专利名称：重组α－L－艾杜糖苷酸酶,其生产和纯化的方法以及治疗其缺乏导致的疾病的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、酶学、生物化学和临床医学领域。具体的，本发明提供了一种重组α-L-艾杜糖苷酸酶(α-L-iduronidase)、生产和纯化该酶的方法以及治疗包含α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏和粘多糖代谢病I(MPS I)的一些遗传病的方法。
背景技术：
糖类在活有机体的活动中起了许多重要作用。除了它们的新陈代谢作用，糖类是人体内与其它许多成分，如蛋白质和脂(称为糖缀合物)共价结合的结构组分。例如，人结缔组织和细胞膜包含蛋白质、糖类和蛋白聚糖基质。该蛋白聚糖基质的糖部分，对机体结构提供了重要的性质。
切开糖的溶酶体酶α-L-艾杜糖苷酸酶的遗传缺陷导致称为粘多糖代谢病I(MPS I)的溶酶体积储异常(Neufeld,E.F.,和Muenzer,J.(1989).“遗传病代谢基础”中的粘多糖代谢病(Scriver,C.R.,Beaudet,A.L.,Sly,W.S.和Valle,D.,编辑)，pp.1565-1587,McGraw-Hill,New York)。MPS I的严重形式常称为Hurler综合征，而且和多种问题，如精神发育迟缓、角膜模糊、粗糙面部特征、心脏病、呼吸系统病、肝和脾肿大、疝和关节强直等相关。患Hurler综合征的病人常在10岁前就死亡。中度形式称为Hurler-Scheie综合征，常不严重影响精神功能，但疾病可导致在10多岁和20多岁的死亡。Scheie综合征是MPS I的最轻形式。它可以具有正常寿命，但关节强直、角膜模糊和心脏瓣膜病导致严重问题。
根据British Columbia调查，估计MPS I的发病率是全部新生儿中1100，000(Lowry等，人类遗传学85389-390(1990))，根据爱尔兰的研究，为170,000(Nelson，人类遗传学101355-358(1990))。看来对该疾病没有人种差异。似乎全世界该疾病都被过低诊断，不是因为病人在诊断作出之前就由于并发症死亡，就是因为该综合征的较轻形式可被误诊为关节炎完全忽略。有效的MPS I新生儿普查可以发现一些以前未发现的病人。
除了骨髓移植，没有对MPS I的有意义治疗。骨髓移植在治疗一些该疾病的症状中可能有效，但对MPS I具有高度致病率和死亡率，而且由于缺少合适的捐赠者，通常是不可行的。对所有病人可行的另一种治疗将对治疗和处理该疾病提供重要突破。
发现α-L-艾杜糖苷酸酶能纠正培养Hurler细胞的酶缺乏之后，已长期考虑将酶替换治疗作为MPS I的可能治疗手段。在该纠正过程中，通过受体介导的胞吞作用，将含有甘露糖-6-磷酸残基的酶吸收入细胞，并传递到溶酶体，在其中酶清除贮存的底物、硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素。由于组织中α-L-艾杜糖苷酸酶的来源不足，该治疗对人的应用以前并不可行。酶置换概念首次有效的以修饰的胎盘葡糖脑苷脂酶用于Gaucher病人。Gaucher病人中葡糖脑苷脂酶的传递和有效摄入证明了酶能以足量吸收入体内，来提供有效治疗。
对于MPS I的α-L-艾杜糖苷酸酶治疗，需要一种酶的重组来源来获得治疗上充分数量的酶供应。该哺乳动物酶在1990年被克隆(Stoltzfus等，生物化学杂志2676570-6575(1992))，而该人酶在1991年被克隆(Moskowitz等，FASEB J6A77(1992))。
附图简述
图1代表了编码α-L-艾杜糖苷酸酶的cDNA的核苷酸和推断的氨基酸序列。提供了核苷酸1到6200。提供了从开放阅读框中的第一个甲硫氨酸开始的氨基酸。
图2代表根据实施例1中列出的程序获得的洗脱液SDS-PAGE的结果。泳道1是空白。泳道2含有高分子量标准品。泳道3是空白。泳道4含有浓度为50微克的牛血清白蛋白。泳道5到10代表分别含有1微克、2微克、5微克、5微克、5微克和5微克量重组产生的人α-L-艾杜糖苷酸酶的洗脱液。
图3揭示了16个MPS I病人中相对于正常排泄值的尿GAG水平。在未治疗的MPS I病人中，尿GAG水平范围很广。用重组α-L-艾杜糖苷酸酶治疗后，未降解GAG排泄减少了50％以上是衡量人体对治疗有反应的有效手段。
图4显示了MPS I病人酶治疗前后的白细胞艾杜糖苷酸酶活性。
图5显示了酶治疗前后口腔艾杜糖苷酸酶活性。
图6显示了仅用重组酶治疗8周后，三个病人中肝脏和脾脏的充分缩小以及关节和软组织积储的显著临床改善与未降解GAG减少65％以上有关。
图7显示了仅治疗12周后，在用重组酶治疗的病人中，肝脏和脾脏基本正常化。
图8显示了6个病人用重组酶治疗22周后，尿GAG排泄的急剧下降。
发明简述一方面，本发明的特征是产生其量能治疗性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的方法。在一个主要实施例中，该方法包含将编码全部或部分α-L-艾杜糖苷酸酶的cDNA转染入适合表达它的细胞的步骤。在一些实施例中，使用了编码完整α-L-艾杜糖苷酸酶，优选人α-L-艾杜糖苷酸酶的cDNA。然而，在其它实施例中，可用编码其生物活性片段或突变体的cDNA。特别是，可产生一或多种氨基酸取代，仍保持或增强酶的生物活性。在其它优选例中，用表达载体来将cDNA转移入用于其表达的合适细胞或细胞系。在一个具体优选例中，将cDNA转移入中国仓鼠卵巢细胞来建立细胞系2.131。在其它优选例中，该产生程序具有一或多个下列显示特别高的产生水平的特征(a)产生过程中，细胞生长培养基的pH可以低至约6.5到7.0，优选约6.7-6.8，(b)约每12小时可换大约2/3到3/4培养基，(c)用间断纯氧喷雾，氧饱和量最适约80％，(d)最初可用含约10％血清的微载体来产生细胞块，然后用快速冲洗转移到用于生产的无蛋白质培养液中，(e)含有补充量的一种或多种成分，选自谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、核糖核苷和脱氧核糖核苷的无蛋白质或低蛋白质培养基，如JRH Biosciences PF-CHO产品是最适的，(f)在多次分批加料过程，而不在标准的预定灌流过程中，可用灌流棒如Bellco灌流棒，和(g)可用温和的丁酸钠诱导过程来诱导α-L-艾杜糖苷酸酶表达增加。
在第二个方面，本发明提供了一种转染细胞系，其具有能产生其量能治疗性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的特征。在优选例中，本发明的特征是一种稳定和可靠产生能治疗性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶量的重组中国仓鼠卵巢细胞系如2.131细胞系。在一些优选例中，细胞系可含有表达构建物的至少约10个拷贝。在更多优选例中，细胞系表达其量为每107细胞每天至少约20-40微克的重组α-L-艾杜糖苷酸酶。
在第三个方面，本发明提供了适合产生其量能治疗性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的新颖载体。在优选例中，本发明的特征是包含巨细胞病毒启动子/增强子元件、由鼠Ca内含子构成的5′内含子、编码α-L-艾杜糖苷酸酶的全部或片段或突变体的cDNA、和3′牛生长激素聚腺苷酸化位点的表达载体。另外，优选编码α-L-艾杜糖苷酸酶的全部或片段或突变体的cDNA长约2.2kb。该表达载体可与任何合适的常用选择载体如pSV2NEO一起，以例如50比1的比率转染，来增强多拷贝插入。另外，可用基因扩增来诱导多拷贝插入。
在第四个方面，本发明提供了根据本发明方法产生的新颖α-L-艾杜糖苷酸酶，而且其量能治疗性使用该酶。根据本发明，α-L-艾杜糖苷酸酶的比活力每毫克蛋白质大于200,000单位。优选的，超过每毫克蛋白质约240,000单位。本发明的α-L-艾杜糖苷酸酶的分子量约为82,000道尔顿，约70,000道尔顿是氨基酸而约12,000道尔顿是糖类。
在第五个方面，本发明的特征是纯化α-L-艾杜糖苷酸酶的新颖方法。根据第一个实施例，可以使细胞块在含有约10％血清的培养基中生长，然后转到改良的无蛋白质生产培养基上，不经任何显著适应来产生用于纯化的高比活力初始材料。优选的，使用浓缩/渗滤流程，它能除去重组生产该酶所需的外源材料，例如，Pluronics F-68，一种常用的保护细胞不受喷雾损伤的表面活性剂。通常应将这些外源材料从大量粗物质中分离出来，来防止弄脏柱。在另一个优选例中，酸化第一柱上样液来使无蛋白质培养基配制物中发现的糖醛酸的竞争性抑制效果变得最小。也是优选的，用肝素、苯基和分子排阻柱纯化流程，使用可自动化步骤和可验证的培养基来生产纯酶。在另一个优选例中，用肝素和苯基柱步骤来除去较不希望有的带切口的或降解的α-L-艾杜糖苷酸酶。在另一个优选例中，用酸性pH处理步骤来灭活可能的病毒而不伤害酶。
在第六个方面，本发明的特征是一种治疗完全或部分由α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏引起的疾病的新颖方法。在一个实施例中，本方法的特征是单用重组α-L-艾杜糖苷酸酶或其生物活性片段或突变体或联用药物学上可接受的载体。在其它实施例中，该方法的特征是将编码全部或部分α-L-艾杜糖苷酸酶的核酸转移到体内一个或多个宿主细胞中。优选例包括按要治疗的生物体(优选哺乳动物或人)的需要优化剂量，来改善疾病症状。在优选例中，疾病是粘多糖代谢病I(MPS I),Hurler综合征，Hurler-Scheie综合征或Scheie综合征。
在第七个方面，本发明的特征是用于治疗全部或部分由α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏引起的疾病的包含α-L-艾杜糖苷酸酶的新颖药物组合物。这些组合物可以是适合于多种途径施用的，如胃肠外、外用、鼻内、吸入或口服施用的。在该范围内，实施例的特征是编码全部或部分α-L-艾杜糖苷酸酶的核酸序列，它可以在体内施用进入受α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏影响的细胞中。
发明详述在一个方面，本发明的特征是产生其量能治疗性使用该酶的α-L-艾杜糖苷酸酶的方法。总的来说，本方法的特征是用编码全部α-L-艾杜糖苷酸酶或其生物活性片段或突变体的cDNA转化合适的细胞系。本领域的那些技术人员可制备除了本文明白描述的，用于在用其转染的合适细胞系中最理想产生α-L-艾杜糖苷酸酶的那些以外的表达构建物。另外，熟练技术人员可容易的设计编码天然存在的α-L-艾杜糖苷酸酶的生物活性片段和突变体(它们具有和天然存在的全长酶相同或相似的生物活性)的cDNA片段。
要建立α-L-艾杜糖苷酸酶的重组来源，可构建一大系列的表达载体，并试验其α-L-艾杜糖苷酸酶cDNA的表达。根据瞬时转染实验和稳定转染，可识别提供特别高水平表达的表达构建物。在本发明的一个实施例中，通过转染α-L-艾杜糖苷酸酶表达构建物并选择提供特别高水平表达的高表达克隆，开发了一种中国仓鼠细胞系2.131。根据本发明的该实施例，这样的中国仓鼠细胞系可比正常细胞系分泌多大约5,000到7,000倍的α-L-艾杜糖苷酸酶。因此，可正确加工如此产生的α-L-艾杜糖苷酸酶，将其吸收入具有高亲和力的细胞并纠正患Hurler综合征病人的α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏细胞。
用于产生其量能治疗性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的方法的特征是为大量产生该酶特别设计的产生过程。根据该过程的优选例，用微载体作为生长贴壁细胞的花费低廉的规模可放大的表面。
根据本发明，用于产生α-L-艾杜糖苷酸酶的方法的其它优选例，优化了一种培养系统。在第一个实施例中，在产生过程中降低培养基pH到大约6.5到7.0，优选约6.7-6.8。这样的pH的一个优点是能增强在酸性pH下更稳定的溶酶体酶的聚集。在第二个实施例中，每12个小时换大约2/3到3/4的培养液。该程序的一个优点是增强重组α-L-艾杜糖苷酸酶的分泌率并收获更多的活性酶。在第三个实施例中，用间歇纯氧喷雾代替连续喷雾，将氧饱和度优化到大约80％。在第四个实施例中，用最初含大约10％血清的cytodex 2微载体来产生大量细胞，然后用快速冲洗转移到用于生产的无蛋白质培养基上。在第五个实施例中，可将如JRH Biosciences PF-CHO产品的生长培养基优化成包括补充量的一种或多种选自谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、核糖核苷和脱氧核糖核苷的成分。在第六个实施例中，在多次分批加料过程，而不在标准的预定灌流过程中，可用灌流棒如Bellco灌流棒。在第七个实施例中，可用温和的丁酸钠诱导过程来诱导α-L-艾杜糖苷酸酶表达增加，而基本不影响糖类加工和酶的细胞摄入。这种诱导过程可在生产中提供两倍的增加，而不显著改变翻译后加工。
根据本发明产生α-L-艾杜糖苷酸酶的方法的具体优选例的特征是，本文描述的一种或多种或全部最佳化条件。因此本发明的生产方法提供了具有下列特征的生产培养过程1．优选在大量培养瓶中用顶部棒(Bellco灌流棒或其等价物)搅拌，用基于微载体的培养(用Cytodex 2珠或其等价物)。可通过在DME/F12 1:1培养基(用包括核糖核苷、脱氧核糖核苷、丙酮酸、非必需氨基酸和HEPES的成分改良)中的10％胎牛血清在大约6.7-6.9的pH中培养达到这些珠的贴壁。在该培养基中培养3日后，开始冲洗过程，其中约每12小时用无蛋白质培养基替换大约2/3培养基，总共进行大约3-4次冲洗。然后在整个剩余培养时间内，将细胞在无蛋白质培养基中培养。
2．优选将培养条件保持在80％空气饱和度的溶解氧，pH大约6.7，温度大约37℃。这可用控制塔、运转单元和如Wheaton生产的合适探针来达到。然而，熟练技术人员可轻易理解这能方便的由其它厂商的相当的控制系统来达到。与40％和60％空气饱和度相比，大约80％的空气饱和度导致α-L-艾杜糖苷酸酶分泌的提高。然而，90％空气饱和度与80％空气饱和度相比不提供分泌的显著增加。可通过间歇纯氧喷雾，用5微米不锈钢喷雾器或其等价物提供溶解氧。大约6.7的pH对α-L-艾杜糖苷酸酶的积聚是最佳的。酶在大约7.0以上的pH特别不稳定。在大约6.7的pH以下，分泌率会降低，特别是低于大约6.5的pH。因此在大约6.6到6.8的pH之间保持了最佳培养。
3．生产培养基可以是JRH Biosciences称为Excell PF CHO的商业可购得的专利培养基的改良形式。用2.131细胞系等细胞系时，该培养基支持与血清培养基相当的分泌水平。优选将其改进，包括大约6.7(+/-0.1)的酸性pH，而且它可用7.5mM的HEPES缓冲。培养基可含有0.05到0.1％的Pluronics F-68(BASF)，它是非离子表面活性剂，或其等价物(特征是具有保护细胞免受和喷雾有关的剪切力的优点)。培养基还可含有证实对提高培养基高于现有无蛋白质培养基生产率重要的专利补充物。那些本领域技术人员可轻易理解，可根据在特定时间点可行的具体商业实施例连续优化培养基的选择。这种变化包含常规实验，并将包括在本发明的范围内。
4．可用氨基酸分析仪将废培养基和起始培养基比较来分析生产培养基。这种分析已证明2.131细胞系将标准PF CHO培养基中的甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸消耗到起始浓度的10％左右的水平。将这些氨基酸补充到高水平可导致增强能比基线的产生量提高2-3倍的培养物密度和生产率。熟练技术人员将理解本发明范围中的其它细胞系可同等的用于根据本方法产生α-L-艾杜糖苷酸酶。因此，可能需要或多或少补充营养物来优化培养基。这些优化将包括在本发明范围内，并不需过度的实验来实施。
5．可用核糖核苷和脱氧核糖核苷补充培养基，来支持缺乏二氢叶酸还原酶的细胞系2.131。熟练技术人员可理解本发明范围内的其它细胞系也可同等的用于根据本方法产生α-L-艾杜糖苷酸酶。同时可能或多或少需要核糖核苷和脱氧核糖核苷来优化培养基。这些优化将包括在本发明范围内，并不需过度的实验来实施。
6．培养3-4日达到铺满后，可大约每12小时换大约2/3培养液。可使用如Bellco灌流棒(它是一种搅拌装置，中空，尖端有筛滤板)来完成培养基的更换。通过棒上的40微米筛板，经过中空内部来泵出培养液。从含有酶的上清液中分离出带有2.131细胞块的微载体。
7．已通过生产率研究显示培养基的迅速和频繁周转可导致从细胞培养物中酶总收集量的提高。较低的频率导致酶较低的总的堆聚。在12小时培养循环中对酶分泌率的研究证明在培养期的大部分时间中，细胞在活跃的分泌酶。更频繁的周转未必会得到更多的酶。该实施例的方法已证明优于灌流培养，也远优于严格的分批培养或每天或隔天分批/加料策略。使用大约每12小时更换，可将细胞保持在具有高度活力和高水平生产率的极好状态。
8．可通过使用基因表达的丁酸钠诱导来增强α-L-艾杜糖苷酸酶的产生。2.131细胞系的系统研究证明能使用大约2mM丁酸，并导致酶产生有2倍或更大的诱导，而对糖的加工影响最小。还未证明更低的丁酸水平也能诱导，而更高水平可导致更高的诱导，但会降低产生的酶对患α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏的病人的细胞的亲和力。结果提示两倍或更高的诱导导致糖较少加工和较少的酶被磷酸加成，和毒性增加。一个具体优选方法采用每48小时在培养系统中加入2mM丁酸。该实施例导致使用该方法产生的酶有约两倍的诱导，而对酶摄入亲和力无显著作用(K-摄入小于30U/ml或2.0mM)。使用具有上述所有改良和诱导的特征的本方法实施例，15升培养系统在峰培养密度时可产生大约每天每升培养液25毫克，或更多。
在第二个方面，本发明提供了具有产生其量能治疗性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的独特能力的转染细胞系。在优选例中，本发明的特征是2.131细胞系等重组中国仓鼠卵巢细胞系，它们能稳定而可靠的产生大量α-L-艾杜糖苷酸酶。在优选例中细胞系可能含有包含CMV启动子、Cα内含子、人α-L-艾杜糖苷酸酶cDNA和牛生长激素聚腺苷酸化序列的表达构建物的至少约10个拷贝。在更优选例中，细胞系以每天每107细胞至少约20-40微克的量表达被正确加工、高摄入形式、适合于酶替换治疗的α-L-艾杜糖苷酸酶。因此，对于本发明该方面的优选例，适应于产生其量能治疗性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的转染细胞系拥有一个或多个下列特征1．优选例的细胞系衍生自一种亲本细胞系，其中细胞经培养传代，直到获得更小的尺寸和更快的生长速率，和直到它们易于附着于底物。
2．用含有2和3、大约2.2kb长的人cDNA和3′牛生长激素巨细胞病毒启动子/增强子元件、含有鼠外显子聚腺苷酸化位点之间的Ca内含子的5′内含子的表达载体转染优选例细胞系。可用如50比1的比率，用任何合适的常用选择载体如pSV2NEO转染表达载体。选择载体pSV2NEO反过来赋予成功转染的细胞以G418抗性。在具体优选例中，用大约50比1的比率，因为该比率增强了多拷贝数插入片段的获得。根据一个实施例(其中提供了中国仓鼠卵巢细胞系2.131)，有α-L-艾杜糖苷酸酶的表达载体大约10个拷贝。这样的细胞系已显示能生产大量人α-L-艾杜糖苷酸酶(最少每天每107细胞20微克)的活性。特别优选例如2.131细胞系拥有产生正确加工，含有与N连接的寡糖(含用磷酸在6位修饰的高甘露糖链，其量足以产生具有高亲和力的酶(K-摄入小于3nM))的酶的能力。
3．本发明的细胞系如中国仓鼠卵巢细胞系2.131产生的酶被迅速同化入细胞，消除粘多糖积储并在患α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏的病人细胞中具有大约5天的半衰期。
4．优选例的细胞系如2.131细胞系适应大量培养并在这些条件下稳定产生人α-L-艾杜糖苷酸酶。优选例的细胞能在大约6.6到6.8的酸性pH下生长并分泌α-L-艾杜糖苷酸酶，在该pH下α-L-艾杜糖苷酸酶的积累会提高。
5．根据本发明，细胞系的具体优选例，如2.131细胞系，使用特别配制的无蛋白质培养基能每天两次分泌超过每毫升2,000单位(每毫升8微克)水平的人α-L-艾杜糖苷酸酶。
在第三个方面，本发明提供了适合产生其量能治疗性使用的α-L-艾杜糖苷酸酶的新颖载体。足量重组α-L-艾杜糖苷酸酶的产生是对酶结构研究和酶置换治疗的关键必备条件。根据本发明的细胞系允许产生相当量的正确加工以备摄入的重组α-L-艾杜糖苷酸酶。已描述了其它三种溶酶体酶，α-半乳糖苷酶(Ioannou等，细胞生物学杂志，1191137-1150(1992))、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(Bielicki等，生物化学杂志，289241-246(1993))，和N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶(Anson等，生物化学杂志，284789-794(1992))在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中，使用不同启动子并在一种场合通过扩增来超量表达。本发明的特征是缺乏二氢叶酸还原酶的CHO细胞系，但根据本发明的优选例，扩增是不需要的。另外，本发明提供了用CMV立即早期基因启动子/增强子高水平表达人α-L-艾杜糖苷酸酶。
本发明优选例的特征是表达载体包含巨细胞病毒启动子/增强子元件、由衍生自外显子2和3之间的鼠长链免疫球蛋白Cα基因的小鼠Ca内含子构成的5’内含子、人长约2.2kb的cDNA，和3’牛生长激素聚腺苷酸化位点。可用50比1的比率和任何合适的常用选择载体如pSV2NEO一起转染该表达载体。而选择载体如pSV2NEO赋予成功转染的细胞G418抗性。在具体实施例中，用大约50比1的表达载体比选择载体，因为该比率能增强多拷贝数插入片段的获得。根据一个实施例(其中提供了中国仓鼠卵巢细胞系2.131)，有大约10个α-L-艾杜糖苷酸酶表达载体的拷贝。这样的表达构建物已显示能在合适细胞系如中国仓鼠卵巢细胞系2.131中产生大量人α-L-艾杜糖苷酸酶(最少每天每107个细胞20微克)的活力。
在第四个方面，本发明提供了根据本发明方法产生的新颖α-L-艾杜糖苷酸酶并因此存在能治疗性使用该酶的量。本发明的方法产生正确加工并为高摄入形式的，适合于酶替换治疗和对体内治疗有效的基本纯的α-L-艾杜糖苷酸酶。
根据本发明，α-L-艾杜糖苷酸酶的比活力超过每毫克蛋白质约200,000单位。优选的，每毫克蛋白质超过约240,000单位。本发明全长α-L-艾杜糖苷酸酶的分子量是大约82,000道尔顿，包含约70,000道尔顿的氨基酸和12,000道尔顿的糖类。本发明的重组酶比之前报道的尿酶的部分纯化制备物能更有效被细胞胞吞。根据本发明的重组酶有效降低放射性S-标记的GAG在α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏成纤维细胞中的积聚，表明它被运输到溶酶体(GAG储存的位点)。这种纠正所需的极低浓度的α-L-艾杜糖苷酸酶(半最大纠正浓度为0.7pM)，对酶替换治疗的成功是非常重要的。
人α-L-艾杜糖苷酸酶cDNA预期在信号肽切开后有一个653个氨基酸的蛋白质，有70,000道尔顿的预计分子量。氨基酸测序揭示了N-末端的丙氨酸26给出了一个预计的629个氨基酸的蛋白质。人重组α-L-艾杜糖苷酸酶在成熟蛋白质位置8具有一个组氨酸。预测的蛋白质序列包含6个可能的N-连接寡糖的修饰位点。所有这些可在重组蛋白质中被修饰。已证明第三和第六个位点含有一个或多个甘露糖6-磷酸残基，引起摄入细胞的高亲和力。下列肽相当于具有N-末端丙氨酸和下列序列的人重组α-L-艾杜糖苷酸酶的氨基酸26-45ala-glu-ala-pro-his-leu-val-his-val-asp-ala-ala-arg-ala-leu-trp-pro-leu-arg-arg本发明α-L-艾杜糖苷酸酶的过度表达不导致其它依赖甘露糖-6-P导向的溶酶体酶的普遍分泌。分泌的重组α-L-艾杜糖苷酸酶和正常分泌的酶在许多方面相似。在各种测定中发现其分子量是77,82,84和89kDa，与尿纠正因子发现的87kDa(Barton等，生物化学杂志，2467773-7779(1971))，和培养人成纤维细胞分泌的酶76kDa和82kDa(Myerowitz等，生物化学杂志，2563044-3048(1991)；Taylor等，生物化学杂志274263-268(1991))一致。研究中和研究间的差异是由于测量的不精确。重组酶的胞内加工的图式-分子大小的缓慢减小和最后额外的小于9kDa条带的出现和人成纤维细胞酶是相同的。最快的条带是80N-末端氨基酸蛋白水解切开造成的。
在第五个方面，本发明的特征是一种纯化α-L-艾杜糖苷酸酶的新颖方法。在优选例中，本发明的特征是一种纯化重组α-L-艾杜糖苷酸酶的方法，其已被优化成提供用可验证的层析树脂和方便的加样、洗涤和洗脱操作快速而有效的纯化。纯化本发明的α-L-艾杜糖苷酸酶的方法涉及一系列能使酶从无蛋白质的生产培养基中高产率的纯化的柱层析步骤。
根据第一个实施例，可以使大量细胞在含有约10％血清的培养基中生长，然后转到改良的无蛋白质生产培养基上，不经任何显著适应来产生用于纯化的高比活力的初始材料。在第二个实施例中，使用浓缩/渗滤流程，它能从粗物质除去外源材料如Pluronics F-68来防止其污染柱。在第三个实施例中，酸化第一柱上样液，来使无蛋白质培养基配制物中发现的糖醛酸等的竞争性抑制作用变得最小。在第四个实施例中，用肝素、苯基和分子排阻柱纯化流程，使用可自动化步骤来生产纯酶。在第五个实施例中，用肝素和苯基柱步骤来除去不需要的代切口的或降解的α-L-艾杜糖苷酸酶。在第六个实施例中，用酸性pH处理步骤来灭活可能的病毒而不伤害酶。
根据本发明纯化α-L-艾杜糖苷酸酶的方法的具体优选例的特征是根据下列具体实施例的一种以上或所有优化。本发明的纯化方法因此可提供具有本文描述的特征的纯化α-L-艾杜糖苷酸酶。
1．浓缩/渗滤用空心纤维浓缩器(A/G Technologies,30K截留值)处理粗上清液，来大约减少75％的液体体积，然后用肝素加样缓冲液(10mM NaPO4,pH5.3,NaCl200mM)渗滤。渗滤是从上清液除去不需要的化合物如Pluronics F-68(一种在本发明的许多细胞培养物中需要的表面活性剂，会弄脏柱)的重要步骤。渗滤也可以部分除去能妨碍结合于肝素柱的竞争性抑制剂。这些抑制剂可在PF-CHO培养液中发现，而且相信它们是衍生自存在于该具体培养基中的大豆水解物的糖醛酸。
2．肝素柱可在加到肝素-SepharoseCL-6B上之前将加样液调整到大约5.0的pH。肝素柱的其它类型如肝素FF(Pharmacia)具有不同的键，不和α-L-艾杜糖苷酸酶有效结合。较低的pH会在某种程度上中和糖醛酸，减少了它们的竞争性作用。没有渗滤和pH调节，PF-CHO培养液运行肝素柱(基本上没有酶流穿)。可用pH大约为5.3的缓冲液洗涤柱，然后用0.6M NaCl洗脱。结合和洗脱盐浓度的狭窄范围能得出有效的纯化步骤和常在一步后得到纯度大于90％的酶。
3．苯基柱可在下一步中使用苯基-Sepharose BP(Pharmacia)。可将肝素洗脱液调整到大约1.5M NaCl，并加到该柱上。树脂的选择和盐浓度一样重要，可确保酶完全结合(不流穿)，而且用大约0.15M NaCl可方便并完全的洗脱。获得的洗脱液是接近纯的α-L-艾杜糖苷酸酶。
4．可进行pH灭活来提供除去可能的病毒的强有力的步骤。将苯基合并液用柠檬酸pH3.0调节到大约3.3，在室温下保持大约4小时。然后可以中和酶。具有该步骤的实施例已证明能最少除去大约5log单位病毒。该步骤基本不灭活或影响酶活性。
5．然后可将酶浓缩并注射到Sephacryl S-200柱上，收集酶峰。
已证明以这种方式纯化的酶在N-连接的糖的位置3和6含有足量甘露糖-6-磷酸残基，来给出低于每毫升30单位(低于2nM)的酶摄入亲和力。该酶能充分纠正粘多糖积储疾病并具有大约5天的胞内半衰期。
在第六个方面，本发明的特征是治疗完全或部分由α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏引起的疾病的新颖方法。重组α-L-艾杜糖苷酸酶提供了犬MPSI模型酶替换疗法。该犬模型由于基因突变α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏，和人MPS I相似。将纯化、正确加工的α-L-艾杜糖苷酸酶静脉施给11只犬。在用每公斤25,000到125,000单位每周剂量治疗3、6或13个月的犬中，酶在不同的组织中被摄入，并减少许多组织中的溶酶体积储。该疾病的长期治疗和行为、关节强直、表皮和生长的临床改善有关。更高剂量的治疗(每周每公斤125,000单位)得到更好的效果，而且除了行为、关节强直、表皮的更快速临床改善外，还包括尿GAG排泄的正常化。
即使25,000单位的小剂量(0.1mg/kg/wk)酶治疗也导致显著的酶在一些组织中分布和减少GAG积储。如果持续1年以上，对行动、活力、生长和整体健康情况具有显著的临床效果。该剂量的治疗并不改善其它作为该成分所致疾病的重要部位的组织如软骨和脑。每两周施用5次的125,000单位(0.5mg/kg)的更高剂量证明可达到改善的组织通透性，而且组织水平的治疗性作用在2周中就会完成。对该增加剂量的研究已在两只犬上进行。这些MPSI犬显示显著的临床改善，而且尿GAG的排泄基本降到正常范围内。除了改变给药技术控制的免疫反应，酶治疗还未显示显著的临床或生物化学毒性。该更高的每周剂量酶治疗对改善MPSI的一些临床特征和降低积储是有效的，没有显著的毒性。
在第七个方面，本发明的特征是含有人α-L-艾杜糖苷酸酶用于治疗α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏的新颖药物组合物。该重组酶可用许多途径，如胃肠外、外用、鼻内、吸入或口服给药来施用。本发明的其它方面提供了通过将其和可以是固体、半固体或液体或可吸收的胶囊的药物学上可接受的载体一起配制来施用酶。药物组合物的例子包括片剂，滴剂如鼻用滴剂，皮肤涂用的组合物如软膏、凝胶、霜和悬浮液，吸入用喷雾剂，鼻喷雾剂和脂质体。按组合物重量，通常重组酶包含0.05％至99％或0.5％至99％，如将用于注射的含0.5和20％之间的组合物，和将用于口服的含0.1至50％的组合物。
要产生用于口服给药的含治疗性酶的剂量单位形式的药物组合物，可以用酶和固体、粉末载体，如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、土豆淀粉、玉米淀粉、支链淀粉等淀粉、昆布粉或柑橘类果肉粉、纤维素衍生物或明胶，也可包括润滑剂如硬脂酸镁或钙，或Carbowax或其它聚乙二醇蜡，并压成片剂或糖衣丸的核心。如果需要糖衣丸，可用例如含有阿拉伯胶、滑石和/或二氧化钛的浓缩糖溶液，或可用溶于易挥发有机溶剂或有机溶剂混合物的膜形成剂包裹核心。可在这些包衣中加入染料，以区分不同活性物质内容。对于由明胶和例如作为增塑剂的甘油构成的软明胶胶囊组合物，或相近的封闭胶囊，可将活性物质和Carbowax或合适的油，如芝麻油、橄榄油或花生油混合。硬明胶胶囊可含有活性物质颗粒和固态粉状载体如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、土豆淀粉、玉米淀粉或支链淀粉等淀粉，纤维素衍生物或明胶，而且还可以包含硬脂酸镁或硬脂酸作为润滑剂。
本发明的治疗性酶还可通过胃肠外施药，如通过皮下、肌肉内或静脉注射或通过缓释皮下植入物。在皮下、肌肉内或静脉注射中，可将治疗性酶(活性成分)溶解或分散在液相载体中。为了胃肠外施药，可以将活性材料与可接受的载体，优选花生油、棉籽油等各种植物油适当混合。还可使用其它胃肠外载体如使用solketol，甘油、缩甲醛和水性胃肠外配制物的有机组合物。
对于经注射胃肠外使用，组合物可以包含根据本发明的活性酸的水溶性药物学上可接受的盐的水溶液，理想的是浓度为0.5-10％，可任选包含水溶液中的稳定剂和/或缓冲物质。可将溶液的剂量单元有利的灌封在安瓿中。
当用皮下植入物的形式施用治疗性酶时，将化合物悬浮或溶解在本领域技术人员已知的缓慢分散的材料中，或通过使用渗透泵等的恒定驱动力以缓慢释放活性材料的装置施用。在这些情况下，可以在一段延续期间内施药。
对于外用，适合用软膏、凝胶、悬液、霜或类似物形式的药物组合物。活性物质的量可以变化，例如，活性物质重量在0.05％-20％之间。这种外用的药物组合物可用已知方法制备，如将活性物质和已知载体材料如异丙醇、甘油、石蜡、十八烷醇、聚乙二醇等混合。药物学上可接受的载体还可包含已知化学吸收促进剂。吸收促进剂的例子是二甲基乙酰胺(美国专利号3,472,931)、三氯乙醇或三氟乙醇(美国专利号3,891,757)，某些醇及其混合物(英国专利号1,001,949)。也在英国专利说明书1,464,975中描述了对未破损皮肤的外用施药的载体材料，其公开了由包含40-70％(v/v)异丙醇和0-60％(v/v)甘油(如存在任何平衡成分，是不超过溶剂总体积40％的稀释剂的惰性组分)的溶剂构成的载体材料。
含有治疗性酶的药物组合物施用的剂量可以在大范围内变化，可以由各种因子，如疾病的严重程度、病人年龄决定，而且可能须个别调整。提到作为每日施药的治疗性酶量的可能范围是从大约0.1毫克到大约2000毫克或从1毫克到大约2000毫克。
可能适当的配制含有治疗性酶的药物组合物，从而使其以单剂量单位或多剂量单位提供在这些范围内的剂量。除了含有一种治疗性酶(或多种治疗性酶)，本配方还可含有一种或多种用于组合物中治疗性酶催化的反应的底物或辅因子。含有治疗性酶的组合物也可含有一种以上治疗性酶。
本方法和组合物中使用的重组酶也可通过用编码重组α-L-艾杜糖苷酸酶的核酸转化病人细胞来施用。可将如此编码的核酸序列引掺入用于转化入要治疗的个体的细胞中的载体中。本文描述了这些载体的优选例。可将载体设计成整合入该个体的染色体，如反转录病毒载体，或在宿主细胞中自主复制。可以将包含编码α-L-艾杜糖苷酸酶的核苷酸序列的载体设计成能提供酶的连续或可调节的表达。另外，可将编码酶的基因载体设计成稳定的整合入细胞基因组或仅瞬时存在。可将常规基因治疗的一般方法学应用于编码α-L-艾杜糖苷酸酶的多核苷酸序列。可在Friedman，科学，2441275-1281(1989)；Ledley,J.Inherit.Metab.Dis13587-616(1990)；和Tolstoshev等,Curr Opinions Biotech155-61(1990)中找到常规基因治疗技术的综述。
施用重组酶的具体优选方法是静脉内给药。具体的优选组合物包含重组α-L-艾杜糖苷酸酶、生理盐水、将pH维持在大约5.8的磷酸盐缓冲液和人白蛋白。也可以下列量提供这些成分α-L-艾杜糖苷酸酶 0.05-0.2mg/ml或12,500-50,000单位/ml氯化钠溶液 Ⅳ袋中150mM，总体积50-250cc磷酸钠缓冲液10-50mM,pH5.8人白蛋白1mg/ml已描述了本发明。提供下列实施例说明发明主题，但仅用于说明而不用于限制。
实施例1产生重组艾杜糖苷酸酶标准技术，例如Sambrook等(1987)“分子克隆实验手册”2nded,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.可用来克隆编码人α-L-艾杜糖苷酸酶的cDNA。将之前克隆的人α-L-艾杜糖苷酸酶cDNA从bluescript KS亚克隆作为HindIII-ⅩbaI片段，亚克隆入PRCCMV(InVitrogen)。用克隆pRIR14.5(Kakkis等，核酸研究，167796(1988))的碱基788-1372(Tucker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,787684-7688(1991)的PCR扩增构建了衍生自鼠免疫球蛋白的外显子2和3之间的Cot内含子的内含子盒。该盒包括外显子2的3′末端的136bp和外显子3的5′末端的242bp，其将留在正确剪接的cDNA中。在内含子盒的编码区中不存在ATG序列。将内含子盒克隆到α-L-艾杜糖苷酸酶cDNA的5′HindIII位点。通过XhoI消化除去neo基因，然后重新环化载体来产生pCMVhldu。
融化一小管主细胞库，并将其放置在三个T150瓶中，其中加有DME/F12加补充物加10％FBS和50011g/mlG418。3-4天后，用胰蛋白酶-EDTA将细胞传代到6个含有相同培养基的高容量滚瓶中。将2×109细胞的接种物加到含有60克Cytodex2微载体和DME/F12加补充物，10％FBS和50011g/ml G418的，最终体积为13升的Wheaton微载体瓶中。用灌流棒搅拌器通过Bellco顶部驱动搅拌瓶。通过温度，DO和pH监控培养，并用具有PC界面(BioPro软件)的Wheaton小型中试工厂控制系统控制。将参数用加热套，氧气喷雾器和碱泵控制在设定点37℃,80％空气饱和度和pH6.7。将培养物培养3-4日，在此时培养物由1-3×106细胞/ml的对数生长产生。此后，每隔12小时，用PF-CHO培养基(依顾客要求改良，JRHBiosciences)替换培养基一次。将头2份收集物放置在一边作为“洗出物”，第三份收集物是产物流出的开始。每48小时加入决定性的2mM丁酸钠来诱导艾杜糖苷酸酶表达的增加。每12小时替换10升培养基继续生产，并将收集物滤过1微米滤膜来除去游离细胞和碎片。连续监测培养物的温度、pH和DO。每日两次在培养基替换之前对培养物取样，并用相差显微镜检查细胞状态和微生物，用便携葡糖计试验葡萄糖含量，用荧光底物试验检查艾杜糖苷酸酶活性。用总细胞蛋白质试验在运动中检查数次细胞量。在运行中途，细胞量达到107细胞/ml。然后将收集的含有艾杜糖苷酸酶的生产培养物用A/GTechnology空心纤维分子滤膜截留值分子量30,000浓缩5倍。然后将浓缩液用至少3倍体积的10mMNaPO4,pH5.8中的0.2M NaCl渗滤8小时。该步骤从浓缩液中除去Pluronics F68和糖醛酸。这些分子会抑制肝素柱的功能。将浓缩液调节到pH5.0，滤过1.0和0.2微米滤膜，然后加到肝素-Sepharose CL-6B柱上。用10倍柱体积的0.2M NaCl,10mM NaPO4,pH5.3洗涤柱，用0.6MI,10mM NaPO4,pH5.8洗脱酶。将洗脱液调节到1.5M NaCl，滤过1微米滤膜，并加到苯基-Sepharose HP柱上。用10倍柱体积的1.5M NaCl,10mM NaPO4,pH5.8洗涤柱，并用0.15M NaCl,10mMNaPO4,pH5.8洗脱酶。
用1M柠檬酸pH2.9酸化酶部分到pH3.3来进行病毒灭活，并在室温，pH3.3下保温酶4小时，用1M磷酸盐缓冲液将酶再调节到pH5.8。在掺加示踪剂的实验中证明该步骤能除去5log或更多的反转录病毒。将灭活酶滤过0.2μ滤膜，在A/G Technologies空心纤维浓缩仪(截留值分子量30,000)上浓缩，注射到SephacrylS200凝胶过滤柱的循环中，并收集峰。将合并的峰滤过0.2μ滤膜，配成0.1MNaPO4,pH5.8并装入试管。
可进行一系列的研究来测试酶的质量、纯度和效价。洗脱物的SDS-PAGE结果提供于图2。
从该程序获得的一种重组人α-L-艾杜糖苷酸酶显示了每毫升100,000单位的效价，并具有总蛋白浓度0.313mg/ml。
实施例2重组α-L-艾杜糖苷酸酶治疗是有效的对9只MPSI犬和6只MPSI猫以纯化的重组α-L-艾杜糖苷酸酶短期静脉给药，已显示酶在各种组织中被显著摄入，以及在一次给药后24小时组织中估计有50％或更多被吸收。虽然肝和脾吸收了最多量的酶，并有最好的病理学改善，已在许多但不是全部组织中观察到了病理学和粘多糖含量的改善。具体的说，软骨、脑和心脏瓣膜没有显著改善。观察到一只犬在13个月的长期治疗中的临床改善，但其它研究被限制在6个月或以下。接受重组人酶的所有犬和大多数猫出现了对人产物的抗体。IgG抗体是补体激活型(可能是犬IgG等价物)。也在至少13％用糖脑苷酶治疗的Gaucher病病人中观察到了该现象。也在一只犬中观察到了可能和免疫复合物疾病相关的蛋白尿症。在其它治疗动物中未观察到其它抗体作用。未观察到特异毒性，另外临床实验室研究(全血细胞计数、电解质、BLJN/肌酸酐、肝酶、尿分析)也正常。
即使用小剂量25,000单位(0.1mg/kg/wk)的酶治疗也导致一些组织中有显著的酶分布，并降低GAG积储。如果持续1年以上，治疗的关于行为、活力、生长和整体健康的显著临床效果是明显的。该剂量的治疗不改善该成分重要致病部位的其它组织如软骨和脑。每两周施用5次的125,000单位(0.5mg/kg)的更高剂量证明可达到改善的组织通透性，而且组织水平的治疗性作用在2周中就可完成。对该增加剂量为期6个月的研究正在两只犬上进行。这些MPSI犬显示显著的临床改善，而且尿GAG的排泄基本降到正常范围内。除了改变施用技术控制的免疫反应之外，酶治疗还未显示显著的临床或生物化学毒性。每周一次更高剂量的酶治疗对改善MPSI的一些临床特征并降低积储是有效的，而没有显著的毒性。
这些对MPSI犬的各个研究和对MPSI猫的一个研究，结果显示了重组人α-L-艾杜糖苷酸酶是安全的。这些相同结果也提供了重要的依据该重组酶对治疗α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏是有效的。
实施例3对人有效的重组α-L-艾杜糖苷酸酶治疗α-L-艾杜糖苷酸酶的人cDNA预测了信号肽切割后有653个氨基酸的蛋白质和有70,000道尔顿的预计分子量。氨基酸测序揭示了N-末端的丙氨酸26给出了629个氨基酸的预计蛋白质。人重组α-L-艾杜糖苷酸酶具有成熟蛋白质位置8的组氨酸。该预测的蛋白质序列包含6个可能的N-连接的寡糖修饰位点。所有这些位点在重组蛋白质中被修饰。已显示第三和第六位点含有一个或多个甘露糖6-磷酸残基，它们能引起高亲和性摄入细胞。
该肽相当于人重组α-L-艾杜糖苷酸酶的氨基酸26-45，具有N-末端丙氨酸和下列序列ala-glu-ala-pro-his-leu-val-his-val-asp-ala-ala-arg-ala-leu-trp-pro-leu-arg-arg重组酶由于糖类修饰，在SDS-PAGE上具有82,000道尔顿的表观分子量。已通过UCLA蛋白测序设备对纯化人重组α-L-艾杜糖苷酸酶进行了测序。优选静脉施用重组酶。人重组α-L-艾杜糖苷酸酶以0.05-0.2mg/ml(12,500-50,000单位/mL)的浓度用10mL聚丙烯小瓶供应。酶的最终剂量形式包括人重组α-L-艾杜糖苷酸酶，生理盐水，pH5.8的磷酸盐缓冲液和1mg/ml的人白蛋白。这些可制备在生理盐水袋中。
组分组合物α-L-艾杜糖苷酸酶0.05-0.2mg/mL或12,500-50,000单位/mL氯化钠溶液 Ⅳ袋中150mM，总体积50-250cc磷酸钠缓冲液 10-50mM,pH5.8人白蛋白 1mg/mL在研究中包括了显示MPSI疾病的临床表型，并且白细胞和成纤维细胞中α-L-艾杜糖苷酸酶水平低于正常的1％的病人。所有病人显示粘多糖在内脏和软组织中积聚和不同程度功能损伤的一些临床证据。通过测量尿GAG排泄随时间减少的百分比可确定效果。图3揭示了16个MPSI病人与正常排泄值相比的尿GAG水平。在未治疗的MPSI病人中，尿GAG值范围很广。用重组α-L-艾杜糖苷酸酶治疗后，未降解GAG排泄下降50％以上，是一种测量个体对治疗的反应的有效手段。图4显示了MPSI病人中酶治疗前后白细胞艾杜糖苷酸酶的活性。在图5中描述了酶治疗前后的口腔艾杜糖苷酸酶活性。图6显示了三个病人中肝和脾脏的大大收缩，以及关节和软组织积储的显著临床改善，与重组酶治疗仅8周后未降解GAG大于65％的减少相关。图7显示了用重组酶治疗仅12周后，用重组酶治疗的病人中肝和脾的基本正常化。图8显示了11个病人中用重组酶治疗22周尿GAG排泄的急剧下降。肝和脾大小的临床评估是评估MPSI病人中成功的骨髓移植治疗的最为广泛接受的方法(Hoogerbrugge等，Lancet3451398(1995))。这些测量在MPSI病人中和降低内脏GAG积储高度相关。
虽然本发明已根据现存优选例进行了描述，必须理解的是，可产生各种改变，而不超越本发明精神的范围。因此本发明仅受权利要求限制。
权利要求
1．一种产生α-L-艾杜糖苷酸酶的方法，其特征在于，该方法包含用编码全长α-L-艾杜糖苷酸酶或其生物活性片段或突变体的cDNA转化合适的细胞系。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，合适的细胞系是中国仓鼠卵巢细胞系2.131。
3．如权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法中的中国仓鼠卵巢细胞分泌比引入编码全长α-L-艾杜糖苷酸酶、或其生物活性片段的cDNA之前分泌的α-L-艾杜糖苷酸酶大约多5,000到7,000倍的α-L-艾杜糖苷酸酶。
4．如权利要求1所述的方法，其特征在于，转染细胞生长在微载体上。
5．如权利要求1所述的方法，其特征在于，将培养系统优化成使产生过程中的培养pH降低到大约6.7-6.8。
6．如权利要求1所述的方法，其特征在于，培养系统生长培养基的大约2/3到3/4约每12小时更换一次。
7．如权利要求1所述的方法，其特征在于，将培养系统氧饱和度优化到大约80％。
8．如权利要求7所述的方法，其特征在于，用间歇纯氧喷雾法将培养系统氧饱和度优化到大约80％。
9．如权利要求1所述的方法，其特征在于，用最初含大约10％血清的微载体来产生用于培养系统的大量细胞。
10．如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包含冲洗转移到用于生产的无蛋白质培养基上。
11．如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用了包含JRH BiosciencesPF-CHO生长培养基的培养系统。
12．如权利要求11所述的方法，其特征在于，优化所述生长培养基为包括补充量的一种或多种选自谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、核糖核苷和脱氧核糖核苷的成分。
13．如权利要求1所述的方法，其特征在于，用灌流棒进行分批加料过程。
14．如权利要求1所述的方法，其特征在于，将丁酸钠加到培养系统中。
15．有产生α-L-艾杜糖苷酸酶能力的转染细胞系。
16．如权利要求15所述的转染细胞系，其特征在于，转染细胞系是一种重组中国仓鼠卵巢细胞系。
17．如权利要求15所述的转染细胞系，其特征在于，该转染细胞系是重组中国仓鼠卵巢2.131细胞系。
18．如权利要求15所述的转染细胞系，其特征在于，该转染细胞系含有至少10个包含CMV启动子、Cα内含子、α-L-艾杜糖苷酸酶cDNA，和牛生长激素聚腺苷酸化序列的表达构建物拷贝。
19．如权利要求15所述的转染细胞系，其特征在于，该转染细胞系表达量至少每天每107细胞表达大约20-40微克的α-L-艾杜糖苷酸酶。
20．一种适应在转染细胞中产生人α-L-艾杜糖苷酸酶的载体。
21．如权利要求20所述的载体，其特征在于，该载体适应在中国仓鼠卵巢细胞CHO中产生人α-L-艾杜糖苷酸酶。
22．如权利要求20所述的载体，其特征在于，该载体包含一个CMV立即早期基因启动子/增强子。
23．如权利要求20所述的载体，其特征在于，该载体包含巨细胞病毒启动子/增强子元件，由外显子2和3之间的鼠Ca内含子构成的5′内含子，编码全长α-L-艾杜糖苷酸酶或其生物活性片段的cDNA和3′牛生长激素聚腺苷酸化位点。
24．一种根据权利要求1所述的方法产生的重组α-L-艾杜糖苷酸酶。
25．一种根据权利要求1所述的方法产生的α-L-艾杜糖苷酸酶，其特征在于，该酶具有至少大约每毫克200,000单位比活力。
26．如权利要求25所述的α-L-半乳糖苷酶，其特征在于，该酶具有至少大约每毫克240,000单位的比活力。
27．一种纯化α-L-艾杜糖苷酸酶的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤(a)进行浓缩/渗滤程序来从样品中除去一种或多种不要的化合物；(b)酸化步骤(a)的样品；(c)使步骤(b)的样品从肝素柱上流过；(d)使步骤(c)的样品从苯基柱上流过；(e)使步骤(d)的样品从Sephacryl柱上流过；和(f)使基本纯化的α-L-艾杜糖苷酸酶流过。
28．一种治疗全部或部分由α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏引起的疾病的方法，其特征在于，该方法包含施用重组α-L-艾杜糖苷酸酶的步骤。
29．一种治疗全部或部分由α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏引起的人疾病的方法，其特征在于，该方法包含施用重组人α-L-艾杜糖苷酸酶的步骤。
30．如权利要求28所述的方法，其特征在于，该疾病是粘多糖代谢病。
31．如权利要求28所述的方法，其特征在于，该疾病是MPSI。
32．如权利要求28所述的方法，其特征在于，该疾病选自Hurler病、Scheie综合征和Hurler-Scheie综合征。
33．如权利要求28所述的方法，其特征在于，患该疾病的病人的α-L-艾杜糖苷酸酶活性为正常活性的大约1％或更低。
34．如权利要求28所述的方法，其特征在于，至少约25,000单位或0.1mg/kg重组α-L-艾杜糖苷酸酶每周一次被施用给患其缺乏症的病人。
35．如权利要求28所述的方法，其特征在于，至少约125,000单位或0.5mg/kg重组α-L一艾杜糖苷酸酶每周一次被施用给患其缺乏症的病人。
36．一种药物组合物，其特征在于，该组合物包含重组α-L-艾杜糖苷 酸酶和药物学上可接受的载体。
37．如权利要求36所述的药物组合物，其特征在于，该组合物还包含氯化钠溶液、缓冲液和人白蛋白。
38．如权利要求36所述的药物组合物，其特征在于，该重组α-L-艾杜糖苷酸酶以浓度大约为0.05到0.20mg/mL或每毫升大约12,500到大约50,000单位存在。
39．如权利要求36所述的药物组合物，其特征在于，所述人白蛋白以至少大约1mg/mL的浓度存在。
40．如权利要求36所述的药物组合物，其特征在于，所述缓冲液是浓度为大约10-50mM的磷酸钠缓冲液。
41．如权利要求36所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的pH维持在大约5.8。
全文摘要
本发明提供了一种重组α－L－艾杜糖苷酸酶及其生物活性片段和突变体,产生和纯化该酶的方法以及治疗包含α－L－艾杜糖苷酸酶缺乏和粘多糖代谢病Ⅰ(MPSⅠ)等一些遗传病的方法。
文档编号A61K48/00GK1300323SQ9980606
公开日2001年6月20日 申请日期1999年5月7日 优先权日1998年5月13日
发明者E·D·卡基斯, B·塔纳马奇 申请人:加州大学洛杉矶分校港口研究和教育院