专利名称：Dna,rna和蛋白的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测低浓度测试物质，尤其是病原体指示物检测的设备和方法，特别是涉及血清中DNA,RNA和蛋白的检测。
传统上，疾病的诊断依赖于临床表现。然而随着核酸和单克隆抗体检测方法的出现，已经开发了新的检测疾病技术。核酸的检测已经被用于异常基因产物相关的疾病，例如贫血症，杭廷顿氏舞蹈病以及某些地中海贫血突变型。另外，核酸的检测已被用于细菌和病毒病的检测，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)。而且，单克隆抗体检测方法在一些疾病例如癌症上的确诊和分类已经获得认可。
正如本领域的技术人员所期望的，病原体指示物的检测已经被应用于检测一些与异常基因相关的疾病、与确定的核酸序列的存在有关的疾病和与免疫系统有关的疾病。此处所述的病原体指示物包括DNA、RNA、抗体、抗原和其它的蛋白质。
现有的研究和临床实验室中人工病原体指示物的检测方法一般准确性、灵敏性较低，且在操作方法和解释结果方面都有人为的误差。其它技术，例如培养的方法也不适于很多疾病。例如，肺结核杆菌生长速度很慢使得检测很难甚至无法进行。
Smith等人的专利US5,753,439描述了一种方法，检测特征性二核苷酸和三核苷酸序列来测定目的基因序列，以筛选与序列有关的遗传缺陷或疾病。测试在固体表面进行，可以进行多次。然而，该方法不能提供一种检验步骤，确保测试结果准确且灵敏，并判断方法是否存在误差。
Muller的专利US5,824,478描述了一种方法，一种样品与一种检测探针和一种捕捉探针接触，形成一种检测探针一被分析物一捕捉探针复合物，其被用于检测样品中的一种目的分析物。该目的分析物、捕捉探针和检测探针可以是核酸和多肽。然而，该方法也不提供一种检验步骤，确保测试结果准确且灵敏，并判断方法是否存在误差。
在一个标准酶ELISA免疫测定方法中，用一个有许多含有抗体的小凹坑，比如96个凹坑的盘。在ELISA方法中消除误差的一种方法是使用对照物。其中一个凹坑带有阳性抗体，用作一种阳性对照，其余的凹坑用于检测病人的血清。加入血清样品后，冲洗该凹坑，然后加入带有一种酶的第二抗体。再冲洗，加入一种酶作用物与酶进行显色反应，反应产生的颜色与一种抗原的存在有关。这种方法发生误差的概率很高，人为误差可能导致某些凹坑被冲洗两次或未冲洗，试剂加入两次或未加入。或者凹不小心被外来的物质污染。例如，过度冲洗会冲掉所有的万分得到一种假阴性结果，而不完全的冲洗会检测未结合的物质，产生假阳性结果。对照坑不能保证任何其它凹坑存在病原体批示物。此外，坑与坑之间色度的差异对结果的解释带来额外的不确定性。
以前的测试方法大多数需要时间、技术和样品有一定的浓度，且一个技术员操作的数量也有限。因工作量大，此种检测费用高。
由于所有上述的原因，以及其它更多的原因，一种新的方法、设备和一个检测病原体指示物的试剂盒是所期望的，其应当准确、可重复，并且能够灵敏地判断方法中的错误。
本发明提供了一种在一个试验样品中检测测试物质存在的方法。本方法包括如下步骤(A)将一定测试样品和一种对照物质装于一个测试柱子，其中该柱子至少有两个网，所述的一个网有一个对照捕捉物；至少一个上述的网有一个目的捕捉物质特异于相应的检测样品中待检测的物质，因此对照捕捉物将与对照物质结合形成一种结合对照物质；并且目的捕捉物将与相应的检测物质结合形成一种结合物质；(B)冲洗检测柱除去任何与捕捉物未结合的物质；以及(C)检测在每一种网上的结合物质的存在。本方法可以进一步包括加入一个标记物到每一种网上的结合物上以形成标记的结合物质，然后检测到标记结合物质的存在。
在另一个实施方案中，本方法提供了在一个样品中检测一段DNA序列存在的方法。该方法包括如下步骤(A)变性一个测试样品失活来形成一个待检测的单链目的DNA序列；(B)将测试样品和第一对照单链DNA序列装于一个其至少有两个网的检测柱，所述的一个网有第一对照单链捕捉DNA序列，至少一个上述的网有一个目的单链捕捉DNA序列特异于相应的检测样品中的目的DNA序列；并且其中的目的单链捕捉DNA序列与测试样品中的相应的目的DNA序列相结合形成一个双链DNA序列，并且第一个对照单链捕捉DNA序列将与第一个对照DNA序列相结合形成一个双链对照DNA序列；(C)加入一个流动相溶剂到柱子中除去未结合的DNA；(D)加入一种酶来破坏单链DNA；(E)加入变性溶液来分离已形成的双链DNA序列，然后加入一种冲洗溶剂除去变性的非捕捉单链序列，因此单链捕捉DNA序列在每一种网上重新形成；(F)加入DNA探针提供在步骤(E)中形成的单链捕捉DNA序列可检测的标记；(G)加入冲洗溶液除去非结合的DNA探针；(H)检测来自每个网的任何信号。在步骤(B)中，在将样品加入测试柱前，先在样品中加入第一个单链对照DNA序列，或者第一个单链对照DNA序列与样品分别加入检测柱。而且，该方法可进一步包括加入可与标记物反应的底物来产生可检测的信号。
此外，该方法进一步包括加入第二种对照单链DNA序列到检测柱中，其中检测柱有一个对照网其含有第二个对照单链的捕捉DNA序列。
另一个实施方案中，每个网上有多于一个的单链捕捉DNA序列，并且标记物随着单独网上的单链捕捉DNA序列的不同而不同，因此不同的DNA序列可以在一个单个网上被检测。
在又一个实施方案中，检测一个测试样品一段DNA序列的方法包括如下步骤(A)提供一个阳性对照单链DNA序列；(B)使一个测试样品变性从而形成一个待检测的单链目的DNA序列；(C)加入测试样品和一个阳性对照DNA序列到一个检测柱，其中该柱子有至少两个网，其中所述的一个网有一个第一个对照单链捕捉DNA序列可以和阳性单链，捕捉DNA序列的一部分结合；至少一个上述的网有一个目的单链捕捉DNA序列与相应的检测样品中的目的DNA序列有特异性，因此阳性对照DNA序列与第一对照单链捕捉DNA序列相结合，其中结合的阳性DNA序列有一个双链区和一个单链区；并且存在于检测样品中的目的DNA序列与目的单链捕捉DNA序列相结合，其中结合的DNA序列有一个双链区和一个单链区；(D)加入一种冲洗溶液到柱中除去未结合DNA；(E)加入DNA探针来提供可检测的标记物来连接步骤(C)中形成的结合阳性对照DNA序列的单链部分和结合目的DNA序列的单链部分；(F)加入一种冲洗溶液到柱中除去未结合的DNA探针；以及(G)检测每个网的任何信号。另外，该方法可进一步包括加入与探针反应的底物来产生可检测的信号。
阳性对照单链DNA序列用一个待检测的目的DNA序列制备，制备方法选自如下任一方法(1)在一个预定的切割位点插入一个对照DNA片段到一个待检测的目的DNA序列中到；以及(2)从目的DNA序列的预定的切割位点除去一个小片段DNA。
进一步的，本方法中步骤(C)进一步包括加入一个阴性对照DNA序列到检测柱；其中检测柱也有一个其上含有第二对照单链捕捉DNA序列的对照网。用于结合阴性对照DNA序列，因此阴性对照DNA序列与第二对照单链捕捉序列结合形成一个结合的阴性对照DNA序列。阴性对照单链DNA序列不同于目的DNA序列也不同于阳性对照DNA序列。
在其它方面，本发明提供了一种方法用于检测测试样品中的一个RNA序列的存在。检测测试样品中一段RNA序列的存在包括如下步骤(A)提供一个阳性对照单链DNA序列；(B)加入一个测试样品和阳性对照DNA序列到一个检测柱其中该柱有至少两种网，所述的一种网有第一对照单链捕捉DNA序列用于结合阳性对照DNA序列；至少一种所述的网有一个目的单链捕捉序列特异于检测样品中相应的目的RNA序列，因此阳性对照DNA序列与第一条对照捕捉DNA序列结合以形成一个双链阳性对照DNA序列，并且在检测样品中出现的RNA序列与目的捕捉DNA序列相结合从而形成一个双链DNA/RNA复合体；(C)在柱上加入一种冲洗液，除去未结合的阳性对照DNA和目的RNA；(D)加入一种酶到柱中破坏单链DNA和RNA；(E)加入一种变性溶液分离已形成的双链对照DNA序列和双链DNA/RNA复合体，并且加入一种冲洗溶液除去变性的非捕捉单链DNA和RNA序列，这样，单链捕捉DNA序列在第一网上重新形成；(F)加入DNA探针来提供可检测标记来检测步骤(E)中形成的单链捕捉DNA序列；(G)加入一种冲洗溶液到柱中除去未结合的DNA探针；以及(H)检测每一种网的任何信号。另外本方法进一步包括加入可与标记反应的底物来产生可检测的信号。
在一个实施方案中，阳性对照单链DNA序列的一部分与目的RNA序列的一部分相同。第一个对照单链捕捉DNA和目的单链捕捉DNA在捕捉序列的一部分有一段相同的序列，因此一种共同的DNA探针在步骤(F)中被用于检测重新形成的对照和目的捕捉序列。
在一个进一步的实施方案中，RNA检测方法的步骤(A)进一步包括提供了一个阴性对照单链DNA序列其不同于目的RNA序列也不同于阳性对照DNA序列。步骤(B)进一步包括加入阴性对照DNA到检测柱，其也有一个对照网含有第二对照单链捕捉DNA序列。第二对照捕捉DNA序列部分匹配于阴性对照DNA序列，因此阴性对照DNA序列与第二对照捕捉DNA结合以形成一个双链DNA序列，其也有未结合的单链部分。步骤(F)中的DNA探针并不与在步骤(E)中形成的部分第二对照单链捕捉DNA序列相配，并且在其二者间无结合发生。因此，在正常条件下第二对照网在步骤(H)中没有信号被检测到。
在另一个实施方案中，第二对照单链捕捉DNA序列与目的捕捉DNA和第一个对照捕捉DNA序列不同。
在一个另外的实施方案中，第一个对照捕捉DNA，第二对照捕捉DNA和目的捕捉DNA在捕捉序列的一部分有相同序列，一个共同的DNA探针被用于步骤(F)来检测重新形成的对照和目的捕捉序列。
另外，本发明提供了一种用于分析检测物质的柱子，其中该柱子有至少两种网，所述的一种网有第一对照捕捉物质，用于检测第一对照物的存在，并且至少一种上述的网有一种待检测的测试捕捉物。该柱子也含有至少两种小室，每种小室有一种网，所述的一种小室其网上有第一对照捕捉物用于检测第一对照物的存在，并且至少所述的一种小室在网上有一种测试捕捉物，用于检测待检测的测试物。
在另一个实施方案中，其中所述的小室有依次连接不同小室的连接装置，以及小室被沿着小室的纵轴通过连接装置被连接。可选择地，小室可以并排放置。另外，网可以置于与纵向柱垂直的平面上的网盘上。当柱子旋转时，网将被运送到样品点、试剂点以及检测点。
另外，柱子进一步有一种小室或一种含有第二对照物的网用于检测第二对照物的存在。
在另一方面，本发明提供了一个试剂盒。该试剂盒包括(A)用于分析测试物的柱子，其中柱子至少有两种网，所述的一种网有第一对照捕捉物用于检测第一对照物质的存在，并且至少所述的一种网有一种捕捉物用于检测待检测的测试物；(B)用于检测测试物存在的试剂。
另外，本发明提供了一套用于检测样品中的测试物的装置。该装置包括(A)一个柱操纵系统其含有一个柱支架和一个柱卸载测试柱的卸载器；(B)一个样品点用于加入一个样品到测试柱中；(C)一个试剂点；(D)一个检测点用于检测对照物和检测柱的测试物；以及(E)包括一个旋转框架其携带柱支架的固盘传送带；其中的固盘传送带传送测试柱到样品点、试剂点以及检测点。
在另一个实施方案中，检测点有多个检测器用于检测一个或多个对照物质和一个或多个测试物质在网上的存在。
在另一方面，本发明提供了一个样品分配器含有(A)一个样品固定器其含有一个侧壁和一个与侧壁相连的底部；其中上述的底有一个孔其被一个能被穿刺的膜密封；以及(B)有一个出口的穿刺器用于上述其孔膜的穿刺。
样品分配器的穿刺与测试柱相连。当样品固定器置于穿刺口的顶部，以及柱的下部时，穿刺器穿透样品固定器的薄膜因此分配样品固定器中的液体样品到测试柱中。
图1是本发明的一个实施方案所用装置的部分示意图。
图2A和2B表明一个用于运输试剂到柱中的试剂运输点。
图3表明了一个用于检测来自柱的信号的检测器。
图4表明了一个由4个小室组成的柱。
图5A,5B和5C大体表明了本发明的一个实施方案的过程。
图6表明利用本发明的方法分析6个样品的读数，其中每个样品用2个对照进行分析。图中，A是阳性对照信号，C是阴性对照信号，B是测试样品的信号。
图7表示用于检测样品中一段DNA序列的方法。
图8表示用于检测样品中一段DNA序列的另一种方法。
图9A和9B表示用于检测样品中一段RNA序列的一种方法的两种模式。
图10A和10B分别表示使用前和使用中的一个柱子和一个样品分配器。图10C是上述与样品固定器和穿透器相连之前的图10A和10B的柱子和样品固定器的部分截面图。
图11表示一个网盘系统，含有一个纵向轴和一个多网盘，每个盘上有多个网。
图12表示本发明另一个实施例所用装置的示意图。
优选实施方案的详细描述一方而，本发明提供了一套用于检测样品中测试物的装置。该装置包括(A)一个样品加入点用于加入样品到一个测试柱其有至少两种网；(B)至少一个试剂点以及一个冲洗点；(C)一个检测点用于检测测试柱中的对照物质和测试物质；以及(D)从样品加入点到试剂点、冲洗点和测试点来运输检测柱的运输装置。
检测柱可以被自动或人工安装到装置上。检测柱可以有不同的形状和构造。一般地，柱子至少有两种网，一种网有第一对照捕捉物用于检测第一对照物的存在，且另外的网有一个捕捉物用于检测待检测的测试物。柱子可以至少有两种小室，一种小室有一种网，一种含有第一对照物在网上的网用于检测第一对照物的存在，并且另一种小室在网上有一个捕捉物用于检测一种待检测的测试物。检测柱的详细描述和实施例在后面介绍。
每一个试剂点有运输一种已测定的量的试剂到柱中的运输的装置，且冲洗点也有运输的功能，即可运输已测定的量的冲洗液到柱子中。检测点有一个或多个检测器用于检测测试柱中的信号。
可选择地，装置可进一步包括另外的点用于回收循环已用过的测试柱。其它的点包括(A)一个用于加入分离物到测试点的分离点，用于从捕捉物分离测试物；(B)在每一个分离点后的第一次冲洗点，用于加入冲洗物质用于从柱中冲洗被分离的检测物；(C)用于检测测试物的存在的第一检测点；(D)运输测试柱到每一个分离点，冲洗点和检测点的运输装置。
该装置也可以有用于进一步分离的第二分离点，第二冲洗点以及第二检测点来用于分离，冲洗并检测从而完成循环过程。
在一个实施方案中，一种装置见图1。该装置含有一个柱运输设备11和一个测试管运输设备12，其中每一个也有与传递设备相关的设备(未显示)，一般而言方向如箭头A和B所示，柱传输设备11有多个柱13，其与柱传输设备等距离相连。柱13与柱运输设备11的相连优选是暂时性的，这样用过的或有缺陷的柱子可以被除去或被替换。测试管运输器12有多个测试管14，例如，血清管。优选地，测试管14被等距的连接于测试管运输器12。测试管14与测试管运输器12的连接优选是暂时的所以用过的或有缺陷的柱子可以被除去或被替换。除去运输器的方法优选的为标引的方法(未显示)。传输器11和12，测试管14和柱13被覆盖在室15和16内，与窗口17分隔开，窗口17足够的宽敞可容下一个柱18和一个相连的测试管19。柱传输设备11和测试管传输设备12被标示出。因此，当处于窗17的位置时，只有一个测试管19与一个相连的柱18相邻。
在室16内，有若干个试剂点，例如试剂点20-25，用于当柱标示通过点时加入试剂到柱中。当一个试剂点加入一种冲洗溶液到柱子中，试剂点也叫做一个冲洗点。在试剂点的未端或下游，有一个检测设备27。在如图1所示的实施例中，也有一个清洁带28。在清洁带的位置有一系列的冲洗点29，用于从柱中分离不需要的物质的分离点，以及相关的检测器30。
可以理解除了一系列的冲洗点，分离点和检测点外，也可以有一个单独的冲洗点，分离点和检测点，且如果任何的污染在柱子通过第一次检测点时被检测出柱子可以再次通过冲洗点，分离点以及检测点。例如，此可以通过一个转动平面来完成。
另一种类型的设备如图12所示。该设备有一个柱操纵系统，其含有柱支架186和一个柱卸载器187。如图所示，当样品分析完成或当一个检测柱的错误被检出后柱卸载器将卸载检测柱。
该设备有一个带有转动框185的固盘传送带，其携带柱固定器。固盘传送带在样品分析中传输测试柱到样品点，试剂点和检测点。柱操纵系统可以进一步包括一个自动的柱装填设备。
该设备有一个样品点用于加入样品到一个测试柱。样品点包括一个柱推动器188和一个压力盘189，在柱推动器顶端排列成一行。在如图12所示的样品点，一个样品分配器190。与检测柱一起使用用于检测过程。样品分配器的具体描述见后面图10中的描述。一般来说，一个样品分配器位于检测柱的顶端。在一种向下的物理压力下，样品分配器将液体样品分配到检测柱中。当一个检测柱和一个样品分配器被安装到固盘传送带的柱支架中且当固盘传送带传输柱子通过样品点时，柱子滑到压力推进器的顶端却停留在压力盘的下面。在柱子中产生的压力导致样品器分配液体样品到测试柱中。如图中所示的柱推进器被一个中心缝环绕适合柱流出口。在操作中，推进器可以是转动的，或者处于静止状态。推进器也可以是其它型状，如椭圆形。
可选择的，样品也可以通过注射泵或手工被加到检测柱。设备也有试剂点191，以及检测点(未显示)用于检测测试柱中的对照物和测试物。
图2A和2B显示了一种类型的试剂点和一种类型的柱子。在试剂点有一个试剂瓶31内有试剂32。试剂瓶31有一个橡胶隔膜33，通过它一个双孔的针34可以穿透。双孔针34有一个管35其与一个空气贮藏器(未显示)相连。第二管36与运输管37通过一个双阀交叉点38相连。而且双阀交叉点38连接到测量注射器39。第二管36和运输管37可以是一个。单独的管有一个双阀交叉点。阀V1和阀V2在双阀交叉点，38可以使试剂32被注入测量注射器39并被从测量注射器39通过传输管37排出。柱40恰位于运输管37的下部因此试剂可以通过例如重力被传输到柱40中。可选择地在运输管37和柱40之间可以是一个不透液体的连接处。试剂可以从顶部或连接在充气管上的真空区利用压力通过柱子。
另一方面，本发明也提供了用于分析样品中测试物的柱子。此外的测试物包括但不限于DNA,RNA,PNA，抗体，抗原和蛋白以及与DNA,RNA和蛋白特异性结合的物质。优选地，测试物可以是病原体的指示物，例如DNA,RNA和抗原。柱子至少有两种网，所述的一种网有第一对照捕捉物用于检测第一对照物的存在，所述的另一种网有一种测试捕捉物用于检测一种待检测的测试物。柱子可以至少有两种室，至少一种室容纳一种有第一对照捕捉物的网，并且至少一种室容纳一种有一种测试捕捉物用于检测待检测的测试物的网。每一个小室有连接装置与其它的小室按顺序连接。另外，小室也可以并排放置。
此处所用的术语测试物是指待检测的测试样品。其也指根据专门应用的目的物质，目的蛋白，目的DNA，目的RNA，目的抗原。术语测试捕捉物是指一种与待检测的测试物特异性相连的捕捉物。检测捕捉物也根据特殊的应用指应用目的捕捉物，目的捕捉蛋白和目的捕捉DNA。
除了一种网有一种第一对照物，柱子也有多个网每一个有一个不同的捕捉物用于检测多于一种的测试样品中的检测物。可选择的，一个柱子可进一步含有一种网其上有用于检测第二对照物的存在的第二对照捕捉物。此外，一个柱子也另有带有一种其不含捕捉物的网的小室。此网可被用于检测方法的背景信号。
用于检测对照物和检测中待检测的测试物包括但不限于单链DNA序列，抗体，抗原和蛋白。适宜根据待检测的测试物选择捕捉物。
可选择的，网盘也可被用于该检测方法。网盘有多个网位于与纵向轴相垂直的平面上。检测点也有多个检测器其可被用于检测对照或测试物在网位的存在。
图3显示了一种类型的柱子。柱40含有一个柱鞘41和一个流出管42。柱鞘41容纳3种网43,44和45，其彼此分隔开。网沿着柱40的纵轴X-X分隔开。虽然，3种网如图2A和2B所示，但必须至少有两种网在柱中，至少一种网被用于检测对照物，且至少一种网被用于检测测试样品中的物质是否存在。网43-45可以是以任何适宜的材料制成用于吸附一种捕捉物，后面将更详细地描述。通常地，网的材料有大的表面积，例如烧结的玻璃，烧结的塑料，玻璃纤维，小珠，微粒，碎屑以及膜。当用膜的时候，固体支持物是需要的。一种网的实施例是一层精细的乳胶颗粒其上附着捕捉抗体，其中乳胶颗粒分散到疏松的烧结玻璃平面上。此处所指的网有时是指玻璃原料或者纤维碎片。与网相邻的柱壁优选为透明的，以利于光化学或其它化学反应的检测。
网优选为特定的顺序排列，因此在某个特定的网的位置的任意反应可以被鉴定到。明显地，任意反应的检测通过特定的捕捉物来证实是很重要的。例如，重要的是用一个对照捕捉物来检测任意反应，如用白蛋白作为对照捕捉物可检测到，但不能用任意其它的捕捉物。例如结核杆菌捕捉物。由于上述原因，最好有一种装置保证网的顺序与其相关的捕捉物结合材料按预定的顺序排列。
柱40可以为任意的形状，圆柱状，正方形，长方形，或一面平的圆柱状。在图2A,2B,3,5A和5C，柱40是一个阶梯形的管。此形状需要网43、44和45有不同的直径。如后所详述，每一网有不同的捕捉物吸附在其上面。如上所述，带有第一捕捉物的网经常被放在最上位置43是很重要的。使网43较其它网的直径大保证网43不能处于预留给44或45网的位置。相反地，网45直径较小，并将一种不同的捕捉物加到网43的捕捉物，保证网45不能被放在网43或44的位置。显而易见地，这对网正确放置在柱中是有益的。当然，带有正确放置的网的柱子可以以其它的方式完成，因此阶梯形的管排列(如图2A,2B,3,5A到5C)，并不重要。显然，柱子可能有圆形横断面，正方形横断面或其它的合适形状。
如下所述至少一种网例如43被做为对照。在一些情况下第二网例如45也被用做第二对照，将根据柱子及装置的使用被描述。第三种网例如44用于检测测试管样品中的特定化学成分的存在，例如一个病人血清中的病原体指示物。
如图2A，双阀接合点38的上端阀V1为开放并且下端阀V2为关闭，来保证一定量的试剂被吸入测量注射器39，图2B中，双阀接合点38的上端阀V1是关闭的，下端阀V2开放，从而保证在测量注射器39中的一定量的试剂经运输管37被排出。
图3表明柱40与检测器相邻。在实施例中，为了避免误读，检测器块46的形状为可容纳柱套41的形状。检测器块46有通道47,48,49使得从网43,44,45发出的任何信号，分别通过检测器50,51,52。阶梯形柱鞘的另一个优点如图3所示，每一个网的信号被阻止通过相邻的检测器通道。虽然UV检测器在一些情况下应用，但优选的为激光检测器。
一些反应是光化学反应，并且光化学的检测可直接由从网发射的光束决定；如图3中47-49通道的定位所指。但是有时需要测定从每个网上表面的一个角发射的光。因此，线路将被折射引导这些光到适合的检测器。
其它的反应可能需要不同的检测系统。例如，如本领域技术人员熟知，有检测一定反应的适宜光源是必须的。另外，不同于图2A的柱子可能需要不同的排列的检测装置，如后面所述。
虽然图3表明了一种方式例如缩小来自网43到通道48的光的交叉，如果反应次数是以千分之一秒的阶数并且从相邻网的反应之间有一个明显的时间间隔，阻止从一个检测器到另一个光交叉可能是不重要的。
来自检测器的信号可以用若干种方式显示。例如，信号可以显示在纸上或显示器上。信号也可以被处理测出不同网上病原体指示物的浓度。信号的数据可以以电子形式贮存并通过本地或远程方式重新获得。除了数据，也可应用软件提供测试的信息以及，由此帮助观察者理解并解释结果。远程获取的一个好处是一个需要该测试的医生可以快速并直接观察原始数据，并不需要一个技术人员的帮助和解释。因为每个柱至少有一种对照实验，医生可以立即估计到实验是否正确操作并且对任何表明在该条件下有无病原体的指示物的结果有高度的信任。此外，因为试验可以快速操作，医生可以在相对少的时间内进行实验，并很快能够看到病原体指示物的浓度是增加还是减少。
柱子的另一种排列如图4所示。柱100由小室101,102,103和104和一个流出室105组成，流出室105有一个流出孔118。室102和103如所示在完整的柱100的右侧，用箭头M和N表示室102和103在柱中的放置。排列方法保证室102仅仅与室101的底部相连，室103仅仅与室102底部相连，室104仅仅与室103的底部相连。一个保证不同的室之间以正确的顺序相连的适宜实施例是对不同的室在特别的位置嵌入狭槽，或使不同的室有不同数目的狭槽。
如图4所示的实施例，室101有一个排水管114及一个无捕捉物的网106。小室102有一个排水管115和带有第一对照捕捉物109的网108。室103有一个排水管116和一个带有病原体指示物捕捉物111的网110。室104有一个排水管117和一个带有第二对照捕捉物113的网112。带有相关捕捉物的4个室的重要性将在后面描述，特别是利用DNA的一种与一种病原体指示物相关的检测方法。排水管114,115,116和117的存在是选择性的。当网是有合适孔径的玻璃原料制成，无需排水管。此种网如图8所示在柱120和图9A中的柱140中。另一方面，如果用一种膜作为网，一种固体支持物是必需的且排水管是优选的。
在一些国家，用过的柱不是重新利用而是丢弃，而其它的国家是允许再利用的。如果在允许重新利用的情况下，为确保柱子不被污染，优选用自动的清洗过程，否则不能使用。在此过程中，用过的柱子用能够破坏任何除了网上捕捉物外的东西的试剂冲洗。冲洗后，要测定柱子上是否有不期望存在的物质，如果存在，进行进一步的清洗和检测程序。如果一系列清洗后，某个柱子依然不干净，该柱子被丢弃并用新柱子替换。
图11中显示一种网盘其提供了一种选择性的用于检测测试物的网的整个装置。柱180有多个网盘181,182,183和184。每个网盘有多种网例如A,B,C,D,E,F,G,H和J在盘181上，其可以被看作柱的相当物。例如网A和B可被用于阳性和阴性对照物的检测，剩下的网C到J用于检测七种不同病原体指示物物的检测。网可以被用于结合的方法，标记的方法和检测的方法大体上同前述。因为在任何一个网盘上的网在与柱180的纵向垂直的平面上，检测最好通过放置检测器在盘上进行。例如，检测可以用检测器D1到D9来进行。如图11所示的实施例如，可以理解网181上的物质的检测已经完成并且盘181已经被转出检测器D1到D9的范围。检测器D1到D9的位置是用于检测盘182的网的捕捉物和标记物。因此每一个单独的盘可以适用于检测大量的物质，例如病原体指示物。
本发明的另一个方面是提供了一种方法用于检测测试样品中蛋白的存在。此方法包括的步骤如下(A)加入样品和对照物到柱子中其中柱中甚少有两种网，所述的一种网有第一对照捕捉物用于结合对照物。至少所述的一种网有一种目的捕捉物用于结合测试样品中待检测的目的蛋白。因此对照物与第一对照捕捉物结合形成一个结合对照物，且存在的目的蛋白与测试捕捉物结合。
(B)加入冲洗液到柱中除去未结合的对照物和未结合的目的蛋白。
(C)加入一种标记物到柱中，与对照物和被结合的目的蛋白相结合；(D)加入冲洗液到柱中除去未结合的标记物；(E)检测任何来自标记的和被结合的对照物以及来自任何标记的和被结合的目的蛋白的任何可检测得到的信号。
此方法可进一步包括加入与标记物反应的底物从而产生可测的信号。对照物可以与检测物分别加入到柱子中，可选择地，对照物可以被加入到测试样品中并先于样品加到柱子中。
上述过程的目的蛋白包括抗原，抗体和其它的蛋白。当目的蛋白为抗原，捕捉物为与目的抗原将特异性结合的抗体。标记物可以是一种初级抗体，其与被结合的有化学或酶标记物的目的抗原结合。此外，上述过程并不仅限于蛋白分析。当测试物能够特异性地与捕捉物结合时，即可应用此方法。
本发明的范围中的一个方法现在被描述的为血清样品中蛋白检测。图5A,5B和5C大体上用简单的术语表示了该过程，其中检测了对照蛋白Pc，例如白蛋白，以及蛋白Pt，例如结核杆菌蛋白。对照蛋白Pc存在于血清中且不知道结核蛋白Pt是否存在于病人的血清中。参见图1，对照蛋白Pc本来已经在试管19的样品中，或已经预先加入样品中，对照蛋白Pc可以与病人样品被分别加到柱子中，或者加入病人样品之前或之后加入。网43是一种烧结玻璃原料其上含有第一捕捉抗体Ab1，且网44是一种烧结玻璃原料其上结合第二捕捉抗体Ab2，如图5A所示。网43和44存在于同一柱子中并且被标示在窗口17。因此该柱子在18的位置(见图1)。已经说明，在测试管19中的血清含有对照蛋白Pc，为了举例说明的目的，可以设想被测试的蛋白PT例如结核杆菌蛋白是存在的。一个技术人员从测试管19取等份的血清到柱子18的上部，然后传送带转动，因此柱被移到第一个试剂点。如此下来，血清穿过了网43和44。对照蛋白Pc与第一个网43上捕捉抗体Ab1结合，且蛋白pt与网44上的第二捕捉抗体Ab2结合，如图5B所示。在第一个试剂点，对柱子进行冲洗。冲洗的目的是除去任何多余的血清，包括未结合的对照蛋白Pc和蛋白pt。
可以理解转移血清到柱子中也可以是自动完成的。当血清转移到柱子的时候，血清测试管与相应鉴定的柱子被记录，或者由技术人员来完成，例如将鉴定号码输入计算机；或者自动的方法例如对测试管和柱子用条形码表示。
在第一个试剂点冲洗后，柱子被送到第二试剂点。在第二试剂点，初级的抗体Ab3(将与对照蛋白Pc结合)被加入到柱子中。初级抗体Ab3例如有光化学标记。在进入第三个试剂点以后，将与蛋白pt结合的初级抗体Ab4被加入到柱中，如图5C所示。初级抗体Ab4也有光化学标记。柱子进入第四个试剂点，其是一个冲洗点。冲洗除去任何多余的初级抗体Ab3和Ab4。抗体Ab3和Ab4优选是相同的，此种情况下，对于初级抗体只需要只有一种试剂点。
然后柱子进入第五个试剂点，其也与检测器相连。在第五个试剂点，一种触发溶液被加入到柱子中，触发溶液与初级抗体Ab3和Ab4的标记物反应。假设此反应为光化学反应，由43和44的每一个网上发射光。来自网43的光信号由检测器50检测，来自网44的光信号由检测器51检测。来自网43的光显示对照蛋白Pc在网上的存在并且来自网44的光显示网上Pt蛋白的存在。
从上述讨论可以看出在血清中如果没有pt蛋白存在，显然没有这样的蛋白结合到捕捉抗体Ab2上。因此没有与初级抗体Ab4反应的物质，检测器51也就没有光化学检测信号。
利用对照蛋白PC的优点是如果加入触发溶剂后检测器50没有检测到的信号，就会指示操作错误。如果对照蛋白Pc有信号，因此分析结果的人可以合理地肯定缺乏网44的信号，确实表明在血清中无蛋白pt，或蛋白pt浓度在检测限以下。
对照蛋白可以是经常出现在血清样品中的蛋白，例如白蛋白或者一种专门加入到血清中或直接加入到柱子中的对照蛋白。
有时还需要有第二对照蛋白(P2)，其可以被利用表明是否过程的所有步骤都已进行。例如网45上可能有第三种捕捉抗体Ab5(未显示)。加入带有第一对照蛋白Pc和可能的蛋白pt血清后，冲洗柱子，第二对照蛋白P2可以被加入。第二对照蛋白P2将与第三种捕捉抗体Ab5结合。第三种捕捉抗体Ab5可以被加入带有标记，例如光化学标记的初级抗体Ab6的加入而激活。现在，不是加入上述的含有初级抗体Ab3和Ab4的试剂，而是含有初级抗体Ab3,Ab4和Ab6的试剂被加到柱40。冲洗并加入触发溶液后，任何与初级抗体Ab6的反应将被检测器52检测。应该指出，如果需要，第二对照蛋白可以与第一对照蛋白一起加到柱子上。
应该认识到如果第二对照蛋白P2没检测到，可以确定初级抗体Ab3和Ab4没被加入到柱中，因此可以进一步说明是否完全的分析过程已被正确进行。
虽然上述都是与血清样品的病原体指示物的检测相关，上述方法可以适用于检测病毒或化学物质例如药品，致癌剂，爆炸物，镇静剂，或污染物。
图6表明利用该技术的结果，有两种对照网A和C以及一种网B，其被用于检测特定病原体指示物的存在。在图6中，6种样品在柱1-6中测试。样品柱1,2,3和4表明两种对照蛋白的存在，因此表明血清的存在并且正确的第一对照物和病原体指示物的初级抗体被加入。样品柱1,3和4表明在网B中病原体指示物的存在，然而样品2中没有病原体指示物被检测到。因为两种信号都是阳性，操作者可以确定无病原体指示物信号，样品柱2显示没有病原体指示物的存在。在样品5中，没有对照信号的存在，表明样品柱中不含有任何对照蛋白，因此缺少网B的信号是无意义的。阴性结果可能是假的。
在样品6中，第二对照不存在。这表明检测第一对照和病原体指示物的正确的初级抗体未被加入。因此样品6错误显示了第一对照和病原体指示物的存在。网A和B中物质的检测已被进行，其可能或不可能是第一对照物和病原体指示物。因此样品6也是无意义的。
本发明优于从前方法，样品5在从前的方法中，会被认为是绝对阴性，其实在网B上是假阴性，并且样品6在从前的方法中会被认为是绝对阴性，其实在网B上是假阴性。
本发明的另一方面是提供检测样品中DNA序列的方法，该方法包括如下步骤(A)使检测样品变性产生待检测的单链目的DNA序列，(B)将测试样品和第一单链对照DNA序列加入到测试柱，柱子至少有两种网，所述的一种网在其上有第一对照单链捕捉DNA序列；至少所述的一种网其上有与相应的测试样品的目的DNA序列特异性的结合的一种目的单链捕捉DNA序列；并且其中的目的单链捕捉DNA序列将与测试样品中的相应目的DNA序列相结合产生双链对照DNA序列；并且第一对照单链捕捉DNA序列将与第一对照DNA序列相结合产生双链对照DNA序列；(C)加入冲洗液到柱中除去未结合的DNA；(D)加入一种酶到柱中破坏任何单链DNA；(E)加入一种变性液来分离已形成的双链DNA序列，并且加入冲洗液除去变性的非捕捉单链序列，使单链捕捉DNA序列在每种网上重新形成；
(F)加入DNA探针来提供可检测的标记，用于步骤(E)中形成的单链捕捉DNA序列的检测；(G)加入冲洗液到柱子中除去未结合的DNA探针；(H)检测来自每个网的任何信号；该方法可以进一步包括加入与标记物反应产生可检测信号的底物。第一单链对照DNA序列可以在将样品导入测试柱前加入到测试样品中，或与测试样品分别加入测试柱中。该方法进一步包括导入第二单链对照DNA序列到测试柱中，其中测试柱也有一种对照网其上有第二对照单链DNA捕捉序列。应用本发明的方法，一种单独的网也可以有不只一种的单链捕捉DNA序列在其上。在这种情况下，因为不同单链捕捉DNA序列在一种网上，标记物就不同，因此不同DNA序列可以在一种单独的网上被检测。
图7表明利用上述DNA分析的方法。在这个特殊的实施例中，没有必要利用例如PCR技术扩增DNA，作为对照(对照单链捕捉DNA序列)的单链合成DNA(SSDNA(a))和目的病原体指示物(目的单链捕捉DNA序列)的单链DNA(SSDNA(b))被加在柱中的网61和62上，用于提供上述的捕捉物(图7中分别为63和64所示)的等价物。
病人的样品被制备，因此DNA如果存在已被分离。分离的目的DNA和对照DNA被变性为单链DNA并且被加到柱中(如图7中60所示)。对照DNA和目的DNA如果存在，将特异性地与单链对照捕捉DNA序列和目的单链捕捉DNA序列分别结合。变性的对照DNA和病人样品中的目的DNA分别等价于图5A到5C所示的对照蛋白和目的蛋白。
柱子被清洗以除去非结合DNA。一种只特异性破坏单链DNA和RNA的酶，例如S1核酸酶65被加入到柱子中。已知，S1核酸酶只破坏单链DNA和RNA，而非双链DNA或RNA/DNA复合体。因此，如果无SSDNA(a)或SSDNA(b)的结合，单链DNA将被破坏。但是，如果SSDNA(a)或SSDNA(b)已经被结合形成双链DNA，双链DNA将不会被破坏。接着进行一个冲洗步骤，一种变性的溶液66被加入到柱中。此种变性溶液分离任何双链DNA成为单链DNA。柱子再次冲洗。
冲洗后对照和目的DNA的标记DNA探针被加入到柱子中。优选的一种适于对照和目的DNA的单标记DNA探针67被应用。然后，柱子被清洗除去任何非结合的探针。任何标记DNA探针的存在可利用合适的检测手段被检测，例如触发溶液和检测器。
在如图7如示的过程中，变性样品60只使对照DNA68变性。没有目的病原体指示物的存在。因此，只有SSDNA(a)63被与对照单链DNA68退火来形成双链DNA69。因为无变性的目的DNA,SSDNA(b)保持单链。因此，加入S1核酸酶以后，SSDNA(b)被破坏只剩下对照双链DNA69。对照双链DNA69被用变性液66变性，剩下单链DNA70(其与SSDNA(a)相同)。无单链目的DNA变性(71)。最后加入标记的DNA探针67，其形成了一种双链对照DNA72，其可以被检测。在这种情况下，只有对照DNA可以被检测，因为无目的DNA的存在。
在一个进一步的实施例中，本发明提供了另一种方法用于检测样品中DNA的序列。该方法包括(A)提供了一种阳性对照单链DNA序列。
(B)将测试样品变性产生单链目的DNA序列；(C)在至少有两个网的柱上加入测试样品和阳性对照DNA序列，其中一种网有第一对照单链捕捉DNA序列用于结合一部分阳性对照DNA序列；至少一种上述的网有一种目的单链捕捉DNA序列特异于样品中相应的目的DNA序列，因此阳性对照DNA序列与第一对照单链捕捉DNA序列相结合，其中结合的阳性对照DNA序列有一个双链部分和一个单链部分；并且样品中的目的DNA序列与目的单链捕捉DNA序列相结合，其中结合的目的DNA序列有一个双链区部分和一个单链区部分；
(D)加入一种冲洗液到柱中除去未结合的DNA；(E)加入DNA探针提供可检测的标记用于吸附被结合的阳性对照DNA序列的单链区部分和步骤(C)中产生的结合的目的DNA序列的单链区部分。
(F)加入冲洗液到柱中除去未结合的DNA探针；(G)检测来自每个网的任意信号。
该方法可进一步包括加入与标记物反应产生可检测信号的底物。阳性对照单链DNA序列用一种待检测的目的DNA序列制备，制备过程为如下任意一种1)在预定的酶切点将一段对照DNA片段插入到待检测序列的目的DNA序列；以及2)在预定的酶切点从目的DNA序列除去小片段的DNA；另外，本方法可以进一步包括加入一种阴性对照DNA序列到测试柱。在这种情况下，测试柱也有一种对照网其上有第二对照单链捕捉DNA序列用于结合到阴性对照DNA序列，因此阴性对照DNA序列与第二对照单链捕捉序列结合形成一个阴性对照DNA序列。该阴性对照单链DNA序列与目的DNA序列不同，也不同于阳性对照DNA序列。
对照DNA序列可与测试样品分别加入到测试柱，或在测试样品加入柱之前加至样品中。
举例说明如图8，选择待检测的目的DNA序列，例如结核杆菌DNA序列。用已知技术插入或者去除一部分目的DNA序列，形成突变体。例如图8，这样的突变型目的DNA被作为阳性对照。目的DNA序列是A-B。在如图8所示的实施例中，阳性对照的形成是在酶切点G，通过插入一段合成的DNA片段C-D，例如100个核苷酸的碱基，到目的序列A-B。阴性对照也形成，其为一段合成的DNA片段E-F，其序列不存在于待检测的目的DNA中。
例如，选择一段目的DNA大约300碱基进行克隆，并通过DNA测序证实。基于已克隆的DNA，大约100碱基的非目的DNA的小片段被插入到克隆的DNA中间做为阳性对照DNA。一个大约200碱基对的非目的DNA也被选择克隆并通过DNA测序证实，并做为阴性对照DNA。当进行测试时，病人的样品被加入到测试管，其中也至少含有阳性对照，并且可含有阴性对照。
在上述方法的变化中，阳性对照可以从目的DNA上切除一小段的DNA(大约100个碱基)。
为了如图8所示的目的，可以假设病人有待检测的病原体指示物DNA。例如结核杆菌DNA。带有病人DNA的样品A-B，阳性对照DNA序列A-C-D-B和一种阴性对照DNA序列E-F被制备。所有DNA序列被变性，因此病人的DNA，阳性对照以及阴性对照为单链DNA形式。
测试柱120被制备其有三种单链捕捉DNA物质。阳性对照捕捉DNA122有一段与插入DNA序列C-D特异性结合的序列。目的捕捉DNA123有一段序列，在阳性对照DNA的切割位点的两侧(目的DNA点H的两侧)结合到目的DNA上。具体地，在目的DNA序列上的点H以及在阳性对照上的酶切点G是相同的。阴性对照DNA124有一段序列并特异结合于合成的DNA片段E-F。如图8所示，阳性对照捕捉DNA122，目的捕捉DNA123和阴性对照捕捉DNA124分别在网126,127和128上。在第四种网125上无DNA吸附。网125的目的是决定样品中背景的＂噪声＂。网125,126,127和128分别与柱120垂直。
当进行样品的实验时，其中包含病人的样品(目的DNA如果存在)以及阴性和阳性对照，样品被加入柱120。可以理解如果在样品中有任意阳性对照DNA A-C-D-B，其将与带有序列C-D的阳性对照捕捉DNA122结合，留下B位点邻近的一段序列，使其可与单链DNA探针(129)相结合。如果样品中有任何目的DNA A-B，其将与目的捕捉DNA123在酶切点H相结合，留下B位点附近的一段序列，使其可与单链DNA探针(129)相结合。
如果任何阴性对照DNA E-F在样品中，其将与阴性对照捕捉物DNA124相结合。当然，如果无目的DNA A-B存在，目的捕捉DNA123将仍然不被结合。可以理解阴性和阳性对照可以与病人样品分别被直接加入到测试柱中。
样品通过120柱后，网被冲洗以除去多余的未被结合到任何捕捉物的单链DNA。冲洗后，可以与目的序列A-B的未结合部分相结合的合成的单链DNA探针129通过柱120。如图8所示，序列接近位点B。探针129自身将会结合到存在的阳性对照DNA A-C-D-B或目的DNA A-B上，例如，在图8所示的B位点邻近的共同末端序列。本方法一优点是共同的探针序列可用作对照物和目的DNA。在图7所示的方法中，需要使用两种不同的探针序列。此外，图8所示的方法中，在对照物和目的DNA探针结合的特异性和亲和力是相同的。共同的反应机理为检测过程提供了一种更好的对照。
因为阴性对照DNA E-F并未含有探针129的序列，所以无探针129与阴性对照DNA E-F的结合。探针129上有一个检测标记用于检测探针的存在。如果没有与网126相关的检测信号，在柱中无阳性对照DNA A-C-D-B。缺失阳性对照信号指示操作的错误。如果存在与网128相关的检测信号，则探针已与一种不应存在的物质结合，该测试被怀疑存在问题。
虽然阴性对照是第二对照，除了从阳性对照获得信息外，阴性对照也提供了重要的信息，在正常条件下，用于阴性对照的网从不产生信号。如果一种信号从一种阴性对照网检测出来，表示存在几个问题。例如(1)探针不够特异；(2)柱子堵塞或者冲洗不完全；(3)冲洗液被污染，或者(4)样品被污染。例如，被病人所吃的特定的食物或药物中荧光含量高的物质所污染。当使用网125时，一些这样的情况也可以被检测出。
可选择地，用图8所示的方法在一种网上也可以有多于一种的单链捕捉DNA序列。在这种情况下，对照和测试DNA如果在相同的网上就不能含有用于探针结合的相同序列。用于对照和不同目的DNA的探针和标记也是不同的，因此不同DNA序列可以在一种网上被检测出。
如此处所述，对照DNA物质和任何目的DNA物质的检测信号可能受到一些背景干扰，这些干扰是样品中的其它物质与网的成分相互作用所导致。网125可以检测到背景干扰，对照DNA或目的DNA不受影响。从对照DNA或目的DNA的检测所获得的信号可以根据干扰程度进行调整。
可能的结果如表1表示表1
因此，可以看出所进行的检测试验对是否存在病原体指示物给出了一个高度可信的结果。
在可以重复利用的情况下，当在DNA方法中需重复利用柱子时，柱子可以用变性液通过柱子表面被清洗。这导致了捕捉物重复成为单链捕捉物。然后向柱子中加入只与被结合的目的物质结合而不与捕捉物结合的探针和触发化合物，并检测任何反应。正常情况下，没有反应被检测出并且柱子可以被冲洗而重新利用。如果有任何反应被检测出，则需用变性液进一步处理。此循环过程可以用图8所示的DNA分析方法。
在另一方面，本发明也提供了检测样品中RNA的方法。在从前已知的方法中，必须分离RNA并把RNA转变为DNA。这将导致RNA的丢失和/或降解。有时RNA的丢失在90％以上。本发明克服了此问题并且在本测试方法中大大提高了效率，即使有RNA的丢失也是很少的。此外，如与本发明相关的其它实施例所述，提高了测试的可靠性和准确性。
用于检测样品中一段RNA序列存在的方法包括如下步骤(a)提供了一种阳性对照单链DNA序列。
(b)加入测试样品和阳性对照DNA序列到测试柱中，其中柱子有至少两种网，所述的一种网其上有第一对照单链捕捉DNA序列用于结合阳性对照单链DNA序列；至少所述的一种网上有专门与样品中相应的目的RNA序列单链捕捉DNA序列，因此阳性对照DNA序列与第一对照单链捕捉DNA序列相结合形成一种双链阳性对照DNA序列，并且样品中存在的RNA序列与目的单链捕捉DNA序列相结合形成双链DNA/RNA复合体；(c)加入一种冲洗液到柱子中以除去未结合的阳性对照DNA和目的RNA；(d)加入一种酶到柱子中去破坏单链DNA和RNA；(e)加入一种变性液去分离已形成的双链对照DNA序列和双链DNA/RNA复合体，然后加入一种冲洗液除去变性的非捕捉单链DNA和RNA序列，因此单链捕捉DNA序列在每种网上重新形成；(f)加入DNA探针去提供在步骤(e)中产生的可检测的单链捕捉DNA序列的标记；(g)加入一种冲洗液到柱子中除去未结合的探针；以及(h)检测来自每种网的任何信号。
本方法可以进一步包括加入可与标记反应的底物以产生可检测的信号。有不同的模式用于实施RNA检测方法。在一个模式中，阳性对照单链DNA序列与目的RNA序列不同并且第一对照单链捕捉DNA序列与目的单链捕捉DNA序列不同。此外，步骤(f)中应用的DNA探针与第一对照捕捉物和目的捕捉序列不同。
在另一种模式中，阳性对照单链DNA序列有一部分其与目的RNA序列的一部分有相同的序列。第一对照单链捕捉DNA和目的单链捕捉DNA在捕捉序列有相同的序列。因此共同的DNA探针被用在步骤(f)中用于检测重新形成的对照和目的捕捉序列。
此外，RNA检测方法的步骤(a)还可以包括提供一种阴性对照单链DNA序列，其与目的RNA序列和阳性对照DNA序列不同。在这种情况下，步骤(b)进一步包括加入阳性对照DNA到测试柱中，其也含有一种对照网其上有第二对照单链捕捉DNA序列。该第二对照捕捉DNA序列部分与阴性对照DNA序列相配，因此阴性对照DNA序列与第二对照捕捉DNA序列相结合，形成双链DNA序列，其也有未结合的单链部分。步骤(f)DNA探针与步骤(e)中形成的形成的部分第二对照单链捕捉DNA序列不相配并且在二者之间无结合发生。因此正常条件下，步骤(h)中第二对照网上无信号被检测出。
也有利用阴性对照的不同模式。在一种模式中，第二对照单链捕捉DNA序列与目的捕捉DNA和第一对照捕捉DNA序列不同。
在一种可供选择的模式中，第一对照捕捉DNA，第二对照捕捉DNA和目的捕捉DNA在捕捉序列的一部分有相同的序列。在步骤(f)中利用一种相同的DNA探针检测再形成的对照和目的捕捉序列。
本发明的一种RNA检测过程的模式大体如图9A所示。阳性和阴性对照被合成。例如，阳性对照DNA A-B以及阴性对照DNA G-E被合成。它们都是单链DNA序列。但是用做阳性和阴性对照的核苷酸序列不同于目的RNA C-D。
测柱140被制备其有3种单链捕捉DNA。阳性捕捉DNA142有一段序列其与阳性对照序列A-B特异性结合。目的捕捉DNA143有一段序列其与如果存在的目的RNA C-D结合。阴性对照捕捉DNA144含有序列E-F其将部分地。例如30-70％，结合到阴性对照序列G-E，即，结合的(双)链较单链G-E序列或E-F序列短。如图9A所示，阳性对照捕捉DNA142，目的捕捉DNA143和阴性对照捕捉DNA144分别在网146,147和148上。在第四种网145上其中没有附着捕捉DNA。网145的作用是检测样品中背景“噪声”。网145,146,147和148分别与柱140垂直。
当进行测试时，病人的样品(目的DNA，如果存在)以及阳性对照被加入柱140。可以理解，阳性对照DNA A-B将与阳性对照捕捉DNA142结合并且如果样品中有任何目的RNA C-D其将与目的捕捉DNA143结合。当然，如果无目的RNA C-D存在，目的捕捉DNA143将不被结合。
样品通过柱140后，网被冲洗，除去未与任何捕捉物相结合的多余的单链序列。然后将阴性对照DNA G-E通过柱140。序列G-E将与目的捕捉DNA144结合。冲洗后，S1核酸酶通过柱子。因为S1核酸酶破坏了单链DNA，没有相互结合的阴性对照DNA G-E和阴性对照捕捉E-F的单链部分将被破坏。这将从阴性对照捕捉物上剩余双DNA的小片段。很明显，如果其它的单链捕捉物(142或143)未被结合，也会被破坏。
柱子被重新冲洗后双链物在被再次冲洗前被变性。然后，合成的单链DNA探针(在图中未示)被加到柱140中用于检测留在柱子中的任何单链阳性对照捕捉DNA142和单链捕捉DNA143。探针上有检测标记，其被用作检测探针的存在。如图7所示，在RNA分析中利用单链DNA探针检测的机理与DNA分析中相同。
类似于图7中的DNA分析，用图9A的RNA检测方法，一个单独的网上可以有不止一种单链捕捉DNA序列。同一网上的不同单链捕捉DNA序列的标记不同，所以可以在同一个网上检测不同的DNA序列。
图9B显示出RNA检测的另一种模式。阳性对照和阴性对照的基本概念仍与上述DNA和RNA检测中的相同。图9B中举例说明的方法有一个共同的单链捕捉DNA部分a-b，在用于分别捕捉阳性对照和阴性对照以及目的RNA序列的三个捕捉序列的一个末端。此不同于图9A的方法，其中的阴性对照捕捉DNA序列没有与阴性对照以及目的捕捉序列部分相同的部分。接着上述图9A所述的相同方法，在加入S1核酸酶后，阴性对照捕捉序列的共同部分a-b将被酶破坏，然后被冲洗剂洗去。因为共同部分a-b是一个未结合的单链部分。一个带有标记的常用的探针在变性和最终的冲洗步骤后被应用。如果样品中存在目的RNA，该探针将与重新生成的阳性对照捕捉序列的共同部分a-b结合。网上将会检测到信号。然而，正常的操作条件下在有阴性对照序列的网上没有检测到信号。因为阴性对照捕捉序列a-b将不再存在。在此情况下，如果上述噪音水平的任意信号在阴性对照网上被检测到，表明操作的错误。图8中说明的前面讨论的DNA检测方法的所有四种可能的错误在此也可能存在。此外，在这种情况下，错误也可能由所用的S1核酸酶的质量和效率引起。因此，作为一个优点，本方法可进一步说明和调控试剂以及仪器的操作条件，确保检测的质量。
在图9B中，为便于说明，共同的捕捉部分a-b定位于捕捉序列的一个末端。然而，可以理解，共同部分可以是捕捉序列的任意位置。此外，为探针结合以及然后检测的目的，可以有多于一个共同部分。
计算机可被用于处理和显示检测器的信号。优选地，计算机用于控制运输设备的指示、指令使用试剂、控制加至柱中及如果存在的清洗点的试剂的量。计算机的使用增强了方法的重复性和可靠性。可以理解其它的控制方法也可被应用，例如，机电法。
图10A到10C是分配样品或试剂到柱中的一种仪器，也称为样品分配仪，其包括一个样品储存器157和一个穿刺器151。图10A显示了一个柱150其包括小室151,152,153和154。在上部小室151的顶部155有一个释放喷嘴156，其同轴于柱150的纵轴。上部小室151也称为小孔。分离柱150的是一个样品容器157，其有一个开放的较低的末端158和一个可关闭的上端159或有导入空气或其它气体的装置。侧样品室157是一个带有中心穿孔的环状圆盘160，其用薄膜162密封，其中的薄膜能够被穿孔。样品小室157含有试剂161。优选地，样品小室157的内径大于小室151的外径。可以理解，尽管图10A到10C显示的试验柱和样品分配器为圆柱形的，可选择的，只要孔和喷嘴合适，柱和分配器也可是其它形状的，例如正方形或矩形。
在图10C中，放置了样品容器157，所以环状圆盘160恰好在传输喷嘴156上方。如图10B中所示，由于样品容器157较低，喷嘴156引起刺穿薄膜162且允许试剂151流入柱150。在图10A到10C所给的特定的实施例中，室151有双重的功能，一个刺穿薄膜162的穿刺器分配液态样品以及一个柱连接体，在样品容器与柱之间提供一个连接。
本说明书附图的柱为垂直排列的。可以理解柱可以为水平排列。例如，柱的小室可以被并行的放置。在这种情况下，在网上有对照捕捉物质的小室可被放置在网上有实验捕捉物质的小室旁。因此，一个对照和一个实验对可同时进行。在带有对照捕捉物的对照物和带有捕捉物的测试物问的专一性比较小时，这种结构更合适。
在另一方面，本发明提供了一个试剂盒，其包括(a)一个用于实验材料分析的柱；以及(b)用于检测实验材料的存在的试剂。试剂盒中的柱有至少两个网，一个其上有用于检测第一对照物质存在的第一对照捕捉物质，另一个网上上有用于检测一个实验材料的捕捉物质。试剂盒中的柱也可至少有两个小室，每一个小室有一个网，一个小室在网上有第一对照材料用于检测第一对照材料的存在，以及另一个小室有用于检测一个待检测的实验材料的捕捉材料。试剂盒也包括清洗液用于除去柱中过量的试剂。
如此处所显示的，本发明的方法有广泛的应用。应用范围包括与癌症，自身免疫疾病，传染性疾病，瘀血以及与兽医医学有关的研究和诊断。例如，本发明的DNA法可被用于N.淋病，H.ducfeyi,trepona pallidum,人乳头状瘤病毒(HPV)，单一疱疹病毒(HSV)，传染性软疣病毒(MC)，阴道毛滴虫的诊断。RNA法可用于人类免疫缺陷病毒(HIV)的诊断。
可以理解，仅仅通过增加网、加入捕捉材料以及检测材料，可在一个单柱中进行多个实验。例如，用于特定蛋白，DNA序列和RNA序列的实验可同时进行。
本发明通过引用优选的实施方案被描述。然而，应理解为发明不限于此，本发明的范围由权利要求限定，而不是被说明书限定。
权利要求
1．一种检测测试样品中测试物质存在的方法，包括步骤(a)在一个测试柱中加入一种测试样品和一种对照物质，该柱至少有两个网，所述的一个网上有一种对照捕捉物质；至少所述的一个网有一种目的捕捉物质其特异于测试样品中的待检测的相关测试物质，以使对照捕捉物质与对照物质结合，形成一种结合的对照物质；并且目的捕捉物质与相关的测试物质结合形成结合物质；(b)冲洗测试柱，除去没有被结合到捕捉物质上的物质；以及(c)检测每一个网上结合物质的存在。
2．根据权利要求1的方法，其中所述的对照物质与测试样品分别加入测试柱。
3．根据权利要求1的方法，其中所述的在测试柱加入对照物质是在样品加入测试柱之前进行的。
4．根据权利要求1的方法，其中所述的方法进一步包括加入一种标记物到每一种结合物质中，以形成标记结合物质，然后检测标记结合物质的存在。
5．根据权利要求1的方法，其中所述的测试物质是选自含有DNA,RNA,PNA，抗原，抗体，蛋白以及能够特异性结合DNA,RNA和蛋白的物质的组中的一种。
6．一种检测测试样品中DNA序列存在的方法，包括步骤(a)使测试样品变性，形成待检测的单链目的DNA序列；(b)加入测试样品和第一单链对照DNA序列到测试柱中，其中的柱有至少两个网，所述的一个网上有一种第一对照单链捕捉DNA序列；至少所述的一个网有一种目的单链捕捉DNA，其特异于测试样品中的相关目的DNA序列，且其中的目的捕捉DNA序列将与测试样品中的相关目的DNA序列结合形成一个双链DNA序列，以及第一对照捕捉DNA序列将与第一对照DNA序列结合形成一个双链对照DNA序列；(c)加入一种冲洗液到柱中除去未结合的DNA；(d)加入酶到柱中以破坏单链DNA；(e)加入一种变性溶液分离形成的双链DNA序列，然后加入冲洗液除去变性的非捕捉单链序列，以使单链捕捉DNA序列在每一网上重新生成；(f)对步骤(e)中形成的单链捕捉DNA序列加入DNA探针，提供可检测的标记；(g)加入一种冲洗液到柱中除去未结合的DNA探针；(h)检测每一网上的任何信号。
7．根据权利要求6的方法，其中的方法进一步包括加入一种与标记物反应的底物，以发出可检测的信号。
8．根据权利要求6的方法，其中的第一单链对照DNA被加至测试柱中以选自下列组的一种方式(1)与测试样品分别加入；(2)在加入样品到测试柱中之前加至所述的测试样品中。
9．根据权利要求6的方法，其中的步骤(b)进一步包括加入一个第二对照单链DNA序列到测试柱中；其中的测试柱也有一个对照网，其上有第二对照单链捕捉DNA序列。
10．根据权利要求6的方法，其中所述的网在一个单独的网上有多于一个单链捕捉DNA序列。
11．根据权利要求10的方法，其中的标记物因为一个单独的网上有不同的单链捕捉DNA序列而不同，所以不同的DNA序列可在一个单独的网上被检测。
12．根据权利要求6的方法，其中所述的测试柱另有一个其上没有捕捉DNA的网。
13．根据权利要求6的方法，其中所述的酶为S1核酸酶。
14．一种检测测试样品中的DNA序列存在的方法，包括步骤(a)提供一种阳性对照单链DNA序列；(b)变性测试样品，使要检测的目的DNA序列形成单链；(c)导入测试样品和阳性对照DNA序列到测试柱中，其中的柱有至少两个网，所述的一个网上有一种第一对照单链捕捉DNA序列，用于结合阳性对照DNA序列的一部分；至少所述的一个网有一种目的单链捕捉DNA，其特异于测试样品中的相关目的DNA序列，以使阳性对照DNA序列结合于第一对照单链捕捉DNA序列，其中的结合阳性对照DNA序列有一个双链部分和一个单链部分；且测试样品中的目的DNA序列结合于目的捕捉DNA序列，其中的结合的目的DNA序列有一个双链部分和一个单链部分；(d)加入一种冲洗液到柱中除去未结合的DNA；(e)加入DNA探针提供可检测的标记物，连接在步骤(c)中形成的结合的阳性对照DNA序列的单链部分与结合的目的DNA序列的单链部分；(f)加入一种冲洗液到柱中除去未结合的DNA探针；(g)检测每一网上的任何信号。
15．根据权利要求14的方法，其中的方法进一步包括加入一种与标记物反应的底物，发出可检测的信号。
16．根据权利要求14的方法，其中的阳性对照单链DNA由用于检测的目的DNA序列制备，制备方式选自下列组的一种(1)在预定的剪切点插入一个对照DNA片段到目的DNA序列中；(2)在预定的剪切点从目的DNA中除去DNA的小片段。
17．根据权利要求14的方法，其中的阳性对照单链DNA用选自下列组的一种方式加至测试柱中(1)与测试样品分别加入；(2)在加入样品到测试柱中之前被加至所述的测试样品中。
18．根据权利要求14的方法，其中的步骤(c)进一步包括加入一个阴性对照DNA序列到测试柱中；其中的测试柱也有一个其上有一个用于结合阴性对照DNA序列的第二对照单链捕捉DNA序列的对照网，以使阴性对照DNA序列结合于第二对照捕捉序列，形成一个结合的阴性对照DN序列。
19．根据权利要求18的方法，其中方法进一步包括阴性对照单链DNA序列的制备；其中的阴性对照DNA序列有一个不同于目的DNA序列以及不同于阳性对照DNA序列的DNA序列。
20．根据权利要求14的方法，其中所述的测试柱另有一个其上没有捕捉DNA的网。
21．根据权利要求14的方法，其中所述的网在一个网上有多于一个单链捕捉DNA序列。
22．根据权利要求21的方法，其中的探针和标记物是不同的，因为一个单独的网上结合有不同的单链捕捉DNA序列，所以不同的DNA序列可在一个单独的网上被检测。
23．一种检测测试样品中的RNA序列存在的方法，包括步骤(a)提供一种阳性对照单链DNA序列；(b)导入测试样品和阳性对照DNA序列到测试柱中，其中的柱有至少两个网，所述的一个网上有一种第一对照单链捕捉DNA序列用于连接阳性对照DNA序列；至少所述的一个网有一种目的单链捕捉DNA序列，其特异于测试样品中的相关目的RNA序列，所以阳性对照DNA序列结合于第一对照单链捕捉DNA序列，形成一个双链阳性对照DNA序列；且测试样品中的RNA序列结合于目的捕捉DNA序列，形成一个双链DNA/RNA复合物；(c)加入一种冲洗液到柱中除去未结合的阳性对照DNA和目的RNA；(d)加入一种酶到柱中破坏单链DNA和RNA；(e)加入一种变性溶液来分离形成的双链对照DNA序列和双链DNA/RNA复合物，然后加入冲洗液除去变性的非捕捉DNA和RNA序列，以使单链捕捉DNA序列在每一网上再生成；(f)加入DNA探针提供可检测的标记物，用于步骤(e)中形成的单链捕捉DNA序列；(g)加入一种冲洗液到柱中，除去未结合的DNA探针；以及(h)检测来自每一网上的任何信号。
24．根据权利要求23的方法，其中的方法进一步包括加入一种与标记物反应的底物以发出可检测的信号。
25．根据权利要求23的方法，其中的阳性对照DNA序列不同于目的RNA序列，第一对照捕捉DNA序列不同于目的捕捉DNA序列；其中的步骤(f)使用的DNA探针不同于第一对照捕捉序列和目的捕捉序列。
26．根据权利要求23的方法，其中的阳性对照DNA序列有一部分与目的RNA序列相同；其中的第一对照捕捉DNA和目的捕捉DNA在部分捕捉序列中有一个共同的序列，所以共同的DNA探针被用在步骤(f)中用于再生成的对照和目的捕捉序列的检测。
27．根据权利要求23的方法，其中步骤(a)进一步包括提供一个阴性对照单链DNA序列，其不同于目的RNA序列和阳性对照DNA序列；其中的步骤(b)进一步包括加入阴性对照DNA到也有第二对照单链捕捉DNA序列的对照网的测试柱中；其中的第二对照捕捉DNA序列部分地匹配于阴性对照DNA序列，使得阴性对照DNA序列结合于第二对照捕捉DNA序列，以形成一个双链DNA序列，其也有未结合的单链部分；其中在步骤(f)中，DNA探针不匹配于步骤(e)中形成的再生成的部分第二对照单链捕捉DNA序列，在探针和第二对照捕捉之间没有结合产生，因此，在步骤(h)中正常的条件下没有来自第二对照网的信号被检测到。
28．根据权利要求27的方法，其中的第二对照捕捉DNA序列不同于目的捕捉DNA和第一对照捕捉DNA序列。
29．根据权利要求27的方法，其中的第一对照捕捉DNA，第二对照捕捉DNA序列以及目的捕捉DNA在捕捉序列的部分有一个共同序列；以及一个共同DNA探针被用在步骤(f)中用于再生成的以及目的捕捉序列的检测。
30．根据权利要求27的方法，其中的对照DNA序列以一种选自下列组的方式被加至测试柱中(1)与测试样品分别加入(2)在加入样品到测试柱中之前在样品中加入对照DNA序列。
31．根据权利要求23的方法，其中所述的网在一个单独的网上有多于一个单链捕捉DNA序列。
32．根据权利要求31的方法，因为一个网上的捕捉DNA序列的不同，其中的标记物也不同，所以不同的DNA序列可在一个单独的网上被检测。
33．根据权利要求23的方法，其中所述的测试柱另有一个没有捕捉DNA的网。
34．根据权利要求23的方法，其中所述的酶为S1核酸酶。
35．用于检测测试物质的柱，该柱至少有两个网，所述的一个网上有用于检测第一对照物质的第一对照捕捉物质；且至少所述的一个网有一种用于检测待测试物质的测试捕捉物质。
36．权利要求35所述的柱，该柱有一个网其上有一种第一对照捕捉物质，且大多数的网分别有一个特异的测试捕捉物质，用于检测一种特异的待检测的试验物质；其中的测试捕捉物质彼此不相同。
37．权利要求35所述的柱，其中的柱有一个其上有第一对照捕捉物质的网，至少一个网其上有测试捕捉物质，用于检测一种待检测的试验物质，以及一个其上有第二对照捕捉物质的网，用于检测第二对照物质存在。
38．权利要求35所述的柱，其中的网沿着柱的纵向分开，互不相连。
39．权利要求35所述的柱，其中的柱包括至少两个小室，每一小室有一个网，所述的一个小室有第一对照捕捉物质在网上，用于检测第一对照物质的存在；至少一个所述的小室有一种测试捕捉物质在网上，用于检测待检测的测试物质。
40．权利要求39所述的柱，其中的柱还有一个在网上有第二对照物质的小室，用于检测第二对照物质的存在。
41．权利要求39所述的柱，其中所述的小室有依次连接不同小室的连接装置，沿着小室的纵轴，小室间通过连接装置被连接。
42．权利要求39所述的柱，其中所述的小室被并行放置。
43．权利要求35所述的柱，其中所述的网位于一个网盘上，该盘位于垂直于纵向的杆的平面上。
44．一种试剂盒，包括(a)一个用于分析测试物质的柱，其中所述的柱有至少两个网，一个网上有一种用于检测第一对照物质存在的第一对照捕捉物质，且至少一个所述的网其上有一种目的捕捉物质，用于检测待检测的测试物质；以及(b)用于检测测试物质存在的试剂。
45权利要求44的试剂盒，其中所述的网包含在一个小室中；其中至少两个小室被连接在一起形成所述的柱。
46．一种用于样品中测试物质的装置，包括(a)一个柱操作系统，包括柱支架以及卸载测试柱的柱卸载器；(b)一个用于加样品到测试柱中的样品点；(c)一个试剂点；(d)一个检测测试柱中的对照物质和测试物质的检测点；以及(e)一个包括一个旋转框架其携带柱支架的固盘传送带；其中的固盘传送带传送测试柱到样品点，试剂点，以及检测点。
47．权利要求46的装置，其中的样品点包括一个柱推动器和一个在柱推动器顶端排列成一行的压力盘；当安装有样品分配器的测试柱被装进固盘传送带的柱支架上，以及当固盘传送带传输柱子经过样品点时，柱子滑到柱推进器的顶端而停留在压力盘的下面；其中产生的压力使得样品分配器将样品分配进测试柱。
48．根据权利要求46的装置，其中的柱操作系统进一步包括一个自动柱装载器。
49．根据权利要求46的装置，其中的试剂点有传输装置，传输已测定量的试剂到柱中。
50．根据权利要求46的装置，其中的检测点有多种检测仪用于检测在柱上网中的对照物质和测试物质的存在。
51．根据权利要求46的装置，其中的检测点有多种检测仪，用于检测网上多于一种的对照物质和多于一种的测试物质。
52．一种样品分配器，包括(a)一种样品容器，其包括一个侧壁以及一个连接于侧壁的底部；其中所述底部有一个用能被穿透的薄膜密封的孔；(b)一个穿透器，其上有一个传输喷嘴用于穿透所述孔的薄膜。
53．根据权利要求52的样品分配器，其中的穿透器连接于测试柱；当样品容器被安装在穿透器的顶部且位于柱的下部时，所述的穿透器穿透样品容器的薄膜，将样品容器中的液体样品分配到测试柱中。
全文摘要
本发明公开了检测样品中的测试物质存在的方法和装置。将被测样品加入到至少有两种网的测试柱中。其中的一种网有用于检测对照物存在的对照捕捉物质。其它的每一种网有特异于待检测物质的捕捉物质。捕捉物质将与相应的测试物质结合形成结合物质,然后冲洗测试柱,除去没有结合到捕捉物质上的物质。最终,在每一个网上检测结合物质的存在。本方法用于检测样品中的病原体指示物,特别是适用于DNA和RNA的检测。
文档编号A61K35/12GK1301311SQ99806438
公开日2001年6月27日 申请日期1999年6月5日 优先权日1998年6月8日
发明者陈海星 申请人:Acgt医药公司