来源于sart－1的肿瘤抗原肽的制作方法

专利名称：来源于sart－1的肿瘤抗原肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于SART-1的肿瘤抗原肽，更详细地讲，本发明涉及来源于SART-1的新型肿瘤抗原肽及其功能上具有同等特性的衍生物，以及体内或体外应用该肿瘤抗原肽及其衍生物的肿瘤治疗剂，预防剂或诊断药等。
背景技术：
已知有机体的免疫系统，特别是T细胞对其排除肿瘤起着重要作用。实际上，在人的肿瘤部位发现了对肿瘤细胞具有杀伤活性的浸用性淋巴细胞(Arch,Surg,126:200,1990)。从黑色素瘤中可比较容易地分离出识别自身肿瘤细胞的细胞毒性T细胞(CTL)(Immunol.Today,8:385,1987；J.Immunot,138:989,1987；Int.J.Cancer.,52:52,1992等)。另外，通过输入CTL而进行黑色素瘤治疗的临床效果提示了T细胞在肿瘤排除中的重要性(J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994)。
很长一段时间，人们不清楚攻击自身肿瘤细胞的CTL的靶分子是什么，但通过最近免疫学和分子生物学的进展而逐步明了。即，CTL应用T细胞受体(TCR)，通过识别叫做肿瘤抗原肽的肽与主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原(MHC-Ⅰ类抗原，人的叫做HLA抗原)形成的复合体而攻击自身的肿瘤细胞。
肿瘤抗原肽是肿瘤特有的蛋白质，也就是说它是肿瘤抗原蛋白在细胞内合成后，通过蛋白酶体，在细胞内分解而产生的。所生成的肿瘤抗原肽在内质网内与MHC-Ⅰ类抗原(HLA抗原)结合形成复合体运输到细胞表面，以完成抗原提呈。肿瘤特异的CTL识别该抗原提呈的复合体，通过细胞杀伤作用和淋巴因子的产生而发挥抗肿瘤效果。随着这一系列作用的阐释，通过将肿瘤抗原肽或肿瘤抗原蛋白作为所谓的癌疫苗应用，可达到增强肿瘤患者体内肿瘤特异性CTL的治疗方法。
作为肿瘤抗原蛋白质，一叫做MAGE的蛋白质是1991年由T.Boon等首次从黑色素瘤细胞鉴定出的(Science,254:1643,1991)。其后，主要从黑色素瘤细胞中鉴定出几个肿瘤抗原蛋白。作为黑色素瘤抗原，已鉴定出黑色素细胞组织特异的蛋白质-gp100(J.Exp.Med.,179:1005,1994)、MART-1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3515,1994)、酪氨酸酶(J.Exp.Med.,178:489,1993)等黑素体蛋白、不仅在黑色素瘤而且在各种癌细胞和正常睾丸细胞中表达的MAGE相关蛋白质(J.Exp.Med.,179:921,1994)、具有肿瘤特异的氨基酸突变的β-连环蛋白(J.Exp.Med.,183:1183,1996)、CDK4(Science,269:1281,1995)等。作为黑色素瘤以外的肿瘤抗原蛋白已鉴定出HER2/neu(J.Exp.Med.,181:2109,1995)、p53(突变型)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,93:14704,1996)等癌基因产物,CEA(J.Natl.Cancer.Inst.,87:982,1995)、PSA(J.Natl.Cancer.Inst.,89:293,1997)等肿瘤标志物，HPV(J.Immunol.,154:5934,1995)、EBV(Int.Immunol.,7:653,1995)等病毒蛋白等。这些抗原在综述(Immunol.Today,18:267,1997；J.Exp.Med.,183:725,1996；Curr.Opin.Immunol.,8:628,1996等)中有详细说明。
为了将肿瘤抗原蛋白和肿瘤抗原肽用于肿瘤的治疗和诊断，鉴定出广泛适用于扁平上皮癌(食道癌、肺癌等)的肿瘤抗原是重要的，因为扁平上皮癌的发生率远远高于黑色素瘤。于是本发明者们从食道癌来源的扁平上皮癌细胞克隆了编码肿瘤抗原蛋白的基因，首次从黑色素瘤之外的肿瘤细胞成功地克隆了编码新型肿瘤抗原蛋白质(SART-1)的基因，从该SART-1鉴定出几个与HLA-A26结合的肿瘤抗原肽(J.Exp.Med,187:277,1998，国际公开第97/46676号)。
期望这些肿瘤抗原肽在临床上实际应用时不仅可用1种而且可用多种不同的肿瘤抗原肽。也就是说并不限于所有的癌细胞均表达同一种肿瘤抗原。考虑到一个癌细胞上可提呈2种以上不同的肿瘤抗原肽，所以应用几种不同的肿瘤抗原肽进行治疗会更有效。事实上，应用单一的肿瘤抗原肽对黑色素瘤的效果不显著，因此尝试开发了几种肽的鸡尾酒式制剂(Int.J.Cancer,66:162,1996；Int.J.Cancer.67:54,1996)。鉴于这样的背景，希望鉴定出广泛适用于发生频率高的扁平上皮癌的新型肿瘤抗原肽。
本发明的目的是提供由SART-1而来的肿瘤抗原肽。也就是说，本发明的目的是提供由SART-1而来的肿瘤抗原肽及其功能上具有同等特性的衍生物，或者体内、体外应用这些肿瘤抗原肽及其衍生物的肿瘤治疗剂，预防剂或诊断剂。本发明的由SART-1而来的肿瘤抗原肽是与HLA-A24结合而被提呈的肿瘤抗原肽，日本人中约60％的HLA抗原为HLA-A24，所以它适用于大多数患者，再者，由于它广泛适用于发生频率高的扁平上皮癌，所以期待它能用作新型的抗肿瘤药。扁平上皮癌是人癌中发现最多的癌症的一种，尤其是食道癌和肺癌对现在的化疗法和放射法具有相对的抵抗性。从这一点来讲，期待开发出本发明的肿瘤抗原肽。
发明公开本发明者们对上述由SART-1而来的肿瘤抗原肽中与HLA-A24结合而被提呈的肿瘤抗原肽进行了研究，结果表明序列号1～5中的肽具有肿瘤抗原肽的活性，由此完成了本发明。
即，本发明的要点涉及(1)肿瘤抗原肽，它包括序列号1～5任一序号中氨基酸序列的全部或部分，且与HLA-A24抗原结合能被细胞毒性T细胞所识别，或者涉及其功能上具有同等特性的衍生物；(2)肿瘤治疗剂或预防剂，它包括至少1种选自上述(1)的肿瘤抗原肽及其衍生物的物质作为有效成分；(3)重组DNA，它包括至少一种编码上述(1)中肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA；(4)通过表达上述(3)中的重组DNA而获得的多肽；(5)肿瘤治疗剂或预防剂，它包括上述(3)中的重组DNA或上述(4)中的多肽作有效成分；(6)与上述(1)中的肿瘤抗原肽或其衍生物特异性结合的抗体；(7)抗原提呈细胞，它将HLA-A24抗原与上述(1)中的肿瘤抗原肽或其衍生物所形成的复合体提呈到从肿瘤患者分离出的具有抗原提呈能力的细胞表面；(8)肿瘤治疗剂，它包括上述(7)的抗原提呈细胞作有效成分；(9)细胞毒性T细胞，它能特异性识别HLA-A24抗原与上述(1)中的肿瘤抗原肽或其衍生物所形成的复合体；(10)肿瘤治疗剂，它包括上述(9)中的细胞毒性T细胞作有效成分；(11)肿瘤诊断药，它包括上述(1)的肿瘤抗原肽或其衍生物。
附图简述

图1表示提呈本发明的肿瘤抗原肽，表达HLA-A2402的VA-13细胞作用下，KE-4CTL产生的IFN-γ量。
本发明的最佳实施方案本发明中的肿瘤抗原肽包含序列号1～5任一序号中氨基酸序列的全部成部分，且与HLA-A24抗原结合能被细胞毒性T细胞(CTL)所识别，序列号1～5中的序列来自SART-1(J.Exp.Med.,187:277,1998；国际公开第97/46676号)也就是说，该肽是1)由序列号1～5中任一氨基酸序列构成的肽，或者2)含有序列号1～5中的任一种氨基酸序列，比该氨基酸序列较长的肽，或者由序列号1～5中任一氨基酸序列的一部分构成的肽，且与HLA-A24抗原结合而被CTL所识别的肽。
上面(1)的肽中适宜的包括由序列号3、4、5中的氨基酸序列所构成的肿瘤抗原肽，另外，上面(2)中肽的长度包括由8～11个氨基酸构成的肽。
上述肽可参照在普通的肽化学中所应用的方法进行合成，合成方法可按文献(肽合成(Peptide Synthesis),Interscience,New York,1966,蛋白质(The Proteins),Vol2,Academic Press Inc.,New York,1976；肽合成，丸善(株)1975；肽合成的基础和实验，丸善(株),1985，医药品的开发等第14卷，肽合成，広川书店，1991)等记载的方法进行。
本发明中讲的，与HLA-A24抗原结合而被CTL识别，是指本发明的肿瘤抗原肽与HLA-A24抗原结合形成复合体，CTL识别该复合体。
本发明的肿瘤抗原肽与HLA-A24抗原结合后能否被CTL所识别，也就是说该肽是否具有作为HLA-A24限制性肿瘤抗原肽的活性，可进行检测，例如按J.Immunol.,154,p2257,1993中记载的测定方法进行检测。具体而言，从HLA-A24抗原阳性的人分离末梢血淋巴细胞，体外添加候选的肽进行刺激时，测定它是否能诱导特异性识别该候选肽脉冲(pulsed)的HLA-A24阳性细胞的CTL。这里，有无诱导出CTL可进行检测，例如通过酶联免疫吸附法(ELISA)等测定对抗原肽提呈细胞产生反应了的CTL所产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量。此时的抗原肽提呈细胞(靶细胞)包括食道癌细胞株KE-4(FERM BP-5959)。另外，也可通过测定CTL对51Cr标记的抗原肽提呈细胞杀伤性的方法(51Cr释放方法，Int.J.Cancer,58:p317,1994)进行检测。再者可通过这样的方法进行检测将表达HLA-A24cDNA(Cancer Res.,55:4248-4252(1995),Genbank登录号M64740)的表达质粒导入COS-7细胞(ATCC No.CRL1651)和VA-13细胞(理化学研究所细胞银行)中，用候选肽进行脉冲，让KE-4CTL(FERM BP-5934)和上述CTL对该细胞进行反应，测定该CTL所产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量。
以下将这里叙述的测定方法称作“肿瘤抗原肽的测定法”。
本发明中所讲的“与肿瘤抗原肽功能上具有同等特性的衍生物”(以下有时略作肿瘤抗原肽衍生物)是指它是本发明的肿瘤抗原肽的氨基酸序列中有1个或数个氨基酸残基发生了改变的变异体，且具有与HLA-A24抗原结合能被CTL所识别的肿瘤抗原肽特性。也就是说，所有本发明肿瘤抗原肽的氨基酸序列中有1个或几个氨基酸残基发生改变了的变异体，并且具有与HLA-A24抗原结合而被CTL所识别的肿瘤抗原肽活性的，均包括在本发明的肿瘤抗原肽范围之内。
这里所讲的氨基酸残基的改变是指氨基酸残基的置换、缺失和/或添加(包括向肽的N末端、C末端添加氨基酸)，优选氨基酸残基的替代。在氨基酸残基进行替代时，只要是能维持肿瘤抗原肽的活性，所替换的氨基酸残基的数目及位置是任意的。
但是，与HLA-A抗原结合而被提呈的抗原肽的序列具有规律性(基元序列)，已知HLA-A24抗原时，由8～11个氨基酸构成的肽中，从N末端开始第2位的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，C末端的氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸(Immunogenetics,41:178,1995；J.Immunol.,152:p3913,1994；J.Immunol.,155:4307,1994)。另外，与在该基元序列基础上得到的氨基酸有相似性质的氨基酸残基也是许可的。因此，本发明的肿瘤抗原肽衍生物中也包括在这些基元序列上氨基酸可发生置换的位置上发生置换，即第2位和/或C末端的氨基酸替换或其它的氨基酸，且具有肿瘤抗原肽活性的衍生物。优选第2位和/或C末端的氨基酸置换成上述基元序列中可发生置换的氨基酸，且具有肿瘤抗原肽活性的肿瘤抗原肽衍生物。从与HLA-A24抗原结合而被提呈的观点来看，肽的长度优选为8～11个氨基酸。
具体的例子有包含序列号l～5任一项中将氨基酸序列的第2位置换成苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸中任一个和/或将C末端置换成苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸中任一个的氨基酸序列的全部或部分的序列。这里变异肽的例子分别显示于序列号6～l0中。另外，本发明的肿瘤抗原肽衍生物中也包括包含序列号17中氨基酸序列全部或部分的肽。
如前所述，本发明的肿瘤抗原肽是SART-1的一部分构成的包含具有HLA-A24结合基元序列的氨基酸的全部或部分的肽。同样，作为由SART-l的一部分构成，且具有HLA-A24结合基元序列的肽，包括由序列号11～16中的氨基酸序列所构成的肽。这些包括序列号11～16中氨基酸序列全部或部分的肽，或者在上述基元序列基础上将该肽进行改变了的肽衍生物等存在肿瘤抗原肽的活性，这通过前面所讲的活性测定方法可容易地筛选出。
本发明的肿瘤抗原衍生物，可与本发明的肿瘤抗原肽同样，用前示所讲的合成方法来合成候选肽，然后将之进行前述的肿瘤抗原肽测定方法，以此来鉴定它与肿瘤抗原肽是否具有功能上的同等特性。
本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物至少通过1种或2种以上的组合来用作肿瘤治疗剂或预防剂。本发明提供含有以肿瘤抗原肽或其衍生物为有效成分的肿瘤治疗剂或预防剂。当把本发明的肿瘤治疗剂或预防剂施用给HLA-A24阳性且SART-l阳性的患者时，肿瘤抗原肽或其衍生物被提呈到抗原提呈细胞的HLA-A24抗原上，对HLA-A24抗原复合体特异的CTL增殖，可破坏肿瘤细胞，从而可进行肿瘤的预防或治疗。由于SART-1广泛表达于食道癌、肺癌等扁平上皮癌，所以本发明的肿瘤治疗剂或预防剂适用范围广。再者，上述扁平上皮癌大多对化疗和放疗有抵抗性，而并用本发明的肿瘤治疗剂可增强其治疗效果。
为了建立细胞性免疫效果，本发明的肿瘤治疗剂或预防剂可与佐剂一起施用，或作为粒状剂型施用。佐剂可应用文献(Clin.Microbiol.Rev.,7:277-289,1994)中记载的。另外，作为脂质体制剂可考虑与直径数μm的珠子结合的粒状制剂、与脂类结合的制剂等。施用方法可考虑皮内施用、皮下、静脉注射等。制剂中本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的施用量要根据治疗的目的疾病、患者的年龄、体重等进行适宜调整，但通常是0.0001mg～1000mg，优选为0.001mg～1000mg，更优选0.1mg～10mg，数日～数月施用1次。
此外，本发明的肿瘤治疗剂或预防剂除以前于所述的本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物为有效成分外，可如下所述，以编码本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA和该DNA的表达产物-多肽作为本发明的肿瘤治疗剂或预防剂的有效成分。
近年来有应用编码所谓“多表位”(polytope)的DNA作DNA疫苗的方法，其中连结了多个CTL表位(例如J.Immunol.,160,p1717,1998等)。因此，连结至少1种或2种以上编码本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA，在某些情况下由与编码其它肿瘤抗原肽的DNA连结制成重组DNA，整合到适当的表达载体之后可作为肿瘤治疗剂或预防剂的有效成分。另外，不仅上述重组DNA可用作治疗剂或预防剂，该重组DNA在宿主细胞内表达而得到的多肽也可作为肿瘤治疗剂或预防剂的有效成分。
这里，“重组DNA”可在DNA合成及常规的基因工程学技术的基础上很容易地进行制备，例如参照Molecular Cloning 2nd Edt.,ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)等书。另外，将该重组DNA整合到表达载体中时也可参照前面的教科书。
所制备的本发明的重组DNA是否产生与HLA-A24抗原结合被CTL识别的肿瘤抗原肽，可通过以下方法进行测定。
即，首先，用具有候选重组DNA的表达质粒及具有编码HLA-A24抗原的eDNA(Cancer Res.,55:4248-4252(1995),Genbank登录号M64740)的表达质粒共转染COS-7细胞(ATCC CRL1651)和VA-13细胞(理化学研究所细胞开发银行)。转染可用脂质体转染法，如应用Lipofectamine试剂(GIBCO BRL公司)进行。然后加入HLA-A24限制性的CTL(例如KE-4CTL、FERM BP-5954)使之作用，测定CTL反应后产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量，例如用ELISA法等进行测定，以检测候选DNA是否具有活性。
当本发明的重组DNA用作肿瘤治疗剂或预防剂使用时，可使用以下方法。
即，作为将本发明的重组DNA导入细胞内的方法，可应用病毒载体的方法以及其它方法(日经科学，1994年4月，20-45页；月刊药事，36(1):23-48(1994)；实验医学增刊，12(15),(1994)以及它们引用的文献)中的任一种方法。
通过应用病毒载体的方法包括将本发明的DNA整合剂病毒的方法，如整合到逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒等DNA病毒或RNA病毒。其中特别优选应用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒等的方法。
其它方法有将表达质粒直接施用到肌肉内的方法(DNA疫苗法)、脂质体法、脂质体转染法、显微注射法、磷酸钙法、电穿孔法等，尤其优选DNA疫苗法、脂质体法。
当本发明的重组DNA作为试剂实际应用时，方法有将该DNA直接导入体内的in vivo法，以及从人采集某种细胞，体外将DNA导入该细胞，然后将该细胞转输给人体的ex vivo法(日经科学，1994年4月，20-45页，3月刊药事，36(1),23-48(1994)；实验医学增刊，12(13)(1994)及它们引用的文献等)。优选in vivo法。
通过in vivo法施用时要根据治疗的目的疾病、症状等通过适宜的施用途径给予。例如静脉、动脉、皮下、皮内、肌肉内施用等。当in vivo施用时常采用液态制剂的形式，通常制备成含有本发明的重组DNA作有效成分的注射剂，必要时可加入常用的载体。另外，在含有本发明重组DNA的脂质体或膜融合脂质体(仙台病毒(HVJ)-脂质体等)中，可制备成悬浮剂、冷冻剂、病么浓缩冷冻剂等脂质体制剂形式。
本发明的重组DNA在制剂中的含量可根据治疗的目的疾病、患者年龄、体重等进行适当调整，通常为0.0001mg～100mg，优选为0.001mg～10mg，优选数日～数月施用1次。
将本发明的重组DNA如上施用给肿瘤患者时，与该重组DNA相对应的多肽在抗原提呈细胞内高表达。其后，在细胞内分解，生成的单个肿瘤抗原肽与HLA抗原结合形成复合体，该复合体高密度提呈到抗原提呈细胞表面，该复合体特异的CTL在体内高效增殖，然后破坏肿瘤细胞。如上，来达到肿瘤的预防或治疗。
表达上述重组DNA而得到“多肽”的过程是，将上述重组DNA整合到适当的表达载体(例如pSV-SPORT1等)，制成表达质粒，将该表达质粒导入宿主细胞内得到转化体，在适当的培养基上培养该转化体，使之表达、生产。这里所讲的宿主细胞包括大肠杆菌等原核生物，酵母样单细胞真核生物、昆虫、动物等多细胞真核生物的细胞等。另外，基因导入宿主细胞的方法有磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电脉冲法等。可用一般的生化学方法对如上所得的多肽进行分离、纯化。该多肽是否产生与HLA-A24抗原结合而被CTL所识别的肿瘤抗原肽可这样检测例如本发明的多肽被巨噬细胞等吞噬细胞摄取，在细胞内形成肽片段，然后加入对该肽片段与HLA-A24抗原的复合体特异的KE-4CTL等CTL，然后测定CTL反应后产生的各种细胞因子(例如IFN-γ)的量，以此来进行检测。
本发明的多肽作为肿瘤治疗剂或预防剂使用时可与前面本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物采取同样地施用方式、施用方法及施用量。将本发明的多肽施用给肿瘤患者时，它被摄取到抗原提呈细胞内，然后在细胞内分解，生成的单个肿瘤抗原肽与HLA抗原结合形成复合体高密度提呈到抗原提呈细胞表面，对该复合体特异的CTL在体内有效增殖，从而破坏肿瘤细胞。如上达到肿瘤的预防或治疗。
本发明提供与本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物特异性结合的抗体。该抗体可很容易地制备，如参照Antibodies；A Laboratory Manual,Lane,H.D．等编辑，Cold Spring Harber Laboratory Press出版，New York,1989等中记载的方法。即，用本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物通过常用的方法免疫适宜的动物，获得识别肿瘤抗原肽或其衍生物的抗体，再制作中和其活性的抗体。抗体的用途包括亲和层析、免疫学诊断等。免疫学诊断可适当选择免疫印迹法、放射性免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光或发光测定法。
本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物、或本发明的重组DNA或使该重组DNA表达而得到的多肽，在肿瘤患者的治疗中可如下在体外应用。
即，本发明提供抗原提呈细胞，它能将本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物与HLA-A24抗原形成的复合体提呈到来源于肿瘤患者的具有抗原提呈能力的细胞表面。这里所讲的“具有抗原提呈能力的细胞”没有特殊限制，只要是其细胞表面表达可提呈本发明肿瘤抗原肽或其衍生物的HLA-A24抗原即可，特别优选提呈能力高的树突状细胞。
另外，由前面所讲的具有抗原提呈能力的细胞制备成本发明的抗原提呈细胞时要添加的物质，不仅可应用本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物，也可应用本发明的DNA或多肽。
本发明的抗原提呈细胞的获得是从肿瘤患者分离出具有抗原提呈能力的细胞，体外用本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物或本发明的多肽脉冲刺激该细胞，制备HLA-A24抗原与上述肽或其复合体形成的复合体(Cancer Immunol.Immunother.,46:82,1998；J.Immunol.,158:p1796,1997；Cancer Res.,59:p1184,1999)。应用树突细胞时的制备是例如通过Ficoll法从肿瘤患者的末梢血中分离出淋巴细胞，然后除去非粘附细胞，在GM-CSF、IL-4的存在下培养粘附细胞，诱导树突细胞，让该树突细胞与本发明的肿瘤抗原肽或多肽共培养，通过脉冲制备成本发明的抗原提呈细胞。
另外，通过将本发明的重组DNA导入上述具有抗原提呈能力的细胞而制备抗原提呈细胞时可参考Cancer Res.,56:p5672,1996和J.Immunol.,161:p5607,1998等进行。不仅DNA,RNA也可同样制备抗原提呈细胞，但此时参考J.Exp.Med,184:p465,1996等进行。
本发明提供含有以上述抗原提呈细胞为有效成分的肿瘤治疗剂。为了稳定保持抗原提呈细胞，优选该治疗剂中包含生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基等。施用方法可应用静脉内、皮下、皮内施用等。
当把上述治疗剂转输给患者体内时，看来在HLA-A24阳性且SAR-1阳性患者体内高效诱导特异性CTL，治疗肿瘤。
作为体外应用本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的方法，包括以下的过继免疫法。
即，在黑色素瘤患者中，体外大量培养患者本人的肿瘤浸润性T细胞，将之回输到患者体内的过继免疫法观察到治疗效果(J.Natl.Cancer.Inst.,86:1159,1994)。另外在小鼠的黑色素瘤中观察到体外用肿瘤抗原肽TRP-2刺激脾细胞，使肿瘤抗原肽特异的CTL增殖，将该CTL施用给移植了黑色素瘤的小鼠，可观察到肿瘤抑制(J.Exp.Med.,185:453,1997)。这是特异性识别抗原提呈细胞的HLA抗原与肿瘤抗原肽复合体的CTL增殖的结果。因此考虑到用本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物，或用本发明的重组DNA和多肽体外刺激患者末梢血淋巴细胞，使肿瘤特异的CTL增殖后，将该CTL回输给患者的治疗方法是有用的。
本发明还提供CTL，它能特异性识别上述HLA-A24抗原与本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物的复合体。
再者，本发明提供含有以本发明的CTL为有效成分的肿瘤治疗剂。为了稳定维持CTL，优选该治疗剂中包含生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、培养基等。施用方法有静脉内、皮下、皮内施用等。
将上述治疗剂回输到患者体内时，在HLA-A24阳性且SART-1阳性患者体内促进CTL对肿瘤细胞的杀伤作用，通过破坏肿瘤细胞治疗肿瘤。
本发明的肿瘤抗原肽及其衍生物可用作诊断肿瘤的诊断药成分。即，应用本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物作为诊断药，可通过从肿瘤可疑患者的样品(例如血液、肿瘤组织等)中检测出抗体的存在来进行肿瘤早期发现，再发、转移的诊断。另外，也可用于筛选肿瘤患者对以本发明的肿瘤抗原肽等为有效成分的医药的适用性。具体而言，可通过免疫印迹法、RIA、ELISA、荧光或发光测定法进行该诊断。
近年建立了一种应用抗原肽与HLA抗原的复合体，检测抗原特异性CTL的新检测方法(Science,274:p94,1996)。本发明的肿瘤抗原肽或其衍生物与HLA抗原的复合体可用于上述检测方法，通过肿瘤抗原特异性CTL的检测可进行肿瘤发现、再发、转移的诊断。即本发明提供含有本发明的肿瘤抗原肽及其衍生物的肿瘤诊断药。
具体而言，按文献(Science,274:p94,1996)中记载的方法制备HLA抗原与肿瘤抗原肽的复合体的4倍体，HLA抗原用荧光标记，用流式细胞仅对肿瘤可疑患者末梢血淋巴细胞中的抗原特异性CTL进行定量，以进行上述诊断。
以下通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限于这些 SART-1“725-733”Ala-Phe-Arg-Gln-Leu-Ser-His-Arg-Phe(序列号1的合成)。
树脂应用Fmoc-Phe-Alko Resin(O.56mmol 1g,100-200目)。应用该树脂100mg按后面的表1开始合成，按Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBn)-OH、Fmoc-Len-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH的顺序进行偶联。偶联后进行到后面流程图1的步骤3，得到肽树脂。
向所得树脂中加入2ml Reagent K(5％酚，5％茴香硫醚、5％H2O、2.5％乙硫醇/TFA溶液)，室温反应2.5小时、冰浴下向反应液中加入10ml二乙醚，搅拌10分钟，过滤，用10ml二乙醚洗涤。向存留物中加入10ml醋酸水溶液，搅拌30分钟后过滤，分出树脂，用4ml醋酸水溶液洗涤。将滤液冷冻干燥后，把所得粗肽溶解到醋酸水溶液中，注到预先用0.1％TFA水平衡过的反相系统填充剂COSMOSIL 5C18-AR柱(28φ×250mm)中，用0.1％TFA水洗柱，然后在200分钟内将乙腈的浓度增加到20％，以7ml 1min的流速洗脱。用200nm的吸光度监测洗脱液，收集合目标物的积分，冷冻干燥，得到18.4mg Ala-Phe-Arg-Gln-Leu-Ser-His-Arg-Phe。
用逆相系统填充剂YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)、用0％～60％含0.1％TFA的乙腈线性梯度洗脱法进行分析时，所得肽的保留时间为18.3分钟，其氨基酸分析值及质谱分析值与理论值一致。氨基酸分析水解1％酚/6N盐酸水溶液，110℃、24小时分析方法茚三酮法Ser:0.82(1)Glx:0.96(1)Ala:0.99(1)*Leu:1.00(1)*标准氨基酸Phe:1.91(1)His:0.92(1)Arg:1.72(2)()内为理论值质谱分析(FAB)[M+H]+:1161
流程图1步骤时间(分)×次数1．(洗涤)DMF 1.2ml 1×22．(脱保护)50％哌啶/DMF 12×13．(洗涤)DMF 1.2ml 1×74．(偶联)各氨基保护氨基酸(5当量)/NMP溶液0.9ml，DIC(5当量)/NMP溶液0.3ml30×15．(洗涤)DMF 1.2ml 1×26．(偶联)各氨基保护氨基酸(5当量)/NMP溶液0.9ml,DIC(5当量)/NMP溶液0.3ml30×17．(洗涤)DMF 1.2ml 1×4〔2〕SART-1“740-750”Lys-Met-Lys-Thr-Glu-Arg-Arg-Met-LYs-Lys-Leu(序列号2)的合成树脂应用Fmoc-Leu-Alko Resin(0.57mmol/g、100-200目)。应用该树脂100mg，与前面(1)同样顺次偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pme)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，然后进行脱保护。将所得粗肽溶解到醋酸水溶液中，注入预先用0.1％TFA水平衡过的逆相系填充剂COSMOSIL 5C18-AR柱(28φ×250mm)中，用0.1％TFA水溶液洗涤，然后在200分钟内将乙腈的浓度增加到21％，以7ml/min的流速洗脱。用220nm的吸光度监测洗脱液，收集含目标物的级分，冷冻干燥，得到38.1mg Lys-Met-Lys-Thr-Glu-Arg-Arg-Met-Lys-Lys-Leu。
用逆相系填充剂YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)，用含0.1％TPA的0％-60％乙腈线的梯度洗脱法进行分析时发现所得肽的保留时间为15.3分钟，其氨基酸分析值(但Met未检测到)及质谱分析值与理论值一致。氨基酸分析水解1％酚/6N盐酸水溶液，110℃、24小时分析方法茚三酮法()内为理论值Thr:0.88(1)Glx:0.91(1)*Leu:1.00(1)*为标准氨基酸Lys:3.39(4)Arg:1.64(2)质谱分析(FAB)[M+H]+:1448[3]SART-1“746-753”Arg-Met-Iys-Lys-Leu-Asp-Glu-Glu-Ala-Leu(序列号3)的合成树脂应用Fmoc-Leu-Alko Resin(0.57mmol/g,100-200目)。应用该树脂100mg，与前面(1)同样顺次偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH，然后脱保护。将所得粗肽溶解到醋酸水溶液中，注入用1％TFA水溶液平衡过的逆相系填充剂COSMOSIL 5C18-AR柱(28φ×250mm)，用0.1％TFA洗涤柱子，在200分钟将乙腈的浓度增加到20％，以7ml/min的流速洗脱。在220nm吸光度下监测洗脱液，收集含目标物的级分，冷冻干燥，得到24.6mgArg-Met-Lys-Lys-Leu-Asp-Glu-G1u-Ala-Leu。
应用反相系填充剂YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)，用0％-60％含0.1％TPA的乙腈线的梯度洗脱进行分析时发现所得肽的保留时间为17.4分钟，其氨基酸分析值(但Met未检测到)及质谱分析值与理论值一致。氨基酸分析水解1％酚/6N盐酸水溶液，110℃、24小时分析方法茚三酮法()内为理论值Asx:0.95(1)Glx:1.85(2)
Ala:0.97(1)*Leu:2.00(2)*标准氨基酸Lys:1.72(2)Arg:0.81(1)质谱分析(FAB)[M+H]+:1232[4]SART-1“746-756”Arg-Met-Lys-LYs-Leu-Asp-Glu-Glu-Ala-Leu-Leu(序列号4)的合成树脂应用Fmoc-Leu-Alko Resin(0.57mmol/g,100-200目)。应用该树脂100mg，与前面(1)同样顺次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH，然后进行脱保护。将所得粗肽溶解到醋酸水溶液中，注入到预先用0.1％TFA水溶液平衡过的反相系填充剂COSMOSIL 5C18-AR柱(28φ×250mm)中，用0.1％TPA水溶液洗涤后，将乙腈的浓度在200分钟内增加到23％，以7ml/min的流速洗脱。用220nm的吸光度监测洗脱液，收集含目标物的级分，冷冻干燥，得到28.8mg Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Asp-Glu-Glu-Ala-Leu-Leu。
用逆相系填充剂YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)，通过0％-60％含0.1％TPA的乙腈线的梯度洗脱进行分析时发现所得肽的保留时间为19.6分钟，其氨基酸分析值(但Met未检测到)及质谱分析值与理论值一致。氨基酸分析水解1％酚/6N盐酸水溶液，110℃、24小时分析方法茚三酮法()内为理论值Asx:0.98(1)Glx:1.87(2)Ala:0.97(1)*Leu:3.00(3)*标准氨基酸Lys:1.70(2)Arg:0.83(1)质谱分析(FAB)[M+H]+:1345[5]SART-1“738-766*”Lys-Met-Ser-Ser-Ser-Asp-Pro-Thr-Leu(序列号17)的合成树脂应用Fmoc-Leu-Alko Resin(0.57mmol/g,100-200目)。应用该树脂100mg，与前面(1)同样顺次偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，然后进行脱保护。将所得粗肽溶解到醋酸水溶液中，然后注入到预先用0.1％TFA水溶液平衡过的逆相系填充剂COSMOSIL5C18-AR柱(28φ×250mm)中，用0.1％TPA水溶液洗涤，然后在200分钟内将乙腈的浓度增加到17％，以7ml/min的流速进行洗脱。用220nm的吸光度监测洗脱液，收集含目标物的级分，冷冻干燥，得到24.1mgLys-Met-Ser-Ser-Ser-Asp-Pro-Thr-Leu。
应用逆相系填充剂YMC-PACK ODS-AM柱(4.6φ×250mm)，用0％-60％含0.1％TPA的乙腈线性梯度洗脱进行分析时发现所得肽的保留时间为16.3分钟，其氨基酸分析值(但Met未检测到)及质谱分析值与理论值一致。氨基酸分析水解1％酚/6N盐酸水溶液，110℃、24小时分析方法茚三酮法()内为理论值Asx:0.90(1)Thr:0.83(1)Ser:1.40(3)*Leu:1.00(1)*标准氨基酸Lys:0.83(1)Pro:0.88(1)质谱分析(FAB)[M+H]+:965
首先，用Ficoll法从HLA-A位点为A24结合型的健康人末梢血中分离淋巴细胞。加淋巴细胞到24孔板中，2×106细胞/孔，用含45％的RPMI 1640培养基、45％的AIM-V培养基、含10％的FCS及100U/ml的IL-2的培养基进行培养。向培养液中加入10μM的上述肿瘤抗原肽，刺激末梢血淋巴细胞。1周后，与经X线照射(50Gy)的约2×105个末梢血淋巴细胞一起加入上述肿瘤抗原肽10μM，进行第2次刺激。再过l周后，同样地进行第3次刺激。第3次刺激1周后，回收培养的淋巴细胞。以表达肿瘤抗原蛋白且HLA-A2402阳性的KE-4细胞及表达肿瘤抗原蛋白但HLA-A2402阴性的QG56细胞为靶细胞(1×104个)，用ELISA法测定上述淋巴细胞(8×104个)产生反应时培养上清中IFN-γ的量。结果如下面的表1中所示。
表1

从表1中可以看出用“746-75”、“746-756”及“758-766*”刺激的末梢血淋巴细胞对阴性对照的56产生非特异的反应，对KE-4显示较强的反应性。这表明它们可诱导抗原肽特异的CTL。序列表的单独文本(free text)序列号6记载的氨基酸序列中第2位的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，第9位的氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
序列号7记载的氨基酸序列中第2位的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，第11位的氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
序列号8记载的氨基酸序列中第2位的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，第10位的氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
序列号9记载的氨基酸序列中第2位的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，第11位的氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
序列号10中氨基酸序列的第2位为苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸，第9位的氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
产业上利用的可能性本发明提供来自SART-1的肿瘤抗原肽及其功能上具有同等特性的衍生物，或者提供体内或体外应用这些肿瘤抗原肽及其衍生物的肿瘤治疗剂、预防剂或诊断剂。本发明的肿瘤治疗剂或预防剂可适用于多数患者，且可广泛用于发生频率高的扁平上皮癌，所以期待它有抗肿瘤剂的应用性。
序列表<110>ITOH,Kyogo<120>来源于SART-1的肿瘤抗原肽<130>99-024-PCT<150>JP10/196152<151>1998-7-10<160>17<210>1<211>9<212>蛋白质<213>人<400>1Ala Phe Arg Gln Leu Ser His Arg Phe5<210>2<211>11<212>蛋白质<213>人<400>2Lys Met Lys Thr Glu Arg Arg Met Lys Lys Leu5 10<210>3<211>10<212>蛋白质<213>人<400>3Arg Met Lys Lys Leu Asp Glu Glu Ala Leu5 10<210>4<211>11<212>蛋白质<213>人<400>4Arg Met Lys Lys Leu Asp Glu Glu Ala Leu Leu5 10<210>5<211>9<212>蛋白质<213>人<400>5Lys Met Ser Ser Ser Asp Thr Pro Leu5<210>6<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变体<222>2<223>Xaa是Phe,Tyr,Met或Trp。<220><221>变体<222>9<223>Xaa是Phe,Leu,Ile,Trp或Met。<400>6Ala Xaa Arg Gln Leu Ser His Arg Xaa5<210>7<211>11<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变体<222>2<223>Xaa是Phe,Tyr,Met或Trp。<220><221>变体<222>11<223>Xaa是Phe,Leu,Ile,Trp或Met。<400>7Lys Xaa Lys Thr Glu Arg Arg Met Lys Lys Xaa5 10<210>8<211>10<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变体<222>2<223>Xaa是Phe,Tyr,Met或Trp。<220><221>变体<222>10<223>Xaa是Phe,Leu,Ile,Trp或Met。<400>8Arg Xaa Lys Lys Leu Asp Glu Glu Ala Xaa5 10<210>9<211>11<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变体<222>2<223>Xaa是Phe,Tyr,Met或Trp。<220><221>变体<222>11<223>Xaa是Phe,Leu,Ile,Trp或Met。<400>9Arg Xaa Lys Lys Leu Asp Glu Glu Ala Leu Xaa5 10<210>10<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变体<222>2<223>Xaa是Phe,Tyr,Met或Trp。<220><221>变体<222>9<223>Xaa是Phe,Leu,Ile,Trp或Met。<400>10Lys Xaa Ser Ser Ser Asp Thr Pro Xaa5<210>11<211>9<212>蛋白质<213>人<400>11Asp Phe Ser Ala Ser Ser Thr Thr Ile5<210>12<211>10<212>蛋白质<213>人<400>12Asp Phe Ser Ala Ser Ser Thr Thr Ile Leu5 10<210>13<211>10<212>蛋白质<213>人<400>13Val Tyr Cys Ile Glu Asp Lys Met Ala Ile5 10<210>14<211>11<212>蛋白质<213>人<400>14Lys Tyr Ser Arg Arg Glu Glu Tyr Arg Gly Phe5 10<210>15<211>8<212>蛋白质<213>人<400>15Gly Tyr Lys Pro Asp Val Lys Ile5<210>16<211>10<212>蛋白质<213>人<400>16Glu Tyr Val Asp Glu Thy Gly Arg Lys Leu5 10<210>17<211>9<212>蛋白质<213>人工序列<220><221>变体<400>17Lys Met Ser Ser Ser Asp Pro Phr Leu权利要求
1．肿瘤抗原肽及其功能上具有同等特性的衍生物，它包含序列号1～5中任一氨基酸序列的全部或一部分，且与HLA-A24抗原结合后能被细胞毒性T细胞所识别。
2．权利要求1的肿瘤抗原肽衍生物，它包含由序列号1～5中任一氨基酸序列的第2位和/或C末端氨基酸残基替换为其它氨基酸残基而得到的氨基酸序列的全部或一部分。
3．权利要求2的肿瘤抗原肽衍生物，它包含序列号6～10中任一氨基酸序列的全部或一部分。
4．权利要求1的肿瘤抗原肽衍生物，它包含序列号17中氨基酸序列的全部或一部分。
5．一种肿瘤治疗剂或预防剂，它含有选自权利要求1-4任一项中的肿瘤抗原肽及其衍生物的至少1种作为有效成分。
6．一种重组DNA，它含有至少一种DNA编码权利要求1-4任一权利要求中的肿瘤抗原肽或其衍生物的DNA。
7．一种多肽，它是使权利要求6中的重组DNA表达而得到的。
8．一种肿瘤治疗剂或预防剂，它含有权利要求6中的重组DNA或权利要求7中的多肽作有效成分。
9．一种抗体，它能与权利要求1-4任一项中的肿瘤抗原肽或其衍生物特异性结合。
10．一种抗原提呈细胞，它能将HLA-A24抗原与权利要求1-4任一项中的肿瘤抗原肽或其衍生物形成的复合体提呈到从肿瘤患者分离出的具有抗原提呈能力的细胞表面。
11．权利要求10中的抗原提呈细胞，它是将权利要求6中的重组DNA或权利要求7中的多肽掺入从肿瘤患者分离出的具有抗原提呈能力的细胞内得到。
12．一种肿瘤治疗剂，它含有权利要求10或11中的抗原提呈细胞作有效成分。
13．一种细胞毒性T细胞，它能特异性识别HLA-A24抗原与权利要求1-4任一项中的肿瘤抗原肽或其衍生物所形成的复合体。
14．一种肿瘤治疗剂，它含有权利要求13中的细胞毒性T细胞作有效分。
15．一种肿瘤诊断剂，它含有权利要求1-4任一项中的肿瘤抗原肽或其衍生物。
全文摘要
由SART－1而来的肿瘤抗原肽及其功能上具有同等特性的衍生物,或应用该肿瘤抗原肽的肿瘤治疗剂或预防剂。
文档编号A61K38/00GK1315960SQ99810466
公开日2001年10月3日 申请日期1999年7月7日 优先权日1998年7月10日
发明者伊东恭悟, 中尾真修 申请人:伊东恭悟