专利名称：血红蛋白－多糖缀合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为全血的增补剂或部分替代物给患者施用的生物相容性氧载体。更具体地说，本发明涉及作为血液替代物或增补剂给哺乳动物施用的、基于血红蛋白的氧载体(HBOCs)，以及它们的制备方法。
作为血液的天然氧转运蛋白组分的血红蛋白是构成血液替代物的主要成分的显而易见的候选物(例如作为水溶液)。已开展了并报导了大量科研工作，试图提供起血液替代物作用的、令人满意的血红蛋白溶液。然而，红细胞外的血红蛋白的化学性质明显不同于红细胞内它的性质(例如，关于它的氧亲和性)。人们早就认识到需要血红蛋白的某种形式化学修饰从而使它适用作血液替代物，并已进行了很广泛的研究。
人们熟知，血红蛋白包含四个亚单位的四聚体，该四个亚单位即是两个α亚单位(各具有一条珠蛋白肽链)和两个β亚单位(各具有一条珠蛋白肽链)。该四聚体具有约64千道尔顿的分子量，并且每个亚单位具有大致相同的分子量。处于稀水溶液中的四聚血红蛋白容易解离成α-β二聚体，在某些条件下甚至解离成α亚单位单体和β亚单位单体。所述二聚体和单体分子量太低而不能保留在身体的循环系统中，于是，通过肾过滤后与尿一起排泄。这就导致这种产品在体内不可接受地短的半寿命。以前已认识到所述亚单位之间的化学键合对于保障维持所述四聚形式的益处(“分子内交联”)。此外，还认为两个或多个四聚单元一起连接形成分子量大于64千道尔顿的血红蛋白低聚物和聚合物(“分子间交联”)在很多情况下是所需的。
因此，一种开发供临床用的HBOCs的方法是分子内交联血红蛋白单元成分子量约为64千道尔顿的稳定化四聚体，以及任选通过分子间交联使这些四聚体低聚成2～6个这种四聚体的低聚物。已提出了用于该目的的多种交联剂，包括氧化开环的糖类，例如o-棉子糖(例如，授予Hsia的美国专利4,857,636和授予Pliura等的美国专利5,532,352)，双官能二酰亚胺化物，例如二乙基-丙二酰亚胺盐酸盐(授予Muzur的美国专利3,925,344)，氢化三嗪，二乙烯基砜，二异氰酸酯，戊二醛和其它二醛(授予Bonsen等的美国专利4,001,200)，双琥珀酰水杨酸酯(授予Tye的美国专利5,529,719)，二-和三-酰基的磷酸酯(授予Kluger等的美国专利5,250,665)及其它物质。
另一种制备供临床用的、具有适当分子量的HBOCs的方法是将血红蛋白与生物相容性多糖偶联。与交联的低聚血红蛋白相比，这样的缀合物应具有这一优点，即，每个HBOC单元要求更少量的血红蛋白，所以，在制备方面应当更经济，而且具有减小的血红蛋白相关的毒性。在制备HBOC时，胶体与血红蛋白的结合还能通过调节胶体的尺寸、它的修饰程度和胶体与血红蛋白的比率而控制流体性质(例如粘度和胶体渗透压)。这些相同的参数可被用于控制产品的最终分子量和血管滞留时间。
美国专利4,064,118(Wong)提出了血液替代物或血液增量剂的制备，即，通过将血红蛋白与选自葡聚糖和分子量约为5kDa～2,000kDa的羟乙基淀粉的多糖物质化学缀合。但是，该专利中只举例了葡聚糖的应用。
Baldwin等，“四面体”(“Tetrahedron”)37.pp1723～1726(1981)“聚合物结合的血红蛋白样品的合成”描述了从葡聚糖和羟乙基淀粉(HES)的化学修饰而生成醛取代的聚合物，以及它们接着与血红蛋白反应，生成可溶性的、聚合物结合的血红蛋白。尽管这样生成的产物能结合氧，据报导，它们不适用作血液替代物，因为它们的氧结合曲线显著地左移，表明它们具有太高的氧亲和性(P50太低)。
本发明的一个目的是提供一种新的HBOC。
本发明的另一个目的是提供一种适用作HBOC的新型多糖-血红蛋白缀合物。
本发明的又一个目的是提供一种制备适用作HBOC的新型多糖-血红蛋白缀合物的方法。
在本发明的方法中，应用了呈氧化开环形式的多糖。在该氧化形式中，至少一部分糖单体单元被氧化而生成醛基。然后，将这样形成的氧化多糖与胞外血红蛋白反应，于是，该血红蛋白，通过珠蛋白链的伯氨基与氧化多糖的醛基反应，通过席夫碱键与所述多糖共价结合。最初很迅速地生成一种产物，它包含较大量的、宽分子量分布(128～＞500kDa)的很高分子量物质(大约500kDa或更高)。
在将该产物于适当条件下的水溶液中保存时，它可被以可控的程度在较短时间内(例如4～48小时，根据条件而定)转化成分子量分布窄得多、分子量低得多的产物(90～200kDa)。该产物在化学还原而使血红蛋白与多糖之间的席夫碱键还原成仲胺键之后，结果具有这样的性质例如，在37℃下，氧亲和性在P50=4～50mmHg的范围内(根据缀合时血红蛋白的配体状态而定)，这使它特别适合作为基于血红蛋白的氧载体的候选物供临床用于哺乳动物。转化程度可通过对应用的还原步骤定时而控制。此外，生成的产物不含可检测的未反应血红蛋白(如果存在的话，它会解离而给出估计引起肾损伤的αβ-二聚体)，而且不含可检测量的过高分子量产物(高于约500～600kDa)。
所以，按本发明的第一方面，提供了一种多糖-血红蛋白缀合物，它适用作基于血红蛋白的氧载体，在37℃下具有的氧亲和性(以需要保持50％氧饱和度的氧环境分压表示)为P50=4～50mmHg，并且不含可检测的残余未结合的血红蛋白和不含可检测残余量的、分子量高于约500kDa的组分，所述缀合物是这样制备的将血红蛋白与氧化多糖反应而生成高分子量的缀合复合体，通过在适当pH值(容易通过简单的常规实验确定)和2℃～约45℃的温度的溶液中贮存使该高分子量的缀合复合体降解，从而生成所述多糖-血红蛋白缀合物。
本发明的进一步方面提供了一种适用作氧转运蛋白的多糖-血红蛋白缀合物，它包含的血红蛋白通过该血红蛋白上氨基的仲胺键与多糖上的醛基残基以共价键连接，所述醛基是通过所述多糖的糖单体单元氧化开环而形成的。
按另一方面，本发明提供了一种制备基于血红蛋白的氧载体的方法，该方法包括将携带醛基的氧化开环的多糖与血红蛋白反应而生成其席夫碱连接的缀合物，让该缀合物在引起该缀合物分子量减小的条件下放置，通过将席夫碱键还原成稳定的仲胺键而稳定该缀合物，然后回收这样生成的多糖-血红蛋白缀合物的溶液，它不含可检测的未结合血红蛋白残余物而且不含可检测的分子量大于约500～600kDa的产物残余物。
图1、2和3是下文实施例2的产物的色谱图；图4是下文实施例3的产物的大小排阻色谱分析；图5是下文实施例6的产物的一组类似色谱图；以及图6是下文实施例7的产物的一组类似色谱图。
图7和8是下文实施例8的产物的类似色谱图组。
图9是阐述下文实施例10的结果的一组类似色谱图。
图10、11和12是下文实施例11的产物的类似色谱图组。
本申请中描述的表观分子量是通过与已知分子量的o-棉子糖聚合血红蛋白(polyOR-Hb)标准物的大小排阻色谱洗脱时间比较而得出的。因为估计血红蛋白-胶体缀合物在伸展的胶体链组分中包含较大量截留的水，所以，只包含与血红蛋白以共价键连接的分子的缀合物实际分子量小于所述表观分子量。但是，正是表观分子量或排除体积才能描述所述缀合物的体内保留时间，所以，将应用上面描述的分子量来描述本文报导的缀合物。
用于本发明方法中的血红蛋白优选是人血红蛋白(得自红细胞)。不过，本发明也适合构成血液替代物基础的其它类的血红蛋白，例如动物血红蛋白，尤其是牛血红蛋白，以及猪血红蛋白等。人血红蛋白目前是优选的选择，从而形成给人患者施用的血液替代物的基础。
可按标准的已知方法回收和制备血红蛋白而应用于本发明。例如，将红细胞溶解，通过标准的离心、过滤等技术从其中除去细胞碎屑和基质。优选地，应用浓度为2～20wt％血红蛋白的血红蛋白溶液，生成一种具有最需要的组成和组合性能的产物。最后纯化可以合适地用色谱法进行。有益地应用描述于美国专利5,439,591(Pliura等)中的顶替色谱法。
血红蛋白可能以紧密(T)形态(一般通过去氧血红蛋白表现)或者以松弛(R)形态(一般通过氧合血红蛋白或一氧化碳血红蛋白表现)天然存在。呈T状态的血红蛋白的氧结合特性是更需要的特性，因为该形态中血红蛋白的氧亲和性允许肺维管结构中有效的氧结合和外周组织中的氧卸载荷。所以，在本发明的方法中，优选应用去氧血红蛋白。在缀合到预先交联或未交联的羟乙基淀粉(HES)上之后，去氧血红蛋白保持T构型的氧结合特性。但是，如果因任何理由选择从R构型血红蛋白开始，本发明优选的方法是在全过程中稳定血红蛋白在R构型。R状态的和T状态的血红蛋白混合物能与HES反应而获得氧结合特性处于R状态构型和T状态构型之间的产物。
血红蛋白生成去氧血红蛋白的去氧作用优选是通过用非氧化性气体(例如氮)按已知技术处理血红蛋白溶液而进行的。优选用氮气流继续处理，接着进行适当的脱气达足够长的时间，这样，实现至去氧血红蛋白的完全转化。
适用于本发明的多糖包括那些，即具有确定的生物相容性，并且具有能氧化开环而生成反应性醛基的糖单体单元。它们包括淀粉和淀粉衍生物、葡聚糖、菊粉等。在应用于本发明的多糖中，优选的是羟乙基淀粉和葡聚糖，以HES为最优选的。
所述血红蛋白能与呈如下形式的氧化羟乙基淀粉反应呈其天然的未交联形式，或者呈其交联的、64kDa四聚稳定化形式，或者呈其交联的、包含64～＜500kDa加合物的低聚形式。当呈其交联的形式应用时，制备交联的和交联低聚的血红蛋白的优选的交联剂是从寡糖[例如棉子糖(即o-棉子糖)]氧化开环而得的多醛。一种制备o-棉子糖的合适的方法和关于它与血红蛋白的反应被描述于上述美国专利5,532,352(Pliura等)，它的公开内容并入本文作参考。虽然o-棉子糖是应用于本发明该实施方案中的优选的交联剂，但决不是仅限于它。可以令人满意地应用任何其它已知的Hb交联剂，例如前述的那些，诸如描述于美国专利5,250,665(Kluger等)中的磷酸三甲磺酰甲酯[trimesoylmethyl phosphate(TMMP)]。
应用于本发明优选的实施方案中的羟乙基淀粉原料适当地具有约70～约1000kDa的分子量。它是以种种型号和品种可商购的。应用于本发明的型号和品种不是关键性的。事实上，任何目前可商购的HES品种都可被用作原料，只要它们具有大致如前面提出的分子量即可。具有约0.5～0.7的取代比(即羟乙基比葡萄糖单元的值)的那些是特别合适的。
要制备应用于本发明的HES，将它氧化以便在其上生成大量醛基。这可通过各种氧化方法实施，优选的一种是与高碘酸盐(钠或钾)反应。该反应可这样进行在低温(例如0～5℃)下的水溶液中，应用适当量的高碘酸钠(根据所需的氧化度选择)。反应是在约1～4小时内完成的。可应用超滤或渗析除去不需要的低分子量盐和HES组分，于是提供一种控制要与Hb缀合的氧化HES的分子量范围的方法。该氧化HES可被直接用于或者在适当地回收(例如通过冻干)后重溶于水而用于同血红蛋白缀合。
缀合反应适当地在水溶液中进行。所述血红蛋白可以任选是交联的Hb和/或低聚的Hb。可将它例如与一氧化碳连接(CO-Hb)。终产物中更低的P50值是用CO-Hb获得的，更高的值是用去氧Hb获得的。Hb氧化HES的摩尔比可在约0.25∶1～5∶1的任何范围内变化，但优选在0.5∶1～3∶1的大致范围内。反应最好在碱性pH(例如7.5～9.0范围内)和在室温下进行。
根据分析发现，初始(例如约1小时后)生成的反应产物具有很高的分子量，得到分子量很可能超过500kDa的组分，不论起始多糖的分子量是多少。该初始产物还包含宽范围分子量的产物。我们能通过将产物保持在水溶液中[优选在7.2～10的大致pH范围内和在或接近室温(15℃～30℃)时]达至多约48小时的时间而实现产物分子量的受控制减小，获得不含分子量高于约500,000的组分的产物，而且获得窄分子量分布(例如，包含主要为100～200kDa分子量的物质)的产物。只有很少(如果存在的话)残余32kDa物质。32kDa物质的量太少以致不需专门的步骤来除去它。
这样生成的缀合物必须通过将Hb和HES之间(可逆的)席夫碱键还原成稳定的仲胺键和通过还原任何未反应的醛基而得以稳定。可在一步中(其中，席夫碱键和醛基一步被还原)或者分两步完成该还原。强还原剂将在一步还原中生效，弱些的还原剂需要两步操作。
该还原步骤优选被用作控制最终产物的分子量和分子量分布的方法(通过其适当的定时)。一旦完成了还原，产物就得以稳定，在贮存时不会出现分子量或分子量分布的任何显著的进一步变化。因此，每隔一段时间分析反应产物样品就能对还原步骤定时而将产物稳定在选定的特性。
硼烷二甲胺是作为还原剂的优选的选择。这是一种足以在一步完成两个还原反应的强还原剂。还可应用其它水溶性硼烷低级烷基胺还原剂，这些还原剂包括但不限于硼烷-叔丁胺，硼烷-氨；硼烷-二甲胺；硼烷-三甲胺；硼烷-三乙胺；以及吡啶硼烷。其它适用的还原剂是氰基硼氢钠和硼氢化钠。
在缀合中生成的席夫碱的还原以及任何残余的未反应醛基的还原最适合在2～25℃的温度范围内的水溶液中进行达10～36小时(优选24小时)的一段时间。反应混合物适当地被缓冲至pH7～10，优选至8.0～9.5。还原剂对亚氨基和醛基总量的摩尔比在1∶1～5∶1的范围内，优选在1.5∶1～3.5∶1的范围内，它基于还原剂对被添加而引发交联的醛基的化学计量。
优选应用最后的一步渗滤来除去残余的低分子量产物，例如淀粉降解残余物、二甲氨基硼烷残余物、盐、缓冲剂残余物等。然后，可将产物与合适的赋形剂混合而形成HBOC。
这样制备的缀合物突出地表现出用作HBOC的主要成分的合适的性能。它表现低氧亲和性(P50=20～50mmHg)以及产物的窄分子量分布(MWD100～200kDa)，在促进解离成αβ-二聚体的条件下不含可检测的、m.wt.为32kDa的产物或m.wt.高于约500kDa的产物。
至于在应用前贮存，从产物除去全部氧以防自动氧化是适宜的。脱氧产物可在防止氧的引入的条件下(或者冷冻或者在更高温度下)贮存。可在施用前引入氧，或者可让产物在体内获得氧。所述一氧化碳形式可以类似方式贮存并在应用前氧合。该产物可以氧合形式被冷冻贮存或者在更高温度下贮存直至认为自动氧化度是不可接受的。
只是为了阐述起见在下列具体的非限制性实施例中进一步描述了本发明。实施例1-氧化羟乙基淀粉的制备将9.0g重均分子量(MW)为450kDa、羟乙基取代度为0.7的羟乙基淀粉溶于90mL水。将0.49、0.98和1.96g偏高碘酸钠[分别代表0.3、0.6和1.2eq高碘酸盐/mol(HES中存在的邻二醇)]加到单独的30mL该溶液等份样中。这些量足以提供存在的二醇基大约30％、60％和100％的氧化。在4℃的暗处反应4小时后，应用15kDa分子量截止膜(cutoff membrane)对冷却水充分透析该溶液。将最后的滞留物冻干成白色粉末并在室温下贮存。也可将透析后的氧化HES溶液直接用于Hb的缀合。按类似方法氧化和制备MW为200kDa、取代度为0.5的HES。还通过直接氧化用0.9％NaCl配制的HES而制备氧化HES。对高碘酸盐消耗量和最终醛含量的测定结果表明应用的高碘酸盐范围导致部分至完全氧化全部存在的二醇基，而且，氧化度容易通过改变应用的高碘酸盐量而控制。实施例2-含各种氧化HES和CO-血红蛋白的缀合物的制备研究了CO-Hb与不同相对比率的氧化HES(HES-CHO)的反应。基于HES的预期邻二醇含量计算了高碘酸盐的氧化当量。在一种情况下，将0.54g氧化的450kDa HES(应用1.2eq高碘酸盐按实施例1中所述制备的)溶于3.0mL 100mM HEPES缓冲剂(pH8.1)。将该HES-CHO溶液按如下比例加到一氧化碳处理后的血红蛋白(COHb,200mg/mL于水中)中0.76mL HES-CHO∶0.041mL COHb,0.73∶0.078和0.61∶0.195,给出最终Hb浓度分别约为10、20和50mg/mL。使反应在22～25℃和在pH8时进行，在不同时间取样用于MW测定，即，应用PharmaciaSuperdex 200柱(1×30cm)，用0.5M MgCl2+25mM Tris(pH7.2)以0.4mL/min洗脱。在所有三个HES∶COHb比率下，在前几小时内，Hb被完全修饰，所给出物质的洗脱时间比得上polyHb对比物[MW大于128kDa并达到高于柱的排阻限(＞500 kDa polyHb)的范围]。附图1示出了得自0.5∶1 Hb∶HES产物(50mg Hb/ml)的色谱图[在不同时间记录的，与poly Hb对比物(底部曲线)比较]。垂直的虚线表示32kDa未修饰的α-β二聚体的洗脱时间。在洗脱级分中跟踪血红蛋白在414nm处特征性的吸光度。在下一个30小时中，产物的洗脱时间减小而给出洗脱时间比得上MW为128kDa的poly Hb对比物的物质，未检测到未修饰Hb，也没有超出柱的排阻限的物质。MW演变的模式和终产品MW范围在所有三个HES∶Hb比率下都相似，如同用0.6eq高碘酸盐氧化的HES一样。应用0.3eq高碘酸盐/二醇氧化的HES制备的缀合物通常明显包含与未修饰的a-b二聚体共同洗脱的物质。所以，更高的氧化度是产生不含未修饰二聚体的缀合物所优选的。
当应用更少的Hb时，在前数小时中生成的缀合物的平均MW更低。应用如实施例1中所述的氧化200kDa HES获得了相似的反应和结果。当应用450kDa HES时，与200kDa HES相比，终产品的平均MW更高。附图2示出了在所示的不同氧化度下，HES200/0.5(虚线)和HES450/0.7(实线)的Hb+HES-CHO的终产物的色谱图(都以1∶1的Hb∶HES-CHO比率)。
在缀合早期，应用高碘酸盐氧化的70kDa HES(0.3、0.6和1.2eq高碘酸盐比计算的二醇)获得的Hb-HES缀合物也生成更高MW物质，接着转化成更低MW(图3)。早期缀合物的平均MW以及转化成更低MW物质所需的时间依赖于HES 70的氧化度。缀合48小时后，一些物质与polyOR-Hb对比物的32kDa未修饰Hb组分共洗脱，这些物质残留于得自最低HES氧化度
的缀合物中。在应用最高度氧化的HES 70[1.2eq高碘酸盐/计算的二醇]反应48小时后，在分析柱排阻限洗脱的显著量的物质保留了。在应用0.6eq高碘酸盐/计算的二醇氧化的HES反应48小时内，获得了不含未修饰的血红蛋白和在柱排阻限洗脱的物质的产品。实施例3同时大规模制备高MW和低MW的Hb-HES缀合物从单一反应制备了不同MW的Hb-HES缀合物，其中，分离并稳定了一部分具有高MW的早期缀合产物，使余下的缀合产物在稳定化之前转化成更低MW产物。比较了这两种产物的物理性质和体内特性以便能阐明一种比另一种更有益的性能。
将944g HES(200kDa，取代度=0.5)溶于8L WFI中，冷却到4℃，然后添加370g NaIO4，在暗处搅拌混合物达5.3小时。全部NaIO4在不到1小时内溶解。将混合物过滤(0.2um)，再应用30kDa再生纤维素膜对12体积室温WFI(注射用水)渗滤。然后，通过中空纤维膜与N2接触而脱氧。冻干的样品指示最终浓度为128mg HES-CHO/mL。将1.2L COHb(23.2g/dL于WFI中)与2.0L 200mM HEPES(pH8.1)缓冲剂合并，再通过中空纤维膜先后与O2和N2接触而充氧和脱氧。将4.5kgHES-CHO溶液(128g/L)与脱氧的Hb(3.2L,9.0g/dL)合并，将混合物在脱氧条件下保存。通过大小排阻色谱法监测生成的缀合物的MWD。
缀合3小时后，将反应物体积的一半在N2中转移到分离器，添加溶于1.7L WFI中的56mL 3M NaOAc和196g DMB。最终DMB初始醛的比率是1.5∶1。在充入CO和渗滤之前将混合物在室温下的N2中保存23小时。在引发Hb-HES缀合反应29小时后，类似地用NaOAc和DMB处理另一半混合物达17.5小时。然后，将两种DMB还原的反应物充CO，先后对WFI和林格乳酸盐(Ringer’s lactate)(每种溶液各为约10体积)渗滤。用0.1N HCl调节pH至7.5～7.6。浓缩这两种溶液以致胶体渗透压为80～100mmHg。对产品充氧，移取约四分之三用于无菌过滤并以氧形式包装。将每种余下的量脱氧并以脱氧形式包装。将充氧的产品在-80℃下贮存，脱氧的产品在4℃下贮存。通过还原早期缀合产物而获得的更高MW的产品在下文被称为HIMW HES-Hb。通过还原晚期缀合产物而获得的更低MW的产品在下文被称为LOMWHES-Hb。通过大小排阻色谱法估测的MW分布示于图4中。在4℃或-80℃下贮存的四个月中，MW分布未改变。
在对两种产品测试的不同浓度下，HIMW HES-Hb的胶体渗透压(COP)始终高于LOMW HES-Hb(表1)。关于HIMW HES-Hb和LOMW HES-Hb，在6.5和9.0gHb/dL时的粘度分别为8.9和3.0cSt。HIMW HES-Hb，它在MW分布方面比得上其他人制备的HES-Hb缀合物和葡聚糖-Hb缀合物，因而具有这样的胶体性质，即，有望在血流性质和流变性质方面导致比LOMW HES-Hb更大的变化。更高MW HES血浆组分对流变因子(例如粘度和红细胞叠积)和对血液凝固的有害影响已被描述了[Trei等，血栓形成和止血(Thrombosis and Haemostasis)74:1452～6(1995)]。表1关于HIMW和LOMW HES-Hb的COP的浓度依赖性
实施例4-配体状态对最终P50的效果通过先后暴露于氧和氮中而分别对COHb(55mg/mL于水中)充氧和脱氧。按实施例1中所述那样应用0.6eq高碘酸盐氧化200kDaHES，用100mM HEPES(pH8.1)配制成60mg/mL，脱气后用氮吹洗。将2.5mL该氧化的HES溶液加到0.8mL脱氧的Hb溶液中，提供1eq Hb/mol初始未氧化的200kDa HES。在22～25℃的氮气氛中48小时后，将反应混合物在乙酸钠中配成0.3M，然后添加3eq二甲胺硼烷/mol初始醛。24小时后，在溶液中充入CO气体，对乳酸化林格溶液充分透析。进行了类似操作其中，将没有除去CO配体的COHb与应用0.6eq高碘酸盐氧化的200kDa HES反应。应用Hemox-Analyzer(TCSInstruments,Southhampton,Pennsylvania,U.S.A.)在37℃下测定两种产物的氧结合特性。脱氧Hb的缀合导致最终P50为26mmHg。COHb的缀合导致最终P50为4mmHg。两种产物都是非协同的。实施例5-交联血红蛋白的应用按实施例1中所述那样应用0.3eq和0.6eq高碘酸盐在独立的反应中氧化200kDa HES，用270mM碳酸氢钠(pH8.1)配制成125mg/mL。将3.0mL各氧化的HES溶液加到独立的1.0mL三甲磺酰三(磷酸甲酯)(TMMP)交联的Hb[64kDa交联的Hb，美国专利5,250,665(Kluger等)，125mg/mL于水中]的等份液中，同样加到1.0mL o-棉子糖聚合的Hb[64～＜500kDa Hb聚合物，美国专利5,532,352(Pliura等)，117mg/mL]的等份液中，共计四个反应，所有情况都提供1eq Hb/mol初始未氧化的200kDa HES。两种血红蛋白产物都呈CO形式。在22～25℃的CO气氛中反应30小时后，添加乙酸钠至0.3M的最终浓度。然后添加3eq二甲胺硼烷/mol初始的醛。24小时后，将反应物对水透析(10kDa MWCO)，再对乳酸化林格溶液(pH7.4)透析。然后应用Hemox-Analyzer在37℃下记录氧结合特性。
全部Hbs的MW分布都向更高的值偏移。应用Hb和TMMP交联的Hb，有可能修饰全部起始Hb并且在48hr小时内未检测到空体积物质(Superose 12，解离条件)。PolyOR-Hb缀合物含有显著的空体积物质。P50s(37℃)是HES+CO-TM-Hb,5～7mmHg；HES+CO-polyOR-Hb,5～7mmHg。全部产物都是非协同的。实施例6-反应时间和温度的变化对小规模样品研究了更短的反应时间和更低的温度(12比22℃)对Hb-HES MWD的影响。应用了200kDa和450kDa HES的氧化形式。
应用了脱氧Hb。通过先后暴露于氧和氮将COHb[50mg/mL于75mMHEPES缓冲剂(pH8.1)中]分别进行充氧和脱氧。将氧化HES(得自分别应用0.6或1.2eq高碘酸盐/mol邻二醇的200或450kDa HES)溶于100mM HEPES缓冲剂(pH8.1)中至最终浓度为60mg/mL，接着将溶液脱气和用氮吹洗。将0.253mL Hb与1.6mL氧化200kDa HES溶液合并，再将0.498mL Hb与1.4mL氧化450kDa HES溶液合并，在两种情况下提供1eq Hb/mol初始未氧化的200kDa或450kDa HES。使这些溶液在22℃的氮气氛中反应，再配制相同的溶液，使它们在12℃下反应。如实施例2中所述那样在不同时间点测定MWD。色谱图示于图5。
在22℃下，两种氧化HES的最终MWD都更窄，并且两个温度下反应时间越长则最终MWD更窄。450kDa HES产品的平均MW(实线)大于200kDa衍生物(虚线)，在更低温度下的MW差异更大。在更低温度下反应进行更慢，导致更大平均MW和更宽分子量范围(与更高温度下的类似反应时间相比)。实施例7-放大试验将氧化HES与脱氧Hb的缀合放大供体内评估。
用100mM HEPES缓冲剂(pH8.1)将COHb配成125mg/mL，通过应用中空纤维气体交换器先后与氧和氮接触使它不含配体。将47g氧化200kDa HES(如实施例1中那样应用0.6eq高碘酸盐制备的)溶于280mL 100mM HEPES缓冲剂(pH8.1)，然后脱气和用氮吹洗。再将氧化HES溶液加到脱氧Hb中，保持在22～25℃的氮气氛中，定期检测MWD。在16小时内，全部Hb被修饰了，并且在柱的排阻限没有洗脱产品(图6)。最低的曲线(为了比较而给出的)得自用氧化开环的棉子糖交联的Hb(polyOR-Hb)。用乙酸钠将反应物配成0.4M，添加36g二甲胺硼烷[代表大约3eq硼烷/mol初始的醛]。21小时后，对反应混合物充氧，对乳酸化林格溶液渗滤(10kDa MWCO)并调节到pH7.4。产品具有P50(37℃)=26mmHg而且是非协同的。大小排阻色谱流出液的小角激光光散射分析指示MW为90～210kDa。未检测到游离醛。
体内半寿命分析表明Hb-HES产品能长期保存。将一定体积的该产品(用乳酸化林格溶液调节到3.0g Hb/dL，相当于总血液体积的10％)注入清醒的大鼠并测定血管保留时间。半寿命是6.0小时，与关于等体积polyOR-Hb(用乳酸化林格溶液调节到10.0g/dL)测定的5.1小时相比。实施例8Hb与氧化葡聚糖的缀合和向更低MW的转化应用0.45eq或1.36eq高碘酸盐/二醇(2个二醇/葡聚糖链单体)制备了两种氧化葡聚糖。用2.39g或7.18g高碘酸钠(分别为0.45和1.36eq)处理溶于40mL 4℃水的2.0g葡聚糖(260kDa)溶液。在4℃的暗处搅拌4小时后，将溶液透析(10kDa MW截止)并冻干成白色粉末。将50mg氧化葡聚糖[于1mL 80mM HEPES缓冲剂(pH8.1)中]与0.062mL COHb(200mg/mL)合并，通过大小排阻色谱法在解离、非变性条件
下监测该缀合反应。结果示于图7[关于用0.45当量高碘酸盐/二醇氧化的葡聚糖的产品]，以及图8[关于1.36当量高碘酸盐/二醇的试验]。两个反应表明了初始形成主要在柱排阻体积中洗脱的高MW物质。得自高度氧化的葡聚糖的缀合物比应用更低程度氧化的葡聚糖时被更迅速地转化成低MW物质。关于polyOR-Hb对比物和高度氧化的葡聚糖缀合物MW曲线的相似性(后者总体更高的MW除外)启示，该缀合物由聚合的、交联的Hb物质(它们被多糖片段修饰了)构成。该构型形式还启示了在某些条件下获得的氧化HES缀合物(图3)。实施例9LOMW和HIMW Hb-HES缀合物的血浆半寿命使雄性Sprague Dawley大鼠适应环境达一周(自由获取食物和自来水)。在试验日，用Ketaset(盐酸氯胺酮，60mg/kg，肌内)和Atravet(马来酸乙酰丙嗪，2.0mg/kg，肌内)麻醉大鼠。应用与填充了肝素-盐水溶液(50USP单位肝素/mL)的PE50导管连接的2.5～3.5cm PE1O导管在右股动脉和静脉插管。将2～3.5cm PE1O经过股动脉插入下腹主动脉和经过股静脉插入大静脉。将两条插管皮下进入后颈并外置。在该外科手术结束时，应用手术缝线缝合手术部位。在操作结束时，两条插管都被填充肝素-盐水溶液(500 USP单位肝素/mL)。然后，给动物配备啮齿类动物粘连安全带和小型输送转盘，将动物单独地放入代谢笼中。手术0.5～1.5小时后使动物复原并且在整个试验期间使动物居留在代谢笼中。在恢复期后，将静脉插管与自动输注泵连接。给清醒的动物输注对比溶液(10g/dL polyOR-Hb于乳酸化林格溶液中，以及在血浆中稀释同样物质至4g/dL)或试验产品[实施例2的产品，低分子量(LOMW)HES-Hb和高分子量(HIMW)HES-Hb,5.0和3.5g Hb/dL于乳酸化林格溶液中]，分别相当于10％的总血液体积，以0.2mL/min送递。在输注结束后20分钟(时间=输注后0.33小时)和在时间=1、3、6、10、22、28和34小时采集血样。通过离心分离血浆并在-80℃贮存直至通过大小排阻色谱法分析。从在414nm处记录的已校正背景的吸光度计算总的血红蛋白，对采集血液的时间描点，血浆半寿命是从单指数拟合导出的。关于4和10g/dL polyOR-Hb，以及LOMW HES-Hb和HIMW HES-Hb溶液的血浆半寿命分别是5.1、5.5、8.9和15.6小时。
与从实施例7的产品(它具有与LOMW类似的分子量分布)获得的半寿命相比时，从有限的试验数据表明后一种产品(它得自更高度氧化的HES)获得了更长的半寿命。实施例10Hb-HES在血浆中的体外稳定性用大鼠血浆将实施例6中制备的Hb-HES稀释10倍，在37℃下保温，模拟5～10％(vol/vol)最大负荷施药。通过大小排阻色谱法在解离的、非变性条件
下，在49小时中分析该混合物。结果示于图9。在该时间内未检测到低分子量物质(产品降解的象征)。在保温的第一小时内出现了高分子量物质(在分析柱的排阻限洗脱的)。这些物质相应于修饰血红蛋白和大鼠触珠蛋白的高分子量复合物，与应用数种其它在血浆中保温的聚合血红蛋白产品的观测结果相符。实施例11-各种MW物质在Hb-HES缀合过程中的稳定化应用二甲胺硼烷(DMB)还原作用终止Hb与氧化HES的缀合过程中出现的分子量变化。将同490uL 80mM HEPES(pH8.1)合并的2.0mLCOHb(200mg/mL于H2O中)脱氧。将充N2的674mg氧化HES(预先从HES 450/0.7、1.10eq高碘酸盐/计算的二醇制备的)溶于6.8mL脱气后的80mM HEPES(pH8.1)中。往该氧化HES溶液中添加950uL的Hb溶液，给出1∶1的最终Hb∶HES(450kDa)比率。3小时后，将2mL该反应混合物加入新配制的充N2的152mg DMB[提供约3eq DMB/初始的醛(相对于氧化HES计算的)]溶于1.6mL添加了350uL 4M NaOAc的已脱气水中的溶液。6小时后，类似地处理2mL所述Hb-HES反应物的等份液。22小时后，在反应物中充入CO，在4℃下将反应物充分对水透析72小时。通过大小排阻色谱法在解离的、非变性条件
下测定缀合、还原过程中和透析后的MW分布。结果示于图10(在3小时时经历还原的产品)、图11(在6小时时经历还原的产品)和图12(未还原的产品)。在室温下的22小时还原过程中，在3小时和6小时观测的产品(二者都是高MW缀合物)MW分布未显著变化，在4℃下72小时透析过程中也未显著变化。因此，用3eq.DMB/初始的醛还原防止了Hb-HES缀合物向更低MW的转化，如在未还原的样品中见到的那样(图10)。如实施例3中所述，当应用更小当量的DMB/初始的醛时，也见到高MW物质的稳定化。该还原方法可被用于稳定缀合反应过程中产生的任何MW分布。
权利要求
1．一种适用作氧转运蛋白的多糖-血红蛋白缀合物，它包含以共价键连接的血红蛋白，即，通过该血红蛋白上的氨基与多糖上由其氧化糖开环而形成的醛基残基之间的仲胺键而连接，所述仲胺键是这样生成的第一步，通过所述氨基和所述醛基的反应而形成席夫碱键，接着在第二步，通过还原而实现稳定化，该缀合物不含可检测的残余未结合血红蛋白而且不含可检测残余量的、分子量大于约500kDa的组分。
2．权利要求1的缀合物，其中，所述多糖是羟乙基淀粉或葡聚糖。
3．权利要求2的缀合物，其中，所述血红蛋白是人血红蛋白。
4．权利要求3的缀合物，其中，所述血红蛋白是去氧血红蛋白。
5．权利要求3的缀合物，其中，所述血红蛋白被分子内交联了。
6．权利要求3的缀合物，其中，所述多糖是分子量为约70～约1000kDa的羟乙基淀粉。
7．权利要求6的缀合物，其中，所述羟乙基淀粉具有约0.5～0.7的取代比。
8．权利要求6的缀合物，它在37℃下具有4～50的P50。
9．一种制备基于血红蛋白的氧载体的方法，该方法包括将携带醛基的氧化开环的多糖与血红蛋白反应而生成其缀合物，将该缀合物保持在预定pH的水溶液的受控制条件下而引起该缀合物受控制的分子量减小和分子量再分布，通过将多糖和血红蛋白之间的席夫碱键还原成稳定的仲胺键而稳定该缀合物，然后回收这样生成的多糖-血红蛋白缀合物的溶液，它不含可检测的未结合血红蛋白残余物而且不含可检测的分子量大于约500～600kDa的产物残余物。
10．权利要求9的方法，其中，所述多糖是葡聚糖或羟乙基淀粉(HES)。
11．权利要求10的方法，其中，所述缀合物被保持在约7.2～10的pH条件、约15～30℃的温度的水溶液中而引起分子量减小和分子量再分布。
12．权利要求11的方法，其中，分子量减小和分子量再分布是通过将醛-胺键还原成仲胺键使所述缀合物被稳定而终止在预定程度的。
13．权利要求12的方法，它包括一步还原，从而引起所述稳定化和基本上同时还原残余醛基。
14．权利要求12的方法，它包括两步还原，第一步引起所述稳定化，第二步还原醛基。
15．权利要求13的方法，其中，所述还原是用基于硼的还原剂进行的。
16．权利要求15的方法，其中，所述还原剂是硼烷二甲胺。
全文摘要
通过血红蛋白与氧化开环的多糖(例如羟乙基淀粉或葡聚糖)的反应制备了适用作基于血红蛋白的氧载体的血红蛋白缀合物,缀合后,在能使它转化成更低分子量产物的条件下贮存生成的缀合物。然后,用还原法稳定缀合物形成血红蛋白与多糖之间的仲胺键,再作为HBOC配制。
文档编号A61K35/14GK1301179SQ99806176
公开日2001年6月27日 申请日期1999年3月25日 优先权日1998年3月31日
发明者G·W·埃达姆森 申请人:赫姆索尔公司