因外显子5到外显子8，其中的在所述选择标记选择下存活且生长的ES细胞是阳性ES细胞；和b)通过将所述的阳性ES细胞引入到C57BL/6胚泡中产生转基因小鼠。
9．如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括步骤将所述的转基因小鼠交配以产生所述转基因纯合的转基因小鼠。
10．一种减轻新生儿呼吸窘迫综合症的方法，其特征在于，包括对怀疑有所述综合症的胎儿在子宫内施用药学上可接受的皮质酮。
全文摘要
依赖于促肾上腺皮质素释放因子(CRF)基因家族成员的信号途径对脑和垂体组织有多效作用。描述了两种在生物化学和药理学上相异的促肾上腺皮质素释放因子受体亚类(促肾上腺皮质素释放因子受体－1和促肾上腺皮质素释放因子受体－2)。为了研究具体受体亚类在发育和生理上的作用,产生了一种促肾上腺皮质素释放因子受体－1基因缺陷型小鼠。这种基因工程改造的小鼠品系揭示了,促肾上腺皮质素释放因子受体－1在下丘脑－垂体－肾上腺轴线的发育和功能及在介导与焦虑相关的行为改变和移动性节律方面是必需的。
文档编号A61P11/00GK1302376SQ99804650
公开日2001年7月4日 申请日期1999年3月30日 优先权日1998年3月30日
发明者李国芬, W·韦尔 申请人:研究发展基金会