专利名称：乙酰胆碱增强剂的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及喹啉衍生物，更具体地说，本发明涉及属于乙酰胆碱增强剂的喹啉衍生物，特别涉及乙酰胆碱增强剂N-[2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氢-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮富马酸单盐，后面称作化合物A(“Cm.A”)。
背景技术：
阿耳茨海默氏病(早老性痴呆，或“AD”)是一种病因学不明的疾病。AD的普遍有害作用是认知功能的逐渐缺失。目前研究了若干治疗该疾病的途径。然而，迄今为止，只有一种途径显示有足够的临床安全性和有效性因而被美国食品和药物管理局(“FDA”)批准可以上市。这种治疗途径集中于抑制乙酰胆碱酯酶(“AChE”)。AChE是一种降解神经递质乙酰胆碱(“ACh”)的酶。降解过程被抑制后，ACh神经递质在神经裂缝中停留的时间延长，从而增加该神经递质的化学和功能效果例如增强认知功能。FDA批准了两种这样的AChE抑制剂1,2,3,4-四氢-9-吖啶胺(即“他克林”，THA；“COGNEX”)和donepezil(E2020；“ARICEPT”)。欧洲允许上市的AChE抑制剂为rivastigmine(ENA713；“EXELON”)。这三种化合物明显的副作用是恶心和/或呕吐。这种副作用限制了医师对病人按照没有副作用的最大剂量用药，显然是因为例如这种副作用可能使病人不服用所有需要的剂量，或者这种副作用可能导致病人完全停止服用这种药物。
当AChE的抑制是解决AD相关性临床缺陷的一种途径时，另一种途径可能增加ACh的产生。据报道，5-羟色胺5-HT3受体拮抗剂增加了ACh的神经释放。参见例如Ramirez,M.J等.,712:2脑研究(BrainRes)274(1996)；Crespi,D.，等35:4药理学研究(Pharmacol.Res)351(1997)；和Roychoudhurg,M.和Kulkani,S.K.,19:1 Methods FindExp.Clin.Pharmacol.43(1997)。另外据报道，与年龄相当的对照组相比，患有AD的病人中5-HT3受体认知部位的浓度没有变化，可参见Barnes,N.M.,等.,1:3-4神经报道(Neuroreport)253(1990)。另外还报道了5-HT3受体拮抗剂能够抑制呕吐，参见Parikh,P.M.等在印度癌症杂志(Indian J.Cancer)33:1,17(1996)。
在USP 5,190,951、USP 5,540,934和USP 5,300,517中公开了喹啉衍生物具有AChE活性。
需要具有多重治疗机理的化合物。例如，对于治疗神经学疾病例如AD来说，优选既能抑制AChE活性又能增加ACh神经产生的化合物，这样在临床上把ACh、AChE抑制和AD之间建立了有益的联系。本发明正是涉及这种以及其它重要目的。
发明的公开本发明提供ACh增强剂的精选的喹啉衍生物。在优选的方案中，提供具有下列结构的乙酰胆碱增强剂
在一些优选的方案中，乙酰胆碱增强剂是上述化合物的可药用盐。特别优选的ACh增强剂为N-[2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氢-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮，即 在一个非常特别优选的实施例中，乙酰胆碱增强剂为N-[2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氢-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮，富马酸单盐，即 此处称作化合物A(“Cm.A.”)。
本发明还提供在含有乙酰胆碱酯酶和5-羟色胺5HT3受体的系统中既抑制乙酰胆碱酯酶又拮抗5-羟色胺5HT3受体的方法。在优选的方案中，这些方法包括把优先选自下式化合物或其可药用盐的乙酰胆碱增强剂引入到系统中
在更优选的方案中，化合物是 或其可药用盐。在更特别优选的方案中，乙酰胆碱增强剂具有下式结构 本发明还提供含有乙酰胆碱增强剂的药物组合物。在优选的方案中，药物组合物含有下式化合物 或其可药用盐。
在更优选的方案中，药物组合物含有下式化合物 或其可药用盐，其中可药用盐优选 本发明还提供既抑制乙酰胆碱酶又拮抗5-羟色胺5HT3受体的方法，包括对需要抑制乙酰胆碱酯酶和拮抗5-羟色胺5HT3受体的人提供本发明的药物组合物，所述组合物优选包括 或 附图的简要描述
图1A显示N-[2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氢-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮的结构。
图1B显示图1A的化合物的特别优选的盐N-[2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氢-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮富马酸单盐(“Cm.A”)的结构。
图2A-F表示在自由活动的清醒幼龄大鼠(2A,2C,2E)和成年大鼠(2B,2D,2E)的纹状体微透析样品中，Cm.A、他克林(“THA”)和E2020对Ach细胞外含量的作用结果。在第0分钟给药化合物(腹膜内注射.，如箭头符号所示)。对照组动物注射生理盐水(腹膜内注射)。各个点表示含S.E.M.的平均值(N=4-6)。*,**相对于对照组，P＜0.05,0.01。
图3A-C表示在自由活动的清醒大鼠海马微透析样品中，Cm.A(3A)、THA(3B)和E2020(3C)对Ach细胞外含量的作用结果。在第0分钟给药化合物(腹膜内注射.，如箭头符号所示)。对照组动物注射生理盐水(腹膜内注射)。各个点表示含S.E.M.的平均值(N=6)。*,**相对于对照组，P＜0.05,0.01。
图4A-B表示在麻醉大鼠中，Cm.4A和THA(4B)对5-HT引起的von Bezold-Jarish效应(“BJE”)的抑制作用效果图，每10分钟注射1个大丸剂剂量的5-羟色胺。各个点表示含S.E.M.的平均值。*,**相对于对照组，P＜0.05,0.01。
图5表示在被动回避任务中Cm.A对东莨菪碱诱导的记忆缺失的作用结果图。各柱表示含S.E.M.的平均值。##相对于未处理组P＜0.01。**相对于对照组，P＜0.01。
图6表示在被动回避任务中Cm.A对环己酰亚胺诱导的记忆缺失的作用结果图。各柱表示含S.E.M.的平均值。##相对于未处理组P＜0.01。*,**相对于对照组，P＜0.05,0.01。
图7表示在被动回避任务中，用Cm.A和THA进行单次处理对BF-损害诱导的记忆缺失的作用结果。各柱表示含S.E.M.的平均值。#,##相对于伪处理组P＜0.05,0.01。*,**相对于对照组，P＜0.05,0.01。
图8表示在被动回避任务中，用Cm.A、THA和E2020进行反复处理对BF-损害诱导的记忆缺失的作用结果。各柱表示含S.E.M.的平均值。#,##相对于伪处理组P＜0.05,0.01。*,**相对于对照组，P＜0.05,0.01。
图9表示在射线迷宫任务中Cm.A对由东莨菪碱诱导的空间记忆缺失的作用结果示意图。各柱表示含S.E.M.的平均值，*,**相对于对照组，P＜0.05,0.01。
图10表示在射线迷宫任务中，用Cm.A反复处理2星期，其对由SEP损害诱导的空间记忆缺失的作用结果。各柱表示含S.E.M.的平均值，*相对于对照组，P＜0.05。
图11A-B表示在水迷宫任务中Cm.A(11A)和THA(11B)对东莨胆碱诱导的空间记忆缺失的作用结果示意图。各个点表示10-12只大鼠的平均值。*,**相对于东莨胆碱组，P＜0.05,0.01。
图12A-C表示在水迷宫任务中，Cm.A(12A)、THA(12B)和E2020(12C)对BF-损害诱导的记忆缺失的作用结果。各个点表示7-12只大鼠的平均值。*,**相对于BF-损害对照组，P＜0.05,0.01。
图13A-B表示Cm.A(13A)和THA(13B)对成年大鼠的空间学习改进结果示意图。各个点表示7-10只大鼠的平均值。*,**相对于未处理组，P＜0.05,0.01。
图14A-F为一系列同Cm.A有关的化合物结构，分别称为Cm.B-Cm.G，它们都属于乙酰胆碱增强剂。
图15是一个柱状图，其总结了对动物腹膜注射Cm.A以测定该化合物结合5HT3受体的能力。
发明详述USP 5,190,951、USP 5,540,934和USP 5,300,517公开了用于抑制AChE的喹啉衍生物(包括其盐及其哌啶衍生物)。这些参考文献报道了这些喹啉衍生物用于治疗或预防“痴呆”以及用于治疗“患有痴呆或具有患痴呆危险性”的人。根据这些参考文献，老年性痴呆被分为脑血管型和早老性痴呆型两大类。在上述专利文献中还公开了制备这些喹啉衍生物的方法，同时还报道了在这些喹啉衍生物中精选的化合物显示具有抗AChE活性以及具有改善东莨胆碱诱导的记忆缺失的作用。上述专利文献全文在此引入作为参考。
据发现，根据本发明，在上述文献中公开的所选择的化合物(包括Cm.A)还属于5-HT3受体的强拮抗剂。5-HT3受体的拮抗剂特别能够导致神经递质ACh的神经释放(例如.,Ramirez，文章同上)。在肠内壁也分布着HT3受体，因此如上所述，5-HT3受体拮抗剂可防止呕吐反应(例如Parikh，文章同上)。本领域技术人员知道，临床上已经评价并且被美国批准上市的AChE抑制剂的一种最普遍副作用就是呕吐。而对于例如AD等疾病来说，可以认为这样的副作用在临床上是可以接受的，如果这样化合物的效果是最低限度，则这种临床上可接受的副作用可能导致病人停止用药。而且，这样的副作用可能因实际原因阻止医师对病人提供较高剂量的这种药品。
因此，如果一个化合物不但具有多重作用治疗模式，并且还有助于降低某些同半机械学类似治疗有关的副作用，那么这样的化合物将在病人和医师可用的治疗库上提供巨大的改进。此处描述的这些化合物包括Cm.A就是这样的化合物。
在一些优选的方案中，提供具有下列结构的乙酰胆碱增强剂 和上述化合物的可药用盐。特别优选的ACh增强剂为N-[2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氢-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮，即 在一个特别优选的方案中，乙酰胆碱增强剂为N-[2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氢-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮富马酸单盐，即 此处称化合物A(“Cm.A.”)。
本发明还提供在包括乙酰胆碱酯酶和5-羟色胺5HT3受体的系统中既抑制乙酰胆碱酯酶又拮抗5-羟色胺5HT3受体的方法。在优选的方案中，所述方法包括把乙酰胆碱增强剂引入到该系统中，所述乙酰胆碱增强剂优先选自下式化合物 和其可药用盐。
在一些更优选的方案中，所述化合物为 或其可药用盐。在更特别优选的方案中，所述乙酰胆碱增强剂具有下式结构 本发明还提供含有乙酰胆碱增强剂的药物组合物。在优选的方案中，所述药物组合物包括下式化合物 或其可药用盐。
在更优选的方案中，所述药物组合物包括下式化合物 或其可药用盐，其中的可药用盐优选 本发明还提供既抑制乙酰胆碱酶又拮抗5-羟色胺5HT3受体的方法，包括对需要抑制乙酰胆碱酯酶和拮抗5-羟色胺5HT3受体的人提供本发明的药物组合物，所述组合物优选包括 或
下面将详细描述，Cm.A显示为AChE抑制剂(参见实施例2)和5-HT3受体拮抗剂(能够增加神经性ACh的释放)(参见实施例4)，并且同相同剂量的THA和E2020相比，Cm.A显示没有这两个化合物所具有的副作用例如呕吐(参见实施例1，下同)。由于具有双重机理(抑制AChE和拮抗5-HT3受体)，本发明化合物(例如Cm.A.)在此称为“乙酰胆碱(ACh)增强剂”。
已经指出，在上面的美国专利参考文献中已经公开了制备这样的化合物的方法。此处公开的化合物可药用盐包括可药用的酸加成盐、金属盐、铵盐、有机胺加成盐和氨基酸加成盐。酸加成盐的例子为无机酸加成盐例如盐酸盐、硫酸盐和磷酸盐，和有机酸加成盐例如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐和乳酸盐；金属盐的例子为碱金属盐如锂盐、钠盐和钾盐，碱土金属盐如镁盐和钙盐，铝盐和锌盐；铵盐的例子为铵盐和四甲基铵盐；有机胺加成盐的例子为同吗啉和哌啶加成的盐；氨基酸加成盐的例子为甘氨酸盐、苯丙氨酸盐、谷氨酸盐和赖氨酸盐。特别优选富马酸单盐。
根据本发明方法的优选方案，把本发明的组合物或化合物引入到既需要抑制乙酰胆碱酯酶又需要拮抗5-羟色胺5-HT3受体的系统中。此处所用的术语“引入到…系统中”指把所需要的化合物或组合物以同活性组份一致的方式放入系统中，这样既引起系统中乙酰胆碱酯酶的抑制，同时又拮抗系统中存在的5-羟色胺5-HT3受体。术语“系统”即包括生物体特别是哺乳动物尤其是人，又包括体外系统例如诊断检测等。因此应该认识到可以通过多种途径把本发明的化合物和组合物引入到系统中。在更优选的方案中，所述系统为既需要抑制乙酰胆碱酯酶又需要拮抗5-羟色胺5HT3受体的病人例如AD病人。因此，“引入到系统中”包括给药至病人。
含有公开的化合物的优选药物组合物为片剂；假设是例如AD疾病，优选该治疗剂经口服给药。然而，还可以发现其它给药途径用于本发明方法。因此，此处提供的化合物可以通过同可药用非毒性赋形剂和载体混合制备成药物组合物。如前所述，由于AD的特性，虽然优选口服给药，特别是以片剂或胶囊的形式，但有用的组合物也可以制备成用于胃肠外给药剂型，包括液体溶液剂或栓剂；鼻内给药剂型特别是粉剂、滴鼻剂或气雾剂；或者经皮给药剂型例如透皮贴剂。
本发明的组合物可以方便地以单位剂型给药，可以通过药物领域公知的任意方法制备，例如通过雷明顿药物学(Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,Easton,PA,1980)。胃肠外给药制剂可以含有下列物质作为通常的赋形剂，例如无菌水或生理盐水、聚二元醇类例如聚乙二醇、油和植物源以及氢化萘等。特别地，生物可兼容的、生物可降解的交酯类聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或者聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以作为有用的赋形剂用于控制活性化合物的释放。这些活性化合物的其它非常有用的胃肠外给药系统包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入性输注系统和脂质体。吸入给药制剂含有例如乳糖作为赋形剂，或者可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘氨胆酸酯或者脱氧胆酸酯的水溶液，或者是滴鼻剂形式给药的油性溶液或者鼻内给药的凝胶。胃肠外给药制剂还可以含有用于颊给药的甘氨胆酸盐(酯)、直肠给药的水杨酸盐(酯)或阴道给药的柠檬酸。透皮贴片制剂是优选的亲脂性乳剂。
根据一系列因素包括给药剂量、所用化合物的化学特性(例如疏水性)和给药途径，此处所描述的化合物在治疗组合物中的浓度可以变化。一般来说，可以在含有0.1-10％w/v的胃肠外给药化合物的水性生理缓冲溶液中提供本发明的化合物。优选的给药剂量可能取决于下列因素例如疾病或病症的类型和进展程度、具体病人的总体健康状况、所选化合物的相对生物效应和化合物辅料制剂以及给药途径。
可以在药物组合物中应用本发明的化合物作为唯一的活性成分。或者，本发明的化合物可以同其它活性成分联合用药。
提过下列实施例可以更进一步说明本发明，这些实施例是用于说明本发明，它们不能被认为并且不是用于限制本发明的范围或权利要求书的范围。实施例在下列实施例中的化合物由SSP公司(以前为日本东京SS制药公司(SS Pharmaceuticals,Co.,Tokyo,Japan)提供。实施例1肝毒性分析A．2周研究为了研究Cm.A、THA和E2020的肝毒性，把它们分别以5mg/kg/天的剂量口服给药至Cynomologous猴，每天给药一次，共给药2周。检测下列参数体重、临床指征、食物消耗量、血液生化参数(GOT、GPT、ALP、LDH、γ-GTP、ChE、Bil、T.Pro、Alb、A/G比、T.Cho、NEFA、TG)。给药期间结束后，处死动物，进行尸体剖检。对器官和组织称重，然后进行组织病理学检测。
给药期间，THA和E2020引起偶然的呕吐反应和软粪便(或腹泻)；Cm.A也引起软粪便，但程度比另两个化合物轻。对于用E2020给药的猴，食物消耗量明显减少，体重明显减轻。给药THA或E2020引起血液生化参数的明显变化在THA处理组，ALP和TG升高；在E2020处理组，LDH、T.Cho、NEFA和TG升高。在所有给药组中，尸体剖检、器官重量检测和组织病理学检测均没有检测到太多的变化。检测结果总结在表1中。
表1Cm.A、THA和E2020(口服2周)的肝毒性总结
-没有明显变化 ↑升高；↓降低+轻微++严重(腹泻)这些结果支持的观点是同THA和E2020相比，Cm.,A具有较低的总毒性；Cm.A不显示肝毒性。
B．4周研究把Cm.A、THA或E2020口服给药至Cynomologous猴，给药四(4)周。测试期间，用三种不同方案对动物给药第一种方案，以10mg/kg/天的剂量对动物给药7天，然后经32天冲刷期；第二种方案，以5mg/kg/天的剂量对动物给药14天，然后以10mg/kg/天的剂量对动物给药7天。检测下列参数体重、临床指征、食物消耗量、血液生化参数(GOT、GPT、ALP、LDH、γ-GTP、ChE、Bil、T.Pro、Alb、A/G比、T.Cho、NEFA、TG)。
THA和E2020显示严重的呕吐反应；同时还观测到软粪便或腹泻，体重减轻，食物消耗量减少；某些血液生化参数的变化(TG和NEFA升高，ChE和T.Cho降低)也非常明显。用Cm.A处理的动物显示极小的不利临床指征，食物消耗量和体重没有明显变化。在Cm.A处理的动物组中观测到TG略微升高。结果总结在表2中。
表2Cm.A、THA和E2020(口服4周)的肝毒性总结
-没有明显变化↑升高；↓降低± 数次+++多次这些结果证明同等剂量下，与THA和E2020相比，Cm.A在这些检测参数方面显示较少的毒性特征。实施例2对乙酰胆碱酯酶活性的抑制作用用Cm.A、THA或E2020对Wistar大鼠口服给药。1小时后，处死大鼠，分离出脑部，将其分成若干部分。通过Ellman’s方法测定在海马、纹状体、前皮层和顶骨皮层中AChE的活性。参见，Ellman,G.L.，等.，7生化药物学(Biochem.Pharmacol.)88(1961)。结果总结于表3。
表3Cm.A、THA和E2020对在不同脑部位中AChE活性的作用
*.**相对于对照值P＜0.05,0.01表3中结果证明THA和E2020在相当高的剂量下显示抑制海马中的AChE活性；Cm.A以非剂量依赖性方式抑制AChE(即所有剂量)。实施例3乙酰胆碱的释放A．对纹状体中ACh释放的作用应用自由活动的大鼠，经微透析系统，通过HPLC和ECD方法，连续检测从大鼠脑纹状体(前囟，A:0.2mm,L:3.0mm,H:4.0mm)中得到的灌注液中的ACh含量。参见Messamore,E.，等，32神经药理学.291(1993)和Kawashima,K.，等，350 Naunyn-Schmiedeberg’sArch.Pharmacol.523(1994)。经超过2小时的平衡期后，从5份中获得基本ACh含量。腹膜内注射化合物，然后进行微透析分析3小时。结果总结于图2。
在幼龄大鼠(2月龄的Wistar鼠)，Cm.A(10,30mg/kg)以剂量依赖性方式增加灌注液中的ACh含量分别至131％和369％。尽管有这些增加，几乎没有显示中枢作用的胆碱能症状(例如震颤、咀嚼和打哈欠)(数据未显示)。另一方面，同Cm.A相比，THA和E2020都更高程度地增加ACh的含量，并且维持时间更长，但它们同时显示前面所述的中枢作用的胆碱能症状，同Cm.A相比症状更严重(数据为显示)。
对于成年大鼠(25-27月龄的Fischer 344)，也得到在幼龄大鼠中显示的类似增加，但作用持续时间长于幼龄大鼠。E2020在成年大鼠中的作用比在幼龄大鼠中的作用要差一些，这可能是因为ACh的预处理含量较高的原因(图2F)。除E2020处理的成年大鼠外，在幼龄Wistar大鼠和幼龄以及成年Fisher344大鼠之间，纹状体中的基本ACh含量基本相同。
B．对海马中ACh释放的作用应用自由活动的大鼠，经微透析系统，通过HPLC和ECD方法，连续检测从大鼠脑海马(前囟A:-5.8mm,L:5.0mm,H:4.0mm)中得到的灌注液中的ACh含量。(参见Messamore,E.，和Kawashima,K.，等，350文献同上)。经平衡期后，从5份中获得基本ACh含量。腹膜内注射测试物质，然后进行微透析分析3小时。结果总结于图3。
Cm.A(10,30mg/kg)以剂量依赖性方式增加灌注液中的ACh含量分别为164％和552％。几乎没有观察到中枢作用的胆碱能症状(例如震颤、咀嚼和打哈欠)(数据未显示)。THA和E2020也显示出类似于用Cm.A所观测到的ACh含量增加，但THA的作用较弱些；而且，在增加ACh含量的同时，实施例3A中讨论的胆碱能症状比Cm.A更明显。实施例4
5-HT3受体A．体内研究-对外周5-HT3受体的拮抗作用对麻醉大鼠静脉注射5-羟色胺大丸剂(5-HT)(20μg/kg)，通过活化大鼠的外周5-HT3受体，暂时性引起反射性心动过缓(von Bezole-Jarish作用B.J.E)。应用B.J.E作为模型，测试了Cm.A、THA和E2020对外周5-HT3受体的作用。结果总结于图4。
应用Cm.A的预处理以剂量依赖性方式抑制B.J.E(3至10mg/kg，静脉注射)，血压和心率没有变化(数据为显示)。THA显示略微有降低反射的倾向，但THA在10mg/kg的剂量下引起严重的高血压、多涎和震颤(数据未显示)。E2020(0.1～1mg/kg，静脉注射)不显示对B.J.E的抑制作用，并且E2020在大于1mg/kg的剂量静脉注射时引起高血压、多涎和震颤(数据未显示)。
B．体外研究-IC50测定应用市售5-羟色胺5-HT3结合测试(NovaScreen,Hanover,MD)研究了许多化合物包括Cm.A对5-HT3受体的结合亲和力。受体源为NIE-115细胞(参见Lunnis,S.C.R.和Kilparick,G.J.,189:Evr.
Jrnl.Pharmacol.223(1990)；和Hoyer,D.和Heijt,H.C.,33分子药理学(Mol.Pharmacol.,)303(1988))。参照化合物为一种5-HT3受体拮抗剂“MDL72222”。在25℃下，让反应在含有150nM氯化钠的20mMHEPES(pH7.4)中进行60分钟。在玻璃纤维滤器上快速真空过滤终止反应。检测过滤器上残留的放射性，并将其同对照值进行比较。
在上述条件下，测定Cm.A的IC50值为1.18×10-6(相对地，测定MDL 72222的IC50值为1.74×10-8)。在上述条件下，测定Cm.A的Ki值为5.52×10-7(相比较，测定MDL72222的Ki为8.15×10-9)。表4显示许多的Cm.A相关化合物及类似物的IC50和Ki的比较值(按照上面用于CmA同样的方法测定)。
表4
Cm.B和Cm.D的IC50值(分别为210nM和83nM；按照上述参考专利文献中列出的方法确定)同Cm.A的值相当。参见图14A-14F中Cm.B-Cm.G的结构。
C．5HT3受体的体外结合动物把10mg/kg剂量的Cm.A(在90％乙醇、10％水、载体中)(n=3)或载体(n=3)腹膜内注射至动物(Sprague-Dawley大鼠)。经30分钟后，处死动物，迅速解剖脑部，在维持-42℃温度下的异戊烷中冷冻。在低温恒温器中制备切片(水平和冠状)，在维持-20℃温度下储存。
放射自显影从储存器中取出脑切片，室温解冻30分钟。应用在50mMHEPES/TRIS缓冲盐中的0.5nM(3H)-zacopride(Amerhsam；zacorpide为5-HT3选择性配体)孵育切片，在这些切片中测定总5HT3受体结合。在放射性配体和500nM 5-HT的存在下，测定所孵育的相邻切片间的非特异性结合。室温培养10分钟后，在冰冷的缓冲液中洗涤切片(2×10分钟)，然后用冰冷的蒸馏水洗涤10秒钟。在冷空气流中干燥切片过夜。干燥后，把切片同X-射线胶片(Kodak Hyperfilm)接触，共接触4个月。
分析应用自动图像分析系统DAGE照相机图像软件对放射自显影图像进行分析。从每组，对照组(注射载体)和Cm.A中四个单独的测定中得到平均光学密度；从不接触组织的X-射线区域获得背景测定。测定在称为“杏仁核”的脑区域进行。结果如图15中的柱形格式所示。这些结果表明化合物Cm.A占据了脑内部5HT3受体部位，因为在对照的脑切片中，监测出放射标记的5HT3选择性配体的无能。实施例5抗健忘研究A、被动回避应用雄性Wistar大鼠，应用分段通过型(step through-type)、2-隔室(光和暗)箱进行被动回避研究。在认知试验中，在动物进入黑暗区域的时候，关闭截断门，用电刺激动物(0.5-0.8mA，3秒)。24小时后，进行停留试验把大鼠放于光亮区域，测定动物进入到黑暗区域之前的时间(潜伏期)。截止潜伏期设为600秒。在认知试验前30分钟口服测试物质。
1、东茛胆碱诱导的记忆缺失在认知试验前15分钟让大鼠腹膜内注射东莨胆碱(0.5mg/kg)15分钟。同未处理组相比，东莨胆碱明显缩短了潜伏期。在0.1、0.3和3.0mg/kg的剂量下，Cm.A明显逆转了东莨胆碱的效应，结果总结于图5。
2、环己酰亚胺诱导的记忆缺失在电刺激后，立即用环己酰亚胺(1.5mg/kg)，一种蛋白合成的抑制剂，s.q.处理大鼠。同未处理组相比，环己酰亚胺还明显缩短了潜伏期。Cm.A以非剂量依赖性方式延长了环己酰亚胺诱导的缩短的潜伏期。结果总结于图6。
3、基体前脑(BF)损害诱导的记忆缺失应用Paxinos.G和Watston,C:The Rat Brain in StereotaxicCoosrdinates，第2版，Academic Press,San Diego,CA(1986)中的趋实体性图片集，在两侧鉴定基体前脑(前囟，A:1.4mm,L:±2.6mm,H:-7.0mm)，从其中插入一对微量调节注射器，通过该注射器注入鹅膏蕈氨酸(各7.5μg)以去除神经支配。2星期后，进行认知试验，经单次或多次给药后测定Cm.A、THA和E2020的作用。
Cm.A降低BF-损害的大鼠的潜伏期。单次给药Cm.A(0.03-1.0mg/kg)能够部分但非常显著地恢复由BF损害诱导的记忆缺失，参见图7。另外，图8结果表明与THA和E2020相比，多次给药Cm.A(0.03-0.3mg/kg/天)1星期显示同样有效或更有效的促进恢复。
B．8-港湾放射状迷宫(Eight-arm radial maze)应用雄性Wistar大鼠，应用8-港湾放射状迷宫任务评价Cm.A对空间认知的抗健忘作用。经多次空间认知试验后，应用建立记忆的大鼠(其具有多于7个正确选择，并且错误少于1)。
1、东莨胆碱诱导的空间记忆缺失在建立空间记忆的大鼠中，腹膜内注射东莨胆碱(0.5mg/kg)明显引起正确选择减少，错误增多。口服Cm.A(0.03-0.3mg/kg)明显改善了空间认知缺陷。参见图9。
2、内侧间隔核(Medial septal nucleus,SEP)损害引起的空间记忆缺陷按照实施例4A中BF损害方式，通过微注射鹅膏蕈氨酸(10μg)损害SEP(前囟，A:0.2mm,L:-1.0mm,H:-5.8mm)。
经多次处理2周，Cm.A(3.0mg/kg/天)明显改善了空间记忆缺失。参见图10。
C．水迷宫应用幼龄(2月龄)雄性Wistar大鼠或者幼龄(2月龄)和老龄(22月龄)雄性Fischer344大鼠，在下列参数下观测在Morris水迷宫任务(Morris,R.J.Neurosci.Meth.27(1984))中化合物的抗健忘作用。对于每次训练试验，把大鼠置于水(22℃)中，这样使动物面对环形池(直径150cm，高45cm)壁，然后在5个起始点之一(随机选择)开始。在每次试验中，记录下逃避到隐藏平台(处于四分体中间，低于水平面2cm)表面的潜伏期。在试验期间，每天重复这些步骤1次或2次。
1、东莨胆碱诱导的空间认知缺陷为了观测测试化合物的作用，共进行6次试验(第1天2次、第2天后每天1次)。在每次试验前30和60分钟分别给药东莨胆碱(0.5mg/kg，腹膜内注射)和测试化合物(口服)，结果总结于图11。
随着非处理组中的试验次数增加，逃避到平台表面的潜伏期逐渐减少。东莨胆碱明显地抑制这种认知方法。Cm.A(1.0mg/kg/天)改善了由东莨胆碱诱导的空间认知缺陷。在该试验中，THA显示没有明显作用。
2、基底前脑(BF)损害诱导的空间认知缺失即使经过多次学习7天后，BF损害的大鼠的逃避潜伏期也不减少。用0.3、1.0和3.0mg/kg/天的Cm.A口服处理改善了空间认知缺失。THA(1.0mg/kg/天)和E2020(0.3和1.0mg/kg/天)也改善了BF损害诱导的这种缺失。参见图12。
3、对老龄大鼠的作用与幼龄大鼠相比，老龄(22月龄)大鼠不能缩短潜伏期。即使经过11次试验后，在老龄大鼠中也只出现1次潜伏期的部分减少。然而，Cm.A逐渐把空间认知缺失改善到几乎等同于幼龄大鼠的水平。THA在此试验中显示类似的活性。参见图13。实施例6人Ⅰ相临床分析按照单次给药、双盲法、安慰剂对照、剂量增加研究方法进行了ⅠA相临床试验。该项研究涉及图1A化合物N-[2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氢-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮的特别优选盐(如图1B所示；N-[2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基]-2,3-二氢-9-甲氧基-1H-吡咯[3,4-b]喹啉-1-酮富马酸单盐)的安全性和药物动力学特性。把该化合物以2mg-180mg的剂量、在禁食状态下对50-75岁的健康志愿者(男性和女性)口服给药。共68例参加了该项研究并完成了试验。在此项研究中没有鉴定出最大耐受剂量，也就是说即使在180mg的剂量下，此项研究中，建立真正的“最大耐受剂量”也仅仅是不足够的副作用。确实，该研究中监测的任何安全性参数(生命指征、ECG、血液化学、血液学、尿分析和体格检查)均没有明显的临床学变化。并且没有报道严重的副作用；在接受化合物的个体中，该研究期间出现七次轻微的副作用，这些可能与化合物相关的副作用包括头痛和恶心。
应该注意批准的AChE抑制剂E2020(ARICEPTò)推荐剂量为5或10mg/天。参见Physicians Desk Reference,53版，1999，第960-963页。尽管属于临床建立的AChE抑制剂，没有记载E2020对5HT3受体有任何作用。
本申请文件中提到的各个专利、申请和印刷出版物均在此引入作为参考。
本领域技术人员将会明白，在不偏离本发明的精神状态下可以对本发明的优选实施方案作出许多改变和修改。所有这些变化均落入本发明的范围内。
权利要求
1．选自下式结构化合物和其可药用盐的乙酰胆碱增强剂
2．下式化合物
3．在包括乙酰胆碱酯酶和5-羟色胺5HT3受体的系统中既抑制乙酰胆碱酯酶又拮抗5-羟色胺5HT3受体的方法，该方法包括在所述系统中引入选自下式化合物和其可药用盐的乙酰胆碱增强剂
4．权利要求3的方法，其中所述化合物为 或其可药用盐。
5．权利要求4的方法，其中所述乙酰胆碱增强剂具有下列结构式
6．包括下式化合物或其可药用盐的药物组合物
6．包括下式化合物或其可药用盐的药物组合物
7．权利要求6的药物组合物，该组合物含有化合物
8．抑制乙酰胆碱酯酶和拮抗5-羟色胺受体5HT3的方法，该方法包括对需要的个体提供权利要求6的药物组合物。
9．抑制乙酰胆碱酯酶和拮抗5-羟色胺受体5HT3的方法，该方法包括对需要的个体提供权利要求7的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及具有双重治疗机理的喹啉衍生物,更具体他说,本发明涉及属于乙酰胆碱增强剂的喹啉衍生物,该化合物证明具有抑制乙酰胆碱酯酶活性和拮抗5－羟色胺5HT3受体的活性。特别优选的化合物是乙酰胆碱增强剂N－[2－(1－苄基哌啶－4－基)乙基]－2,3－二氢－9－甲氧基－1H－吡咯[3,4－b]喹啉－1－酮富马酸单盐,后面称作化合物A(“Cm.A”)。
文档编号A61P25/28GK1304411SQ99807110
公开日2001年7月18日 申请日期1999年6月9日 优先权日1998年6月10日
发明者德里克·T·查默斯, 佐藤进, 好田忠行 申请人:阿瑞那制药公司, Ss制药株式会社